Noiunea de pH

pH-ul sau exponentul de hidrogen este definit ca logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentraiei ionilor de hidrogen: pH = log [H+] Prin analogie se definete la fel pHO sau exponent de hidroxil: pHO = log[HO] pH + pHO = pKw = 14
Referitor la soluiile apoase, dac: pH < 7; pHO > 7 atunci soluia este acid pH > 7; pHO < 7 atunci soluia este bazic pH = pHO = 7 atunci soluia este neutr

Indicatori
Indicatorii sunt substane chimice folosite pentru evidenierea punctului de echivalen al reaciilor, punct n care interacioneaz cu excesul de reactiv titrant din ultima picatur, modificndu -i brusc o proprietate uor perceptibil (culoare, solubilitate, fluorescen, etc.). Indicatorii participani la o reacie sunt clasificati n funcie de echilibrele de reacie care se produc ntre titrant i substana din soluia de analizat: indicatori acido-bazici sau de pH, la care modificarea comportamentului lor este o consecin a concentraiei H+ sau OH- (pH-ului soluiilor); indicatori redox, a cror modificare este determinat de variaia potenialului redox al soluiilor; indicatori de precipitare; indicatori de complexare. Indicatorii acido-bazici, cei mai utilizai n laborator, sunt de mai multe tipuri: de culoare, fluorescen, absorbie, turbidimetrici. Substane organice cu caracter acid sau bazic foarte slab, acetia i schimb culoarea n funcie de pH. Schimbarea de culoare se datoreaz modificrii structurii indicatorului i modificrii gradului su de disociaie. Indicatorii sunt caracterizai de anumii parametri pe baza crora sunt alei la utilizare: intervalul de viraj reprezint domeniul valorilor de pH n care se nregistreaz modificarea culorii; exponentul indicatorului reprezint pH-ul la care jumtate din indicator se transform. Condiiile pe care trebuie s le ndeplineasc un indicator acido-bazic sunt urmtoarele: schimbarea de culoare s fie reversibil (indicatorul s funcioneze reversibil); schimbarea de culoare s se produc brusc, deci ntr-un interval de pH ct mai mic; puterea de colorare s fie mare chiar pentru concentraii mici de indicator, astfel nct culoarea s fie uor observabil; solubilitate n ap, pentru ca soluia s fie suficient de colorat; schimbarea de culoare s se produc la adugarea unor cantiti mici de acid sau de baz; stabilitate n concentraiile obinuite de lucru astfel nct s nu fie descompus de ap, lumin, oxigen, dioxid de carbon. Intervalul de pH n care indicatorul i schimb culoarea corespunde domeniului de viraj al indicatorului. Cu ct un indicator are un interval de viraj mai restrns, cu att punctul su de viraj va fi mai sensibil. Indicatorii acido-bazici sunt: indicatori simpli indicatori micti indicatori universali

a. Indicatorii simpli au n general un singur interval de viraj. b. Indicatorii micti reprezint un amestec de mai muli indicatori cu un singur punct de viraj. c. Indicatorii universali sunt amestecuri de mai muli indicatori cu intervale de viraj diferite, ale cror domenii de viraj acoper ntreaga scar de pH = 0 14. Pe lng soluiile de indicatori care se prepar n laborator se utilizeaz i hrtiile indicatoare. Acestea sunt fii de hrtie de filtru impregnate cu soluii de indicatori simpli sau universali , nsoite de o scal colorat, corespunztoare culorii pe care o ia hrtia la diferite valori de pH. Recoltarea sngelui venos Pentru determinri hematologice i biochimice se folosete snge venos, iar recoltarea sngelui se face, n consecin, prin puncie venoas. La adult i copii mari, obinuit, se face recoltarea din venele plicii cotului, iar la sugari i copii mici din venele jugulare sau fontanel. Principiul metodei Sngele este aspirat n vacutainer ca urmare a presiunii mult sczute fa de cea din vasul de snge. Tehnica de lucru Se fixeaz garoul deasupra plicii cotului i se recomand pacientului s strng uor pumnul. Cu ajutorul garoului se produce o staz venoas, lsnd liber fluxul arterial. Se dezinfecteaz tegumentul la locul de puncie cu alcool. Se puncioneaz vena. Se recolteaz sngele direct n vacutainere. Dup recoltare se agit uor vacutainerul de 8 10 ori, fr s se fac spum. Se ndeprteaz garoul i se tamponeaz locul puncionrii cu un tampon cu vat mbibat n alcool. Rezultate Proba de snge venos

Recoltarea sngelui capilar Pentru analize hematologice de tipul: formul leucocitar, morfologie eritrocitar, examinare a frotiului sanguin se recolteaz snge capilar. Recoltarea sngelui capilar se face din pulpa degetului, din clci (la nou-nscui) sau din lobul urechii (la pacieni n stare de oc). Principiul metodei Curgerea spontan a sngelui dup neparea unui vas capilar. Tehnica de lucru Se dezinfecteaz pulpa degetului inelar cu eter. Dup evaporare i uscare se neap pielea rapid i suficient de adnc cu ajutorul acului steril. Se las sngele s curg spontan sau dup o slab presiune. Prima pictur se terge cu o hrtie de filtru sau vat. A doua pictur de snge se depune pe lam i se ntinde frotiul cu ajutorul lamei rodate. Dup prelevare se tamponeaz locul punciei cu un tampon de vat mbibat n alcool. Rezultate Pictura de snge capilar Etichetarea i notarea probelor Probele sunt recoltate n vacutainere corespunztoare, alese n funcie de tipul de analiz cu sau fr substan anticoagulant, etichetate.

Asistenta medical verific identitatea pacientului i noteaz naintea prelevrii pe recipient: numele i prenumele pacientului; numrul foii de observaie; secia; numrul salonului; numrul patului; analizele ce trebuie efectuate; data i ora recoltrii; numele medicului care a recomandat analizele; numele n clar i semntura cadrului medical care a recoltat proba. Se completeaz recomandare pentru ambulator, iar pentru spital se completeaz un bilet de analize ce conine: datele de pe recipient; numrul foii de observaie i secia; numele medicului care a recomandat analizele; analizele ce trebuie efectuate. Erori produse n laborator Cunoscnd importana examenelor biochimice n stabilirea diagnosticului de ctre clinician, acestea trebuie s ndeplineasc exigene din ce n ce mai mari prin controlul tuturor surselor de eroare care ar putea influena acurateea acestora. Pentru evitarea erorilor produse n laborator trebuie respectate urmtoarele reguli: Alegerea reactivilor se face n concordan cu metoda de lucru folosit. Se va ine permanent o eviden strict n ceea ce privete tipul i cantitatea din fiecare tip de reactiv, condiiile de pstrare i termenul de valabilitate. Pentru fiecare lot de reactivi trebuie s existe ser de control. Respectarea criteriilor de alegere a metodei. n prezent se folosesc metode enzimatice ce folosesc volume mici de snge sau ser i care ndeplinesc urmtoarele criterii: specificitate reactivul utilizat n reacie reacioneaz cu o singur substan, cea care trebuie determinat (ex. glicemia cu glucozoxidaz, ureea cu ureaz, acidul uric cu uricaz); reproductibilitate la repetarea multipl a analizei din aceeai prob se obine aceeai valoare; exactitate se obin rezultate asemntoare cu valoarea real prin mai multe determinri din aceeai prob, folosind alte metode n paralel; sensibilitate metoda surprinde concentraii foarte mici ale substanelor. Timpul de lucru al metodei trebuie respectat deoarece, dac acesta este crescut sau sczut, reaciile de culoare sunt prea intense sau nu apar. Probele recoltate (ser, plasm, LCR, urin etc.) trebuie s fie de calitate. Sticlria i cuvetele spectrofotometrului s fie curate, fr s conin urme de substane care ar putea interfera cu reactivii de lucru. Acestea trebuie cltite cu ap distilat i uscate sau, n anumite cazuri, trebuie s fie de unic folosin. Aparatura de laborator trebuie s fie modern i s aib contract de service i garanie. Permanenta ntreinere i verificare a aparaturii se execut zilnic de ctre personalul de laborator i periodic de echipa de service, lucru nscris n fie de eviden pentru control i reparaie. Controlul erorilor ce in de primirea i nregistrarea probelor biologice se realizeaz prin evitarea transcrierilor inutile, existena unui registru unic al laboratorului, tiprirea unui buletin de analiz pentru fiecare pacient, care s reuneasc toate tipurile de analize efectuate, transmiterea datelor on-line, etc. Calificarea i contiinciozitatea personalului de laborator. Pentru meninerea performanelor personalului laboratorului trebuie s existe un manual care s cuprind toate tehnicile de lucru, un manual pentru utilizarea fiecrui aparat i nu n ultimul rnd, un program de perfecionare care s cuprind cursuri, manifestri tiinifice.

Dozarea proteinelor totale prin metoda biuretului

Principiul metodei Reacia biuretului se bazeaz pe formarea unor compui de tip chelalic ntre legtura peptidic i ionul de Cu+, n mediu alcalin, cu apariia unei culori violet sau albastr. Metoda folosete un singur reactiv, n care hidroxidul de cupru este meninut n soluie sub forma unui complex format cu tartratul de sodiu i potasiu i stabilizat cu iodur de potasiu. Valori normale nou-nscui: 5,2 9,0 g/100 ml ser copii sub 3 ani: 5,6 8,6 g/100 ml ser copii peste 3 ani i aduli: 6,6 8,6 g/100 ml ser Variaii patologice Valori sczute ale proteinelor totale (hipoproteinemii): malnutriie; malabsorbie; maldigestie; ciroz hepatic; sindrom nefrotic; glomerulonefrit; insuficien renal cronic; ileus mecanic; hemoragii cronice; arsuri ntinse; amiloidoz; peritonit; hipertiroidie; hiperhidratare. Valori crescute ale proteinelor totale (hiperproteinemii): ciroz hepatic n stadiul compensat; sarcoidoz; paraproteinemii; deshidratare (pseudohiperproteinemie); diaree; stri febrile; diabet insipid; tuberculoz.

Determinarea activitii peptidice Teste de disproteinemie Echilibrul dinamic normal al proteinelor sanguine poart denumirea de euproteinemie i privete att cantitatea total de proteine ct i raporturile cantitative dintre fraciunile proteice. Prin disproteinemie se nelege o modificare cantitativ i calitativ a proteinelor plasmatice, care apare ca urmare a unui mecanism fiziopatologic declanat de o serie de afeciuni. Disproteinemia reprezint incapacitatea organismului de a menine constante i n limite normale fraciunile sale proteice.

Paraproteinemia presupune apariia de proteine atipice (paraproteine), absente n plasma normal i este subordonat disproteinemiei (fiecare disproteinemie este nsoit de apariia de paraproteine). n ser, n condiii fiziologice, proteinele reprezint un sistem coloidal stabilizat prin moleculele de albumin. n cazul modificrii raportului normal albumin/globuline, ca urmare a unor stri patologice nsoite de scderi ale factorilor stabilizani (albuminele) sau creteri ale factori precipitani (globulinele), se produce un dezechilibru n sistemul coloidal al serului (instabilitate/labilitate coloidal). Testele de disproteinemie (testele de labilitate seric) alctuiesc un ansamblu de reacii n care apare o turbiditate sau o floculare prin adugarea diferiilor reactivi n ser, punnd astfel n eviden existena dezechilibrului ntre diferitele fraciuni proteice (modificarea raportului albumin/globuline). VIII.3.1 Testul timol (metoda Mac Lagan)

Principiul metodei Prin adugarea soluiei tampon saturat de timol (pH = 7,4) la o prob de ser apare o turbiditate n cazul n care globulinele sunt crescute (n special 2-globulinele) sau albuminele sunt sczute. Turbiditatea se datoreaz apariiei unui complex timol globulinic fosfolipidic. Gradul de turbiditate se determin fotometric la 660 nm, n cuve de 1 cm. Valori normale 0 4 UML Variaii patologice Valori crescute se nregistreaz n: hepatopatii difuze (infecioase, toxice); ciroz hepatic; inflamaii cronice (poliartrita reumatoid, reumatismul articular acut); colagenoze; endocardita subacut; TBC pulmonar; nefropatii; mielom multiplu; infecii virale; neoplasm.

VIII.3.2 Testul cu sulfat de zinc (testul Kunkel)

Principiul metodei O soluie tamponat de sulfat de zinc (pH = 7,4) adugat la o prob de ser determin creterea turbiditii serului n cazul prezenei -globulinelor n cantitate crescut (direct proporional cu concentraia acestora). Turbiditatea aprut se datoreaz formrii unui complex metal -globuline i urme de globuline (complex insolubil). Valori normale 2 9 uniti turbidimetrice Variaii fiziologice Valorile apar crescute la persoanele vrstnice (pn la 12 uniti) i sczute n primele 6 luni de via extrauterin.

Variaii patologice Testul Kunkel este mai specific ca testul timol i mai selectiv pentru -globuline, punnd n eviden variaia acestora i prezint interes n ceea ce privete prognosticul i evoluia unei hepatite infecioase.

Dozarea lipidelor totale

Explorarea biochimic a lipidelor totale din ser poate furniza indicaii asupra evoluiei diferitelor procese constitutive ale metabolismului lipidic: depozitare, mobilizare din esuturi (n special din cel adipos), transport, degradare (lipoliz) i biosintez (lipogenez). Aceste procese, la rndul lor, pot fi influenate de modificri la nivelul altor ci metabolice. Valori normale Lipide totale = 500 700 mg % Variaii fiziologice Variaiile fiziologice ale lipemiei sunt n funcie de: vrst, sex, ras, tipul de alimentaie, factori genetici, echilibru neuro-endocrin, clim, profesie. Lipemia are o valoare mai redus la nou-nscut i n perioada primei copilrii, dup care prezint o cretere constant pn la vrsta de 60 de ani. Sarcina asociaz o cretere a coninutului de lipide totale. Variaii patologice Valori crescute (hiperlipemie) deficit de catabolizare a lipidelor, respectiv lipoliz diminuat; mobilizare crescut de acizi grai din esutul adipos corelat cu o biosintez crescut de lipide; hiperlipemie congenital; sindrom nefrotic (nefroz); obstrucie a cilor biliare (lipsa acizilor biliari); hipotiroidie (mixedem); hipercorticism; insuficien hepatic; hemocromatoz; tulburri ale metabolismului lipidic din cauza insuficienei pancreatice: diabet; pancreatit acut; maladii arteriale: ateroscleroz; arterit; coronarit; hiperlipemie familial idiopatic (lipidoza splenomegalic). Hiperlipemiile patologice sunt n strns corelaie cu hipercolesterolemiile patologice. Valori sczute (hipolipemie) infecii acute; hipertiroidism; anemie; necroz hepatic avansat; inaniie; malabsorbie.

Dozarea colesterolului total

Sterolii sunt alcooli superiori ciclici hidroaromatici, derivai ai hidrocarburii saturate colestan. n plasm, colesterolul este legat de diferitele clase de lipoproteine: 60% din colesterolul total de ctre LDL, 20% de HDL, 15% de VHDL i 5% de chilomicroni. O colesterolemie crescut favorizeaz ateromatoza. Colesterolul se depune pe arterele mari, formnd plci ateromatoase ce provoac modificri degenerative ale peretelui n care se infiltreaz fibroblati i se depune calciu, provocnd ateroscleroza. Suprafaa rugoas a plcilor ateromatoase favorizeaz formarea cheagurilor. n consecin, determinarea colesterolului total i a celor dou fraciuni, LDL-colesterol i HDLcolesterol sunt frecvent solicitate ca teste screening n evaluarea gradului de risc pentru ateroscleroz, hipertensiune arterial, cardiopatie ischemic i accident vascular cerebral sau pentru monitorizarea pacienilor cu afeciuni coronariene. Dozarea colesterolului total prin metoda enzimatic

Principiul metodei Metoda permite dozarea colesterolului total folosind un sistem enzimatic format din: colesterolesteraz, colesterol-oxidaz i peroxidaz. Reaciile enzimatice sunt urmtoarele: Prin metoda enzimatic, colesterolul este determinat colorimetric, concentraia colesterolului fiind direct proporional cu extincia citit la lungimea de und de 505 nm. Valori normale Colesterol total = 160 200 mg % Variaii patologice Valori crescute (hipercolesterolemie) hiperlipoproteinemii primare (mai ales II, III,V); hipotiroidie; ateroscleroz; colestaz; sindrom nefrotic; anorexie nervoas; gut; diabet zaharat; alcoolism; tratament cu cortizol, retinoizi i androgeni. Valori sczute (hipocolesterolemie) malabsorbie; maldigestie; inaniie; carene alimentare; caexie;

steatoree; afeciuni hepatice (ciroze); hipertiroidie; hipo -lipoproteinemie.

Determinarea fraciilor de colesterol

VII.3.1 Determinarea HDL-colesterolului prin metoda enzimatic-colorimetric

Principiul metodei Acidul fosfowolframic precipit din ser lipoproteinele cu densitate foarte mic (VLDL) i lipoproteinele cu densitate mic (LDL). n prezena ionilor de magneziu precipit chilomicronii , iar lipoproteinele cu densitate mare (HDL) rmn n supernatant. HDL colesterolul din supernatant se determin prin metoda enzimatic.

Intervale de HDL-colesterol corelate cu gradul de risc pentru ateroscleroz, hipertensiune arterial, cardiopatie ischemic i accident vascular cerebral

Brbai Femei

Risc mediu > 55 mg/dl > 65 mg/dl

Normal 35 55 mg/dl 45 65 mg/dl

Risc crescut < 35 mg/dl < 45 mg/dl

Exist o legtur ntre perturbarea metabolismului lipidic i ateroscleroz: Valori pentru Col > 240 mg % i TG > 150 mg % (sau lipide totale > 800 mg%) reprezint factori de risc pentru ateroscleroz, alturi de valorile de risc prezentate n tabelul de mai sus.

VII.3.2 Determinarea LDL-colesterolului prin metoda enzimatic-colorimetric

Principiul metodei Lipoproteinele cu densitate joas (LDL) precipit cu anumii compui de polimeri, iar precipitatul se poate solubiliza cu o soluie de citrat trisodic-clorur de sodiu. LDL-colesterolul se determin enzimatic.

Metoda Friedewald Este o formul de calcul a LDL-colesterolului pe baza valorilor obinute pentru colesterol total, HDL-colesterol i trigliceride. LDL-colesterol = Colesterol total TG/5 HDL-colesterol

Intervale de LDL-colesterol corelate cu gradul de risc pentru ateroscleroz, hipertensiune arterial, cardiopatie ischemic i accident vascular cerebral

Risc sczut

Normal

Risc crescut

LDL-Col

< 130 mg/dl

130 160 mg/dl

> 160 mg/dl

Situaii de neconcordane ntre manifestrile clinice i examenele de laborator: Exist hiperlipemie la subieci clinic sntoi; astfel de subieci pot fi considerai n stadii incipiente de dezvoltare a aterosclerozei sau avnd potenial de evoluie spre ateroscleroz. Nu orice hiperlipemie evolueaz cu ateroscleroz. Exist cazuri de ateroscleroz clinic manifest fr lipemie, la vrste naintate, cnd hiperlipemiile tind s regreseze, iar leziunile vasculare anterior instalate dau manifestri clinice. Lipidele serice tind s scad ulterior unui infarct miocardic acut. Metoda de dozare enzimatic a ureei cu ureaz (metod specific)

Principiul metodei Ureea este hidrolizat sub aciunea ureazei i este transformat n amoniac i dioxid de carbon. n mediu alcalin ionii de amoniu mpreun cu salicilatul i hipocloritul de sodiu, formeaz un compus de culoare verde, fotometrabil. Intensitatea culorii este direct proporional cu concentraia ureei. ureaz Uree + H2O

2NH3 + CO2

Ureaza este o amidaz, enzim care catalizeaz hidroliza legturilor C N, altele dect cele peptidice. Ea scindeaz hidrolitic legturile amidice din uree. Valori normale uree snge: 20 40 mg % (2,49 7,47 mmol/l) urin: 24 30 g / 24 ore Variaii fiziologice Concentraia sanguin a ureei are variaii strns legate de vrst, cu creteri pn la 50 mg/100 ml ser la subieci peste 60 de ani. Alimentaia bogat n proteine determin valori la limita superioar a normalului. n ultimul trimestru de sarcin se constat valori mai sczute, deoarece ftul crete rapid folosind aminoacizii materni. Variaii patologice ale ureei n snge Valori crescute cauze renale: glomerulonefrite acute i cronice; nefroangioscleroze benigne sau maligne; nefropatii tubulare toxice; TBC renal; tumori renale; rinichi polichistic; hidronefroze; hipertrofia prostatei; calculoz renal; insuficien renal acut sau cronic (permite aprecierea gradului leziunilor parenchimatoase). cauze extrarenale: hipercatabolism proteic ce asociaz obligatoriu o component renal de origine ischemic; strile de toxicoz i oc datorate hemoragiilor, arsurilor, traumatismelor.

Valori sczute insuficiena hepatic grav.

Determinarea creatininei serice (metoda Jaff)

Principiul metodei Creatinina, n mediu puternic alcalin, reduce acidul picric la acid picramic de culoare galben portocalie, fotometrabil. Intensitatea culorii este direct proporional cu concentraia creatininei. Valori normale creatinin n snge: brbai 0,6 1,1 mg % femei 0,5 0,9 mg % n urin: 1 1,5 g / 24 ore Variaii patologice Valori crescute: Creatinemia rmne constant att timp ct factorul renal de eliminare nu este afectat. Modificrile acesteia, chiar minore, pot fi semnificative pentru diagnostic deoarece creterea acestor valori este direct proporional cu severitatea bolii. cauze prerenale: insuficiena cardiac congestiv; deshidratri masive prin: vrsturi incoercibile; diaree; administrare excesiv de diuretice; transpiraii abundente; diabet zaharat; diabet insipid; gut; afeciuni hepatice; miopatii; polimiozite, etc. cauze renale: insuficien renal acut sau cronic; cauze postrenale: obstrucii ale cilor urinare: neoplasm; litiaz renal; adenom de prostat. n cazul transplantului renal, creteri ct de mici ale creatininei fa de valorile normale ne indic respingerea grefei. Valori sczute: insuficien renal cronic. Metoda de dozare a acidului uric cu uricaz (metod specific)

Principiul metodei Acidul uric este transformat de uricaz n alantoin i ap oxigenat, care sub aciunea peroxidazei oxideaz 2,4diclorfenolsulfonatul i 4 aminoantipirina formnd un derivat de chinon de culoare rouviolet. Intensitatea culorii derivatului obinut este direct proporional cu concentraia acidului uric. Uricaza este o enzim cu specificitate absolut de substrat, acionnd numai asupra acidului uric. Enzimele sunt biocatalizatori sau fermeni de natur organic sintetizate de microorganisme i organisme vegetale sau animale. Prin natura lor chimic sunt proteine, prezente n toate celulele esuturilor i organelor. Enzimele condiioneaz desfurarea, coordonarea i autoreglarea reaciilor specifice materiei vii, prin care se realizeaz procesele metabolice ale creterii, reproducerii i ale tuturor activitilor celulare. Caracterele generale ale enzimelor sunt urmtoarele: acioneaz n cantiti extrem de mici, ceea ce atest faptul c au activitate catalitic mare (transform cantiti foarte mari de substrat); nu se consum; nu modific echilibrul de reacie ci doar viteza de reacie; au aciune reversibil; au specificitate de reacie i de substrat. Enzimele acioneaz att n interiorul organismului, ct i n extrase, n afara organismului, ceea ce permite dozarea lor n laborator. Aciunea enzimelor asupra tuturor activitilor celulare face posibil ca o reacie, incompatibil din punct de vedere termic cu viaa (necesit temperaturi foarte nalte), s aib totui loc, la o temperatur mult mai mic. n funcie de reacia catalitic a enzimei i de substratul asupra cruia acioneaz, enzimele se clasific n ase grupuri: oxidoreductaze, transferaze, hidrolaze, izomeraze, liaze i ligaze. Activitatea enzimatic este influenat de mai muli factori, printre care: temperatura; pH-ul; electroliii; concentraia substratului; concentraia enzimei; substanele activatoare sau inhibitoare din mediu. Dozarea enzimelor se bazeaz pe determinarea activitii lor, adic pe capacitatea lor de a cataliza o reacie dat i se realizeaz n dou moduri: msurarea metabolizrii substratului n unitate de timp; msurarea concentraiei substratului nainte i dup aciunea enzimei. Activitatea enzimatic se exprim n uniti enzimatice raportate la 1 ml (U/ml). O unitate de activitate enzimatic reprezint cantitatea de enzim care modific 1 mol de substrat ntr-un minut i n condiii stabilite (standard). Pentru a putea interpreta corect semnificaia diagnostic a enzimelor plasmatice trebuie avut n vedere locul lor de sintez i mecanismul lor de secreie. Dozarea i interpretarea activitii enzimelor serice sau plasmatice constituie o metodologie curent n medicin cu o deosebit valoare i semnificaie clinic. Determinarea activitii enzimatice permite un diagnostic pozitiv i diferenial corect, aprecierea evoluiei unor boli, aprecierea eficacitii unor terapii aplicate, identificarea unor defecte genetice, etc. Evaluarea cantitativ a unor enzime din serul sanguin prezint o importan deosebit n cazul afeciunilor hepatice, pancreatice, prostatice, cardiace, n anemii, leucoze, tumori, traumatisme musculare, etc., aducnd informaii despre organul sau esutul lezat i n acelai timp despre importana i ntinderea leziunii. Pentru determinrile enzimatice se folsete n special serul sanguin deoarece anticoagulaii inhib aciunea multor enzime.

Influena temperaturii asupra activitii enzimatice Aciunea temperaturii asupra reaciilor enzimatice este dubl: modific viteza reaciei enzimatice sau denatureaz enzima, respectiv apoenzima care este de natur proteic. Temperatura optim este de +37C, deoarece la aceast temperatur distrugerea enzimei este practic nul, iar viteza reaciei este suficient de mare. Mrind temperatura peste aceast valoare, se nregistreaz o diminuare progresiv a vitezei de reacie pn la anularea sa. Acest fapt se explic prin denaturarea termic a enzimei i se produce la o anumit temperatur, proprie fiecrei enzime care se numete temperatur de inactivare. Enzimele sunt termolabile, adic nclzite peste o anumit temperatur i pierd ireversibil activitatea. Principiul metodei Amilaza salivar este activ la +37C, dar prin fierbere se inactiveaz i nu mai are aciune hidrolitic asupra amidonului. Influena pH-lui asupra activitii enzimatice Viteza reaciilor enzimatice este influenat n mare msur de pH -ul mediului n care acioneaz enzima, fapt explicat de natura proteic a enzimelor. Modificrile de activitate a enzimelor sub influena pH-ului mediului sunt datorate modificrii stabilitii i a gradului de ionizare ale enzimelor, substraturilor corespunztoare sau complexelor enzim substrat. Sensibilitatea fa de pH a enzimelor se manifest n legtur cu viteza de producere a reaciei pe care o catalizeaz i n legtur cu stabilitatea lor. Reacia are o vitez maxim pentru o anumit valoare a pH-ului denumit pH optim, iar abaterile de la aceast valoare produc o scdere brusc a vitezei de reacie. Stabilitatea enzimelor este afectat de aciditatea sau alcalinitatea mediului, o enzim fiind stabil numai ntre anumite limite de pH n cadrul crora se poate vorbi de un pH optim de stabilitate. Principiul metodei Amilaza salivar are activitate maxim la un pH specific, care se poate pune n eviden prin hidroliza amidonului ntr-o gam de pH-uri realizate de sisteme tampon. Determinarea activitii ALAT (TGP) prin metoda enzimatic

Principiul metodei Substraturile participante n reacia catalizat de ALAT (TGP) sunt: L-alanina i -cetoglutaratul (oxoglutaratul). Piruvatul rezultat din reacie, n prezena lactat dehidrogenazei (LDH), va reaciona cu NADH +H+ ducnd la formarea NAD+ i L-lactat. Variaia absorbanei msurat la lungimea de und de 340 nm este direct proporional cu activitatea ALAT (TGP). Valori normale aduli: 2 16,5 UI copii pn la 5 ani: 0,2 13 UI Variaii patologice Creteri importante ale ALAT apar n:

hepatita viral acut; hepatopatia toxic cu necroz; Creteri medii: hepatite cronice; ciroze; icter mecanic; ficat de staz acut; mononucleoza infecioas. Creterea aminotransferazelor n afeciunile hepatice: creterea ALAT este mai important dect creterea ASAT n hepatitele infecioase datorit lezrii membranelor celulare; creterea ASAT este mai important dect creterea ALAT n hepatopatiile infiltrative datorit lezrii membranelor celulare i mitocondriale. Determinarea activitii ASAT (TGO) prin metoda enzimatic

Principiul metodei Substraturile participante n reacia catalizat de ASAT (TGO) sunt L-aspartatul i -cetoglutaratul (-oxoglutaratul). Oxalacetatul rezultat din reacie, n prezena malat-dehidrogenazei (MDH), va reaciona cu NADH+H+ ducnd la formarea NAD+ i L-malat. Variaia absorbanei msurat la lungimea de und de 340 nm este direct proporional cu activitatea ASAT (TGO) Valori normale aduli: 2 20 UI copii 3 luni 1 an: pn la 28 UI Variaii patologice Creteri de 10 100 de ori ale ASAT fa de valorile normale se ntlnesc n: infarct miocardic (util n diagnosticul infarctului miocardic acut alturi de CK-MB i LDH); hepatita viral acut; hepatopatii toxice; Creteri moderate: hepatite cronice; ictere colestatice (crete de 5 10 ori fa de valorile normale); afeciuni distrofice musculare; dup traumatisme, intervenii chirurgicale; anemii hemolitice severe; viroze cu tropism hepatic (mononucleoza infecioas). n afeciunile musculare creterile ASAT (TGO) sunt mai mari dect ale ALAT (TGP).

ANALIZA BIOCHIMIC A URINEI

Urina este un produs de filtrare, reabsorbie i excreie, care reprezint activitatea funciei renale i reflect starea fiziologic a organismului. n situaiile n care funcia rinichilor este afectat, acetia devin incapabili s menin homeostazia mediului intern, iar proprietile fizico-chimice ale urinei se modific prin apariia diferitelor substane cu semnificaie patologic.

Examenul de laborator al urinei presupune: examen macroscopic, examen microscopic, examen fizico-chimic, examen citologic i examen bacteriologic. Examenul sumar de urin const n: examen macroscopic, examen microscopic (sediment urinar) i determinri calitative i cantitative ale unor componente care apar n urin n condiii patologice (albumina, glucoza). n situaii clinice speciale pot fi investigate o serie de elemente la cerere: corpi cetonici, bilirubin, urobilinogen, urobilin, prezena sngelui, etc.

Recoltarea urinei
Recoltarea urinei se efectueaz imediat dup emisie, n recipiente de unic folosin sau n vase de sticl absolut curate, cltite cu ap distilat, care s nu-i modifice compoziia. Pentru examenul sumar de urin se folosete urina de diminea. Urina de diminea este urina proaspt, colectat dimineaa, dup ce vezica urinar a fost golit de urina acumulat n timpul nopii i care prezint concentraie maxim. n aceast urin se fac numai determinri calitative, cu aprecieri orientative asupra intensitii reaciilor. Pentru examenul complet al urinei se folsete urina din 24 de ore. Colectarea urinei din 24 de ore ei se face pornind de la o or fix de diminea (de exemplu ora 8.00). Cantitatea de urin emis la acea or se arunc i apoi se adun toate emisiile de urin din urmtoarele 24 de ore, ntr-un vas cu conservani, pn a doua zi la ora 8.00. Determinrile cantitative se realizeaz dintr-o prob de urin preluat din cantitatea colectat n 24 de ore, dup omogenizare, deoarece excreia unor constitueni este influenat de ritmul nictemeral. La urina din 24 de ore este necesar msurarea volumului total de urin, deoarece determinrile care se fac n aceasta se raporteaz la acest volum. Se recomand ca urina s fie examinat imediat dup emisie sau cel mult n 2 3 ore de la recoltare. n caz contrar se impune conservarea urinei prin congelare imediat (20C), pstrare la rece (+4C) sau prin adugarea unor substane conservante care s nu-i modifice compoziia chimic (ex. formaldehid, timol 1g/l, glutaraldehida, CellFix etc.)

Examenul macroscopic al urinei

Msurarea diurezei Diureza este volumul de urin emis n 24 de ore i reprezint echilibrul ntre pierderea de lichide i aportul exogen i endogen de lichide (lichide ingerate + 400 ml ap metabolic rezultat din degradarea alimentelor ingerate). Msurarea cantitii de urin emis spontan n 24 de ore cu cilindrul gradat. Valori normale brbai: 1200 1500 ml femei: 1000 1200 ml nou nscui: 30 60 ml sugari 2 12 luni: 400 500 ml copii 5 8 ani: 650 1000 ml Variaii fiziologice Diureza variaz cu vrsta, cantitatea de lichide ingerate i starea de hidratare a organismului. Variaii patologice Poliurie (diureza > 1800 ml) fiziologic: ingestie crescut de lichide; dup emoii, frig. patologic (n condiiile unui aport hidric normal): cauze extrarenale:

diabet insipid (lipsete ADH, pierderi pn la 20 l/zi, densitatea urinei este egal cu densitatea apei); diabet zaharat (diurez osmotic, pierderi pn la 4 5 6 l/zi, densitatea urinei = 1035 1040; poliurii pasagere apar n: defervescena unor boli infecioase (pneumonie, malarie, febra tifoid); crize astm bronic; tahicardie paroxistic; angin pectoral; colici renale; criz epileptic; insuficien cardiac tratat cu tonicardiace i diuretice; boli edematoase: nefropatii; insuficien renal compensat; afeciuni hepatice. cauze renale: glomerulonefrit cronic; pielonefrit cronic; TBC renal; nefroangioscleroz. Oligurie ( diureza = 100 500 ml) fiziologic: regim alimentar sec (fr ap); transpiraii abundente: efort fizic crescut; munc n mediu cu temperaturi crescute (cuptoare 3000C). patologic: cauze extrarenale: stri febrile; pneumonie; hepatit; pierderi lichidiene: vrsturi incoercibile; diaree; arsuri; hemoragii; insuficiena cardiac netratat; ciroza hepatic decompensat vascular cu ascit i edeme; pleurezii abundente. cauze renale: glomerulonefrit acut (cantitate mic, densitate urinar mare); sindroame nefrotice (crete eliminarea serinelor determinnd densitate crescut); colici renale; scleroze renale decompensate. Anurie (diureza = 50 100 ml) patologic: cauze extrarenale: traumatisme i zdrobiri masive de esuturi (rzboaie, incendii); transfuzii de snge incompatibil; hemoragii masive; avorturi septice; traumatisme chirurgicale (oc postoperator).

 cauze renale: colici renale (reflex de inhibare a rinichiului controlateral); nefropatii bilaterale cu necroze mari ale epiteliului tubular (insuficien renal acut). Msurtori organoleptice: culoare, miros, aspect 1. Culoarea urinei Culoarea urinei normale variaz de la galben-pai (mai diluat, alcalin) la portocaliu-rocat (mai concentrat, acid) spre chihlimbar (n funcie i de ora emisiei: urina din timpul nopii este mai concentrat, mai nchis la culoare). Culoarea este dat de pigmenii pe care i conine: urocrom, urobilin, porfirin. Urini decolorate (palid, apoase) apar n poliurii de diferite cauze, iar cele intens colorate apar n mod fiziologic n cazul alimentaiei hiperproteice, dup efort fizic n cazul transpiraiilor abundente i, n mod patologic, n caz de oligurii, febr, afeciuni hepatice cronice. Modificri de culoare galben-verzuie (brun) n sindroame icterice; roz-roie (n raport cu cantitatea substanei): hematurie (hematii) tulbure; hemoglobinurie (hemoglobin) limpede; mioglobinurie (mioglobin); roie la emisie care prin oxidare devine neagr n porfirinurie; zeam de carne n glomerulonefrit acut; roie n cazul consumului de piramidon, algocalmin, antipirin, sulfamide, sfecl roie, morcov; albastru-verzui n cazul administrrii de albastru de metilen; neagr n melanom, alcaptonurie. 2. Mirosul urinei Mirosul urinei este caracteristic la emisie, uor amoniacal sau fad; se modific n timpul pstrrii. Modificri ale mirosului miros fetid n infecii (cistite, infecii cu Proteus) miros de aceton (de mere putrede) n diabetul zaharat decompensat cu acidoz (prezena n cantiti mari de corpi cetonici) 3. Aspectul urinei Urina la emisie este limpede, clar, transparent i se poate tulbura pe parcursul pstrrii. Modificri de aspect tulbure, opalescent de la / dup emisie: eliminare de sruri (nisip renal); piurie: prezena de puroi, mucus, epitelii, flor microbian, sruri (fosfai, carbonai, urai, oxalai); lipurie: prezena de lipide (aspect lptos).

Examenul microscopic al urinei (sedimentul urinar): urin proaspt emis pentru a evita
descompunerea n timp a elementelor organice. Cea mai indicat urin este cea de diminea, deoarece, fiind mai concentrat, se evit liza elementelor celulare. Examinarea microscopic a sedimentului urinar obinut prin centrifugare timp de 5 minute la 2000 turaii/minut. Dup centrifugarea urinei se decanteaz supernatantul clar, cu grij, pentru a nu tulbura sedimentul format. Se evit centrifugarea energic deoarece distruge elementele figurate. Cu ajutorul unei pipete Pasteur se aspir i se depune o pictur nu prea mare pe lama de cercetat i se acoper cu o lamel pentru a evita formarea bulelor de aer. Rezultate Normal pe un cmp microscopic pot fi: 1 2 hematii, 3 4 leucocite, eventual un cilindru, rare celule epiteliale din cile urinare inferioare, rare cristale (n funcie de alimentaie). Cnd aceste elemente sunt n cantitate crescut, ele capt semnificaie patologic.

Examenul fizicochimic al urinei

Analizele fizicochimice ale urinii utilizeaz metode calitative, semicantitative i cantitative.

Msurarea pH-ului: cu ajutorul hrtiei indicator universal (turnesol) sau cu pHmetru. Acesta se msoar n urina proaspt emis, deoarece urina pstrat se contamineaz n timp cu bacterii i prin fermentarea microbian i schimb reacia spre zona alcalin. Rezultate pH = 6 (5,2 8,2) Reacia normal este slab acid i depinde de alimentaie. n alimentaia vegetarian pH-ul este alcalin din cauza excesului de sruri minerale i organice, iar n regimul carnat pH-ul este acid prin eliminrile crescute de acid uric, urai i fosfai acizi. Modificri de pH pH alcalin afeciuni cronice urinare; infecii urinare; vrsturi; resorbia edemelor. pH acid boli infecioase; boli febrile; TBC renal; diabet zaharat cu acido-cetoz; insuficiena renal grav; medicamente cu radicali acizi. Msurarea densitii : densitatea urinii depinde de concentraia substanelor dizolvate n urin, n principal de uree i sruri (NaCl) la indivizii sntoi, respectiv de glucoz i albumin n cazurile patologice. - urodensimetru calibrat la 15C Rezultate Normal densitatea urinei din 24 de ore este cuprins ntre 1010 1035 (normostenurie), cu variaii n funcie de ingestia de lichide i dup transpiraii abundente. Densitatea este de obicei invers proporional cu volumul urinar i direct poporional cu prezena glucidelor, albuminei, ureei. Densitate urinar sczut apare n scleroza renal, diabet insipid (absena glucidelor), poliurie. Hipostenuria reprezint scderea capacitii de concentrare, cu scderea moderat a densitii urinare maxime n jur de 1020 1022 i apare n unele nefropatii, diabet insipid, tratament cu diuretice. Izostenuria reprezint scderea marcat a densitii urinare la valori de 1010 1011, echivalente cu ale plasmei deproteinizate i indic o insuficien renal avansat. Subizostenuria reprezint o densitate urinar cu valori de 1006 1007 i apare n pielonefrita cronic. Cercetarea elementelor anormale din urin Urina este un lichid biologic de excreie cu o compoziie complex. n anumite stri patologice, unele substane prezente n mod normal n cantiti extrem de mici se pot elimina n cantiti mult mai mari. Patologic apar n urin elemente anormale ca: substane proteice; substane glucidice; compui cetonici; pigmeni sanguini; urobilinogen; pigmeni biliari; acizi biliari. n laboratorul de biochimie se folosesc analizele calitative i cantitative. Analiza calitativ este utilizat n biochimia medical pentru evidenierea unor substane care nu se gsesc n condiii normale n produsul de analizat (ex. n urina normal nu se gsesc glucoz, corpi cetonici, pigmeni sau sruri biliare). Analiza cantitativ se folosete n laboratorul de biochimie medical pentru dozarea n produsul de examinat a unor substane componente care se gsesc n mod normal n acesta, dar cantitatea lor poate fi n

afara limitelor normale (ex. ureea sanguin are valori cuprinse ntre 20 40 mg% care pot crete mult peste normal indicnd o afectare renal). Identificarea proteinelor urinare n mod normal nu exist proteine n urin; doar urme de proteine 20 40 mg%, nedecelabile prin metode uzuale. Proteinele cu molecula mai mic de 58 KDa pot trece prin filtrul renal i se reabsorb. Determinri calitative Analiza proteinelor urinare presupune determinri calitative numai din urina proaspt de diminea, cu aspect clar, limpede.

1. Proba cu acid sulfosalicilic la rece Principiul metodei Substanele proteice din urin precipit la adugarea ctorva picturi de acid sulfosalicilic. 2. Metoda Heller Principiul metodei Precipitarea proteinelor sub form de inel la limita de separare dintre urin i reactiv nitric-nitros. Variaii patologice Prezena n urin a cantitilor anormale de substane proteice din cauza unei afeciuni renale sau extrarenale poart numele de proteinurie (albuminurie). Proteinuriile apar n urmtoarele situaii, fiind: tranzitorii (benigne): efort; febr; expunere la frig. permanente (ntotdeauna patologice): prerenale (strbat uor filtrul renal, paraproteine cu M < 60000): macroglobulinemia Waldenstrm; limfogranulomatoza malign; limfosarcom; proteinuria Bence-Jones (este termostabil la 60C precipit iar la temperaturi mai mari n continuare se limpezete). renale: prin lezarea filtrului renal sau a membranei bazale renale: glomerulonefrita acut; sindrom nefrotic; glomerulonefroza diabetic; hipoxia capilarelor glomerulare rinichi de staz. prin retroresorbie tubular micorat: tubulonefroze toxice (Pb, Hg); rinichiul de oc; sindroame de strivire. postrenale (nu se datoreaz rinichiului ci proceselor patologice ale cilor renale): pielite; cistite; uretrite; prostatite; neoplasme; litiaz Identificarea glucidelor urinare

n mod normal urina nu conine dect cantiti extrem de mici de diferite glucide ca: glucoz, fructoz, manoz, arabinoz, xiloz, (n urina din 24 de ore cca 100 300 mg), care nu pot fi evideniate prin metode obinuite de analiz. n urinele patologice cel mai frecvent glucid ntlnit n cantiti apreciabile este glucoza, prezena ei purtnd numele de glicozurie. n afar de glucoz ns, se mai pot gsi i alte glucide ca: galactoz, fructoz, lactoz, maltoz i diferite pentoze. Termenul corect n acest caz este cel de meliturie, ceea ce semnific prezena unui zahr reductor n urin (glucoz, galactoz , fructoz) i nu este ntotdeauna patologic. Determinri calitative Determinrile calitative se efectueaz n urina de diminea sau n urina de la o emisie. Reaciile Benedict i Fehling evideniaz melituria i ofer indicaii orientative asupra cantitii de substane reductoare n urin. Reacia Benedict Principiul metodei Glucoza, prin funcia sa aldehidic, reduce CuSO4 n mediu alcalin la cald la hidroxid cupric de culoare galben, care trece ulterior n oxid cupros de culoare rou-carmiziu. Reacia Fehling Principiul metodei Glucoza, prin funcia sa aldehidic, reduce la cald n mediu alcalin hidroxidul de cupru de culoare albastr la suboxid de cupru de culoare rou-crmiziu. Reacia Nylander Principiul metodei Glucoza, prin funcia sa aldehidic, reduce srurile metalelor grele la metalul respectiv, n acest caz azotatul de bismut este redus la bismut metalic de culoare neagr. Reacia este foarte sensibil, dar atenie: dac e pozitiv se verific prin reaciile Benedict sau Fehling, deoarece precipitatul poate fi sulfura de bismut, i nu bismutul metalic. Sulfura de bismut este format de unele substane ce conin sulf i care se elimin prin urin (cistin, albumin). Variaii patologice Glicozurie permanent diabet zaharat glicozuria corelat cu creterea glicemiei sanguine (dac glicemia 180 mg/dL se depete pragul de eliminare renal cu apariia glicozuriei) boli renale ( diabet renal simplu, nefroza dobndit/congenital care chiar la o glicemie normal nu permit resorbia glucozei i apare glicozuria tranzitorie: boli infecioase grave febra tifoid; meningite; encefalite; intoxicaii acute i cronice (Pb, Hg); accidente vasculare cerebrale (hemoragice, trombotice); hipertiroidie; boli cronice hepatice; faza acut a infarctului miocardic; pancreatita acut. Identificarea compuilor cetonici n urin Compuii cetonici sunt rezultatul catabolismului acizilor grai i se gsesc n cantiti foarte mici n urina normal, nedecelabile (mai ales sub form de aceton). Compuii cetonici sunt acetona, acidul acetilacetic i acidul hidroxibutiric.

Reacia Legal Imbert Principiul metodei Acetona n mediu de acid acetic, n prezena amoniacului d cu nitroprusiatul de sodiu o culoare rou-violacee. Variaii patologice Compuii cetonici apar n urin n urmtoarele cazuri: frecvent la copii n cazul alimentaiei predominant proteice i lipidice, cu puine glucide; vrsturi cetonemice la copii; diabet zaharat; stri infecioase grave; dezechilibre hidrominerale; inaniie; narcoz; subalimentare; cur de slbire; toxicoza gravidic. Cercetarea pigmenilor biliari n urin Se cerceteaz bilirubina, urobilinogenul, urobilina, acizi i sruri biliare. Urobilinogen Metoda Erlich Principiul metodei Urobilinogenul n prezena paradimetilaminobenzaldehidei (reactiv Erlich) i n mediu acid dezvolt o coloraie roie-crmizie. Valori normale Urobilinogenurie 0,05 2,5 mg/24 ore Variaii patologice Urobilinogenurie crescut: producere excesiv de pigmeni biliari (hemoliz); utilizarea unor medicamente afeciuni hepatice: hepatit viral acut; hepatit cronic agresiv; ciroz hepatic; n perioada subicteric (are importan deosebit pentru diagnostic). Urobilinogenurie sczut: obstrucia cilor biliare (intra i extrahepatice); reducerea florei bacteriene intestinale; producie insuficient de bilirubin (anemii aregenerative); tulburri de excreie urinar a pigmentului. Bilirubina Metoda Lugol Principiul metodei Oxidarea bilirubinei n biliverdin cu ajutorul iodului. Variaii patologice Bilirubinurie: icter mecanic; icter hepatocelular sub form de bilirubin direct (glicuronoconjugat). d. Acizi i sruri biliare Reacia Hay cu floare de sulf Principiul metodei Acizii biliari au proprietatea de a reduce tensiunea superficial a lichidelor n care sunt dizolvai. Prezena acizilor biliari n urin face ca tensiunea ei superficial s scad, iar floarea de sulf sedimenteaz. Variaii patologice

Prezena acizilor biliari i a srurilor biliare poart numele de colalurie care se ntlnete n urmtoarele situaii: ocluzia canalului coledoc (coninutul nu mai ajunge n intestin, se resoarbe n ficat, ajunge n snge i apoi n urin (icter obstructiv); leziuni anatomice i alterri funcionale hepatice (icter parenchimatos); nu apare n icterul hemolitic.