Medii de cultură – preparare, rețete, indicații

Mediile de cultură artificiale sunt substraturi nutritive (lichide sau solide, organice sau
anorganice) ce asigură dezvoltarea și multiplicarea microorganismelor. Se folosesc atât pentru
izolarea și păstrarea sub formă de culturi pure a microorganismelor, cât și pentru identificarea
speciilor în funcție de proprietățile fiziologice pe care acestea le prezintă. Mediile de cultură
trebuie să prezinte proprietăți cât mai asemănătoare cu substraturile naturale:
• să conțină compușii și factorii necesare creșterii microorganismului;
• să aibă pH-ul corespunzător dezvoltării microorganismului;
• să-şi păstreze toate calitățile inițiale pe toată durata incubării;
• să rămână sterile până în momentul inoculării;
• să asigure condițiile de aerobioză/anaerobioză corespunzătoare microorganismului
respectiv;
• să asigure un anumit grad de umiditate.
1. Medii uzuale (simple) asigură cultivarea unui număr mare de fungi (Sabouraud, PDA);
2. Medii complexe (compuse) asigură izolarea și creșterea unor microorganisme care se
dezvoltă slab sau nu se dezvoltă pe medii simple (îmbogățite în vitamine, diferite săruri, AA, alți
factori de creștere);
3. Medii speciale (selective) asigură creșterea preferențială a anumitor specii dintr-un
amestec heterogen de microorganisme sau evidențierea anumitor caractere particulare de
metabolism ale speciei cultivate. Pot conține: un indicator de pH, antiseptice selective,
antibacteriene/antimicotice etc.
Principalii factori în pregătirea mediilor de cultură se referă la:
- sursa de energie;
- calitatea și categoria nutrienților (surse de C, surse de N, macroelemente, microelemente,
factori de creștere);
- parametrii fizico-chimici (temperatură, pH, lumină, agitare-staționare, concentrația
osmotică, concentrația O2 etc.)
În cazul microorganismelor heterotrofe, sursele de C și de energie sunt aceleași !
Surse de C sunt: zaharuri cu catenă scurtă (mono-, di-, tri-, oligozaharide), polizaharide
(amidon, celuloză, hemiceluloze etc.), acizi organici, alcooli și polialcooli, acizi grași, lipide
complexe, compuși aromatici, substanță organică complexă (glico-lipo-proteine).
Surse de N sunt: sărurile de N asimilabile, AA, polipeptide și proteine sau substanțe
organice complexe.
Macroelementele sunt: (altele decât C și N): O, S, P, K, Mg, săruri organice și anorganice
asimilabile.
Microelementele sunt: (Ca, Cu, Fe, Mn, Zn etc.) necesare în cantități foarte reduse și într-
o formă ușor asimilabilă (ioni, săruri solubile, fracții mobile), au rol fiziologic sau sunt utilizați în
sinteza unor constituenți proprii.

1
 Concentrația nutrienților trebuie să fie optimă - la valori reduse nu se înregistrează o creștere
/ dezvoltare maximă, iar la concentrații ridicate pot apărea fenomene de inhibiție (mai ales datorită
presiunii osmotice).
Factorii de creștere sunt necesari în concentrații reduse, dar indispensabili dezvoltării:
vitamine, AA esențiali, acizi organici, precursori etc. (peptidele cu lanț scurt pot induce creșterea
unor microorganisme „non-cultivabile”).
Pentru solidificarea mediilor de cultură se folosesc substanțe gelifiante, cel mai frecvent
utilizat fiind agarul (polizaharid cu proprietăți gelifiante foarte bune, cu stabilitate la temperatura
camerei). Mediile de cultură (solidificate sau lichide) se sterilizează prin autoclavare, frecvent la
temperatura de 121 ℃ (dacă nu sunt compuși termolabili ce necesită temperaturi mai reduse pentru
autoclavare).
Mediile de cultură utilizate pentru izolarea fungilor sunt foarte diversificate, corespunzător
necesităților nutriționale și ecologice ale diferitelor categorii taxonomice. Cele mai frecvent
folosite medii de cultură pentru fungi sunt: Mediu extract de malț-Agar (MEA), mediul
Sabouraud, mediul Czapek-Dox și Mediul Potatoes-Dextrose-Agar (PDA-extract de cartof-agar).
Mediul MEA - pentru prepararea acestui mediu se folosește:
• Extract de malț - 20 g;
• Agar - 15 g;
• Apă distilată - 1000 ml.
Sterilizarea mediului se realizează la 120 °C, timp de 20 minute.
După sterilizare mediul se toarnă în plăci Petri sau eprubete sterile și se utilizează după
răcire.
Pentru a crește selectivitatea sa, acest mediu poate fi adiționat cu cloramfenicol sau
gentamicină (antibiotice rezistente la autoclavare), iar pH-ul ajustat la valoarea 4,5-5,00.
Mediul MEGA îmbogățit în glucoză:
• Extract de malț - 20 g;
• Agar - 15 g;
• Glucoză 10 g;
• Apă distilată - 1000 ml.
Sterilizarea mediului se realizează la 120 °C, timp de 20 minute.
Mediul Sabouraud - acest mediu conține:
• Peptonă - 10 g;
• Glucoză - 20 g;
• Agar - 15 g;
• Apă distilată - 1000 mL.
Sterilizarea mediului se realizează la 120 °C, timp de 20 minute.
Ca și în cazul mediului de cultură MEA, selectivitatea poate fi crescută prin ajustarea pH-
ului și prin adăugarea de compuși antibacterieni.
Mediul PDA - acest mediu conține:
• Extract de cartof - 4 g;

2
 • Glucoză - 20 g;
• Agar - 15 g;
• Apă distilată - 1000 mL.
Sterilizarea mediului se realizează la 120 °C, timp de 20 minute.
Mediu Czapek
• Zaharoză - 30 g;
• Agar - 15 g;
• Fosfat monopotasic - 1 g;
• Sulfat de magneziu - 0,5 g;
• Clorură de sodiu - 0,5 g;
• Sulfat de fier - 0,1 g;
• Apă distilată - 1000 mL.
În funcție de scopul urmărit, mediile pot fi îmbogățite în glucide (glucoză, maltoză,
zaharoză), în polialcooli (manitol, sorbitol, glicerol), vitamine (adăugate ca soluție sterilizată prin
filtrare după autoclavarea mediilor), surse anorganice de azot (sulfat de amoniu, azotat de amoniu,
azotat de sodiu etc.), extract de drojdie sau diferite sucuri și extracte naturale, diferite săruri
minerale pentru asigurarea de macro- și microelemente (P, Mg, S, K, Ca, Mn, Fe, Cu etc.).
Pentru prepararea mediilor lichide se folosesc rețete similare, fără a se adăuga un agent
gelifiant (fără agar). Mediile sunt sterilizate în diferite categorii de vase cu deschidere îngustă
(baloane, pahare Erlenmayer, eprubete) și sunt acoperite cu dopuri ce asigură ermetizarea vasului
sau împiedicarea pătrunderii unor microbi în vase (dopuri de plastic/cauciuc, capace filetate sau,
după caz, dopuri din vată-tifon etc.).
Ajustarea pH-ului se realizează cu ajutorul unor soluții diluate (0,1M HCl, NaOH etc.) la
pH-metrul electronic, anterior sterilizării.
În vederea preparării mediilor, se lichefiază mai întâi agarul într-un pahar Erlenmayer,
ulterior sunt adăugate celelalte ingrediente, funcție de compoziția fiecărui mediu în parte. După
prepararea mediilor de cultură, acestea sunt autoclavate la temperatura corespunzătoare fiecărui
tip de mediu în parte. Concomitent sunt sterilizate plăci Petri goale în etuvă, la temperatura de 180
°C, timp de 60 minute sau plăci Petri sterile de unică folosință (de plastic). După sterilizarea
mediilor de cultură și a plăcilor Petri, turnarea mediilor în plăci se realizează în boxa cu flux
laminar, pentru evitarea contaminării.
Pe lângă mediile prezentate mai sus, diferiți producători comercializează variante diferite ale
acestor medii, cu modificări ale compoziției și parametrilor. În funcție de scopul urmărit și de
grupul taxonomic considerat, pot fi achiziționate diferite produse comerciale. Aceste medii se pot
găsi fie sub formă de pulberi (pentru preparare în laborator), fie deja turnate în vase Petri. Redăm
mai jos câteva dintre categoriile de medii de cultură comercializate, precum și compoziția acestora,
respectiv tipuri de activități pentru care pot fi folosite:
Medii standardizate Merck-Millipore:
1. Roz bengal Agar cu Cloramfenicol este utilizat pentru izolarea și cuantificarea fungilor
din probe de mediu sau alimente.

3
 • Dextroză - 10 g;
• Pulpă de soia digerată cu papaină - 5 g;
• Fosfat monopotasic - 1 g;
• Sulfat de magneziu - 0,5 g;
• Cloramfenicol - 0,1 g;
• Roz bengal - 0,05 g;
• Agar - 15 g;
• Apă distilată - 1000 mL.
2. Dicloran Glycerol Agar cu Cloramfenicol se utilizează pentru izolarea selectivă de
mucegaiuri xerofile din alimente.
• Cloramfenicol - 0,1 g;
• Dextroză - 10 g;
• Dicloran - 0,002 g;
• Sulfat de magneziu - 0,5 g;
• Fosfat monopotasic - 1,0 g;
• Digestia peptică de țesut animal - 5,0 g;
• Agar - 15 g;
• Apă distilată - 1000 mL.
Este selectiv pentru mucegaiuri și pentru levuri (drojdii).
3. OGY Agar pentru identificarea și cuantificarea de levuri (drojdii) și alți fungi în
alimente sau de relevanță clinică.
• D(+)-glucoză - 10 g;
• Extract de drojdie - 5 g;
• Agar - 15 g;
• Apă distilată - 1000 mL.
Este selectiv pentru Aspergillus spp., Candida spp., Penicillium spp., Pichia spp.,
Saccharomyces spp., Zygosaccharomyces spp., mucegaiuri, levuri (drojdii).
4. Peptonă Extract de drojdie Agar pentru cultivarea de levuri (drojdii) și mucegaiuri.
• Cloramfenicol - 0,05 g;
• Glucoză - 40 g;
• Peptonă din soia - 10 g;
• Sulfat de streptomicină - 0,03 g;
• Extract de drojdie - 5 g;
• Agar - 15 g;
• Apă distilată - 1000 mL.
Este selectiv pentru Candida spp., Pichia spp., Saccharomyces spp., Zygosaccharomyces
spp., mucegaiuri, levuri (drojdii).
5. Extract de cartdei Glucoză Roz bengal Agar (Baza) este utilizat pentru inducerea
producției de ascospori.

4
 • Dextroză (glucoză) - 20 g;
• Infuzie de cartofi - 200 g;
• Roz bengal - 0,0084 g;
• Agar - 15 g;
• Apă distilată - 1000 mL.
Este selectiv pentru Aspergillus spp., Candida spp., Pichia spp., Saccharomyces spp.,
Zygosaccharomyces spp., mucegaiuri, levuri (drojdii).
6. Agar Selectiv pentru Fungi Patogeni este utilizat pentru izolarea de fungi patogeni,
mai ales dermatofiți, din materiale contaminate masiv.
• Cloramfenicol - 0,05 g;
• Cicloheximidă - 0,4 g;
• D(+)-glucoză - 10 g;
• Peptonă din făină de soia - 10.0 g;
• Agar - 12,5 g;
• Apă distilată - 1000 mL.
Este selectiv pentru Candida spp., mucegaiuri, levuri (drojdii).
7. YGC Agar este utilizat pentru cuantificarea și izolarea de levuri (drojdii) și mucegaiuri
în produse alimentare (lactate).
• Cloramfenicol - 0,1 g;
• D(+)-glucoză - 20 g;
• Extract de drojdie - 5 g;
• Agar - 14,9 g;
• Apă distilată - 1000 mL.
Este selectiv pentru Aspergillus spp., Candida spp., Penicillium spp., Pichia spp.,
Saccharomyces spp., Zygosaccharomyces spp., mucegaiuri, levuri (drojdii).

ALTE MEDII UTILIZATE

Inhibitory Mould Agar (IMA) - mediu îmbogățit ce conține și cloramfenicol (uneori
gentamicină) pentru a preveni creșterea bacteriilor. Speciile de Rhodotorula nu pot crește (prezența
cloramfenicol inhibă dezvoltarea).
• Cazeină digerată pancreatic - 3 g;
• Fosfat sodic - 2 g;
• Digestie peptică de țesut animal - 2 g;
• Sulfat de magneziu - 0,8 g;
• Extract de drojdie - 5 g;
• Sulfat feros - 0,04 g;
• Dextroză - 5 g;
• Clorură de sodiu - 0,04 g;
• Amidon - 2 g;

5
 • Sulfat de magneziu - 0,16 g;
• Dextrină - 1 g;
• Cloramfenicol - 0,125 g;
• Agar - 15 g;
• Apă distilată - 1000 mL.
Brain-heart infusion (BHI) agar este utilizat pentru cultivarea a numeroase
microorganisme patogene, inclusive bacterii, levuri, fungi filamentoși.
• Infuzie de inimă și creier - 8 g;
• Digestie peptică de țesut animal - 5 g;
• Digerat pancreatic de cazeină - 16 g;
• Dextroză - 2 g;
• Clorură de sodiu - 5 g;
• Fosfat disodic - 2,5 g;
• Agar - 13,5 g;
• Apă distilată - 1000 mL.
Apă Agar (WA) este folosit pentru izolarea fungilor cu creștere rapidă, de pe substrat
sterilizat la suprafață.
Apă Antibiotice Agar (AA) este folosit pentru a elimina bacteriile din culturi și pentru
izolarea fungilor din probe complexe.
Mediu Acidifiat cu Extract de porumb Agar (ACMA) este folosit pentru izolarea fungilor
din substraturi posibil contaminate cu bacterii. Nu este un substitut pentru mediul cu antibiotice,
însă aciditatea inhibă dezvoltarea multor bacterii, iar compoziția permite dezvoltarea multor
categorii de fungi.
Cartof Morcov Agar (PCA) este considerat un mediu mai puțin nutritiv și este utilizat
pentru anumiți fungi în stadiul anamorfic.

Experiment:
Pentru evidențierea influenței surselor de C și N în creșterea și dezvoltarea fungilor, se
vor pregăti câte 3 plăci Petri cu următoarele variante de mediu:
a. mediu având compoziția (g L-1): 2 glucoză, 3 sulfat amoniu, 15 agar;
b. mediu având compoziția (g L-1): 10 glucoză, 3 sulfat amoniu, 15 agar;
c. mediu având compoziția (g L-1): 15 g glucoză, 6 sulfat amoniu, 15 agar;
d. mediu având compoziția (g L-1): 10 glucoză, 3 g azotat de sodiu, 15 agar;
f. mediu având compoziția (g L-1): 15 glucoză, 6 g azotat de sodiu, 0,5 sulfat magneziu, 0,1
fosfat de potasiu, 15 agar.
Mediile pregătite vor fi inoculate cu Bjerkandera adusta și Fusarium oxysporum, prin
decuparea unui disc de mediu agarizat acoperit cu miceliu, cu diametrul de 1 cm, din marginea
culturii și plasare în centrul plăcilor Petri cu variantele de mediu pregătite. Se incubează la 28 ºC,
iar apoi este analizat efectul nutrienților (a concentrațiilor acestora) prin măsurarea diametrelor
coloniilor fungice din plăcile inoculate și compararea rezultatelor pentru diferite variante de mediu.
6
 Colectarea, izolarea și cultivarea fungilor. Tehnici de izolare

Procesul de inoculare reprezintă depunerea pe suprafața sau în profunzimea mediilor de

cultură a microorganismelor din diverse probe (apă, sol etc). Se folosesc ansele de microbiologice,
ace spatulate, pipete Pasteur sau pipete gradate etc.
Izolarea fungilor din probe prin tehnica diluțiilor succesive (seriate) presupune obținerea
unei suspensii de probă în apă sterilă și diluarea acesteia în baza 10. În funcție de tipul de probă și
de încărcătura microbiologică a acesteia, 1 picătură (0,1 mL) suspensie din diluțiile de 10 -3 – 10-7
poate fi plasată și etalată pe suprafața mediilor agarizate (în plăci Petri).
Metoda: se cântărește 1 g de probă și se suspendă în 10 mL apă sterilă. Se agită la minimum
150 rpm (rotații pe minut) pentru dispersarea particulelor și a unităților formatoare de colonii
(UFC), timp de 30 minute. Se prelevează 1 mL din suspensie și se adaugă la 9 mL apă sterilă, după
care se agită timp de 15 minute la 150 rpm – acesta va reprezenta diluția de 10-2. Se procedează
similar pentru diluțiile mai mari. La final, o cantitate bine determinată (ex. 0,1 mL) este utilizată
pentru inoculare, ceea ce permite calcularea încărcăturii microbiologice a probei după germinarea
UFC.
În funcție de scopul urmărit, pot fi folosite medii selective (cu pH acid, sau bazic, bogate sau
sărace în nutrienți, adiționate cu substanțe bactericide sau fungicide etc.) pentru a împiedica
germinarea altor categorii de fungi decât cele de interes.
Tehnica etalării se utilizează mai ales în cazul probelor lichide. Suspensia cu material
biologic se plasează sub forma unei picături (0,1 mL) cu ajutorul unei pipete pe suprafața mediului,
iar această picătură este etalată uniform cu ajutorul unei baghete de sticlă sterile (sub formă de L
sau sub formă de triunghi). Prin etalarea uniformă a lichidului, materialul biologic este împrăștiat
puternic, ceea ce face ca unitățile formatoare de colonii (UFC) să se disocieze și să genereze colonii
separate. Tehnica este utilizată atât pentru obținerea de colonii și izolarea de culturi pure, cât și
pentru evaluarea gradului de încărcare biologică a probei (exprimat în UFC / mL).
Pentru izolarea fungilor prin tehnica amprentării, se utilizează sursa de inocul (proba
biologică, probă de alimente etc.) care este plasată pentru un interval scurt de timp pe suprafața
mediului de cultură, sau sunt desprinse fragmente mici și plasate definit pe suprafața mediului.
Mediile inoculate sunt incubate la temperatură constantă, temperatura variind în funcție de
categoria de fungi ce se dorește a se obține în cultură pură. Intervalul de temperatură favorabil
pentru dezvoltarea majorității fungilor este de 25-30 °C.
Pot fi folosite medii adiționate cu bactericide pentru izolarea drojdiilor.
O variantă modificată a tehnicii amprentării presupune utilizarea unor fragmente de benzi
adezive cu ajutorul cărora se prelevează materialul biologic de la sursă (fragmente de miceliu sau
propagule aderă de partea adezivă a benzii) sau fragmente de hârtie de filtru sterile, umectate, cu
ajutorul cărora „se spală” suprafață-sursă de inocul. Aceste fragmente de benzi adezive sau de
hârtie de filtru se plasează pe placa de cultură.
Inocularea prin descrierea de striuri (anse, bețișoare) se realizează prin mișcarea ușoară
(fără apăsare) pe suprafața mediului de cultură, fie a vârfului ansei microbiologice fie a

7
bețișoarelor, încărcate cu material (conidii, alte categorii de spori, celule de drojdii, miceliu etc.)
și descrierea unor striuri, fie pe cadrane, fie pe cele două jumătăți simetrice ale vasului Petri.
Tehnica este folosită mai ales pentru drojdii sau spori asexuați.
Tehnica înțepării se folosește mai ales pentru fungii filamentoși care formează colonii
extinse, dar și pentru repicarea culturilor prin fragmente de miceliu sau conidii. Cu ansa
microbiologică sau acul spatulat se prelevează material dintr-o cultură pură, material care este
transferat prin înțepare ușoară pe suprafața mediului pe o placă Petri / eprubetă cu mediu proaspăt.
Pentru izolarea din corpuri sporifere / alte probe biologice, se prelevează în condiții
aseptice (în boxa cu flux laminar și utilizând instrumente sterile) fragmente de tramă / sau de probă
biologică de 0,3-1 x 0,3-1 x 0,1-0,2 cm și se plasează pe medii de cultură sterile, în plăci Petri.
Inocularea se face în 1-3 puncte. Punctele de inocul (dacă vor fi mai multe pe placă) se vor afla la
distanță unele de altele, spre marginea plăcii Petri, pentru a evita propagarea altor specii fungice,
în situația în care cultura este supra-infectată. Incubarea se realizează la 25-30 °C, timp de 7-21 de
zile și plasate ulterior la frigider. La anumite intervale de timp, culturile sunt repicate pentru a
revitaliza miceliul fungic.
Mediile inoculate sunt incubate la temperatură constantă, temperatura variind în funcție de
categoria de fungi ce se dorește a se obține în cultură pură. Intervalul de temperatură favorabil
pentru dezvoltarea majorității fungilor este de 25-30 °C.
În vederea izolării fungilor, există mai multe strategii aplicabile pentru crearea unor condiții
selective:
a) utilizarea unor compuși cu efect antimicrobian (bactericid/bacteriostatic,
fungicid/fungistatic, inhibitori pentru actinomicete etc.). Acești compuși trebuie să fie eficienți în
inhibarea speciilor nedorite dar să nu manifeste efect inhibitor (sau să manifeste slab efect
inhibitor) asupra speciilor de interes. Printre compușii utilizați se numără antibiotice cu efect
împotriva actinomicetelor și bacteriilor Gram pozitive (peniciline, vancomicină), împotriva
bacteriilor Gram negative (polimixină, streptomicină) sau antibiotice cu spectru larg (bacitracină,
cloramfenicol, clortetraciclină, gentamicină, kanamicină, neomicină, novobiocină, oxitetraciclină,
tetraciclină). Foarte utili sunt compușii care pot fi autoclavați (sunt termostabili), precum
cloramfenicolul sau gentamicina. În cazul compușilor termolabili (se distrug la temperatură),
adăugarea acestora în mediu se face sub formă de soluție sterilizată prin filtrare, după autoclavarea
mediului.
Compușii antifungici au, de regulă, efect larg asupra tuturor categoriilor de fungi. Unii
compuși prezintă, totuși, o oarecare selectivitate (uneori inhibă complet anumite categorii de fungi
și doar parțial alte grupe taxonomice, permițând izolarea acestora). Printre compușii frecvenți
utilizați se numără: endomicina, nistatina, pimaricina (compuși polienici) sau cicloheximidina.
Alți compuși cu efect antimicrobian utilizați în prepararea mediilor de cultură sunt: oxgal,
propionat de sodiu, roz Bengal, Violet cristal, Verde malachit, săruri biliare, surfactanți și
detergenți, o-fenilfenol, acid galic, acid tanic, alți fenoli, azide, metabisulfiți, difenil,
pentracloronitrobenzen, acid sorbic, săruri de taliu, teluriți, seleniți, permanganați, dicromați,
terpene etc. Astfel de compuși sunt folosiți, uneori, pentru reducerea ritmului de creștere (deci nu

8
inhibarea totală a dezvoltării) pentru a permite fie izolarea, fie cuantificarea numărului de colonii
într-o probă.
b) „îmbogățirea selectivă”. Acest principiu presupune includerea unor nutrienți (mai ales
sursa de energie) care poate fi utilizată de speciile ce se doresc a fi izolate, dar nu pot fi metabolizați
de alte grupe de fungi.
c) modificarea parametrilor fizico-chimici astfel încât să nu permită dezvoltarea unor
categorii de fungi nedorite (aciditate, alcalinitate, salinitate, presiune osmotică crescută etc.).
d) utilizarea unor indicatori (pigmenți și coloranți), care își modifică culoarea în cazul în
care cresc speciile dorite, astfel încât metoda permite diferențierea speciilor/coloniilor, dar nu
inhibarea dezvoltării. Acești coloranți fie sunt absorbiți în celule, fie modificarea culorii este
remarcată în mediu.
Demonstrație practică1:
Pentru exemplificarea utilizării tehnicilor descrise, vor fi inoculate plăci Petri și eprubete cu
mediu drept / înclinat cu diferite variante de mediu cu: fungi filamentoși (Alternaria alternata,
Trametes suaveolens) și drojdii (Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Rhodotorula
glutinis), prin înțepare sau descrierea de striuri.
Vor fi realizate, de asemenea, diluții seriate în baza 10, în eprubete cu apă sterilă utilizând o
probă de sol, iar diluțiile 10-4, 10-5, 10-6 vor fi inoculate prin etalare cu ajutorul unei baghete pe
medii de cultură solidificate.
Toate culturile vor fi analizate la următoarea întâlnire.
Demonstrație practică 2:
Vor fi utilizate corpuri sporifere de ciuperci macroscopice (basidiomicete) pentru izolarea
de miceliu din fragmente de tramă, după metoda descrisă anterior.
Demonstrație practică 3:
Pentru realizarea de inocul lichid standardizat, folosind colonii fungice de miceliu
nesporulat, se vor omogezina (10.000 rpm) culturi pe mediu agarizat în apă distilată sterilă.
Ulterior, stabilirea UFC / ml se realizează prin diluții seriate și inocularea unor volume de 0,1 mL
pe medii de cultură agarizate și inoculul este etalat cu ajutorul unor baghete de sticlă. După
incubare 1 săptămână, plăcile sunt analizate pentru stabilirea densității de UFC și pentru
verificarea lipsei contaminărilor.
Inoculul lichid stardardizat cu celule de drojdii se realizează prin citirea unei culturi lichide
la spectrofotometru la 530 nm, ajustarea se face prin diluții cu mediu de cultură steril până la
obținerea unei densități optice de 0,12-0,15, corespunzătoare cu 0,5 McFarland (aproximatic 106
celule mL-1).
Pentru prepararea unui inocul lichid cu spori (conidii fungice) se spală o cultură sporulată cu
mediu steril lichid și apoi se ajustează densitatea UFC prin diluții și verificare la camera Neubauer.

9
 Examenul microscopic și macroscopic al fungilor

Întrucât fungii prezintă structuri de dimensiuni mai mari ca ale celulelor bacteriene,
examinarea la microscopul optic se realizează cel mai frecvent la obiectivele de 10-60x. Totuși,
atunci când se urmărește analiza unor detalii (măsurători ale anumitor structuri, ornamentația
sporilor, alte detalii la suprafața hifelor) se pot realiza și preparate la obiectivul de imersie 100x
(utilizând lichid de imersie).
Preparatele microscopice pot fi realizate temporar (umede) și montane în apă sau lactofenol
(prezintă avantajul că nu se evaporă, iar preparatul poate fi analizat o perioadă mai lungă de timp)
sau pot fi executat permanent, utilizând ca substrat de montare glicero-gelatina sau balsamul de
Canada (și lutate pe marginea lamelei).
Pentru evidențierea anumitor structuri sau pentru creșterea contrastului și observarea mai
facilă a unor detalii, materialul fungic poate fi supus unei etape de colorare anterioară executării
preparatului. Astfel, materialul fungic este imersat pentru câteva minute în soluții de colorare
(albastru de anilină, albastru de metilen, albastru de metil, roșu de Congo etc.), iar ulterior, acesta
este plasat pe lamă. În anumite situații, colorarea poate fi realizată direct pe lamă, lichidul de
montare conținând și colorantul dorit (mai ales în cazul celulelor de drojdii sau a sporilor).
De asemenea, în anumite situații, analizarea materialului fungic necesită utilizarea unor
reactivi care să dizolve straturile externe ale peretelui celular, precum KOH 5-10%. Punerea în
evidență a structurilor amiloidice sau dextrinoide se realizează cu ajutorul reactivului Melzer.
Morfologia coloniilor
Morfologia coloniilor fungice dezvoltate pe medii de cultură solide este foarte importantă în
analiza și identificarea speciilor. În funcție de poziția taxonomică și varianta de mediu nutritiv,
fungii pot crește și viteze foarte diferite și pot prezenta o morfologie diferită a coloniilor formate
(Fig. 3):
- cu suprafața lucioasă, mată, pulverulentă, încrețită;
- convexe sau aplatizate;
- cu marginea netedă sau zbârcită, fimbriată, neregulată;
- de culori diferite;
- pot prezenta sau nu picături de exsudate pe suprafață;
- pot avea reversul coloniei pigmentat sau nepigmentat;
- pot pigmenta sau nu mediul de cultură;
- pot produce un miceliu aerian caracteristic, cu structuri de reproducere asexuată sau
sexuată, primordii etc.
Demonstrație practică:
Pentru exemplificarea metodelor descrise, vor fi realizate preparate microscopice umede,
colorate cu reactiv Melzer, Albastru de toluidină sau Roșu de Congo și analizate la microscop. De
asemenea, vor fi analizate culturile obținute în experimentele anterioare și observată macroscopic
morfologia coloniilor.

10
 Tehnici de conservare a fungilor

În funcție de scopul urmărit, conservarea fungilor se poate realiza pe mai multe căi,
accesibile într-un laborator cu dotare obișnuită:
a) Prin repicare și menținere în culturi pure, de obicei în eprubete, iar eprubetele
menținute la frigider (4 °C). Pentru menținerea pe o perioadă mai lungă de timp, acestea pot fi
acoperite cu ulei de parafină ce împiedică schimbul de gaze și limitează evoluția culturii.
Această metodă prezintă o serie de limitări: apariția unor mutații ce conduc la modificarea
proprietăților unei culturi; riscul de contaminare; consum sporit de materiale; proceduri laborioase
și cronofage în cazul colecțiilor mari. Din aceste considerente, prezervarea pe termen mediu și
lung a fungilor, fără a fi nevoie de repicarea repetată, este de dorit.
b) prezervarea pe termen mediu prin crio-prezervare, culturile fungice fiind imersate
într-o soluție crio-protectoare (substanțe osmotic active: glicerol, glucoză, lapte degresat etc.) și
menținute ulterior prin congelare (-20 ̶ -80 °C);
c) prezervarea pe termen mediu prin liofilizare. Culturile sunt tratate inițial cu o substanță
crio-protectoare apoi supuse procesului de liofilizare și păstrate ulterior în fiole, la temperatura
camerei. Această procedură poate fi aplicată celulelor procariote, sporilor sexuați și de rezistență
ai ciupercilor și altor celule ce nu prezintă vacuom dezvoltat. Hifele fungice nu rezistă liofilizării;
d) Prin conservare în substanțe cu efect antimicrobian puternic (prezervante): soluție
formalină 30%, etanol 70%, etanol 96% etc. În acest caz, pot fi conservate doar eșantioane moarte
și nu culturi/structuri vii;
e) Sub formă de lame microscopice permanente. Și în acest caz pot fi conservate doar
eșantioane moarte dar care prezintă valoare științifică / de referință sau pentru analiza ulterioară a
unor materiale;
f) Prin criostocare. Criostocarea presupune introducerea materialului / culturii în
echipamente speciale, sub azot lichid (-196 °C). Reprezintă cea mai bună metodă de conservare și
poate fi utilizată pe termen lung cu păstrarea nealterată a multor proprietăți. Metoda prezintă, însă,
dezavantajul de a putea fi aplicată doar în laboratoarele care dețin infrastructura necesară (tancuri
sub azot lichid, instalații de furnizare azot lichid) care este costisitoare.
Experiment:
Pentru a fi exemplificate principiile de prezervare a culturilor pe termen mediu vor fi
realizate culturi de basidiomicete pe mediu Extract de malț-Agar (vor fi inoculate speciile
Bjerkandera fumosa, Trametes suaveolens și Trametes gibbosa sau culturi obținute în urma izolării
din probe de sol) și vor fi incubate pentru 10-13 zile. Prezervarea eficientă este asigurată de vârsta
tânără a unei culturi – cu cât culturile sunt mai îmbătrânite, cu atât eficiența prezervării scade.
După incubare, vor fi desprinse cu acul spatulat fragmente de miceliu și plasate în tuburi de
polipropilenă de 1,5 ml, sterilizate prin autoclavare (de tip Eppendorf). În tuburi, peste fragmentele
de miceliu va fi aplicată o soluție de zaharoză 15% (sau glicerol 15%), sterilizată prin autoclavare.
Tuburile închise vor fi lăsate timp de 2 ore ca substanța osmotic activă (zaharoza) să intre în celule,

11
apoi vor fi plasate la congelator. La următoarea întâlnire, va fi testată viabilitatea miceliului
prezervat prin cultivare pe plăci Petri cu mediu Extract de Malț-Agar.

Punerea în evidență a enzimelor ligninolitice

Fungii lignicoli pot produce o serie de enzime ligninolitice, cu variate întrebuințări

(micoremedierea poluanților organici, procese industriale, aplicații de laborator etc.). Pentru
stimularea producerii de ligninaze, fungii trebuie cultivați pe medii ce conțin substrat lingo-
celulozic, dar sărăcit în alți nutrienți. Basidiomicetele lignicole produc, mai ales, lacază în
concentrații diferite și cu activitate enzimatică ce variază cu specia. Lacaza este o enzimă secretată
extracelular (oxidoreductază), implicată în depolimerizarea ligninei. Sinteza lacazei este indusă în
condiții de stres nutritiv (medii de cultură cu un conținut redus în nutrienți) și în prezența
materialelor lignocelulozice.
Experiment:
Pentru a pune în evidență producerea lacazei, se vor pregăti medii de cultură lichide, în
flacoane Erlenmeyer (50 mL mediu/flacon 100-200 mL) și vor fi inoculate cu miceliu de la speciile
Bjerkandera adusta, Irpex lacteus și Trametes gibbosa, în condiții de agitare și incubate la 25 °C.
Mediul de cultură va avea următoarea compoziție (L-1): 6 g tărâțe (paie), 6 g glucoză, 3 g
(NH4)2SO4, 0,01 g CuSO4. Prezența ionilor de cupru este necesară, întrucât lacaza este o enzimă
ce conține în centrul catalitic atomi de Cu.
Se vor prepara 2 flacoane Erlenmeyer cu câte 50 ml mediu lichid.
Determinări kinetice pentru determinarea activității unor enzime ligninolitice.
Pentru punerea în evidență a unor enzimelor ligninolitice sunt efectuați, inițial o serie de
pași: prelevare lichid de cultură, centrifugare la 6000 rpm, 30 minute și obținerea supernatantului.
Acest supernatant este utilizat ca extract enzimatic brut și folosit la determinări. Pentru enzimele
ligninolitice au fost elaborate diferite protocoale de lucru ce presupun utilizarea unor substraturi
caracteristice pentru anumite enzime (ABTS sau siringaldazina pentru lacază, di-metoxifenol
pentru lignin-peroxidază etc.). Transformarea acestor substraturi prin acțiunea enzimelor conduce
la modificarea culorii compusului rezultat, modificare ce poate fi monitorizată fotometric la
lungimea de undă caracteristică, iar pe baza dependenței între absorbanța înregistrată se cuantifică
concentrația produșilor de reacție rezultați per unitatea de timp și în acest fel cinetica reacției
(viteza de transformare a substratului per unitatea de timp). Exprimarea acestei cinetici este
considerată activitatea enzimei respective: cantitatea de enzimă necesară transformării 1 M
substrat/min.
În experimentul de față se va folosi ABTS (2,2’-azino-bis(acid 3-etilbenzotiazolin-6-
sulfonic) ca substrat ce este oxidat de lacază cu formarea unui compus colorat în verde.
Protocol:
- se utilizează 0,25 mL extract enzimatic brut (supernatant),
- 0,5 mL 0,1M tampon acetat de sodiu, pH 5,00 (acid acetic-acetat de sodiu);

12
 - la final se adaugă 0,5 mL soluție ABTS de concentrație 300 mg L-1.
Reacția se desfășoară în cuva de citire la spectrofotometru și este monitorizată timp de 5
min, la 420 nm. Se va folosi ca și coeficient de absorbție molară pentru ABTS – εABTS=36 000
mol-1cm-1min-1.
Act enz.=(Vol reacție x Abs x calea optică)/(minute x Vol enzimă x εABTS)= (1 x 1 x
Abs)/(5x0,25x36000)=moli/ml/min.
În mod similar, pentru testarea activității enzimatice a lacazei se poate ultiliza ca substrat
specific sirigaldazina.
Protocolul utilizat: amestec reacție 1 mL - extract enzimatic 0,33 mL, tampon acetat, pH 5,0
0,46 mL, siringaldazină 0,6 mL (soluție etanolică 60%, siringaldazină 0,06 g L-1), monitorizarea
reacției timp de 4 minute la 525 nm, (εsiringaldazină 65 000 M-1cm-1).
Suplimentar, supernatantul obținut va fi fracționat prin tehnica precipitării cu sulfat de
amoniu (saturație sulfat de amoniu: 20%, 40%, 60%, 80%). În acest sens, după dizolvarea unei
cantități de sulfat de amoniu la 0 °C (pe pat de gheață), corespunzătoare obținerii saturației dorite,
soluția va fi centrifugată la 6000 rpm timp de 50 minute (0 °C) pentru sedimentarea proteinelor
precipitate/denaturate. Sedimentul obținut se resuspendă în soluție tampon acetat pH 5.00, iar
procesul se reia în etapa următoare prin utilizarea noului supernatant obținut. Procesul se bazează
pe proprietatea proteinelor de a se denatura reversibil în contact cu o soluție salină de concentrație
crescută. Denaturarea proteinelor este dependentă de concentrația soluției saline, în funcție de
masa moleculară a proteinei (există o inversă proporționalitate între masa moleculară a proteinei
denaturate și concentrația soției saline).
După obținerea fracțiilor precipitate, acestea vor fi dializate prin membrane tubulare de
dializă (Sigma Alrdich), în apă distilată. După îndepărtarea compușilor/ionilor cu masă moleculară
mică din fracția precipitată (cu precădere a sării), scăderea concentrației saline conduce la re-
naturarea proteinelor, implicit a enzimelor în suspensie, astfel încât poate fi testată activitatea
enzimatică. Acest proces permite obținerea unor fracții mai concentrate dintr-o proteină dorită
(enzima) concomitent cu îndepărtarea din suspensie a altor compuși cu masă moleculară mică (spre
exemplu glucoza).
Pentru a concentra soluția obținută în urma dializei (datorită presiunii osmotice
soluția/suspensia de proteine va crește în volum prin absorbția apei în interiorul membranei),
aceasta va fi supusă liofilizării, până la obținerea concentrației dorite sau eliminarea completă a
apei din soluție.

Obținerea de compuși aromatizanți cu ajutorul fungilor

Multe specii fungice produc diferiți compuși aromatizanți, fie compuși organici volatili sau
solubili în apă. Printre compușii frecvent întâlniți în culturile de basidiomicete lignicole se numără
benz-aldehida și p-anizolul (precum și alți derivați) dând mirosuri caracteristice de fenicul sau
anason, dar și compuși cu sulf cu miros caractersitic de usturoi. Producția acestor compuși are loc

13
pe medii variate, compoziția mediului jucând un rol important. Prin utilizarea unor medii complexe
se asigură necesarul de compuși precursori, utilizați în sinteza substanțelor aromatizante.
Experiment:
Pentru punerea în evidență a unor compuși aromatizanți vor fi folosite atât medii solide
agarizate (MEGA), inocularea realizându-se în plăci Petri (Bjerkandera fumosa, Mycetinis
scorodonius, Polyporus arcularius și Trametes suaveolens, ), bogate în nutrienți.
Mediile de cultură vor avea în compoziție (L-1) extract de malț (15 g), glucoză (5 g), extract
de drojdii (3 g), fulgi de cartofi (10 g). După sterilizare vor fi inoculate cu fungii selectați și vor fi
incubate în condiții staționare. Mediile lichide vor avea aceeași compoziție, excepție agarul – 2
flacoane Erlenmeyer a câte 50 ml mediu.
Analiza și evaluarea rezultatelor: secreția compușilor aromatizanți, în special a celor
volatili, va fi pusă în evidență pe cale olfactivă. Speciile fungice utilizate nu prezintă nici un risc
asupra sănătății oamenilor, astfel încât mirosirea flacoanelor și a plăcilor va permite decelarea
compușilor aromatizanți.

Utilizarea de materiale lignocelulozice pentru cultura ciupercilor comestibile

Multe dintre ciupercile comestibile sunt cultivate pe diferite variante de composturi bogate
în materii lignocelulozice, frecvent utilizate fiind reziduurile agricole, pentru scăderea costurilor
de producție. Experimentul are scopul de a prezenta metodele de inoculare și de obținere a
miceliului, respectiv de obținere a corpurilor sporifere (sau primordiile) în condiții de laborator.
Experiment:
Pentru evidențierea versatilității echipamentului enzimatic al speciilor Pleurotus ostreatus,
P. eryngii și P. nebrodensisi va fi realizată o variantă de compost având la bază paie și adaosuri
pentru creșterea cantității de glucide ușor accesibile (făină de grâu, tărâțe), dar și variante pe bază
de cariopse de cereale.
Compostul format din paie și făină va fi umectat și autoclavat în pungi autoclavabile, iar
amestecurile de cariopse de cereale vor fi autoclavate (după înmuiere) în borcane de sticlă
borosilicată.
Inocularea se va realiza atât cu miceliu de la speciile menționate și incubarea se va realiza la
temperatura de 25 °C (ulterior 15 °C).
Prin observații vizuale va fi analizat stadiul dezvoltării miceliului în compost, acoperirea
compostului cu hife și dezvoltarea miceliului pe cariopsele de cereale. O atenție particulară va fi
acordată potențialelor infecții, pentru a evalua dacă inocularea a fost executată corect sau nu.

14
Testarea toleranței la metale grele a unor culturi fungice în scopul evidențierii
potențialului de micoremediere

Multe specii fungice, cu precădere basidiomicete, pot tolera și absorbi/adsorbi concentrații

ridicate ale unor metale. Proprietatea acestor fungi de a extrage din sol și de a transloca în
organismul lor (prin diferite mecanisme, chelare, complexare etc.) ioni metalici, poate fi exploatată
în strategiile de bio-decontaminare a solurilor poluate cu metale grele. Speciile micorizante
favorizează neutralizarea acestor ioni (prin relație cu plantele partenere) prin diferite mecanisme
biochimice, rezultând compuși organo-metalici mai puțin toxici.
Experiment:
Pentru a pune în evidență acest fenomen, vor fi realizate medii de cultură agarizate (pe bază
de extract de malț-glucoză) adiționate cu diferite săruri ale unor metale grele (CuSO4, MnSO4,
ZnSO4, Fe2(SO4)3) în concentrații de 0,5 g L-1.
Mediile de cultură vor fi inoculate cu miceliu de Trametes gibbosa, Trametes suaveolens și
Pleurotus ostreatus, vor fi apoi incubate la 25 °C. După perioada de incubare, vor fi analizate și
măsurate coloniile fungice pe plăcile martor și probele tratate, în cazul culturilor pe medii solide.
Toxicitatea manifestată de ionii de metale grele asupra miceliului fungic este cuantificată
prin măsurarea biomasei fungice (diametre colonii pe plăci Petri sau biomasă uscată și umedă pe
mediile lichide) pe mediile adiționate cu metale comparativ cu martorul - medii neadiționate. In
funcție de gradul de toxicitate se poate stabili concentrația minimă inhibitorie – MIC (concentrația
minimă la care a fost înregistrată inhibiția).

Testarea potențialului unor specii de basidiomicete în biocontrolul unor fungi

fitopatogeni

Multe specii de basidiomicete prezintă importanță în strategiile de biocontrol, datorită

compușilor organici secretați, compuși cu variate efecte biologice (inclusiv acțiune biocidă) sau
datorită metabolismului foarte versatil, ce permite utilizarea unor nevertebrate ca sursă de
nutrienți.
Printre compușii organici valoroși produși de basidiomicete se numără sinteza unor compuși
organici volatili, cu efect antifungic, utilizabili în strategiile de biocontrol.
Experiment:
Pentru punerea în evidență a unor astfel de fenomene, se vor cultiva pe plăci Petri
bicompartimentate (cu mediu agarizat pe bază de extract de malț) izolate de basidiomicete
lignicole (într-o jumătate) și izolate de Fusarium oxysporum și Alternaria alternata (specii
fitopatogene) în cealaltă jumătate. Inocularea se realizează cu discuri de agar acoperite cu miceliu.
Se realizeqază și plăci martor (pentru comparație), în care se inoculează doar agentul fitopatogen
într-una dintre jumătățile plăcii. Analiza se realizează după incubare (25 ºC, 1-2 săptămâni), prin

15
măsurarea diametrelor coloniilor agentului fitopatogen în placa martor, comparativ cu plăcile co-
inoculate cu basidiomicete.

Testarea potențialului unor specii de basidiomicete lignicole în bioremedirea

unor poluanți organici

Datorită enzimelor extracelulare pe care le secretă, basidiomicetele lignicole pot degrada o

paletă variată de poluanți organici, printre care și multe categorii de coloranți sintetici.
Experiment:
Pentru punerea în evidență a acestor mecanisme, se vor realiza medii cu extract de malț (atât
agarizate, cât și lichide), adiționate cu câte unul din următorii coloranți: Albastru de metil, Roșu
de Congo și Fucsină acidă, în concentrații de 100 mg L-1.
Concomitent vor fi inoculate și plăci martor, cu medii neadiționate, pentru compararea
rezultatelor.
Plăcile Petri și flacoanele Erlenmeyer astfel obținute vor fi inoculate după sterilizare cu
miceliu de la speciile: Trametes gibbosa și Bjerkandera adusta.
Concomitent vor fi inoculate și plăci martor, cu medii neadiționate, pentru compararea
rezultatelor.
Analiza vizuală, coroborată cu măsurarea diametrului coloniilor fungice pe medii îmbogățite
prin comparația cu diametrele coloniilor fungice pe medii neîmbogățite (martorul) va oferi
informații despre toleranța fungilor față de acești agenți poluanți. Măsurarea diametrului haloului
de decolorare (acolo unde este prezent) permite cuantificarea vitezei și eficienței de degradare a
coloranților sintetici.
Determinări spectrofometrice pentru evidențierea degradării coloranților sintetici pe
medii lichide.
Pentru determinările spectrofotometrice, se prelevează lichid cultural, se centrifughează
pentru îndepărtarea particulelor solide, cum ar fragmente de miceliu, se vor sedimenta, apoi
centrifugatul obținut se decantează și se obține supernatantul. Supernatantul astfel obținut se citește
la spectrofotometru la lungimea de undă caracteristică absorbanței maxime a colorantului
respectiv. În cazul în care colorantul se găsește în concentrații prea mari iar densitatea optică este
prea mare și depășește sensibilitatea aparatului, se efectuează diluții cunoscute, pentru a permite
ulterior calcularea concentrației.
Pentru aflarea lungimii de undă caracteristice absorbanței maxime, se verifică
disponibilitatea datelor în literatură, iar în cazul în care acestea lipsesc, sau colorantul nu este
cunoscut, atunci se citește întreg spectrul în domeniul vizibil 390-700 nm. Pentru substanțele
incolore se pot face citiri și la lungimi de undă mai mici (λ=300…390) (atât cât permite
sensibilitatea aparatului). După aflarea picului caracteristic (a lungimii de undă caracteristice) se
alege lungimea de undă respectivă pentru toate citirile ulterioare.

16
 Pentru a putea cuantifica concentrația de colorant rămasă în mediu, se va stabili ecuația
dreptei privind dependența dintre concentrație și absorbanța. În acest sens, vor fi realizate
concentrații diferite (cunoscute) ale colorantului și se vor face citiri la λ caracteristică. Datele
obținute sunt folosite pentru realizarea unui grafic și aflarea ecuației dreptei. Cel mai ușor mod de
a face acest lucru este de a introduce datele într-un document excel (sau alte aplicații similare), a
crea un grafic de tip liniar (cu absorbanța și concentrația corespunzătoare pe cele două axe) și apoi
afișarea pe grafic a ecuației dreptei și a coeficientului r2. Cu cât r2 are o valoare mai apropiată de
1 (ex. 0,998) cu atât calculele și determinările sunt mai precise. Dacă această valoare este mult sub
1, atunci trebuie repetată operațiunea întrucât s-au strecurat erori (”dreapta” devine o curbă).
Ecuația obținută are forma y=ax+b, unde y și x=concentrația/absorbanța, iar a și b-sunt
constante a acestei ecuații (afișate/cunoscute). Pentru probele a căror concentrație nu o cunoaștem,
măsurăm absorbanța și aflăm concentrația în funcție de aceasta, utilizând ecuația dreptei
(dependența dintre concentrație și absorbanță).
Întrucât degradarea coloranților sintetici este atribuită enzimelor ligninolitice (mai ales lacază
pentru speciile testate), va fi testată activitatea acestei enzime prin metoda ABTS.

Punerea în evidență a producerii de acizi organici (acid citric) cu

Aspergillus niger, în cultură statică de suprafață
Multe specii fungice transformă substratul bogat în glucide în acizi organici determinând acidifierea
puternică a mediului de cultură. Proprietatea fungilor de a produce acizi organici este exploatată economic
pentru obținerea unor astfel de acizi cu variate întrebuințări (ex. obținerea cu tulpini selecționate de
Aspergillus niger a acidului citric, pe cale biotehnologică).
Pentru evidențierea producției de acizi organici, se vor prepara în condiții de laborator a unui mediu
nutritiv bogat în substanțe organice.
Mediul de cultură va avea următoarea compoziție:
-zaharoză – 50 g;
- azotat de amoniu – 4 g;
- fosfat de potasiu – 0,1 g;
- sulfat de magneziu – 0,3 g;
- sulfat de zinc și de fier – câte 0,02 g;
- 1000 mL apă distilată.
Se autoclavează, iar după răcire se inoculează cu Aspergillus niger. Se determină pH-ul post-
autoclavare.
Ajustare pH cu KOH 5%
Evaluarea culturilor de Aspergillus niger și determinarea pH-ului pentru punerea în evidență
a acidifierii mediului.

Probele inoculate anterior vor citite la pH-metru pentru a verifica acidifierea mediului de cultură.

17
 Bibliografie recomandată
DUNCA S., AILIESEI O., NIMIȚAN E., ȘTEFAN M., 2004. Microbiologie aplicată. Editura
Tehnopress, Iași, 293 p.
TĂNASE C., 2002. Micologie. Manual de lucrări practice. Ed. Universităţii “Al. I. Cuza”, Iaşi,
229 p.
TĂNASE C., ŞESAN EUGENIA TATIANA, 2006. Concepte actuale în taxonomia ciupercilor.
Ed. Universităţii “Al. I. Cuza”, Iaşi, 510 p.
WATANABE T., 2002. Pictorial atlas of soil and seed fungi - morphologies of cultured fungi and
key to species. CRC Press, 486 pp

18