LUCRARE DE LABORATOR 1

Tema: Mediile nutritive pentru cultivarea microorganismelor

Scopul lucrării: De a face cunoștință cu tipurile de medii

nutritive, destinația a lor, clasificarea și metodele de pregătire a
mediilor nutritive
 Mediile nutritive se clasifică:
• după componenţă: naturale, artificiale, sintetice.
Medii naturale: laptele, legumele, fructele, decocturile din
acestea, infuziile din drojdii, gunoi de grajd, sol, crupe, carne etc.
Aceste medii nu au o compoziţie chimică definită şi sunt puţin
potrivite pentru studierea particularităţilor metabolice ale
microorganismelor. Ele servesc pentru acumularea şi păstrarea
culturilor microbiene.
Mediile nutritive sintetice se pregătesc artificial, conţin
substanţe chimice determinate care se iau în amestec cu produse
naturale de compoziţie nedeterminată (bulionul de carne
peptonat, agarul peptonat, mediile din cartof cu glucoză şi
peptonă etc.).Astfel de medii nutritive sunt numite semisintetice.
Mediile nutritive sintetice sunt pregătite din substanţe chimice
strict determinate.(pentru elaborarea acestor medii, care vor
îndestula creşterea şi dezvoltarea unui microorganism concret e
necesar cunoașterea particularităților metabolice şi necesitatea lui
în elemente nutritive)
• după destinaţie mediile nutritive pot fi: de bază, selective şi
diferenţial-diagnostice.
Mediile nutritive de bază sunt folosite pentru cultivarea
celor mai răspândite specii de microorganisme saprofite sau
patogene în condiţii controlate de mediu (bulionul de carne
peptonat, agarul peptonat, gelatina peptonată).
Mediile elective sau de acumulare asigură dezvoltarea
anumitor sau a unui grup înrudit de microorganisme şi sânt puţin
potrivite sau absolut nepotrivite pentru cultivarea
microorganismelor străine.
La pregătirea mediilor nutritive elective e necesar de a lua în
considerație relația microorganismelor față sursele de elemente
nutritive, precum şi cerințele microorganismelor faţă pH mediului,
temperatura optimă de dezvoltare, administrarea cu O2, prezenta
factorilor de creștere etc.
Medii nutritive diferenţial-diagnostice se numesc acele medii,
care permit a deosebi repede o specie de microbi de alta.
Componenţa lor se alege în aşa mod ca la creştere şi
dezvoltarea microorganismelor să se poată uşor deosebi
particularităţile tipice numai speciei date.
În componenţa mediilor nutritive se introduc coloranţi – indicatori
speciali, care colorează cultura microbiană studiată într-o
culoare strict determinată.
Aceste medii nutritive se folosesc des în microbiologia medicală,
precum şi la identificarea şi sistematica microorganismelor.
după consistenţă mediile nutritive pot fi lichide, solide şi
granulare.
Mediile nutritive lichide se utilizează pentru acumularea
biomasei microbiene sau a produselor metabolismului lor,
precum şi pentru evidenţierea particularităţilor fiziologo-
biochimice ale microorganismelor.
Mediile nutritive solide se folosesc pentru obţinerea
culturilor microbiene pure (coloniilor izolate) cu scop diagnostic:
descrierea coloniilor, evidenţierea caracterului creşterii lor pe
agarul peptonat, pentru păstrarea microorganismelor,
evidenţierea numărului total de microorganisme şi pentru alte
scopuri. Pentru solidificarea lor se folosesc agar-agarul, gelatina
şi gelul de silicat de potasiu.
Mediile nutritive granulare se folosesc în industria
microbiologică (crupe de grâu fierte, tărâţe îmbibate cu soluţii de
elemente nutritive etc.)
Pentru cultivarea diferitor microorganisme se folosesc mediile nutritive
semiartificiale: se iau 500 g de carne fără oase, grăsime şi tendoane, se taie
în bucăţi mici (sau se trece prin maşina de tocat carne) se pun intr-o cratiţă
emailată, la ea se adaugă un litru de apă de robinet caldă şi se macerează
timp de 12-24 ore la temperatura camerei- timp suficient pentru extragerea
substanţelor solubile în apă, inclusiv şi a vitaminelor hidrosolubile.
Carnea se scoate, se stoarce bine prin tifon, iar bulionul (extractul de carne) se
fierbe timp de 5 min. La fierbere proteinele se coagulează. Bulionul se răceşte
puţin, se filtrează printr-un filtru din vată într-un balon gradat de 1 litru, apăi se
toarnă apă distilată până la semn. Se mai adaugă 10g peptonă pentru a spori
calităţile nutritive ale mediului şi 5 g NaCl pentru crearea activităţii osmotice a
mediului.
Peptona prezintă un amestec de polipeptide (amestec de proteine descompuse
incomplet) ce conţine aminoacizii liberi, fermenţi, acizi nucleici şi diferite
vitamine. Bulionul de carne peptonat prezintă un mediu nutritiv bogat. În caz de
necesitate în mediu se adaugă 1-2% glucide.
Bulion transparent se obține cu adăugarea albuşului unui ou de găină, ce se
agită puternic împreună cu bulionul rece, apoi se încălzește puţin, după aceia
conţinutul se filtrează pentru a înlătura proteinele coagulate. Bulionul
transparent se toarnă în eprubete, baloane, se astupă cu dopuri din vată şi tifon
şi se sterilizează în autoclavă la 1200C timp de 20 min. Pentru obţinerea
mediilor nutritive solide la bulionul de carne se adaugă agar-agar sau gelatină.
Algile Gracilaria и Gelidium – Porțiuni uscate de agar-agar.
două surse de bază pentru Temperatura de topire Т=80-1000С,
producerea comercială al Temperatura de solidificareТ=37-400С
agarului
Pregătirea agrarului peptonat. La bulionul de carne se adaugă 1,5-2,0%
agar-agar. Agar-agarul este o substanţă coloidală de natură vegetală, extrasă
din alge de mare (g. Gelidium), conţine polizaharide, după compoziţie
asemănătoare amidonului.
După topirea agar-agarului mediul nutritiv obţinut se lasă să se răcească, se
determină şi se corectează pH-ul la 7,5-7,8 cu o soluţie de Na2CO3 de 20%, se
toarnă în eprubete (1/3 sau 2/3 din volum), baloane, se astupă cu dopuri din
vată şi tifon şi se sterilizează în autoclavă la t=1200C timp de 20min.
Mediile nutritive din agar peptonat lichefiază la t=1000C şi se solidifică la
t=400C. Mediul se poate păstra steril la rece timp îndelungat şi constituie
substanţa de bază pentru pregătirea mediilor nutritive lichide şi solide.
Actualmente agarul peptonat se pregăteşte dintr-un preparat uscat numit agar
nutritiv uscat (produs pe cale industrială), în componenţa căruia întră bulion
nutritiv, agar-agar, clorură de sodiu (NaCl), fosfat de sodiu (Na2PO4) pH-ul
căruia este egal cu 7,07. Metoda de pregătire a mediului nutritiv solid din acest
preparat este foarte simplă: se iau 5g preparat şi se amestecă cu 100 cm3 apă
distilată rece. Masa obţinută se topeşte în aparatul Koch sau în baia de apă,
apoi se toarnă în eprubete, colbe, se astupă cu dopuri din vata şi tifon şi se
sterilizează în autoclav.
Pregătirea gelatinei peptonate. La bulionul de carne se adaugă 10-15%
gelatină, care este un produs azotos și conţine proteina gluteina şi se obţine
prin fierberea oaselor şi cartilagelor de animale.
Temperatura de topire a gelatinei peptonate este de 24C, iar de solidificare -
de 20C.
Bulionul de carne peptonat cu adăugarea gelatinei se topeşte în aparatul Koch
timp de 30 min.
După lichefierea gelatinei mediul se alcalinizează până la o reacţie slab alcalină
prin adăugarea soluţiei de Na2CO3 de 20%.
Pentru a obţine o gelatină peptonată transparentă, la ea se adaugă un albuş de
ou şi se efectuează aceleaşi lucrări ca şi la căpătarea agarului peptonat. În
continuare mediul nutritiv se filtrează, se toarnă în eprubete, se astupă cu
dopuri de vată şi se sterilizează în aparatul Koch. Se interzice încălzirea
gelatinei peptonate la temperaturi mai mari de 1000C, deoarece ea se
hidrolizează şi îşi pierde capacitatea de a se solidifica.
Baloanele, eprubetele, alte vase cu medii nutritive pregătite pentru cultivarea
microorganismelor se astupă cu dopuri din vată şi tifon. Prin aceasta se
protejează mediile de uscare, de poluare cu diferite microorganisme din aerul
atmosferic, se îndestulează un schimb permanent de gaze între culturile
microbiene şi mediul ambiant.