Metabolism proteic I Proteine

Clasificarea proteinelor
Holoproteine sferoproteine: globuline, albumine scleroproteine: colagen, keratina, elastina Heteroproteine glicoproteine lipoproteine nucleoproteine

Rolul proteinelor
Rol plastic Rol enzimatic Rol hormonal Rol imunitar Rol homeostatic - coagulare i fibrinoliz, echilibru hidroelectrolitic, acido-bazic

Proteinele totale
Valori normale: 6,5 8,5 g/dl
Hiperproteinemia
real aport alimentar proteic crescut, plasmocitoame, tumori secretante de paraproteine pseudohiperproteinemia deshidratri, sdr. de hemoconcentraie

Hipoproteinemia
real scderea aportului, scderea absorbiei intestinale, scderea sintezei interne, pierderi proteice, sechestrare proteic, hipercatabolism proteic pseudohipoproteinemia hiperhidratri, sdr. dr hemodiluie

Metode de investigaie a proteinelor plasmatice

Condiii de recoltare: Dimineaa dup repaus alimentar nocturn Recoltare fr staz (presiunea hidrostatic crescut n vas duce la extravazarea lichidului n interstiiu i apariia hemoconcentraiei) Fr hemoliz se folosesc ace corespunztoare Dac se dorete repetarea analizei, condiiile la cea de-a doua recoltare trebuie s fie similare celor de la prima recoltare. Reacia biuretului (valoare istoric) cuprul bivalent se leag de legturile peptidice i determin apariia unei coloraii albastre cuantificabil spectrofotometric. Intensitatea culorii este direct proporional cu concentraia proteinelor. Valori normale: 6,5 -8,5 g/l proteine totale serice albumine/globuline=1,3 - 1,5 Valori fals crescute la valori mari ale bilirubinei (peste 5mg/dl), hemoglobinei i trigliceridelor (peste 1000 mg /dl)

Separarea proteinelor plasmatice

1. Ultracentrifugare - n funcie de constanta de sedimentare, prin variaia forei centrifuge.

Separarea proteinelor plasmatice

2. Electrodifuzie - analiz calitativ care se face n funcie de sarcina electric global, de masa molecular i de pH-ul soluiei
Noiuni:
pH izoelectric al substanei - pH-ul soluiei la care sarcina electric global a unei substane este 0 pHs > pHi sarcin global negativ pHs < pHi sarcin global pozitiv pHs pt proteinele serice este de 8,6 (>pHi) proteinele sunt ncrcate negativ se vor deplasa spre Anod cu o vitez I.P. cu masa molecular Ordinea fraciunilor proteice va fi dinspre A spre K albumine, globuline, alfa1, alfa2, beta, gama.

Separarea proteinelor plasmatice

Mediile de migrare: Gel : agar, agaroz, n care migrarea poate dura pn la 24 ore Folii de acetat de celuloz i poliacrilamid dureaz 2-3 ore Hrtii de filtru Placa obinut se compar cu o plac standard, evalund grosimea benzilor, intensitatea culorii benzii (la hrtiile de filtru) i sediul migrrii.

Separarea proteinelor plasmatice

Un comportament normal la electroforez = euproteinemie

6 - 8,5 g de proteine totale : Albumine : 50 60 % (3,5 5,5 g) Alfa 1 globuline : 3-4% Alfa 2 globuline : 6-9% Beta globuline : 10 - 12 % Gama globuline : 18 - 20 % Fibrinogenul : 200 450 mg/dl

Separarea proteinelor plasmatice

3. Imunodifuzia are la baz reaciile de precipitare Ag-Ac in mediu solid sau lichid. Precipitarea n solid (difuzia n gel) este de 3 tipuri: Simpl Ac e fix, Ag difuzeaz (IDRS / Mancini) Dubl Ag migreaz spre Ac i Ac spre Ag Migrarea n cmp electric (imunoelectroforez)

Separarea proteinelor plasmatice

Difuzia simpl (imunodifuzia) IDRS sau Mancini
este o metod sensibil, putnd detecta concentraii de pn la 2 g/ml, ns are dezavantajul c necesit timp (1-3 zile pt difuzia complet) i trebuie lucrat manual. Se utilizeaz pentru dozarea Ig, PRC, a fraciunilor C

Este o reacie semicantitativ. Metod:

Pe placa, cu gel de agaroz turnm serul cu anticorpii (se tiu cantitatea de ser i concentraia de anticorpi) Serul bolnavului se pune ntr-un godeu pe placa cu gel de agaroz. Datorit prezenei anticorpilor n gel i migrrii Ag din serul pacientului, n jurul godeului apare un inel de precipitare al crui diametru este direct proporional cu concentraia de antigen.

Separarea proteinelor plasmatice

Imunoelectroforeza este o migrare n cmp electric combinat cu o reacie imun antigen-anticorp (Ag-Ac) Metoda: Se realizeaz n dou etape: placa se mparte n 2 inferior ser normal i superior ser de la bolnav, separate ntre ele printr-un an n care se pune Ac antiprotein. Se las s difuzeze normal Ac i Ag, apoi se introduce n cmp electric. Fiecare arc de precipitare corespunde unei anumite proteine din complexul pe care l cutm Exist rigle pe care sunt desenate arcurile de precipitare normale care se suprapun pe plac i vedem dac arcurile obinute sunt normale sau patologice.
Este o reacie calitativ i are o durat de lucru mare : 24-72 de ore Se utilizeaz pentru confirmarea prezenei unor proteine anormale gamapatii monoclonale i de asemenea pentru confirmarea absenei unor proteine normale (afibrinogenemie, atransferinemie, abetalipoproteinemie). Avantaje: Determin clasa i tipul de Ig n gamapatiile monoclonale Detecteaz proteinuria Bence-Jones Dezavantaje Nu detecteaz componentele monoclonale n cantiti mici Nu detecteaz lanurile uoare ale IgM

Separarea proteinelor plasmatice

Separarea proteinelor plasmatice

4. Electroforeza capilar
Metod intermediar ntre electroforeza clasic i cromatografia lichid Principiu: moleculelor proteice poart ncrcturi electrice diferite i sunt separate lor prin fluxul electroosmotic. Sistemul are 8 capilare ce funcioneaz n paralel realiznd 8 analize simultan. Proba diluat cu tampon este preparat i injectat prin aspiraie n zona anodic. La un voltaj mare separarea proteinelor va fi citit direct la 200 nm, n partea catodic a capilarului.

Probele trebuie depozitate la o temperatur ntre 2 i 8 grade. n aceast perioad valorile C3 i ale fraciunii beta vor scade progresiv, vor apare nici fraciuni n zona gamma i alfa2.

Separarea proteinelor plasmatice

5. Nefelometria
Metoda cea mai folosit n prezent Funcioneaz pe baza reaciei Ag-Ac, unde Ag sunt considerate n acest caz proteinele plasmatice, iar Ac sunt reprezentai de Ac antiprotein uman. Dac nu exist complexe Ag-Ac, fasciculul de lumin trece nedeviat i e captat de detectorul de transmisie. Dac se formeaz complexe, unele raze sunt deviate i sunt captate de detectorul de difuzie.

Exist dou submetode: Turbidimetria apreciaz concentraia de Ag n funcie de cantitatea de lumin captat de detectorul de transmisie Nefelometria propriu-zis apreciaz ct lumin e deviat i captat de detectorul de difuzie. Ulterior se face corelaia ntre cantitatea de lumin captat i concentraia Ag (respectiv a proteinelor) Metoda este rapid, sensibil, automatizat, dar este scump.

Separarea proteinelor plasmatice

Zona albumine i alfa1 gamaglobuline :
Prealbumina; Albumina; Alfa1-antitripsina; Alfa1-glicoproteina acid; Componente ale complementului (C5); Alfa-fetoproteina; Protrombina.

Separarea proteinelor plasmatice

Zona alfa2:
Haptoglobina; Ceruloplasmina; Alfa2 macroglobulina; Colinesteraza; Alfa2 antitrombina; Plasminogenul; Transcortina; Eritropoietina; Componentele C1,C4,C6,C9 ale complementului; Lipoproteine.

Separarea proteinelor plasmatice

Zona beta :
Beta2 microglobulina; Transferina; Imunoglobuline; Lizozim; Beta-lipoproteinele.

Separarea proteinelor plasmatice

Zona gama:
Proteina C reactiv Fibrinogenul Imunoglobuline

Imunoglobulinele
Imunoglobulina A:
60-400 mg/dl Rol important in imunitatea mucoaselor (se secreta 3-5 g de IgA zilnic in lumenul intestinal), prevenind colonizarea cu agenti patogeni Prezent in secretiile digestive, genito-urinare, lacrimale, saliva, laptele matern, etc. Are 2 subclase IgA1 si IgA2, poate exista si in forma de dimer IgA secretorie (rezistenta la actiunea enzimelor digestive)

Valori crescute - de obicei policlonale: Mielom gama-A, ciroza hepatica (alcoolica), LES, PAR cu titluri inalte de FR, sarcoidoza Valori scazute: Izolate teleangiectazia ereditara, disgamaglobulinemie tip III, malabsorbtie, CH, LES, macroglobulinemie Waldenstrom Policlonale agamaglobulinemie, aplazie timica ereditara, disgamaglobulinemie tip I (scad IgG si IgA si cresc IgM), disgamaglobulinemie tip II (IgA si IgM absente, niveluri normale de IgG), la sugar si copii

Imunoglobulinele
Imunoglobulina D
0-14 mg/dl Exprimata pe suprafata LB imature (nu au fost expuse la antigeni) alaturi de IgM sau regasita libera in ser ca monomer Rol in activarea LB, bazofilelor si mastocitelor Valori crescute infectii acute/cronice acutizate, boli autoimune Valori scazute deficite ereditare, imunodeficienta dobandita, mielom non IgD, la sugar si copil mic

Imunoglobulinele
Imunoglobulina M
60-300 mg/dl Exprimata pe suprafata LB sau libera in ser Poate forma polimeri (2 pana la 6 IgM) difuzeaza greu in interstitiu si nu traverseaza bariera placentara - Primii Ac ce apar in cursul unei infectii, reaparand la expuneri ulterioare la acelasi germene - Ex aglutininele - Implicati in reactiile de hipersensibilitate tip II si V dupa clasificarea Coombs si Gell

Valori crescute afectiuni hepatice, infectii acute/cronice acutizate

Valori scazute hipoproteinemii, mielom nonIgM, nou nascut

Imunoglobulinele
Imunoglobulina E
7-15 mg/dl Indica prezenta de afectiuni parazitare sau alergice Valori crescute boli atopice, parazitoze Valori scazute - deficiente ereditare, imunodeficienta dobandita, sdr ataxieteleangiectazie, mielom non IgE Valorile normale nu exclud aparitia simptomelor crize astmatice cu nivel normal de IgE -Ag e recunoscut de Ig, cu activare secundara a mastocitelor, bazofilelor, degranularea acestora cu eliberare de mediatori proinflamatori severitatea reactiei poate merge pana la instalarea starii de soc (soc anafilactic reactie de hipersensibilitate tip I)

Imunoglobulinele
Imunoglobulina G 700-1500 mg/dl
Este produsa de LB Reprezinta aprox 75% din Ig serice Implicata in raspunsul imun secundar/tardiv Singurul izotip de Ig care poate trece prin placenta, conferind protectie imuna in utero (subclasele 1,3,4; subclasa 2 nu traverseaza placenta) e asociat cu reactiile de hipersensibilitate de tip II si III precum si afectiunile autoimune (tip V)

Valori crescute: sarcoidoza, hepatite cronice, boli autoimune, parazitoze, infectii cronice
Valori scazute: sdr cu pierdere de proteine, sarcina, mielomul non IgG, macroglobulinemia Waldenstrom

Structura imunoglobulinica

Lanturi grele rosu si albastru Lanturi usoare verde si galben Ig intre 7 domenii si 9 domenii (domenii constante si variabile)

Modele proteice
- Inflamaia acut Proteine totale normale sau uor crescute; Albumine normale (Excepie: inflamaiilor acute din arsuri ntinse cnd avem hipoalbuminemie); Alfa1 i alfa2 globulinele sunt crescute, mai ales alfa2 caracteristica reaciei inflamatorii acute; Beta i gama globulinele sunt normale; Fibrinogenul crescut; VSH-ul crescut; Prezena proteinei C reactive.

Modele proteice
- Inflamaia cronic Proteine totale normale sau uor crescute; Albumine normale (Excepie: inflamaiilor acute din arsuri ntinse cnd avem hipoalbuminemie); Alfa1 i alfa2 globulinele normale. Valorile crescute arat un episod de acutizare a afeciunii cronice; Gama globulinele crescute; Fibrinogenul crescut; VSH-ul crescut; Prezena proteinei C reactive valorile ei crescute nu sunt caracteristice.

Modele proteice
- Sdr. nefrotic Proteinele totale sczute; Albuminele sczute; alfa 1 globulinele normale (initial) sau sczute (tardiv); alfa 2 globulinele i beta globulinele pot fi normale sau crescute cretere n band (nu trec prin filtrul glomerular); gama globulinele pot fi normale (sdr. nefrotic pur), sczute (sdr. nefrotic impur) sau chiar crescute (patologii autoimune cu hipergamaglobulinemie); lipidele plasmatice, colesterolul crescute.

Modele proteice
- Hepatita acuta proteinele totale sunt normale; albuminele normale spre limita inferioar, dar pot fi i sczute n funcie de severitatea afectarii hepatice (au un turn-over de 21 zile, scderea sintezei hepatice poate fi mascat de nivelul de albuminele existent n momentul declanrii bolii); alfa 1 i alfa 2 globulinele normale; beta globulinele normale n fereastra imunologic, ulterior crescute prin IgM (pot migra i n spectrul alfa 2 i n beta, eventual asociate cu IgA n hepatitele alcoolice); gamma globuline normale n faza de debut i crescute tardiv, cnd se face virajul imunologic;

Modele proteice
- Hepatita cronica proteine totale normale; albumine normale (HC incipiente) sau sczute (HC decompensate parenchimatos); alfa 1 i alfa 2 globulinele normale; beta globuline normale sau crescute n cazul unei hepatite cronice acutizate; gama globuline crescute cu cretere moderat policlonal n cirozele de etiologie viral;

Modele proteice
- Ciroza hepatica proteine totale sczute; albumine sczute prin scderea sintezei; alfa 1 i alfa 2 normale la limita inferioar sau sczute; beta globuline crescute; gama globuline cretere moderat sau sever, de obicei policlonal IgG, IgA, IgM; Ig crescute catabolism sczut i untarea pasajului hepatic;

Proteine anormale
AFP - alfa-1-fetoproteina serica
globulina prezenta in sangele fetal sintetizata in ficat, tractul GI, sacul vitelin prezen fiziologic la ft i n primul an dup natere, precum i la gravide

AFP in serul matern - Dozarea trebuie combinata cu determinarea gonadotrofinei corionice si estriolului neconjugat cand varsta mamei >35 ani Scazuta in: trisomie 21, trisomie 18 coriocarcinom sarcina molara femeile cu DZ au valori cu 20-40% mai reduse decat femeile nediabetice Crescuta in: sarcina gemelara rasa (10-15%> la negri) defecte de tub neural spina bifida deschisa, anencefalie, mielocel defecte de perete abdominal tetralogie Fallot sdr Turner cauze materne neoplasme hepatice, ciroza hepatica

La adult AFP: - Marker tumoral pentru hepatom, tumori testiculare si ovariene (carcinom embrionar, teratom malign), neoplasme pancreatice, gastrice - n hepatite cronice, ciroze hepatice i convalescena dup hepatita acut.
Cresterile asociate cu conditii patologice nonmaligne sunt temporare, valorile scazand ulterior, in timp ce in afectiunile maligne cresterea valorii plasmatice continua Valoare > 50ng/ml este diagnostica pentru o tumora secretanta de AFP

Proteine anormale
Antigenul carcinoembrionar - ACE intrauterin are rol n diferenierea celulelor tubului digestiv; La adult util in monitorizarea cc. colonic recurent sau metastatic dupa interventia chirurgicala, cc mamar, pulmonar, hepatic, pancreatic ACE reflecta masa tumorala nu e recomandat in screening datorita sensibilitatii si specificitatii scazute in stadiile incipiente ale afectiunilor maligne Alte afectiuni cu ACE crescut: Boli inflamatorii nonmaligne - colita ulcerativa, enterita, diverticulita, hepatita cronica, ciroza hepatica, insuficienta renala Valoare diagnostica peste 2,5 ng/ml

Proteine anormale
Gonadotrofina corionic este secretat de sincitiotrofoblast, atinge valoarea maxima in S 811 si scade la minim in S 18, ramanand cst pana la sfarsitul sarcinii Utilizari: - cel mai bun marker izolat pentru screeningul sdr Down - diagnosticul precoce al sarcinii - diagnosticul tumorilor germinative si cuantificarea eficientei terapiei acestora Rezultate fals pozitive la: pacientii postorhiectomie secundar scaderii testosteronului fumatorii de marijuana

Proteine anormale
CA 15-3, BR 27, BR 29 - detectarea recurentei cc mamar si monitorizarea raspunsului la tratament; modificarea semnificativa este de +/- 25%
CA 19-9 crescut in cc pancreatic (70-100%), pancreatita, cc gastric, hepato-biliar CA 27-29 monitorizarea recurentei cc mamar CA 125 creste in afectiuni benigne sau maligne care stimuleaza sinteza peritoneala cc ovarian, endometrial, LMNH, cc pancreatic, hepatic, pulmonar, conditii de afecteaza endometrul (sarcina, menstruatie, endometrioza), inflamatii peritoneale, pleurale