Tema 6. Fiziologia microorganismelor. Mediile de cultură. Cultivarea.

Prepararea şi sterilizarea mediilor de cultură

Un mediu de cultură reprezintă un substrat nutritiv complex, steril, care
trebuie să asigure microorganismelor cantitatea necesară de apă, sursa de carbon,
de azot, săruri minerale, factori de creştere, deci care să le furnizeze substanţele şi
energia necesare în procesele de creştere, reproducere şi întreţinerea funcţiilor
vitale.
Mediul de cultură trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
- să corespundă din punct de vedere nutritiv;
- să aibă o anumită concentraţie a substanţelor nutritive;
- să nu conţină substanţe toxice;
- să aibă un anumit pH;
- să fie steril.
Mediile de cultură se folosesc în practica de laborator sau în practica
industrială şi sunt foarte diferenţiate în funcţie de scopul urmărit. În tehnica de
laborator mediile se folosesc pentru izolarea din mediul natural a diferitelor
microorganisme, pentru obţinerea de culturi pure, pentru întreţinerea culturilor
selecţionate. În scopuri industriale, mediile de cultură sunt utilizate pentru obţinere
de biomasă sau a unor compuşi de natură microbiană.
Din punct de vedere al compoziţiei chimice, mediile de cultură se împart în
3 categorii:
- medii naturale de origine animală sau vegetală, cu o compoziţie chimică
nedeterminată;
- medii sintetice - soluţii de substanţe chimice cu o compoziţie perfect
determinată;
- medii semisintetice - constituite din produse chimice bine definite, dar şi
din produse de origine naturală (cu compoziţie cunoscută).
Constituenţii principali ai mediilor de cultură sunt:
1. Extracte de carne şi macerate
Aceste produse, comercializate în formă concentrată sub denumirea de
„extracte de carne”, conţin în principal proteine puţin hidrolizate, glucide, săruri
minerale, vitamine hidrosolubile. Compoziţia lor variază în funcţie de carnea
utilizată pentru preparare.
2. Extracte de drojdie
Aceste extracte, comercializate sub formă deshidratată, sunt preparate din
drojdia de bere, fiind utilizate ca sursă de aminoacizi şi de vitamine hidrosolubile.
 3. Peptone şi hidrolizate
Peptonele reprezintă un amestec de compuşi solubili în apă care provin în
urma acţiunii enzimelor asupra materialului proteic. Pot fi: peptonă pepsică din
carne, peptonă tripsică din cazeină, peptonă pancreatică de cazeină, peptonă
tripsică de carne, peptonă papainică de soia, peptone compuse.
Hidrolizatele sunt peptone obţinute în urma acţiunii compuşilor anorganici
asupra proteinelor (de ex. acid clorhidric). Cel mai des întrebuinţat este hidrolizatul
acid de cazeină, conţinând aminoacizii constitutivi ai cazeinei din lapte.
4. Agar-agarul sau geloza
Agar-agarul denumit şi geloză este un extract de alge roşii din genul
Gelidium şi Gracilaria, recoltate în mările Japoniei sau ale Noii Zeelande. Se
dizolvă în apă la o temperatură în jur de 90°C şi se solidifică sub 45°C, fiind
utilizat pentru solidificarea mediilor de cultură.
După consistenţă mediile de cultură pot fi lichide, compacte şi semilichide.
Mediile compacte şi cele semilichide se pregătesc din mediile lichide, la care
pentru obţinerea mediului cu consistenţa necesară, de regulă, se adaugă geloză
(agar-agar) sau gelatină.
Cel mai utilizat agent de solidificare este agar-agarul (geloza) - un
polizaharid format din agaroză şi agaropectină, izolat sau obţinut din alge (genul
Gelidium). Agarul are proprietăţi absorbante. Păstrat în apă, nu se solubilizează.
Prin absorbţia apei îşi măreşte volumul de 16-17 ori. Se topeşte la temperaturi mai
mari de 100°C în apă şi se transformă în gel prin răcire la temperatura de 45°C.
Pentru solidificarea mediilor se adaugă 1,5-2 g la 100 ml mediu lichid.
Mediile solidificate cu agar se folosesc pentru cultivarea şi numărarea
microorganismelor deoarece pe medii solidificate celulele formează colonii
caracteristice distincte.
Gelatina, din punct de vedere chimic, este o proteină cu structura
asemănătoare colagenului obţinut din piele de porc, cartilagii şi oase. În apa rece
îşi măreşte volumul de 3-6 ori şi se fluidifică în apa caldă uşor, iar transformarea în
gel are loc foarte lent la temperaturi sub 30ºC.
Pentru solidificarea mediului de cultură cu gelatină se adaugă 12-15 g la 100
ml. La temperaturi ridicate de sterilizare (mai mari de 110ºC), îşi pierde
proprietăţile de gelifiere. Gelatina se foloseşte pentru medii destinate cultivării
drojdiilor, pentru identificarea activităţii proteolitice a microorganismelor.
În tehnica microbiologică se folosesc medii gata preparate obţinute de firme
autorizate, care pot fi livrate în diferite forme (mai frecvent sub formă de praf sau
pulbere). Pe sticlă se menţionează compoziţia mediului şi cantitatea de pulbere
care trebuie dozată la 1 litru de apă pentru obţinerea mediului de cultură. După
dizolvare se face sterilizarea mediului.
Materiale necesare pentru efectuarea lucrării de laborator: cultură
bacteriană crescută în cutii Petri, etanol, pipete, ansă, spatula Drigalski, balanţă cu
precizie de 0,1 g, pahare Berzelius, eprubete sterile cu dop, baloane Erlenmeyer,
bec de gaz sau spirtieră, autoclav, bulion peptonat, geloză peptonată.
Prepararea mediilor de cultură din cele pulverulente şi turnarea lor în
eprubete
Conform indicaţiilor de pe flacoanele conţinând mediile de cultură
pulverulente, se vor cântări cantităţile necesare pentru a obţine câte 1 litru din
fiecare tip de mediu de cultură pentru eprubete şi câte 300 ml mediu pentru
baloanele Erlenmeyer.
Mediul de cultură se aduce la fierbere în paharele Berzelius de 1 litru, până
la dizolvarea agarului, apoi se repartizează câte 10 ml în eprubete sterile, prevăzute
cu dop de vată, care se aşează în coşuri de sârmă şi se acoperă cu hârtie. În mediu
se determină pH-ul şi, dacă este necesar, se ajustează la valoarea dorită. Mediile cu
agar nu trebuie să fie aduse la un pH mai mic de 6, deoarece agarul este parţial
hidrolizat în timpul sterilizării la pH acid şi nu se mai solidifică la răcire. Când sunt
necesare astfel de medii, pH-ul trebuie ajustat după sterilizare.
Baloanele Erlenmeyer se astupă cu dop de vată învelit în tifon, se leagă la
gură cu hârtie şi sfoară. Coşurile şi baloanele Erlenmeyer se introduc în autoclavă
şi sterilizarea se face conform instrucţiunilor.
În general, mediile de cultură trebuie să ofere o suprafaţă de dezvoltare
suficientă pentru microorganisme. De aceea, după sterilizare eprubetele cu mediu
se înclină pentru ca să rămână cu o suprafaţă mare de creştere. Înclinarea se face
prin sprijinirea eprubetelor pe o baghetă, ţinând seama ca mediul negelificat să nu
ude dopul de vată, ci să se oprească la 2-3 cm de acesta. Prin răcire, vaporii ce ies
din mediul cald, se condensează pe pereţii mai reci ai eprubetelor şi cad sub formă
de picături pe mediu, adunându-se pe fundul eprubetei. Din această cauză,
eprubetele cu mediul răcit nu se aşează în poziţie orizontală, ci verticală, în coşuri
de sârmă. Acestea se acoperă apoi cu o hârtie şi se leagă cu sfoară.
Pentru evitarea uscării se recomandă păstrarea mediilor nutritive în frigider.

Fig. Eprubete cu mediul de cultură (geloză peptonată) înclinat

 Metodica de pregătire a bulionului peptonat şi a gelozei peptonate
În cazul în care nu există medii de cultură pulverulente deshidratate,
procurate de la firme specializate, mediile se vor prepara din componenţi naturali
de origine animală sau vegetală. Astfel, pentru pregătirea bulionului peptonat şi a
gelozei peptonate este necesar extractul de carne, care se pregăteşte în felul
următor:
1. 500 g de carne proaspătă de vită, fără oase, grăsime şi tendoane, se trece
prin maşina de tocat carne, apoi la masa obţinută se adaugă un litru de apă de
robinet, se amestecă bine şi se lasă pentru 24 ore la rece sau se termostatează la
37°C 2 ore.
2. Extractul de carne se stoarce prin tifon, se fierbe 5 minute pentru
coagularea proteinei, se răceşte şi se filtrează printr-un filtru de vată, adăugând
ulterior apă de robinet până la volumul iniţial.
3. Extractul da carne se repartizează în flacoane, se sterilizează 20-30 min. la
1 atm. şi se păstrează la întuneric. El are aspectul unui lichid galben-străveziu, cu o
reacţie slab acidă (pH-ul 6,2-6,4) lipsit de proteine.
1. Bulionul peptonat
1. Într-un litru de extract de came se dizolvă la o temperatură moderată şi
agitare 10 g de peptonă şi 5 g de NaCl. Se stabileşte pH-ul mediului în limitele 7,6-
7,8, apoi se fierbe 30-45 min. până la apariţia precipitatului.
2. Bulionul se răceşte, se filtrează prin filtrul de hârtie, se adaugă apă până la
volumul iniţial şi se controlează pH-ul.
3. Ulterior bulionul peptonat se repartizează în eprubete, flacoane şi se
sterilizează 15-20 min. la 1 atm.
2. Geloza peptonată
1. La bulionul peptonat se adaugă 1,5-2,0% de geloză (agar-agar).
2. Amestecul căpătat se agită până la topirea gelozei.
3. Se controlează şi se corectează pH-ul mediului şi după apariţia
precipitatului se filtrează prin filtru de vată-tifon.
4. Geloza peptonată lichidă se repartizează în eprubete şi flacoane şi se
sterilizează 15-20 min. la 1 atm.
Metode de însămânţare a microorganismelor
Însămânţarea cu spatula (metoda Drigalski)
O picătură din materialul cercetat se depune cu pipeta pe geloză în centrul
cutiei Petri şi se repartizează cu spatula pe o porţiune mică, apoi, efectuând mişcări
circulare, materialul se repartizează pe toată suprafaţa gelozei. Pe parcursul
însămânţării capacul cutiei Petri se ridică puţin cu mâna stângă, deschizând astfel
cutia. Ulterior spatula cu resturi ale materialului cercetat din prima cutie se trece în
cutia a doua, apoi în a treia, repartizând uniform materialul pe suprafaţa gelozei.
După terminarea însămânţării spatula se introduce în borcanul cu soluţie
dezinfectantă. Cutiile se semnează şi se termostatează.
Însămânţarea cu ansa bacteriologică
Cutia Petri cu geloză se aşează pe masă cu capacul în sus, se ia şi se ţine cu
mâna stângă vertical, puţin întredeschisă. Materialul cercetat se ia şi se repartizează
cu ansa, care se ţine liber cu degetul mare şi arătător al mâinii drepte. Efectuând
mişcări uşoare, abia atingând suprafaţa gelozei, materialul se însămânţează în
formă de striuri paralele la o distanţă de circa 5 mm unul de altul. Cutiile Petri cu
geloză însămânţate se termostatează.

Fig. Însămânţarea mediilor solide repartizate în cutii Petri: 1 – spatula Drigalski; 2

– însămânţarea culturii de microorganisme cu spatula; 3 – colonii de bacterii după
24-48 ore de termostatare; 4 – schema de însămânţare a culturii de microorganisme
cu ansa bacteriologică.