MICROBIOLOGIE ALIMENTAR LP.

MEDIILE DE CULTUR PENTRU BACTERII I MICEI (CLASIFICARE, COMPOZIIE, MOD DE PREPARARE). TEHNICI DE IZOLARE A BACTERIILOR I MICEILOR DIN ALIMENTE PE MEDII DE CULTUR: NSMNAREA N MEDII LICHIDE, PE SUPRAFAA I N PROFUNZIMEA MEDIILOR SOLIDE.

MEDIILE DE CULTUR Un mediu de cultur poate fi definit ca un suport nutritiv steril, care permite dezvoltarea i studiul unui microb n afara niei ecologice naturale. Pentru a permite dezvoltarea bacteriilor, orice mediu de cultur trebuie s ndeplineasc anumite condiii: s conin substanele nutritive necesare metabolismului bacterian; s aib o anumit reacie (pH) n limitele creia se poate dezvolta bacteria pe care dorim s o izolm; s corespund particularitilor fiziologice ale bacteriilor, innd seama mai ales de tipul de respiraie (aerob, anaerob, microaerofil); s fie steril. n lucrrile curente de bacteriologie se utilizeaz numeroase i variate medii de cultur, care pot fi clasificate pe baza mai multor criterii. 1. Dup consisten: - medii lichide (bulionul nutritiv, apa peptonat) - medii solide (agarul sau geloza nutritiv), - medii semisolide (agarul moale); 2. Dup tipul respirator al bacteriilor: - medii pentru cultivarea bacteriilor aerobe (bullion nutritive, agar ); - medii pentru cultivarea bacteriilor anaerobe (bullion cu ficat, geloza Veillon, bullion VL, bullion VF); 3. Dup compoziie: - medii naturale cu o compoziie complex, incomplet definit, obinute din extracte de carne sau esuturi vegetale; - medii sintetice cu o compoziie chimic bine cunoscut (soluii minerale, aminocizi, glucide simple), utilizate n studiile de metabolism n vederea testrii posibilitilor enzimatice ale bacteriilor; 4. Dup frecvena i scopul utilizrii: A. medii uzuale folosite n mod frecvent deoarece pe aceste medii se dezvolt majoritatea bacteriilor; B. medii speciale , care, la rndul lor, pot fi: -medii de mbogire - conin substane care stimuleaz multiplicarea unor germeni aflai n numr foarte redus n materialele patologice din care dorim s-i izolm (ex., selenitul pentru salmonele));

-medii selective* - conin una sau mai multe substane (antiseptice, antibiotice, sruri biliare, NaCl etc.), care inhib dezvoltarea speciilor bacteriene asociate cu bacteria pe care dorim s o izolm; -medii de diagnostic diferenial permit creterea difereniat a unor bacterii i relev anumite particulariti metabolice semnificative pentru identificare. *Medii selective pentru bacteriile coliforme - Bulion bil-lactoz-verde briliant (BBLV) Simplu concentrat. Se obine din pepton 10 g., lactoz 10g., bil uscat de bou 20 g, verde briliant 0,0133 g sau 13,3 ml soluie alcoolic 1%0, ap distilat 1000 ml, pH 7,3. - Mediul cu lauril sulfat. Se prepar din: tripton 20g, clorur de sodiu 5 g, lactoz 5 g, fosfat dipotasic 2,75 g, fosfat monopotasic 2,75 g, lauril sulfat de sodiu 0,1 g, ap distilat 1000 ml i pH ajustat la 6,8. - Mediul cu lactoz-eozin-albastru de metilen (GEAM, Levine) se prepar din pepton 10 g, lactoz 10 g, fosfat dipotasic 2g, agar 15 -20 g, eozin 0,4 g, albstru de metilen 0,065 g, ap distilat 1000 ml cu pH 7,1. Interpretare: Escherichia coli- colonii de culoare neagr cu luciu metalic i reflex verzui Alte bacterii coliforme- colonii albastru nchis, fr luciu metalic sau colonii atipice, opace, mucoase, roze cu centru gribrun Salmonella-Shigella- colonii transparente Proteus- colonii izolate, neinvadante, opace, roze, uneori mucoase cu centrul violet nchis -Agar cu dezoxicolat i lactoz se prepar din :pepton 10g, clorur de sodiu 5 g, citrat de sodiu 2 g, dezoxicolat de sodiu 0,5 g, lactoz 10 g, rou neutru 0,03 g, agar 15-20 g, ap distilat 1000 ml, pH 7,3. Mediul are culoare roz-rocat. Interpretare: Escherichia coli- colonii roii cu zone de precipitare marginal Enterobacter, Klebsiella- colonii pale, cu centru rou i zon de precipitare marginal Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas,- colonii incolore transparente -Geloz VRBL (lactoz-bil-cristal violet rou neutru) se obine din: pepton 7g, extract de drojdie 3g, lactoz 10g, clorur de sodiu 5 g, sruri biliare 1,5g, rou neutru 0,03g, cristal violet 0,02 g, agar 12-18 g, ap 1000 ml. pH 7,4. *Medii selective pentru Escherichia coli - Bulion Ec cu novobiocin se prepar din: pepton 20g, sruri biliare 1,5 g, sorbitol, 5 g, fosfat dipotasic 4 g, fosfat monopotasic 1,5 g, clorur de sodiu 5 g, ap distilat 100 ml. Dup dizo,varea ingredientelor se introduc 10 mg novobiocin, pH 6,9, se repartizeaz n eprubete cu tub de fermentaie i se autoclaveaz la 1100C timp de 20 min. - Agarul Mac Conkey cu sorbitol este format din: pepton 20g, sorbitol 10g, sruri bilioare 1,5 g, clorur de sodiu 5 g, rou neutru 3 ml sol.1%, cristal violet 0,1

ml din sol. 1%, agar 15 g i ap distilat 1000 ml. Dup adaugarea ingredientelor se ajusteaz la pH 7,1, se adaug soluiile de cristal violet i rou neutru. Intrepretare: E.coli O157H7 este sorbitol negativ i formeaz colinii incolore, iar tulpinile sorbitol pozitive formeaz colonii roz-roii. C. medii de conservare asigur conservarea bacteriilor n laborator (ex., agarul moale). D. medii de transport au o compoziie chimic care permite meninerea nemodificat a raportului numeric ntre diferitele specii microbiene prezente ntr-o prob, n timpul transportului (ex., mediul Stuart). E. medii politrope - permit testarea simultan a mai multor caractere metabolice (ex., mediile TSI, MIU, MILF). *Medii selective pentru enterococi Medii de mbogire Bulion cu azid i glucoz: extract de carne 4,5 g, tripoton 15 g, glucoz 7,5g, clorur de sodiu 7,5 g, azid de sodiu 0,2 g, ap distilat 1000 ml, pH 7,2, autoclavare 15 min la 1210C. Medii selective Agar citrat-azid de sodiu-bil-esculin se prepar din: tripton 17 g, pepton 3 g, extract de drojdie 5 g, sruri biliare 10g, clorur de sodiu 5 g, citrat de sodiu 1g, esculin 1 g, citrat de fier amoniacal 0,50g, azid de sodiu 0,25 g, agar 15 g, ap distilat 1000 ml, pH 7,0-7,2*Medii selective pentru Salmonella Medii de cultur uzuale pentru bacteriile aerobe Bulionul din carneMediul original se prepar din carne de bou sau de cal, mai rar carne de pasre. La 500 g carne tocat se adaug 1 000 ml ap. Se las la macerat o noapte la temperatura camerei, apoi se fierbe timp de 30 minute. Dup rcire, lichidul se decanteaz iar carnea se stoarce prin presare. Lichidul obinut se filtreaz prin tifon i se completeaz cu ap la volumul iniial. Se adaug apoi pepton (10%o), i clorur de sodiu (5) i se ajusteaz pH-ul la 7,2-7,4 cu soluie de NaOH N/1. Se fierbe 15-20 minute i se filtreaz din nou prin vat apoi prin hrtie de filtru. Lichidul obinut se repartizeaz n flacoane de sticl cu dop de vat sau nfiletat i se sterilizeaz prin autoclavare. La ora actual, maceratul de carne este substituit cu extractul de carne sub form de pulbere purificat i standardizat, livrat de diferite firme internaionale (Merk, Difco, Bacto, Oxoid etc.), sau de institutele de produse biologice Pasteur i Cantacuzino. n acest caz pentru prepararea mediului se realizeaz un amestec din: - extract de carne (10 g), - pepton (10 g), - clorur de sodiu (5 g), ap distilat (1 000 ml), Modul de preparare este acelai. Agarul nutritiv sau geloza Este un mediu solid care se prepar din bulion prin adugarea fibrelor sau pulberii de agar, o alg din mrile Japoniei, care nu are valoare nutritiv dar are

proprietatea de a asolidifica mediile lichide. Fibrele de agar se dizolv la temperatura de 80-90C, formnd un lichid vscos care se solidific la temperatura de 45C. Punctul de topire fiind diferit de cel de solidificare, confer mediilor o serie de avantaje pentru bacteriologie. Preparare: la 1 000 ml bulion se adaug 17-30 g agar, de preferat sub form de pulbere. Mediul repartizat n eprubete i sterilizat se solidific n poziie nclinat (agar nclinat), sau dreapt (agar drept). Adugat n bulion n proporie de 0,1% se obine un mediu semisolid (agarul moale), utilizat pentru proba mobilitii bacteriilor i pentru conservarea bacteriilor n laborator. Mediile cu ser Se prepar din medii uzuale (bulion, agar) la care se adaug ser normal, de obicei de cal, n proporie de 1/10. Pentru prepararea agarului cu ser, la mediul topit n prealabil i rcit la 45C, se adaug serul, se omogenizeaz i se las s se solidifice n poziia dorit. Agarul cu snge Sngele defibrinat se adaug steril la agarul nutritiv, n proporie de 5 -10%, dup o prealabil topire i rcirre a mediului la 40C. Mediile cu ser i snge se utilizeaz pentru cultivatrea bacteriilor cu anumite exigene nutritive, care nu se dezvolt pe mediile simple Medii uzuale pentru cultivarea bacteriilor anaerobe Bulionul cu ficat (Tarozzi) Se fierbe ficatul (de cal, bou, cobai, sau iepure) se taie n fragmente mici ce se introduc n tuburi cu 8-10 ml bulion simplu sau bulion glucozat 1%. Se sterilizeaz la 110C timp de 20 minute. Bulionul VF Mediul VF (de la iniialele cuvintelor n limba francez viande = carne; levure = levur (drojdie), are mediul de baz prepart din: pepton triptic (10 g), - NaCl (5 g), - extract de carne de bou (3 g), - extract de drojdie (5 g), - clorhidrat de cistein (0,4 g), - ap (1.000 ml). Se ajusteaz pH-ul la 7,2-7,4; se sterilizeaz prin autoclavare. Geloza VF Compoziie: - bulion VF (980 ml), - agar (20 g). Geloza Veillon Compoziie: - bulion simplu (1.000 ml), - agar (8-10 g), - glucoz (5-10 g), - azotat de potasiu (1-2 g). Se dizolv glucoza i azotatul de potasiu n bulion, se adaug agarul, se nclzete la autoclav, se filtreaz prin vat, se repartizeaz n tuburi Weinberg (diametrul 0,8 -1 cm i nlimea de 20-25 cm), astfel ca mediul s ocupe mai mult

de jumtate din nlimea tubului. Se sterilizeaz la 115C timp de 15 minute. Pentru solidificarea mediului, tubul se ine n poziie vertical. Medii de cultur uzuale pentru micei Mediul Sabouraud solid se prepar din 1000 ml ap distilat, 10 g pepton, 20 g glucoz i 20 g agar de fibre. Se dizolv peptona n 250 ml ap la fierbere, se autoclaveaz 30 min. la 120oC i se filtrez. Se amestec cele dou soluii filtrate, se completeaz cu ap pn la 1000 ml i se adaug agarul splat. Se fierbe pn la topirea agarului, se filtreaz prin tifon, se repartizeaz dup necesiti i se sterilizeaz la 110oC timp de 30 min. - pH final 5,8 - 6,2. Un mediu similar lichid se poate prepara din aceleai ingrediente minus agarul. Aceste medii se utilizeaz pentru izolarea i cultivarea ciupercilor microscopice

Tehnici de izolare a bacteriilor i miceilor din alimente pe medii de cultur: nsmnarea n medii lichide, pe suprafaa i n profunzimea mediilor solide NSMNAREA este operaiunea de introducere ntr-un mediu de cultur
lichid sau de depunere pe suprafaa unui mediu solid, a unei cantiti reduse de material patologic, n scopul izolrii bacteriilor eventual prezente. Aceast operaiune se execut n condiii de asepsie ct mai riguroas, folosind instrumente sterile, recipiente cu medii de cultur sterile, sub protecia unei flcri (bec de gaz, lamp cu alcool) sau a unei hote sterile. nsmnarea se execut cu pipeta Pasteur sau cu acul de nsmnare. TEHNICA NSMNRII N MEDII DE CULTUR LICHIDE se introduce n recipientul ce conine prelevatul, se rcete alipind-o de peretele recipientului, apoi se ia o poriune din produs. Se scoate dopul recipientului cu mediu i se flambeaz gura acestuia. Materialul luat pe bucla ansei din prelevat este introdus n mediul din recipientul deschis sub protecia flacrii. Se descarc ansa pe peretele recipientului, agitnd uor lichidul, se flambeaz din nou gura recipientului i dopul cu care apoi se astup recipientul. Dup nsmnare, ansa se sterilizeaz din nou prin nclzire la rou. Tehnica nsmnrii cu pipeta. Dac se lucreaz cu pipeta gradat, aceasta se scoate din ambalajul steril i se introduce rapid n flacr att capatul ct i toat lungimea ei. Se controleaz apoi rcirea ei prin flambare.

Tehnica insamantarii cu ansa bacteriologica. Ansa cu firul nroit n flacar

Dac se lucreaz cu pipeta Pasteur, se rupe vrful efilat al pipetei, dup care se flambeaz captul. Pipeta flambata i rcit se introduce n recipientul cu produsul prelevat i se aspir de la cteva picturi pn la 1 sau mai muli ml, in raport cu materialul de nsmnat i cantitatea de mediu de cultura. Pipeta trebuie manipulat cu grij pentru a nu uda dopul de vat. Materialul aspirat n pipet se nsmneaz n recipientul cu mediu nutritiv cu aceleai precauiuni de flambare a gtului recipientelor i a dopurilor respective. Pipeta folosit se pune ntr-un pahar cu amestec sulfo-cromic, aspirndu-se din amestec pn la aproximativ 1 cm sub dop. Tampoanele care au servit la recoltarea produselor patologice vor fi descarcate direct n mediu, dup care vor fi introduse n tub i puse n galeata de infecte. TEHNICA NSMNRII PE SUPRAFAA MEDIILOR SOLIDE N PLCI PETRI Tehnica nsmnrii pe suprafa. nsmnarea pe suprafaa mediilor solide se poate face cu ansa. Cnd se nsmneaz medii care au fost solidificate n tuburi, n poziie nclinat, se execut pe suprafaa mediului micri n zig-zag, de la baza ctre exterior, cu precauia de a nu zgaria suprafaa mediului. Cnd se face nsmnarea unui mediu de cultur turnat n plci Petri, materialul de nsmnat se depune cu acul de nsmnare sau pipeta Pasteur pe suprafaa mediului i se disemineaz n linii paralele n 4-5 sectoare, cu acul de nsmnare sau cu spatula Drigalski (o pipet Pasteur ndoit la flacr). n cazul mediilor solidificate n coloan dreapt, nsmnarea se face prin nepare n profunzime. Tehnica nsmnrii prin ncorporare. Se lichefiaza mediul prin ncalzire la 800 C, se rcete la 50 0 C i se introduce produsul de nsmnat cu o pipet steril. Se omogenizeaz prin uoar rotire a recipientului. Mediul astfel nsmnat se toarn dup caz, n plci Petri sterile sau se las ca atare n recipientul n care s -a facut nsmnarea. Dup executarea nsmnrilor se noteaz pe tuburile sau placile cu medii nsmnate, cu un creionul dermatograf sau marker, numrul de nregistrare a probei i data nsmnrii. Mediile nsmnate se incubeaz la termostat, la o temperatur i pentru o perioad de timp variabil, n funcie de specia microbian suspect. Majoritatea bacteriilor patogene pentru animalele cu snge cald se multiplic op tim la temperatura de 370 C, formnd culturi n 24-48 ore de incubaie.

PARTICULARITI PRIVIND CULTIVAREA BACTERIILOR ANAEROBE Bacteriile anaerobe i cele facultativ anaerobe se pot cultiva: - n profunzimea mediilor anaerobe solide (gelloza Veillon, mediul SPS, anaerobic agar etc.),repartizate n tuburi Weinberg; - n medii anaerobe lichide (bulion cu ficat, bulion VF, bulion VL etc.), care vor fi regenerate n prealabil prin fierbere 5-10 minute n baia de ap, pentru eliminarea oxigenului dizolvat n mediu, iar dup nsmnare se vor acoperi cu un strat subire de ulei de parafin steril pentru a evita dizolvarea oxigenului din tub, n mediul nsmnat; - pe suprafaa mediilor solide repartizate n plci Petri, care vor fi incubate n anaerostat (incubator n care oxigenul este nlocuit cu gaze inerte: azot, hidrogen, sau bioxid de carbon, n funcie de exigenele bacteriei cultivate). - pe suprafaa mediilor solide repartizate n plci Petri, anaerobioza realizndu-se prin fixarea pe faa intern a capacului plcii a unui plic de hrtie cu 2 g de amestec oxidoreductor (pirogalol (1 g), carbonat de potasiu (1 g), talc (5 g) i etanarea celor dou pri ale plcii Petri cu o band adeziv, parafin sau agar.