4.

Tehnica cultivării microorganismelor

Mediile de cultură reprezintă substraturi nutritive lichide sau solide,

organice sau anorganice care pot asigura creşterea şi dezvoltarea
microorganismelor.
Ele trebuie să întrunească anumite calităţi care să permită dezvoltarea
microorganismelor:
 trebuie să conţină substanţe nutritive necesare şi factorii de creştere în
cantităţi indicate în reţetele de preparare;
 să aibă un anumit pH corespunzător cerinţelor germenului respectiv;
 mediul trebuie să fie stabil pe întreaga durată a cultivării
microorganismelor;
 trebuie să fie steril în momentul însămânţării;
 trebuie să asigure condiţii aerobe sau anaerobe, funcţie de cerinţele
microorganismelor ce se cultivă;
 să aibă un anumit grad de umiditate, care să se menţină pe tot timpul
cultivării.

Din punct de vedere al provenienţei mediile pot fi:

 de origine naturală: vegetale (cartof, morcov), animală (lapte, bilă),
mediul de extract de sol
 artificiale sau sintetice (apa peptonată, bulionul nutritiv, geloza, gelatina).
Din punct de vedere al complexităţii compoziţiei mediile pot fi:
 medii simple sau uzuale folosite pentru cultivarea celor mai multe specii
microbiene ca: apa peptonată, bulionul, geloza, gelatina, extractul de sol;
 medii complexe sunt folosite pentru izolarea şi creşterea unor
microorganisme care se dezvoltă slab sau nu se dezvoltă pe medii simple
(bilion-ser, bulion-sânge, bulion glucozat, geloză-ser, geloză sânge);
 medii speciale cu o compoziţie care permite creşterea preferenţială a unor
specii de microorganisme şi pun în evidenţă anumite caracteristici
metabolice. Acestea pot fi la rândul lor împărţite în:
1. medii de îmbogăţire - sunt capabile să favorizeze dezvoltarea unor
specii microbiene care se află în concentraţii mici, în produse cu floră
asociată (ex. mediile Müller-Kauffmann, Leifson, Chapman etc);

9
 2. medii selective - sunt medii ce conţin substanţe bacteriostatice care
inhibă creşterea unor specii saprofite sau patogene (ex. mediile Istrati-
Meitert, Levine, Endo, Löwenstein etc);
3. medii elective - sunt medii fără substanţe bacteriostatice a căror
compoziţii oferă condiţii de dezvoltare pentru speciile care cresc mai rapid
decât flora de asociaţie (ex. mediile Löffler şi Bordet-Gengou);
4. medii diferenţiale sau de identificare - conţin indicatori pentru
punerea în evidenţă a unor procese biochimice caracteristice pentru
metabolismul unei specii (fermentarea zaharurilor, capacitatea de oxidare,
reducere); ex. mediile Hins, Drigalski, Fergussen, Clark-Lubs etc;
5. mediile de conservare - sunt mediile folosite pentru menţinerea
viabilităţii culturilor (ex. mediul Dorset, agarul moale).

Pentru solidificarea mediilor de cultură se utilizează:

 Agar-agarul este un poliglucid obţinut din alge ale genului Gelidium. În
stare purificată se prezintă sub formă de pulbere sau fibre şi se adaugă în
cantitate de 0,5 – 2%. În prezenţa apei îşi măreşte volumul de 16 ori. Fibrele
de agar sunt lipsite de proprietăţi nutritive, ele servind numai la solidificarea
mediului. Fibrele tăiate în bucăţi mici se dizolvă în apă la temperatura de
80-90˚C şi constituie un lichid vâscos care are proprietatea de a se solidifica
la 40–45ºC. În mediu acid, supus la temperaturi de sterilizare, îşi pierde
capacitatea de solidificare.
 Gelatina este extrasă din ţesuturi colagenice. Se foloseşte în concentraţie
de 12–15%. Se lichefiază la temperaturi mai mari de 35ºC şi gelifică lent
sub temperatura de 25ºC. Are dezavantajul că poate fi folosită ca nutrient de
către microorganismele cu activitate proteolitică şi în acest caz îşi pierde
proprietăţile de gel.
Sunt firme care livrează medii de cultură gata preparate cum ar fi:
Difco, Sartorius, Merck ş.a.

4.1. Prepararea mediilor de cultură

4.1.1. Medii simple lichide

10
 1. Bulionul de carne este mediul de bază în microbiologie. Prepararea
lui se realizează în două etape şi anume:
 prepararea maceratului de carne;
 prepararea bulionului propriu-zis.

Prepararea maceratului de carne. Carnea slabă de vită în cantitate de

500 g, se curăţă de oase, tendoane, aponevroze şi grăsimi, se toacă şi se
macerează la rece timp de 12-24 ore în 1000 ml apă de robinet. În acest timp
se realizează autoliza ţesuturilor şi solubilizarea produselor de autoliză în
apă. Se fierbe apoi maceratul timp de 10 minute pentru a se accentua
dizolvarea substanţelor solubile şi a se coagula albuminele insolubile. După
răcire se filtrează prin hârtie de filtru sau vată pentru a opri grăsimile, care
sub această formă nu pot fi utilizate de bacterii. Se repartizează apoi zeama
de carne în flacoane sterilizate care se închid cu dopuri de vată învelite în
tifon şi se sterilizează 30 minute la 120˚C. Maceratul astfel obţinut se poate
păstra steril la rece timp îndelungat şi constituie substanţa de bază pentru
pregătirea mediilor lichide sau solide.
Pentru a produce un bulion cu calităţi nutritive superioare, se foloseşte
procedeul autoclavării maceratului de carne la 2 atmosfere. În acest caz,
proteinele sunt degradate în proporţie mai mare până la stadiul de peptone şi
aminoacizi, devenind astfel mai accesibile pentru microorganisme.

Bulionul propriu-zis se prepară în felul următor: la 1000 ml zeamă de

carne se adaugă la cald 10 g peptonă şi 5 g NaCl, se amestecă totul şi se
încălzeşte în continuare până la dizolvarea totală a peptonei. Se lasă să se
răcească, se determină şi se corectează pH-ul la 7,5-7,8 cu ajutorul unei
soluţii de NaOH 10%. Apoi mediul se autoclavează timp de 15 minute la
120˚C pentru precipitarea sărurilor alcalino-teroase. Pentru îndepărtarea
precipitatului şi a resturilor de grăsimi se filtrează prin hârtie de filtru, apoi
se repartizează în baloane, care se închid cu dopuri de vată şi se sterilizează
20 minute la 115˚C.
2. Apa peptonată
În 1000 ml apă distilată se dizolvă la cald 10 g peptonă şi 5 g NaCl. Se
corectează pH-ul la 7,8; se filtrează prin hârtie de filtru, se repartizează în
eprubete şi se sterilizează 20 minute la 120˚C.
11
 Peptonele întrebuinţate în microbiologie sunt substanţe care rezultă
din digestia peptică a cărnii. Ele au o compoziţie complexă şi conţin printre
altele polipeptide şi peptone, necesare metabolismului bacterian. Conţinutul
lor este diferit în funcţie de specia animală care serveşte ca materie primă. O
proprietate importantă este legată de faptul că nu coagulează la căldură.

4.1.2. Medii solide

1. Geloza sau agarul nutritiv

Este un mediu solid ce se prepară din bulion prin adăugarea de agar-
agar (se obţine din alga Gelidium corneum).
Prepararea gelozei se face în felul următor: se adaugă 15-30 g agar la
1000 ml bulion, apoi bulionul se încălzeşte pe baia de apă sau în autoclav la
120˚C timp de 30 minute. Se filtrează prin vată la cald; filtratul se
repartizează în eprubete sau baloane după care se închid cu dopuri şi se
sterilizează în autoclav la 120˚C timp de 30 minute. Geloza nutritivă este
transparentă şi de culoare gălbuie. Se foloseşte de obicei sub formă de
geloză înclinată în tuburi sau repartizată în plăci Petri (Fig. 17).
Mediul astfel preparat nu se poate păstra mult timp în laborator,
deoarece prin evaporare pierde apa şi se usucă.

Fig. 17 - Repartizarea mediului de cultură în placa Petri.

2. Mediul cu gelatină
La 1000 ml bulion încălzit la 80˚C se adaugă 120-150 g gelatină foi.
Se agită până la lichefierea totală a gelatinei, apoi se alcalinizează cu NaOH
10% şi se lasă să se răcească la 55˚C. În acest moment se adaugă albuş de
12
ou, dizolvat în 10-20 ml apă distilată; mediul împreună cu albuşul se agită
puternic. Se autoclavează apoi 30 minute la 115˚C, după care se filtrează şi
se repartizează în eprubete. Eprubetele se închid cu dopuri metalice sau de
vată şi se sterilitează la 110˚C timp de 20 minute. Mediul se lasă să se
răcească în tuburi, acestea având o poziţie verticală.

3. Mediul cu extract de sol

La 1000 g sol fertil se adaugă 1000 ml apă de robinet. Amestecul se
autoclavează la 120˚C timp de 30 minute. Se adaugă în continuare 0,5 g
CaCO3, pentru a produce flocularea coloizilor, apoi se agită şi se filtrează la
cald prin hârtie de filtru dublă. Filtratul iniţial nu este clar, dar se continuă
operaţia până se obţine un lichid limpede. Acesta din urmă se repartizează în
baloane care se acoperă cu dopuri de vată şi se sterilizează în autoclav la
112˚C timp de 20 minute. În prealabil se corectează reacţia mediului la
pH=7.

4.1.3. Medii sintetice

1. Mediul Thornton se foloseşte la cultivarea bacteriilor din sol şi apă.

El are următoarea compoziţie:
KHPO4…………..1 g KNO3…………....0,5 g
Mg SO4………….0,2 g Asparagină……....0,5 g
CaSO4…………...0,1 g Glucoză……….... 20 g
NaCl……………. 0,1 g Agar-agar……......20 g
FeCl3…………….0,002 g Apă distilată ….... 1000 ml.

Ingredientele se dizolvă la cald şi pH-ul se aduce la 7,6; sterilizarea se

face la 105˚C, timp de 20 minute, trei zile consecutiv.

2. Mediul cu glucoză-peptonă-agar este un mediu simplu pentru

detectarea germenilor termofili ca Bacillus stearothermophilus şi pentru
Clostridium sp. Mediul are următoarea compoziţie:
Peptonă…………..................................................1 g
Glucoză….....................................................…....0,2 g
Agar-agar……......................................................15 g
13
 Purpura de brom-crezol slouţie 0,04.....................0,1 g
Apă distilată…………..........................................1000 ml

Ingredientele se dizolvă la cald şi pH-ul se ajustează la 6,8-7. Se

sterilizează 30 minute la 100˚C timp de trei zile consecutiv. Colorantul
purpură bromcrezol este încorporat de către coloniile plate, acestea formând
astfel un halou galben.

4.1.4. Medii naturale

1. Mediul cu felii de cartof

Se spală tuberculii, se dezinfectează cu sublimat coroziv soluţie 0,1%
timp de o oră, după care se spală din nou şi se curăţă de coajă.
Se taie tuberculii în felii subţiri de 2-3 mm şi acestea se aşează în plăci
Petri, la care se adaugă puţină apă.
Se mai pot folosi tuberculii sub formă de cilindri, cu ajutorul
perforatorului de dopuri, se introduc în eprubete şi se sterilizează fracţionat,
pentru a se impiedica uscarea mediului.

4.2. Determinarea reacţiei (pH) mediilor de cultură

Pe lângă condiţiile ce trebuie să le îndeplinească, mediile de cultură au

un anumit grad de alcalinitate sau aciditate în funcţie de cerinţele
microorganismelor cultivate.
Gradul de alcalinitate sau de aciditate al mediilor de cultură se
exprimă prin "pH" care reprezintă logaritmul de semn schimbat al
concentraţiei ionilor de H+ din soluţia dată.
Scara de pH cuprinde toate gradele de reactivitate chimică între 0 şi
14, de la aciditatea absolută (0), până la alcalinitatea absolută (14),
neutralitatea fiind reprezentată de valoarea 7 (obţinută în raport constant de
disociere a apei, care este neutră).
În general, pentru bacterii mediile trebuie să aibă pH-ul cuprins între
7,2 şi 7,6; pentru actinomicete 7,0-7,6 iar pentru ciuperci în jur de 5,6.

14
 Determinarea pH-ului de cultură se face fie cu ajutorul metodelor
electrometrice foarte precise, fie prin metode colorimetrice, care sunt
prezentate la lucrările practice de chimie şi biochimie.
Corectarea pH-ului mediului se face cu soluţii normale de NaOH şi
HCl sau de alte concentraţii (10% sau 20%).
În mod curent, determinarea pH-ului se mai efectuează şi cu ajutorul
hârtiei indicatoare care se bazează pe principiul schimbării de culoare.
Există diferite mărci de hârtie indicatoare fabricate de firme ca Merck din
Germania.
Determinarea pH-ului cu benzi de hârtie este însă mai puţin precisă ca
cea efectuată prin metodele electrometrice sau colorimetrice; de aceea în
lucrările de mare precizie se vor utiliza numai aceste metode.
În timpul sterilizării mediilor de cultură pH-ul se modifică cu 0,2-0,4
unităţi, în funcţie de temperatură şi de aceea este necesară ajustarea acestora
înainte de sterilizare cu 0,2-0,4 unităţi în plus. În timpul cultivării pe medii,
microorganismele modifică uneori valoarea pH-ului iniţial.

Materiale necesare

 stative cu anse, ace spatulate, pensete, baghete din sticlă, spatule;

 plăci Petri cu medii naturale vegetale sterilizate (morcov, cartof);
 plăci Petri cu mediu PDA (potato - dextrose - agar) sterilizate;
 vase Erlenmeyer cu mediu cu extract de sol sterilizate;
 vase Erlenmeyer cu mediu sintetic Ashby lichid.

15