Proteinele plasmatice. Importanta lor in diagnostic.

Metode de dozare. Notiuni de proteomica

 Obiective

1. Cunoasterea principalelor clase de proteine prezente in ser si a importantei lor in diagnosticul

medical.
2. Cunoasterea principalelor metode de identificare si dozare a proteinelor din materialele biologice.
3. Formarea manualitatii si insusirea principiului metodei de dzare in laborator a proteinelor totale
din ser prin metoda biuretului.
4. Cunoasterea principiului electroforezei proteinelor serice si identificarea principalelor clase de
proteine serice separate prin electroforegrama.
5. Cunoasterea principalelor markeri proteici folositi uzual in diagnosticul clinic.
• Proteinele reprezinta compusi esentiali ce stau la baza tuturor proceselor care au
loc in celulelel vii.
• Ele sunt prezente in diferite fluide biologice.
• Plasma contine peste 300 de proteine cu diferite functii in organism (transportori,
enzime, hormoni, anticorpi, factori ai coagularii etc), sediul sintezei majoritatii
proteinelor serice este ficatul.
• In scop diagnostic cel mai des determinate sunt proteinele serice.
 Proteinele serice totale
• Dozarea proteinelor serice
masoara toate proteinele serice
circulante, concentratia
proteinelor totale putand
prezenta atat variatii fiziologice
dar si patologice.
• Testul este utilizat in
screening si pentru investigarea
statusului nutritional sau in
afectiuni insotite de schimbari
ale volumului plasmatic (soc,
deshidratare sau hemodilutie).
Principiul metodei
• Metoda biuret este cea mai folosita in dozarea proteinelor totale si
metoda recomandata de Federatia Internationala de Chimie Clinica.
• Tehnica are la baza reactia dintre ionii de cupru (Cu2+) si grupul de
aminocizi implicati in legatura peptidica in mediul alcalin, cu formarea unui
complex colorat in violet.
• Intensitatea culorii complexului colorat format se va masura la 540nm si
va fi comparata cu cea a unui ser standard cu o concentratie a proteinelor
cunoscuta.

Materialul biologic:
• Se foloseste de preferinta ser dar se poate utiliza si plasma.
• Serul este stabil timp de 24 de ore la temperatura camerei, 1 saptamana la 2-
8 C sau 1 luna la - 20 C.
0 0
 • Limitele de referinta pentru proteinele serice totale sunt: 6.5 – 8.5g/dl (pentru
adulti)
• Variatii fiziologice: scaderi ale valorii serice a proteinelor totale se intalnesc in
ultimul trimestru de sarcina.
• Variatii patologice: deshidratarea, diareea, mielomul multiplu si alte gamapatii
(boli ale imunoglobulinelor) sunt insotite de o crestere a proteinelor serice totale
(hiperproteinemie). Scaderea valorii proteinelor totale (hipoproteinemia) este
asociata cu scaderea concentratiei de albumina.

• Proteinele din ser se pot grupa in doua mari categorii:

1.Albumina: reprezinta peste 60% din proteinele plasmatice,
2.Globulinele: sunt patru clase de globuline fiecare cuprinzand proteine cu functii si
proprietati specifice (α1,α2, β, γ globuline),
 Albumina
Este o proteina globulara sintetizata in ficat, se gaseste atat in spatiul intravascular cat si in fluidele
interstitiale. Se gaseste in concentratie crescuta in plasma unde este responsabila de:
- aproximativ 80% din presiunea coloidosmotica ce mentine echilibrul fluidelor intre
compartimentele organismului,
- leaga si transporta prin sange diferiti compusi (bilirubina neconjugata, fierul, aspirina, hormonii
tiroidieni, medicamente etc)
- participa la mentinerea pH-ului, actionand ca si sistem tampon,
- este o proteina de faza acuta negativa (scade la pacientii ce prezinta afectiuni acute),

• Proprietatea albuminei de a lega diferiti compusi este utilizata in dozarea acesteia prin metode
de legare a diferitilor coloranti precum (albastru de brom fenol, Ponceau S, verde de brom crezol
etc)
 • Limitele de referinta pentru albumina serica sunt: 3.5 – 5.0g/dl (pentru
adulti)
• Cresterea concentratiei albuminei serice (hiperalbuminemia) are o importanta
diagnostica scazuta, se intalneste frecvent in deshidratare. Scaderea nivelului
albuminei serice (hipoalbuminemia) este frecvent intalnita in boli ce afecteaza:
- sinteza – afectiunile hepatice,
- catabolismul (degradarea) crescut al albuminei,
- absorbtia deficitara a aminoacizilor,
- malnutritia (aport proteic insuficient),
- pierdere renala de proteine (proteinurie de origine glomerulara), la nivel intestinal
(enteropatii), sau prin plasma (arsuri intinse).
 Electroforeza proteinelor serice
• Atunci cand valoarea proteinelor totale si respectiv a albuminei indica o modificare
patologica se utilizeaza electroforeza proteinelor serice in vederea precizarii patternului
fiecarei clase de proteine prezente in ser.
• Electroforeza este o tehnica ce se bazeaza pe incarcatura electrica diferita a proteinelor
prezente in ser.
• Datorita caracterului lor amfoter proteinele vor avea o
sarcina electrica ce depinde de pHul mediului si
compozitia acestuia si vor migra in camp electric pe
distante diferite (in functie de volumul moleculei proteice si
de marimea sarcinii) atrase de electrodul cu polaritate
opusa.
• Mediul de migrare este asigurat de catre o solutie
tampon in care se plaseaza suportul de migrare in care vor
fi incarcate probele test. Suportul solid de migrare care
asigura o buna rezolutie este gelul de agaroza.
• Folosirea unui sistem tampon de migrare cu pH 8.5
permite separarea proteinelor serice in 6 fractiuni
(albumina,α1, α2, β1, β2, γ).
Benzile separate se coloreaza cu un colorant proteinofil, cel mai utilizat este amidoblack.
Intensintatea benzilor este masurata cu un software special.
• Valorile de referinta pentru fiecare fractiune in parte sunt:
1. albumina – 53-63% (3,5-5g/dl)
2. α1 globuline- 2.5 – 5% (0.1-0.3g/dl)
3. α2 globuline – 7-13% (0.6-1g/dl)
4. β globuline – 8-14% (0.7-1.1g/dl)
5. γ globuline – 12-22% (0.8-1.6g/dl)
 Tabel1 Benzile de migrare electroforetica a proteinelor serice (modificat dupa Bishop, 2010)
Proteina Functie. Importanta diagnostica
albumina Indicator al starii de nutritie, transportor in sange al unor medicamente si compusi, sintetizata de
catre ficat
α1 globuline
α1antitripsina Reactant pozitiv de faza acuta, inhibitor al proteazelor. deficitul congenital determina aparitia
emfizemului pulmonar
α1 fetoproteina Se secreta in cantitati mici dupa nastere, nivelul crescut apare in spina bifida si unele tumori
α1 glicoproteina acida Reactant de faza acuta, marker in bolile inflamatorii
(orosomucoidul)
α2 globuline
Haptoglobinele Reactanti pozitivi de faza acuta,
- ceruloplasmina -transporta cupru, lipseste in boala Wilson
- α2 macroglobulina -creste in nefroze, boli hepatice, boli inflamatorii, administarea de anticonceptionale
β globuline
transferina Transporta fier, creste in anemia feripriva
β2 microglobulina Component al antigenului leucocitar uman (HLA), creste in bolile inflamatorii (poliartrita
reumatoida, lupus)
Hemopexina Leaga HEM-ul, este reactant pozitiv de faza acuta (creste in inflamatie) sintetizata in ficat, nivel
crescut se mai intalneste in bolile maligne, distrofie musculara. Scade in anemia hemolitica
Complementul seric (C4,C3) Sintetizate de catre ficat, intervin in apararea imuna. Creste in bolile inflamatorii , scad in
malnutritie si anemie hemolitica
Proteina c reactiva Sintetizata de catre ficat, reactant pozitiv de faza acuta ce creste in bolile inflamatorii
γ globuline
ImunoglobulineleA,D,E,G,M Scaderea imunoglobulinelor (hipo-gamaglobulinemie) se intalnesc in bolile limfoproliferative
(leucemii limfatice cronice, limfoame). Cresterea se intalneste in boli hepatice cronice, boli de
colagen, neoplasme.
 Proteinele de faza acuta

• Sunt proteine ce isi modifica valoarea serica ca urmare a mecanismelor de aparare initiate de
organism in urma unor agresiuni (inflamatii, infectii, traumatisme, tumori maligne etc). Proteinele de
faza acuta pozitive sunt cele a caror concentratie creste in raspunsul acut iar cele negative sunt cele
care scad ca urmare a unei agresiuni acute.
• Exemple de proteine de faza acuta pozitive sunt: fibrinogenul, proteina C reactiva (CRP), α1-
glicoproteina acida (orosomucoidul).
• Exemple de proteinele de faza acuta negative sunt: albumina, α1-fetoproteina.
• Proteina C reactiva (CRP) este sintetizata de catre ficat si are rolul de a indeparta toxinele
eliberate prin degradarea celulara.
• Valoarea ei creste seminificativ (de mii de ori fata de valoarea normala) in primele 6 ore de la
debutul unui fenomen inflamator, reprezentand cel mai sensibil marker de faza acuta.
• Concentratia acestei proteine ofera informatii despre intinderea si severitatea procesului
inflamator si este util in monitorizarea terapiei unor afectiuni inflamatorii precum poliartrita
reumatoida.
 Imunoglobulinele

• Sunt glicoproteine produse de catre plasmocite si au rol in recunoasterea si distrugerea

antigenelor (bacterii, virusuri, toxine etc) si intervin astfel in apararea organismului.
• IgG (imunoglobulinele G) reprezinta principala forma prezenta in ser, traverseaza activ placenta
contribuind la protectia imuna a fatului. Se formeaza in cursul raspunsului imun secundar.
• IgM (imunoglobulinele M) se formeaza in cursul raspunsului imun primar si cresterea nivelului
lor in ser indica o infectie recenta.
• IgA (imunoglobulinele A) se gasesc in cea mai mare parte in umori lapte, saliva , lacrimi si la
nivelul mucoaselor tractului respirator, digestiv si urinar. Sunt produse de catre tesutul limfatic asociat
mucoaselor tractului respirator, digestiv avand rol de aparare la acest nivel prin impiedicarea legarii
agentilor patogeni pe suprafata acestor mucoase si patrunderea lor in organism.
• IgE (imunoglobulinele E) se gasesc in ser in concentratii foarte mici, fiind degradate rapid (2
zile). Ele participa la declansearea unui raspuns imun imediat (anafilactic) la contactul cu un alergen.
La persoanele atopice (predispuse la alergii) productia de IgE este exagerata. IgE cresc si in bolile
autoimune, parazitoze intestinale sau mieloame (boala maligna caracterizata prin proliferarea
plasmocitelor la nivelul maduvei osoase) cu IgE.
 Alti markeri proteici cu importanta in diagnosticul clinic

• Mioglobina este un marker utilizat in diagnosticul infarctului miocardic. Este o

proteina globulara ce se gasete localizata intracelular si eliberata in circulatia
sanguina atunci cand muschiul este lezat.
• Dupa un infarct miocardic acut creste la 2-3 ore atingand un maxim la 8-12 ore
(Bishop, 2010).
• Cresteri ale nivelului mioglobinei serice s-au observat si in alte afectiuni precum
sindroamele de zdrobire musculara, distrofia musculara, insuficienta renala, crize
epileptice (tonico-clonice).
• Troponina cardiaca (TNc) este un marker proteic utilizat in diagnosticul
infarctului miocardic cu specificitate mare.
 Proteomica
Cercetarea utilizeaza tehnici de studiu ale proteinelor in scopul identificarii a noi markeri biochimici.
Tehnici precum electroforeza 2D permit separarea proteinelor in spoturi sau benzi individuale ce permit
identificarea lor ulterioara cu ajutorul unor softuri speciale. Markerii proteici specifici unei anumite afectiuni
sunt apoi izolati si studiati prin tehnici sofisticate precum spectrometria de masa.
• Electroforeza 2D combina doua dimensiuni electroforetice diferite, in prima
dimensiune proteinele sunt separate in acord cu punctul lor izoelectric (pI) in gradient
de pH.
• Punctul izoelectric (pI) este punctul la care molecula proteica are incarcatura
neutra.
• A doua dimensiune separa proteinele in functie de masa lor moleculara folosind
un gel de poliacrilamida sodium-dodecil-sulfat (SDS-PAGE). (Bishop, 2010)
• Spectrometria de masa MALDI-TOF si SELDI-TOF este utilizata pentru analiza
complexa a proteinelor separate prin electroforeza 2D folosind tehnica laser de
ionizare si desorbtie a probei si monitorizarea moleculelor de proteina in functie de
masa spectrala a fiecareia.(Bishop, 2010)
 Parte practica
• 1. Dozarea proteinelor totale prin metoda biuretului (Reihnold, 1953)

Reactivi necesari:
1. NaCl 0.9% w/v
2. Reactiv biuret: se dizolva 4g de hidroxid de sodiu in 400ml apa distilata. Se
adauga 4,5g tartrat de sodiu si potasiu.
Se amesteca pentru a se dizolva. Sa adauga apoi 1,5g sulfat de cupru urmat de 4,5g
iodura de potasiu si aduceti la 500ml cu apa distilata.Solutia este stabila 6 luni la
temperatura camerei.
3. Standard BSA (bovine serum albumine) 6g/dl.
 Tehnica de lucru

reactivi blank S1 S2 S3 Proba test

NaCl 0,9% (ml) 2.5 2.45 2.4 2.35 2.4
Standard BSA (ml) - 0.05 0.1 0.15 -
Proba test (ml) - - - - 0.1
Amestecati bine
Reactiv biuret (ml) 3 3 3 3 3
Amestecati bine

Incubati la temperatura camerei timp de 15 min. Setati spectrofotometrul la 0 fata de blank

pentru lungimea de unda de 540 nm si masurati apoi absorbanta standardului di respectiv
probei test.
 Metoda de calcul si curba standard
• Valoarea S1 (standard 1) este ½ din valoarea S2 iar valoarea S3 este 1½ din valoarea
S2. Daca valoarea S2 este de 6g/dl, atunci valoarea S1 va fi 3g/dl iar cea a S3 de 3g/dl.
• Efectuatigraficul de calibrare folosind absorbanta determinata pentru concentratia
cunoscuta (graficul trebuie sa fie linear)

• Exemplu
 • Raportati apoi absorbanta probei la curba standard si aflati concentratia
proteinelor din proba de testat.
• Daca ati verificat linearitatea pentru o solutie standard nu este nevoie sa
folositi de fiecare data curba standard, pentru urmatoarele probe testate se
poate folosi formula:

• (Absorbanta test / absorbanta proba )* conc std S2 = g proteine/dl

• 2. Recunoasteti principalele fractiuni proteice pe o electroforegrama

 Bibliografie

• 1. Reinhold. J.G. (1953). Standard methods of clinical chemistry 1:p :88.

• 2. Bishop M, Fody E., Schoeff L. Clinical chemistry. Editura Lippincott, 2010.
• 3. Anghel Andrei, Daniela Grecu, Felicia Sfrijan, Marilena Motoc, Liviu tamas,
Diana Narita. Biochimie clinica. Principii si aplicatii. Editura Eurostampa,
Timisoara 2006.
• 4. Ramesh Ummanni, Frederike Mundt, Heike Pospisil, Simone Venz, Christian
Scharf, Christine Barett, Maria Falth, Jens Kollermann7, Reinhard Walther, Thorsten
Schlomm, Guido Sauter, Carsten Bokemeyer, Holger Sultmann6, A. Schuppert, Tim
H. Brummendorf, Stefan Balabanov. Identification of Clinically Relevant Protein
Targets in Prostate Cancer with 2D-DIGE Coupled Mass Spectrometry and Systems
Biology Network Platform. PlosOne 2011.