MEDII DE CULTURĂ

CATEDRA DE MICROBIOLOGIE
LP 5
Cultivarea bacteriilor în microbiologia clinică are drept
scop:

• izolarea bacteriilor din prelevatele patologice

• identificarea bacteriilor

• testări pentru inițierea și monitorizarea terapiei

antimicrobiene.
Prelevatele patologice odată recepționate și triate calitativ,
microbiologul trebuie să hotărască:

• mediile de cultură și metodele indicate pentru izolare

• atmosfera, temperatura și intervalul de timp, necesare
pentru izolarea tuturor microorganismelor cu
semnificație clinică din prelevatul examinat
• izolatele cu semnificație clinică, algoritmul și stadiul
până la care conduce identificarea acestora
• dacă antibiograma este indicată și care din rezultatele
ei se impun comunicate.
 MEDII DE CULTURĂ

• sunt folosite pentru cultivarea

bacteriilor.

• se comercializează ca atare, sub

formă liofilizată, gelificată sau gata
turnate în plăci Petri sau pot fi
manufacturate în multe
laboratoare.
 MEDII DE CULTURĂ
• Linnaeus a clasificat toate bacteriile în Ordinul Chaos
în 1763
• în anii 1800, oamenii de știință care studiau "petele"
de ciuperci care apăreau pe pâine mucegăită și carne
au început să realizeze că fiecare "pată" era o specie Carl Linnaeus (Carl von Linné)
individuală de microorganisme, care ar putea fi 1707 - 1778
transferată pe o “piesă” nouă de hrană și cultivată
izolat.
• inspirat de aceste studii timpurii de cultivare a
microorganismelor, Robert Koch a folosit felii subțiri de
cartofi, „plăci Petri" naturale, atunci când și-a început
studiile agenților patogeni bacterieni.
• fără o suprafață solidă, încă umedă a gelului, de care
bacteria să adere și să se multiplice, existau puține
speranțe de a separa o celulă bacteriană de mediul său
pentru a o studia.
 MEDII DE
CULTURĂ
• 1880: Walter Hesse: a experimentat
gelatina pentru cultivarea bacteriilor
pe un suport solid
Dezavantaje:
•era degradată de către bacterii
•se lichefia la 24°C Robert Koch Fanny Hesse
1843- 1910 1850- 1934
• Fanny Hesse: a propus folosirea
agarului, pentru prepararea mediilor
de cultură, substanță folosită la
1939: Arthur Hitchens Morris Leikind:
prepararea diferitelor mâncăruri Robert Koch's "genius lay in his ability to
(supe, deserturi, jeleuri) bring order out of chaos.
 MEDII DE CULTURĂ
• ingredientul de bază al mediilor de
cultură este geloza sau agar – agar.
• agar - agarul este derivat din
polizaharidul agaroză, care formează
structura de susținere din peretele
celular al unor specii de alge marine
– alge roșii (agarofite), din care este
extras cu ajutorul apei fierbinți.
• este un produs organic, hidro -
coloidal Alge marine roșii –
Gelidium spp.
 AGAR - AGAR

• a fost descoperit în anii 1658 de Minoya

Tarozaemon în Japonia, pe care l-a
denumit kanten (vreme rece)
• se prezintă sub formă de fâșii
semitransparente de culoare cafenie -
gălbuie.
• conține: Mizu yōkan - un jeleu popular
japonez de fasole roșie din agar
• 70–80% polizaharide,
• 10–20% apă
• 1,5–4% substanțe minerale.
 AGAR - AGAR

• este format din resturi

galactozidice esterificate la C6
cu o grupare sulfonică.
• are o putere de gelificare
foarte mare.
 MEDII DE CULTURĂ
• agar – agar-ul este folosit la prepararea mediilor de cultură
pentru că asigură suprafața solidă pe care cresc bacteriile și
fungii.
• creșterea bacteriilor nu distruge structura gelului, deoarece cele
mai multe bacterii sunt incapabile să utilizeze agarul pentru
metabolism.
• agarul este comercializat sub formă de pulbere, care în amestec
cu apa și încălzit la 100°C rămâne lichid, iar pe masură ce se
răcește la 40 °C se gelifică.
• mediul cu agar este un mediu relativ inert.
• alte ingrediente sunt adăugate în mediul cu agaroză:
• nutrienți (peptonă, suplimente de carne)
• factori de creștere
• indicatori de pH
 MEDII DE CULTURĂ

Un mediu de cultură optimal trebuie să îndeplinească mai multe

condiții:
•să asigure bacteriilor condiții de dezvoltare cât mai apropiate de
mediul lor natural (organismul uman, organismul animal, sol)
•să nu conțină substanțe inhibitoare pentru bacteriile urmărite
•să permită observarea apariției și dezvoltării culturii (omogenitate,
transparență, luciu al suprafeței)
•să permită dezvoltarea bacteriilor în culturi pure (pH, osmolaritate)
•să fie sterile
 MEDII DE CULTURĂ
CLASIFICARE

Din punct de vedere al stării de

agregare:
• medii lichide
• medii solide
• medii semisolide
MEDII DE CULTURĂ LICHIDE – nu conțin agar
- agar
Pot fi:
•simple: conțin numai ingrediente de bază (peptonă) –
permit creșterea bacteriilor nepretențioase nutritiv
• bulion nutritiv
• apa peptonată
•compuse: conțin pe lângă ingredientele de bază și
componente (sânge, ser sangvin, glucoză, extract de
levură) care permit creșterea bacteriilor pretențioase
nutritiv:
• bulion glucozat 2%
• bulion BHI (Brain Heart Infusion)
 MEDII DE CULTURĂ LICHIDE

Au utilizare restrânsă:
• izolarea din prelevate
necontaminate:
• sânge
• exsudate din seroase
• aspirații din colecții
purulente profunde
• biopsii tisulare prin ac
 MEDII DE CULTURĂ LICHIDE
Mediile de îmbogățire:
•Definiție: medii lichide care favorizează înmulțirea anumitor bacterii și
inhibă dezvoltarea florei microbiene comensale dintr-un produs patologic.
Conțin anumite substanțe inhibitoare care prelungesc faza de lag a
bacteriilor de contaminare, fără a întârzia însă intrarea anumitor patogeni
în faza exponentială.
Exemple:
•bulionul cu selenit acid de Na. - mediu de îmbogățire pentru Salmonella
spp. - preincubarea materiilor fecale 18 h. la 37°C în acest mediu,
favorizează izolarea salmonelelor
•mediul Chapman lichid - mediu de îmbogățire pentru stafilococi
•mediul Pick - mediu de îmbogățire pentru streptococi
•apa peptonată alcalină - mediu de îmbogățire pentru Vibrio cholerae
•mediul Sabouraud lichid - mediu de îmbogățire pentru fungi
 MEDII DE CULTURĂ LICHIDE

Izolarea în medii lichide:

Avantaje:
• cea mai sensibilă metodă de izolare in vitro:
• cultura poate fi inițiată de un număr redus de
bacterii
• volumul prelevatului însămânțat poate fi crescut
• neutralizează prin diluție factori antimicrobieni din
prelevatul examinat
 MEDII DE CULTURĂ SOLIDE

Mediile solide pot fi: 2% agar - agar

• neselective, uzuale
• diferențiale, care diferențiază
printr-un singur caracter grupe
taxonomice sau tulpini
• selective, care inhibă unele
grupe bacteriene favorizând
multiplicarea altora
 MEDII DE CULTURĂ SOLIDE

Mediile neselective: permit creșterea bacteriilor nepretențioase

nutritiv
• geloza – simplă (agar nutritiv)
• agarul îmbogățit cu 5% sânge de berbec – mediul neselectiv cel
mai folosit pentru însămânțarea prelevatelor necontaminate și
a unora din cele contaminate
Ex.: - exsudate din căile respiratorii și din cavitățile conecte
- exsudat conjunctival
- puroi
 MEDII DE CULTURĂ SOLIDE
NESELECTIVE

Compoziție:
Extract de carne de vită …………………… 3.0 g
Peptonă .................. 5.0 g
Agar ………………………………….15.0 g
Apă distilată…………………………….……1000 ml
pH final 6.8 +/- 0.2.

Geloză simplă
MEDII DE CULTURĂ SOLIDE
NESELECTIVE

Compoziție:
Triptonă…………………… 15.0 g
Extract de soia.................. 5.0 g
NaCl ........................5.0 g
Agar ………………………………….15.0 g
Apă distilată…………………………….……1000 ml
Agarul se topește și se răcește la 50°C.
Se adaugă sângele defribinat de berbec.
Se omogenizează ușor.
pH final 6.8 +/- 0.2.

Geloză – sânge cu 5% sânge

de berbec
 MEDII DE CULTURĂ SOLIDE
Mediile diferențiale – conțin substratul pentru o anumită
enzimă sau citotoxină bacteriană și un indicator de pH
Ex:
•geloza – sânge: diferențiază bacteriile hemolitice de cele
nehemolitice
•medii lactozate, cu variați indicatori de pH, diferențiază
enterobacteriile care fermentează lactoza (lactozo –
pozitive) de cele care nu fermentează lactoza (lactozo –
negative)
•medii diferențiale pentru stafilococi: conțin manitol și
indicator de pH: roșu – fenol
MEDII DE CULTURĂ
SOLIDE
DIFERENȚIALE
Hemoliza β – hemoliza totală

Hemoliza α – hemoliza parțială

Geloză – sânge cu 5% sânge de berbec

Mediu neselectiv și diferențial prin
aspectul hemolizei
Hemoliza γ – absența hemolizei
MEDII DE CULTURĂ SOLIDE DIFERENȚIALE
LACTOZATE
Colonii lactozo - pozitive

Compoziție:
Peptonă – 17 g
Proteoză peptonă – 3 g
Lactoză – 10 g
Săruri biliare – 1.5 g
NaCl – 5 g
Roșu neutru – 0.03 g
Cristal violet – 0.001 g
Agar – 13.5 g
Apă – 1.000 ml.
Colonii lactozo - negative
pH: 7.1 +/− 0.2

Mediul MacConkey –
mediu diferențial pentru
bacili Gram - negativi
 MEDII DE CULTURĂ SOLIDE
DIFERENȚIALE
Colonii manitol –
negative (culoare roșie)

Compoziție:
Peptonă: 10,0 g
Extract de carne de vită: 1,0 g
NaCl: 75,0 g
Manitol: 10,0 g
Roșu fenol: 0,025 g
Agar – agar: 15,0 g
Apă distilată: 1.000 ml.
pH = 7,4

Mediul Chapman: mediu

diferențial pentru stafilococi Colonii manitol – pozitive
(culoare galbenă)
 MEDII DE CULTURĂ SOLIDE

Mediile selective – conțin substanțe care inhibă dezvoltarea

bacteriilor de contaminare a prelevatelor.

Există o diversitate de medii selective.

 MEDII DE CULTURĂ SOLIDE
SELECTIVE
Pentru izolarea enterobacteriaceelor din prelevate contaminate
există medii cu trei niveluri de selectivitate:
• slab selective:
• mediul MacConkey (agenți inhibitori: săruri biliare și cristal
violet)
• mediul EMB (Levine) (agenți inhibitori: eozina Y și albastru de
metilen)
• mediul Drigalski (AABTL) (agenți inhibitori: săruri biliare și
cristal violet)
Inhibă bacteriile Gram (+).
MEDII DE CULTURĂ SOLIDE SLAB
SELECTIVE
MEDII DE CULTURĂ SOLIDE SLAB
SELECTIVE

Colonii de E. coli – colonii lactozo –

pozitive, cu aspect metalizat

Colonii
lactozo -
negative

Mediul EMB (Levine)

MEDII DE CULTURĂ SOLIDE MODERAT
SELECTIVE

• moderat selective:
• mediul Salmonella – Shigella (SS)
• mediul ADCL (Agar Dezoxicholat Citrat Lactoza)
• mediul Hektoen
• mediul XLD (Xyloza Lizina Dezoxicholat Agar)
• mediul Istrati – Meitert
Agenti inhibitori: săruri biliare și verde briliant
Inhibă bacteriile Gram – pozitive și o parte din bacilii Gram -
negativi comensali.
MEDII DE CULTURĂ SOLIDE MODERAT
SELECTIVE

Colonie lactozo – negativă

Suspect Salmonella spp.

Colonie lactozo – pozitivă

Mediul SS
 MEDII DE CULTURĂ SOLIDE MODERAT
SELECTIVE

Mediul ADCL (Leifson) Mediul Hektoen

MEDII DE CULTURĂ SOLIDE MODERAT
SELECTIVE
Colonii lactozo - pozititive

Colonii lactozo -
negative
Mediul Hektoen
 MEDII DE CULTURĂ SOLIDE ÎNALT
SELECTIVE

• medii înalt selective:

mediul Wilson – Blair
Agent inhibitor: verde
brilliant
Inhibă o gamă largă de
bacterii pentru a facilita
izolarea salmonelelor.
MEDII DE CULTURĂ SOLIDE
SELECTIVE

Agarul – sânge poate fi făcut selectiv pentru izolarea

unor patogeni pretențioși nutritiv prin adaos de
antibiotice:
• colimicina și acidul nalidixic: inhibă dezvoltarea bacteriilor
Gram (–) și favorizează dezvoltarea celor Gram (+)
• bacitracina: inhibă dezvoltarea bacteriilor Gram (+) și
favorizează izolarea hemofililor
• kanamicina și vancomicina: favorizează izolarea bacililor
Gram (-) anaerobi
 MEDII DE CULTURĂ SOLIDE
SELECTIVE

Agar chocolat cu Bacitracină – HAE2 Geloză – chocolat cu

Geloză – chocolat
Colonii de Haemophilus influenzae colimicină și vancomicină
Francisella tularensis
– VCA3
Neisseria gonorrhoeae
 MEDII CROMOGENE

• conțin multiple substraturi specifice pentru anumite

genuri sau specii bacteriene, iar degradarea lor
specifică determină creșterea bacteriilor sub forma
unor colonii pigmentate în mod diferit în funcție de
substratul degradat, permițând astfel recunoașterea
mult mai ușoară a acestor bacterii.
 MEDII CROMOGENE
Klebsiella
Escherichia coli spp.

Enterococcus
faecalis

Candida albicans Proteus spp.

MEDII CROMOGENE
 MEDII DE CULTURĂ SEMISOLIDE

Medii de identificare: 0,2 – 0,5% agar - agar

•Medii test (convenționale ori microtest):
• testarea motilității bacteriene
• Testul Hugh – Leifson: oxidare – fermentare
• Test Citrat Simmons
•Medii multitest (asociate, combinate):
• TSI (Triple Sugar Iron)
• MIU (Mobilitate, Indol, Urează)
• MILF (Mobilitate, Indol, Lizindecarboxilază,
Fenilalanindezaminaza)
MEDII DE CULTURĂ SEMISOLIDE

Bacterie mobilă –
tulbură întreaga
coloană de mediu

Bacterie imobilă – crește doar

pe urma ansei de
însămânțare, coloana de
mediu rămânând limpede

Testarea
motilității
bacteriene
MEDII DE CULTURĂ SEMISOLIDE

Testul Oxidare – Fermentare (O/F) –

Hugh - Leifson
MEDII DE CULTURĂ SEMISOLIDE

Testul Simmons citrat

MEDII DE CULTURĂ SEMISOLIDE

Testul TSI
MEDII DE CULTURĂ SEMISOLIDE

Testul Indol
MEDII DE CULTURĂ SEMISOLIDE

Testul ureazei
MEDII DE CULTURĂ SEMISOLIDE

Testul
Lizindecarboxilazei
MEDII DE CULTURĂ SEMISOLIDE

Testul
Fenilalanindezaminazei
 INCUBAREA
CULTURILOR
• Temperatura:
• 37°C – majoritatea
bacteriilor
• 20 - 30°C – unele bacterii
(Yersinia enterocolitica, Y.
pseudotuberculosis,
Listeria monocytogenes)
• 42°C – alte bacterii:
Campylobacter jejuni / C.
coli
Se folosește pentru incubare
termostatul.
 INCUBAREA CULTURILOR

• Atmosfera:
• aerobă - în prezența O2 – bacterii aerobe și facultativ
anaerobe
• carboxifilie - în mediu cu 5 – 10% CO2 – bacterii
carboxifile
• microaerofilie - în mediu cu O2 (5 – 7 %), CO2 (8 –
10%), N2 (85%) – bacterii microaerofile
• anaerobă - în mediu anaerob
INCUBAREA CULTURILOR
INCUBAREA CULTURILOR ÎN MEDIU
ANAEROB

• Procedee chimice:
• bulioane cu ingrediente reducătoare (acid thioglicolic sau
thioglicolat de Na.
• tehnica OTT: incinta etanșă în care O2 este îndepărtat prin
reacția cu pirogalolul în mediu alcalin.
• Procedee biologice:
• procedeul Tarozzi: utilizează tuburi cu bulion nutritiv în care
agent reducător sunt fragmente de organe proaspete de animal
prelevate aseptic (ficat, rinichi)
INCUBAREA CULTURILOR ÎN MEDIU
ANAEROB

Sisteme de incubare în atmosferă

Bulion cu acid thioglicolic
anaerobă - anaerojar
 LINK-URI UTILE

• https://www.youtube.com/watch?v=cneascR3OEc
• https://800ezmicro.com/equipment/media-preparation/49-systec-
mediafill.html
 CARACTERE DE CULTURĂ

• Exigențe de cultivare
• Intervalul necesar pentru obținerea culturii
• Aspectul și consistenta coloniilor
• Modificări ale mediului
• Mirosul degajat de cultură

Aceste caractere orientează identificarea izolatelor!

 CARACTERE DE CULTURĂ
EXIGENȚE DE CULTIVARE

• Bacterii nepretențioase
• Bacterii cu anumite exigențe nutritive:
• strict aerobe
• strict anaerobe
• facultativ anaerobe
• microaerofile
• carboxifile
 CARACTERE DE CULTURĂ
INTERVALUL NECESAR PENTRU APARIȚIA
CULTURII

• Microorganisme cu creștere rapidă: cultura

apare dupa 18 – 24 h. (frecvent peste noapte)
• Microorganisme cu crestere lentă: necesită zile
sau săptămâni pentru apariția culturii
 CARACTERE DE CULTURĂ
MORFOLOGIA COLONIILOR
1. Dimensiune: mm.
• colonii mici (Ø < 1 mm.)
• colonii mijlocii (Ø ~ 1 mm.)
• microcolonii (vizibile numai cu stereomicroscopul)
• colonii mari (Ø > 2 mm.)
2. Forma:
• punctiforme
• circulare
• neregulate (“în harta geografică”)
• filamentoase
• dendritice
• lenticulare
CARACTERE DE CULTURĂ
MORFOLOGIA COLONIILOR
 CARACTERE DE CULTURĂ
MORFOLOGIA COLONIILOR
3. Relieful:
• plane
• aplatizate
• convexe
• bombate
• acuminate
• pulvinate
• ombilicate
 CARACTERE DE CULTURĂ
MORFOLOGIA COLONIILOR
4. Marginile:
• întregi
• ondulate
• lobate
• zimțate
• filamentoase
• cu valuri succesive
de invadare a
mediului
 CARACTERE DE CULTURĂ
MORFOLOGIA COLONIILOR

Proteus spp. – aspectul de

valuri succesive pe geloză
simplă
Proteus spp. – aspectul de valuri
succesive pe geloză - sânge
 CARACTERE DE CULTURĂ
SUPRAFAȚA COLONIILOR

• Netedă, umedă, lucioasă – forma de cultură S

(smooth)– condiționată de hidrofilia și încărcătura
electronegativă a structurilor microbiene de înveliș
• Mată, uscată, rugoasă – forma de cultură R (rough) a
microorganismelor cu hidrofilie și încărcătură
electronegativă reduse
CARACTERE DE CULTURĂ

Colonii S Colonii R
 CARACTERE DE CULTURĂ

Colonii R – Tipuri diferite de

Bacillus subtilis colonii R
 CARACTERE DE CULTURĂ
SUPRAFAȚA COLONIILOR

Alte aspecte:
• suprafața papilată
• cu striuri radiare
• zbârcitâ
• catifelată
• pufoasă
• lânoasă
• prăfoasă
Colonii de Aspergillus niger
 CARACTERE DE CULTURĂ
DENSITATEA OPTICĂ

Colonii:
• transparente
• semitransparente
• opace
 CARACTERE DE CULTURĂ

• Irizații ale suprafeței unor colonii: pot fi surprinse

anumite unghiuri de iluminare
• Culoarea coloniilor:
• albă
• galbenă
• aurie
• neagră
în funcție de varietatea pigmenților produși sau a
virajului de culoare a unor indicatori introduși în
mediu.
 CARACTERE DE CULTURĂ

• Modificări ale mediului din jurul coloniilor: pot fi

produse de citotoxine, enzime sau pigmenți difuzibili.
• Hemoliza pe agar – sânge
• Reacții pe medii diferențiale zaharate
• Reacții pe mediul cu gălbenuș de ou
• Pigmentogeneza
 CARACTERE DE CULTURĂ
HEMOLIZA PE AGAR - SÂNGE

• alfa (α): zonă de înverzire a mediului cu numeroase hematii

intacte din cauza hemolizei parțiale
• Beta (β): zona complet clară, incoloră, din cauza hemolizei
complete
• alfa – prim (α’): halou de hemoliză incompletă cu înverzire,
imediat inconjurat cu o zonă de hemoliză clară, completă
• gamma (γ): absența hemolizei
• cald – rece: zonă clară de hemoliză completă (aparută după
incubare la 37°C) înconjurată cu o zonă de hemoliză mai puțin
clară, dar fără modificare de culoare a mediului (apărută după
incubarea în continuare la frigider)
 CARACTERE DE CULTURĂ
REACȚII PE MEDII DIFERENȚIALE
ZAHARATE

• Virajul de culoare al mediului

• Culoarea coloniilor în funcție de indicatorii de pH
• Fermentarea / Nefermentarea substratului
 CARACTERE DE CULTURĂ
REACȚII PE MEDII CU GĂLBENUȘ DE
OU

• Lecitinaza: precipitat opac în jurul coloniilor

• Lipaza: film circular cu irizație perlată în imediata
vecinătate a coloniilor
• Proteoliza: clarificarea mediului din jurul coloniilor
 CARACTERE DE CULTURĂ
PIGMENTOGENEZA

• Pigmenți hidrosolubili difuzează și colorează

progresiv mediul:
• fluoresceina
• piocianina
• piomelanina
• piorubrina
 CARACTERE DE CULTURĂ
MIROSUL DEGAJAT DE CULTURĂ

• Pseudomonas aeruginosa: aromă asemănătoare

florilor de iasomie, florilor de tei, merelor verzi
• Proteus: șocolată arsă
• Clostridii: putrid, fecaloid, de corn ars
• Prevotella melaninogenica: acru
• Nocardiile și streptomicetele: de subsol mucegăit
 CARACTERE DE CULTURĂ
CONSISTENȚA COLONIILOR

• untoasă
• mucoasă – filantă
• “albușului de ou bine bătut spumă”
• friabilă
• cretoasă
• pâsloasă
• pieloasă
 CARACTERE DE CULTURĂ
ADERENȚA LA MEDIU

• neaderente (antrenate de ansa alunecă pe

suprafața mediului) – Moraxella catarrhalis
• puțin aderente
• aderente (Mycobacterium spp.)
• încastrate în mediu (fungi)
 CURBA DE DEZVOLTARE A
BACTERIILOR PE MEDIILE DE
CULTURĂ

Faza Faza de
logaritmică declin

Faza
staționară