-Electroforeza proteinelor serice

-Imunofixarea proteinelor serice

- Metoda nefelometrica- determinarea cantitativa a lanturilor usoare k si

Electroforeza proteinelor serice

Principiul metodei
Electroforeza este metoda de separare a moleculelor proteice n funcie de sarcina electric i de
greutatea molecular. Metoda electroforetic se aplic probelor de ser, urinii i lichidului
cerebrospinal.
Viteza cu care proteina migreaza intr-un camp electric (mobilitatea electroforetica) este specifica
fiecarei proteine in parte si depinde att de proprietile proteinei de separat ct i de proprietile
soluiei n care se face separarea: pH, fora ionic a tamponului, temperatura i intensitatea curentului
electric.
A. n mediu acid:

B. n mediu alcalin:

Fig. 16. Migrarea electroforetic a unor proteine in funcie de sarcina electrica.

Electroforeza proteinelor serice

Materiale si metode
- aparatul semiautomat Hydrasys , SEBIA
- kit Hydragel 12;
- camer umed furnizat cu sistemul HYDRASYS;
- pipete: 10 L si 200 L
- densitometru / scanner capabil s citeasc geluri de 82 x 51 mm sau 82 x 102 mm la o lungime de
und de 570 nm sau cu filtru galben ;
Coninutul kit-ului:
- 10 geluri de agaroz;- 10 pachete ce conin fiecare cte doi burei cu tampon (fiecare burete conine tampon tris-barbital
pH 8.5 0.3);
- 1 recipient (60 mL) ce conine diluant pentru colorant;
- 1 recipient (20 mL) ce conine colorant amidoblack;
- 1 pachet cu 10 aplicatoare (fiecare aplicator conine cte 7, 15 i respectiv 30 de poziii);
- 1 pachet cu 10 buci de hrtie de filtru;
- 1 recipient (100 mL) ce conine soluie de decolorare.
- Fiecare gel conine: agaroz, 0.8 g/dL ; soluie tampon tris-barbital (pH 8.5 0.1).
- Bureii cu soluie tampon conin: tampon tris-barbital (pH 8.5 0.3); azida de sodiu.

Aplicarea probelor, poziionarea aplicatoarelor n camera umed, pregtirea modulului

de migrare i selectarea programului de migrare.

Aplicarea probelor, poziionarea aplicatoarelor n camera umed, pregtirea modulului

de migrare i selectarea programului de migrare.

Electroforeza proteinelor serice

Prezentarea si interpretarea rezultatelor
Rezultatele sunt prezentate sub 2 forme : scanare densitometrica si valori numerice pentru fiecare
fractiune (% si g/dl).

Prezentarea si interpretarea rezultatelor

Fractiune

Interval de ref.(%)

Interval
g/dL

Albumina

53.5 66.5

3.60 5.20

1- globuline

1.4 -4.0

0.10 0.30

2- globuline

8.0 15.7

0.50 0.90

1- globuline

5.6 12.1

0.60 0.80

2- globuline

1.8 7.2

0.20 0.40

-globuline

7.9 18.9

1.00 1.60

de

ref.(conc.)

Electroforeza proteinelor serice

Proteinele identificate in cele 6 fractiuni majore separate prin electroforeza
Fractiunea electroforetica majora

Tipul de proteina

Albumina

prealbumina

1-globuline

1-glicoproteina acida ( orosomucoidul)

1-antitripsina
1-lipoproteinele (HDL)
1-antichimotripsina
protrombina

2-globuline

2-macroglobulina
haptoglobina
antitrombina III

1- globuline

Transferina
- lipoproteine (LDL)
transcobalamina II
hemopexina

2- globuline

Proteina C reactiva
Complement C3
2- microglobulina
2- glicoproteina I si III
IgA

- globuline

Fibrinogen
IgG
IgA
IgM

Modificarile ce pot aparea intr-o migrare electroforetica la

nivelul fractiunilor majore
Bisalbuminemia se poate datora unor mutatii ereditare fara sa aiba consecinte patologice
- dobandita (tranzitorie) datorata unei pancreatite sau tratamentului cu doze mari de
lactam

Hiperalbuminemia- este intalnita cel mai des la pacientii spitalizati care au beneficiat de perfuzii cu
albumina
Hipoalbuminemia- se poate datora unei subnutritii severe, unei sinteze scazute a acesteia ( insuficienta
hepatocelulara, inflamatie), sindrom nefrotic, hipercatabolism ( endocrinopatii dobandite).

Sindrom inflamator acut

Sindromul inflamator acut este asociat cu valori crescute ale fractiunii 2- globulinice si
valori scazute ale albuminei. Acest proces este datorat cresterii proteinelor de faza acuta:
1- antitripsina si haptoglobina .

Lanturi usoare

Prezenta lantului usor in aceasta zona de migrare a fost confirmata prin dou metode: imunofixarea
proteinelor serice si metoda nefelometrica.

Sindrom nefrotic
Sindromul nefrotic este asociat cu :
- valori crescute ale fractiunii 2-globuline lor datorate 2- macroglobulinei
- hipoalbuminemie
- valori crescute ale fractiunii -globulina
- hipogamaglobulinemie.

Ciroza alcoolica
In ciroza alcoolica supraproductia de IgA si IgM duce la fuzionarea fractiilor si
creand un aspect al electroforegramei de bloc

Hipogamaglobulinemia
Apare in imunodeficienta primara sau in imunodeficienta secundara datorata tratamentului cu
corticosteroizi, imunosupresoare, chimio si radioterapiei.
Aspectul de hipogamaglobulinemie mai este prezent si in cazul mielomului multiplu micromolecular
cand in urina se identifica proteine Bence Jones

Hipergamaglobulinemia
Aspectul este de crestere difuza a fractiunii gama datorata in principal bolilor hepatice,
infectiilor bacteriene si parazitare sau bolilor autoimune

Proteina M
Proteina M - se prezinta sub forma unei benzi bine delimitate iar aspectul pe
electroforegrama este acela al unui pic ascutit cu baza ingusta. Apare in neoplaziile
limfoproliferative ( mielom multiplu).

Proteina M

Proteina M

Imunofixarea proteinelor serice

Principiul metodei
Imunofixarea proteinelor serice consta in doua etape:
A. Separarea electroforetica in mediu alcalin, la un pH de 9.1, a proteinelor serice;
B. Imunoprecipitarea folosind antiseruri monospecifice.
Imunoprecipitarea este rezultatul interactiunii antigenelor cu anticorpii specifici intr-un mediu suport
care poate fi un gel de agaroza sau un mediu lichid.
Factorul cel mai important in acest proces este natura bivalenta a moleculelor de anticorp care
reactioneaza cu epitopii multipli ai antigenului solubil.

Materiale, echipamente i accesorii necesare:

- kit Hydragel 1IF, 2 IF, 4 IF sau 9 IF furnizate de SEBIA;
- sistem semiautomat HYDRASYS 2 SEBIA;
- camer umed furnizat cu sistemul HYDRASYS;
- pipete: 10 L si 200 L;
-masc standard SEBIA;
- Fiecare kit este nsoit de un set de antiseruri monospecifice: anti lanuri grele ,, i anti lanuri usoare
i care formeaz complexe imunoprecipitante cu proteinele anormale separate electroforetic.
Coninutul kit-ului:
-10 geluri de agaroz;
-10 pachete ce conin fiecare cte doi burei cu tampon (pH 9.1 0.3);
-1 recipient (60 mL) ce conine diluant pentru colorant;
-1 recipient (20 mL) ce conine colorant amidoblack;
-1 recipient (32 mL) ce conine diluent (soluie alcalin pH 7.5 0.3 i bromfenol albastru) i este utilizat pentru diluia
probelor;
-1pachet cu 10 aplicatoare (fiecare aplicator conine cte 7, 15 i respectiv 30 de poziii);
-1 pachet cu 10 buci de hartie de filtru fin;
-1 pachet cu 10 buci de hrtie de filtru pieptn;
-1 recipient (100 mL) ce conine soluie de decolorare.
-1 recipient de 14,4 ml cu soluie de fixare;
-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lan greu gama;
-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lan greu miu;
-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lan greu alfa;
-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lan usor kappa;
-1 recipient de 8 ml cu antiser anti lan usor lambda.
-1 pachet cu 10 buci de hartie de filtru groas;

Imunofixarea proteinelor serice

Pentru fiecare caz este necesar sa se aplice cate 10 l de proba diluata in sase godeuri dupa cum
urmeaza: ELF, IgG, IgA, IgM, si .
Inainte de a se incepe separarea electroforetica a proteinelor, proba trebuie diluata, pentru
fiecare tip de lant greu si lant usor existand o anumita dilutie standard prezentata in tabelul de mai jos.
Tipul de Ig

Cantitatea de ser si diluant

Electroforeza tuturor proteinelor

30 l ser + 60 l diluant

IgG

20 l ser + 100 l diluant

IgA, IgM, ,

30 l ser + 60 l diluant

Dilutii speciale: pentru valori ale IgG > 20 g/l se recomanda dublarea cantitatii de diluant
pentru valori ale IgG < 5 g/ l se recomanda reducerea la jumatate a cantitatii de
dilaunt

Imunofixarea proteinelor serice

Mod de lucru:
- Aplicarea probei: in decurs de 2 minute se pun cate 10 l de ser diluat in cele 6 godeuri, primul
godeu corespunde unei migrari electroforetice normale iar celelalte godeuri corespund celor trei tipuri
de lant greu (, si ) si celor dou tipuri de lant usor si ;

Aplicarea probelor n godeurile de pe aplicator i poziionarea aplicatorului n camera umed.

Aplicarea soluiei de fixare i a antiserurilor.

n cele 6 godeuri corespunztoare unei singure probe sunt adugate dup cum urmeaz: soluie de
fixare (40 l), i cte 25 l de antiser anti lan , antiser anti lan , antiser anti lan , antiser anti
lan , antiser anti lan .

Imunofixare- interpretare
Rezultatele sunt calitative si permit identificarea tipului de lant greu (H) si lant usor (L)
al unei proteine monoclonale.

Imunofixare- interpretare
Rezultatele sunt calitative si permit identificarea tipului de lant greu (H) si lant usor (L)
al unei proteine monoclonale.

Imunofixare- interpretare

Cuantificarea lanturilor libere usoare k si prin metoda

nefelometrica
Principiul metodei:
Nefelometria masoara intensitatea luminii dispersate de catre un complex Ac-Ag.
Fasciculul de lumina trece prin cuva de reactie in care se afla complexul Ac-Ag iar lumina
dispersata de acest complex este detectata de catre un fotodetector situat la un unghi < 90 0
fata de unghiul initial al fasciculului de lumina. Cantitatea de lumina dispersata este corelata cu
concentratia proteinei de analizat.
In timpul reactiei in vitro, lantul usor se leaga de anticorpul policlonal conjugat cu latex cu
specificitate pentru epitopii expusi pe lanturile usoare libere.
Reactivi necesari:
Kitul FREELITE compatibil cu nefelometrul Dade-Behring BNProSpec care contine:
a) anticorpi policlonali anti k si uman conjugati cu latex;
b) Calibrator ( ser uman ce contine lant policlonal kapa si lambda )- pana in prezent nu exista
un calibrator universal care sa permita realizarea unui control de calitate extern;
c)seruri control +/- (nivel scazut si ridicat).
Fiecare serie de reactivi are propriul calibrator si control.
Reactivi suplimentari: tampon de reactie, diluant.

Cuantificarea lanturilor libere usoare k si prin metoda

nefelometrica
SER

Interval de
referinta

Lant liber k

3.30-19.40 mg/L

Lant liber

5.71-26.30 mg/L

Raport k/

0.26- 1.65

Evolutia in dinamica a unui pacient diagnosticat

cu mielom de tip IgG,
Data

Componenta
monoclonala
g/dl

g2

IgG
mg/dl

K
mg/l

mg/l

R
k/
k/

gama2-2.77

36.5

30.4

<0.119

1160

4.34

1090

0.003

16.6

753

0.022

gama 2- 3.63

7.8

37.74

28.8

1270

0.022

gama2-0.83

45

18.3

12.5

148

0.084

4.63

3.4

18.7

0.18

Separarea electroforetica in gel de agaroza(poz nr.2)

MO 32-33%

Electroforeza nu a mai
identificat prezenta componentei
monoclonale

Imunofixarea proteinelor serice in gel de agaroza

Varsta : 45 ani
21.46 luni post t
autotransplant

29.86 luni post t.

16.8 luni post t

MO 3%
MO 6%

VAD

VELCADE

ZOMETA

LENALIDOMIDA

MO 11-12% celule mieloide

ELF: 2.88 g/dl- 2 globuline
6 luni de la diagnostic : autotransplant
5 luni dupa transplant:
- ELF proteina M
- k normal
- raportul / a scazut cu 27 %
11.5 luni dupa transplant
- ELF normala
- k sub intervalul de referinta
- raportul / crescut
16.8 luni dupa transplant:
- ELF normala
- k si raportul / recadere
21.46 luni ELF proteina M
29.86 luni- ELF si lantul k remisiune
34.6 luni- recadere