MATERIALE BIOLOGICE UTILIZATE ÎN

LABORTORUL CLINIC DE BIOCHIMIE.

RECOLTARE, PRELUCRARE,
CONSERVARE
OBIECTIVE

1. Cunoașterea variabilelor preanalitice ce influențează rezultatul analizelor de

laborator

2. Alegerea și manipularea corectă a sistemului holder-vacutainere și a principalelor

categorii de substante anticoagulante conținute de fiecare dintre acestea.

3. Cunoașterea mecanismelor de acțiune ale diferitelor categorii de substante

anticoagulante și alegerea lor corectă în funcție de analitul ce urmează a fi dozat.

4. Deprinderea abilității de a efectua operația de centrifugare.

 Pentru a putea interpreta un rezultat de laborator personalul medical trebuie să
cunoască cu exactitate compoziția fluidelor biologice și să țină cont de aceste erori
atunci când furnizează un rezultat de laborator.

Dintre materialele biologice folosite în analiza de laborator fac parte: sânge

integral, serul, plasma, urina, saliva, lichid cefalo-rahidian (LCR), lichide de puncție
(sinovial, amniotic, pleural, de ascită).
I. RECOLTAREA PROBELOR BIOLOGICE -SÂNGELE

 Flebotomia sau puncția venoasă este modalitatea de a obține o probă de sânge

venos, în țara noastră această manevră este executată de asistenta medicală. Puncțiile
arteriale, articulare, abdominale, pleurale sunt efectuate de către medicul clinician.

 Înaintea recoltării oricarei probe biologice este obligatorie identificarea

pacientului și etichetarea tuburilor în care se vor recolta probele folosind cel puțin
trei criterii de identificare (ex. Nume, numărul foii de observație, codul numeric
personal).
 Se verifică testele cerute, volumul de sânge necesar și se aleg vacutainerele
și acul potrivit.
 Este
de preferat folosirea sistemului de vacutainer care asigură colectarea
sângelui direct din venă într-un sistem închis fără risc de co ntaminare a
probei sau persoanei care recoltează.
 Sistemelede recoltare cu seringa sau sistemul tip “fluturas” se folosesc
doar la copii sau în situații dificile precum vene fragile sau deteriorate prin
puncții multiple.
 Cel mai adesea acele sterile utilizate au diametru cuprins
între 19 si 22g, pentru un pacient adult se folosesc de rutină acele
cu diametru de 20g.

 Persoana care efectuează o puncție trebuie să respecte toate

măsurile de protecție legate de potențialul infecțios atât în ceea
ce privește propria persoană cât și pacientul (să poarte halat,
mănuși de protecție de unică folosința ce se vor schimba după
fiecare pacient în parte, mască sau ochelari de protecție).
 De asemenea trebuie să prezinte o
atitudine profesională și abilități de
comunicare cu pacientul în scopul
rezolvării cu diplomație a oricaror
situații ostile, generatoare de stress și
să respecte cu strictețe principiile de
etică și dreptul pacienților.
1. LOCUL PUNCȚIEI

 Sealege locul puncției, cel mai frecvent utilizată este fossa antecubitala,
zona din fața cotului.
 Aicise găsesc o serie de vene mari situate imediat sub tegument, ușor de
localizat și puncționat: vena mediană cubitală (cel mai des puncționată),
vena cefalică (de obicei singura venă ce poate fi palpată la pacienții
obezi), vena bazilică (este de obicei ultima alegere este foarte mobil și
există riscul puncționării ramificației nervului median sau al arterei
brahiale care se găsesc în vecinătate).
 Brațul pacientului trebuie să fie sprijinit pe
scaunul de puncție în linie dreaptă de la umăr la
articulația mâini, poziție care să sigure confort
pacientului și să prevină refluxul. Se
dezinfectează locul puncției cu un antiseptic
(alcool, clorura de benzalconiu) prin mișcări
circulare, apoi lăsați să se usuce zona înainte de
punctionare.
! Atenție: nu se dezinfectează tegumentul cu
alcool atunci când recoltam o probă de sânge în
vederea determinării alcoolemiei.
2. PUNCȚIONAREA VENEI

 Seaplică garoul deasupra locului

puncției și se puncționează vena cu
acul atașat la un holder pentru
vacutainer în unghi de 150 față de
antebraț și cu amboul în sus până
când ați străbătut peretele vascular
după care poziția acului se schimbă
paralel cu traiectul venos pentru a
evita puncționarea peretelui opus.
 Se desface garoul și rând pe rând vacutainerele sunt plasate în holder
prin presarea cu degetul mare a vacutainerului în interiorul holderului
astfel încât acul din interiorul holderului să străbată capacul de cauciuc
al vacutainerului.
 Dacăpuncția a fost corect executată sângele va coborî în vacutainer
automat. După recoltare este necesară omogenizarea conținutului
vacutainerului prin efectuarea a 8-10 mișcări de inversie a acestuia.
TIPURILE DE VACUTAINERE ȘI CONȚINUTUL LOR

 Pentru a impiedica procesul de coagulare a sângelui, unele vacutainere conțin

substanțe anticoagulante.

 Mecanismul de blocare a coagulării sângelui este diferit:

 substanțe anticoagulante ce acționează prin legarea Ca2+ : acid etilen diamino tetra
acetic (EDTA) , citrat,

 substanțe anticoagulante ce acționează prin inhibarea trombinei (heparina).

VACUTAINERELE AU CAPACE COLORATE DIFERIT, ÎN FUNCȚIE DE ANTICOAGULANTUL FOLOSIT.

 1. Capac mov/roz – folosește ca anticoagulant EDTA-ul

și este folosit în hematologie, biologie moleculara,
2. Capac bleu/verde – conține Citrat 9+1 și se folosește
pentru testele de coagulare.
3. Capac negru/mov – conține Citrat 4+1 și se folosește
pentru determinarea vitezei de sedimentare a hematiilor
(VSH).
4. Capac verde/portocaliu – conține Heparinat și se
utilizează plasma pentru testele de biochimie.
5. Capac rosu/incolor - este un tub fără anticoagulant.
Serul este folosit pentru testele de biochimie, imunologie
si serologie.
 SUBSTANȚELE ANTICOAGULANTE
 Sunt substanțe ce se opun coagulării sângelui, folosite atât în scop diagnostic (la determinarea
unor analiți) cât și în scop terapeutic (terapia antitrombotică). Coagularea sângelui este procesul prin
care fibrinogenul (o proteină solubilă) este transformat în fibrină (insolubilă) cu ajutorul factorilor
coagulării.

 Substantele anticoagulante sunt capabile să împiedice procesul de coagulare prin mai multe
mecanisme:

 heparina intervine prin blocarea activității antitrombinei III și ca urmare: împiedică formarea
tromboplastinei, împiedică transformarea protrombinei în trombina și acțiunea trombinei asupra
fibrinogenului.

 Citratul de sodiu, EDTA (acidul etilen-diamino-tetraacetic) previne coagularea sângelui prin formarea
de complexe cu ionii de calciu.
3. RECOLTAREA SÂNGELUI CAPILAR

 Este utilă în special la copii pentru efectuarea analizei sângelui și pentru testele
care nu necesită volume mari de sânge. Pentru o analiză biochimică completă sunt
necesari 4-5ml de sânge și necesită puncția venoasă. Locurile de elecție pentru puncția
capilară sunt: falanga distală a degetului și suprafața plantară laterală sau medială a
calcâiului. La nou născut se preferă puncționarea călcâiului.

 Exista o relație directă între adâncimea puncționării și cantitatea de sânge obținută,

astfel pentru a se evita puncționarea prea adâncă se folosesc lantete speciale la care este
posibilă reglarea adâncimii înțepăturii, în special la copii pentru a evita lezarea osului.
 Tehnica puncționării: se dezinfectază locul puncționării cu ajutorul unui tampon steril
imbibat în soluție de alcool și se aștepta să se usuce zona înainte de a efectua incizia;
- se prinde ferm zona adiacentă locului puncționării și efectuați rapid incizia, apăsând
pe butonul lantetei;
- se îndepartează prima picătură de sânge cu ajutorul unei mese de tifon, deoarece
poate conține lichid interstițial care falsifică rezultatele obținute;
- prin mișcări de apăsare ușoară colectați picăturile de sânge care curg liber într-un
microtainer etichetat;
II. PRELUCRAREA UNEI PROBE DE SÂNGE DUPĂ ETAPA DE RECOLTARE
 Presupune separarea principalelor componente ale sângelui în funcție de analitul dorit.

Sângele este un țesut lichid alcătuit din plasmă și celule sanguine

Celulele sanguine (hematii, leucocite și trombocite) sunt suspendate în plasmă, formată din apă și
constituenți dizolvați (compuși chimici de metabolism, enzime, hormoni, anticorpi etc).

 Compoziția sângelui este prezentată în tabelul de mai jos

Plasmă (55%) • Apă (46-47%)
• Reziduu (8-9%)
 Substanțe anorganice
 Cationi (Na+, K+,Ca2+, Mg2+)
 Anioni (Cl-, HCO3-,HPO42-,S042-)
 Microelemente (Fe, Cu, Zn,Ni, Co, F, Br, I)
 Substanțe organice
o Azotate proteice: albumine, globuline, fibrinogen,
o Azotate neproteice: uree, acid uric, creatinină,
creatină, bilirubină, xantină, NH3
o Neazotate: glucide și lipide

Elemente figurate (45%) • Eritrocite

• Leucocite
• Trombocite
DUPĂ PROVENIENȚA COMPONENTELOR ACESTEA SE ÎMPART
ÎN TREI GRUPE PREZENTATE ÎN TABELUL DE MAI JOS
 exogene
Substanțe nutriționale o glucoza
o aminoacizii
o lipidele
o săruri minerale
o vitaminele
 provenite din metabolismul intermediar
o acid piruvic
o acid lactic
o corpi cetonici

 ureea
Substanțe de excreție
 acidul uric
 creatinina
 NH3
 CO2
 Urobilinogen
 Porfirine
Substanțe funcționale  Fracțiunile proteice
o Albumine
o Globuline
o Fibrinogen
 Anioni
o Cl-
o HCO3-
o Fosfați
 Cationi
o Na+
o Ca2+
o Mg2+
 Factori de coagulare și anticoagulare
CENTRIFUGAREA
 Este procesul prin care forța centrifugă este utilizată pentru a separa componentele solide de cele
lichide din compozitia unui amestec. Forța centrifugă (RCF) depinde de trei variabile: masa, viteza
și mărimea roturuli în centrimetri (radius în cm).
 RCF = 1.118 x 10-5 x r x (rpm)2

 r reprezintă radiusul în centimetri măsurat de la centrul axului până la partea inferioara a tubului
în care se găsește proba.

 Prin centrifugare se poate separa serul sau plasma. Acestea trebuie separate de celulele sanguine cât mai
repede posibil, pentru a nu există riscul producerii unor rezultate eronate (se recomanda astfel o limită maximă
de 2 ore din momentul recoltării probei).
 Pentru a obține ser centrifugarea se realizează numai
după ce sângele a coagulat complet (aprox. 30 min).
Serul reprezintă plasma fărp fibrinogen și factori ai
coagulării.

 Sângele se centrifughează la 3000 g timp de 5 min.

 După obținerea serului sau plasmei este

contraindicată recentrifugarea probelor, iar serul și
respectiv plasma vor fi decantate în tuburi separate cât
mai repede posibil.
 III.TRANSPORTUL PROBELOR BIOLOGICE DE SÂNGE

 Transportul probelor pe durată scurtă de timp se face la temperatura camerei în pungi speciale termoizolante
pentru a evita variațiile mari de temperatură.
 Dacă este necesar transportul pe termen mai lung se va evită transportul sângelui integral și se vor
transporta doar serul și respectiv plasma refrigerate în pungi sau cutii termoizolante în care se găsesc pungi
cu gheața.
 Serul sau plasma congelate se vor transporta în cutii termoizolante în care se va pune o cantitate suficientă
de gheață carbonică evitând decongelarea probelor pe parcursul transportului.
IV. ARHIVAREA (CONSERVAREA)
SERULUI ȘI A PLASMEI.

 Serul
sau plasma se conservă prin congelare la
-200C timp de 2 luni sau 1 săptămână la 40C .
Sângele pentru hemoleucogramă recoltat pe
EDTA se poate păstra maxim 24h la 40C.
 V. RECOLTAREA PROBELOR BIOLOGICE-URINA

 Prima urină de dimineață reprezintă urina proaspătă colectată dimineață, după ce a fost
golită vezica urinară de urina acumulată în timpul nopții.

 În această urină se fac determinări calitative (albumină, glucoză, pH, acetonă) și

examenul microscopic al sedimentului urinar.

 Pentru determinările calitative și cantitative se recoltează urina din 24 de ore.

 Urina din 24 de ore este folosită pentru analiza ratei de excreție a diverșilor analiți. Se
recoltează astfel: prima urină de dimineață se aruncă, apoi se începe la oră fixă recoltarea într-
un vas sau mai multe în funcție de debitul urinar, în intervalul a 24 de ore. (Exemplu: de azi
dimineață de la ora 8 până a doua zi dimineață la aceeasși oră).

 Pentru urina de 24 de ore este necesar să se măsoare volumul de urină pentru că

determinările care se fac numai în urina de 24 de ore, se raportează la acest volum.
VI.COMPOZIȚIA CHIMICĂ A URINII

 Urina este un lichid biologic cu o compoziție variabilă formată din apă, electroliți și
substanțe biorganice, a cărui compoziție este strâns legată de compoziția sângelui.

 Compoziția normală a urinii cuprinde atât substanțe organice cât și anorganice.

Astfel prin prezența acestor componente în urină putem evidenția ritmul de eliminare a
sărurilor și produșilor finali, care este util în urmărirea echilibrului hidro-mineral și a
metabolismului intermediar.
COMPOZIȚIA URINII NORMALE ESTE REDATĂ ÎN
TABELUL DE MAI JOS:

Anioni Cationi Componente

organice

 Cloruri  Sodiu  Uree

 Sulf  Potasiu  Acid uric
 Fosfați  Săruri de amoniu  Creatinină
 Calciu  Creatină
 Magneziu  Aminoacizi
 Proteine
 Glucoză
 Corpi cetonici
 Uroporfirine
 Amilază
VII.CONSERVAREA PROBELOR DE URINĂ

 Este recomandată efectuarea analizelor în cel mult 2-3 ore de la ultima recoltare. În
scopul evitării fermentării urinei sau a infectării cu diverse microorganisme urina se
păstreazp la frigider. De asemenea se recomandă congelarea imediată a urinei (sub -
20°C), fie folosirea unor substanțe conservante cum ar fi: toluen, timol, cloroform,
xilen, formol, fenol. Aceste substanțe însă au dezavantajul că influențează
rezultatele. Cloroformul împiedică studiul sedimentului,fenolul împiedică dozarea
acetonei, iar formolul are proprietăți reducătoare ca și glucoza.
VIII. ERORILE PREANALITICE

 Corecta recoltare, prelucrare și conservare a probelor biologice este o etapă critică pentru obținerea
unui rezultat de o acuratețe mare, în acestă etapă putând exista o serie de erori numite erori preanalitice ce
au drept consecința un rezultat eronat.

 Erorile preanalitice se pot clasifica în două categorii:

A. erori analitice controlabile – aceste erori sunt legate de tehnica de recoltare a probei, transportul și
prelucrarea probei până în etapa analitică. Un personal medical instruit poate evita aceste erori.

B. Erori analitice necontrolabile – acestea țin de caracteristicile fiziologice particulare ale fiecarui pacient în
parte (sex, vârsta, rasa, boli asociate etc).

 Pentru a putea interpreta un rezultat de laborator personalul medical trebuie să cunoască cu exactitate
compoziția fluidelor biologice și să țină cont de aceste erori atunci când furnizează un rezultat de laborator.
A. În categoria erorilor preanalitice controlabile pe lângă erorile legate de, tehnica de
recoltare a probei, transportul și prelucrarea probei, mai sunt incluse:

1. variații fiziologice (postura, exercițiu fizic, efortul fizic, variații circadiene, perioada
menstruală)

2. stilul de viață (alimentație, fumat, consumul de alcool, consumul de droguri)

3. administrarea medicamentelor

A. În categoria erorilor preanalitice necontrolabile sunt incluse:

1. factori biologici (vârsta, sexul, rasa, originea etnică)

2. factori de mediu (altitudinea, temperatura mediului ambiant, zona geografică,

variații sezoniere)
 A. Erori preanalitice controlabile (în afara celor legate de tehnica de recoltare, transportul și
prelucrarea probei).

 1. Variații fiziologice

 Postura

 La adult trecerea din clinostatism în ortostatism determină reducerea volumului sangvin cu 10%.
Modificarea posturii determină reducerea volumului plasmatic și creșterea concetrației proteinelor
plasmatice (8%-10%). Aceste modificari revin la valori normale după 10 minute. Aceste modificări se
datorează trecerii fluidului din compartimentul vascular în cel interstițial. Postura determină creșterea
aldosteronului.
 Exercițiul fizic

Exercițiul fizic moderat determină creșterea glucozei sangvine care va stimula producția de insulină.

Nivelul plasmatic al piruvatului și lactatului sunt crescute datorită activității metabolice crescute de la nivelul
mușchilui scheletic. Exercițiul fizic moderat determină scăderi ușoare ale nivelului seric al colesterolului și
trigliceridelor. Persoanele care merg pe jos câte 4 ore pe săptămână prezintă o scădere a nivelului
colesterolului cu 5% și o creștere a HDL-colesterolului cu 3.4%, comparativ cu persoanele sedentare.
 Efortul

Efortul și traumatismele determină eliberarea

creatinkinazei și a mioglobinei.

 Variațiile circadiene

Cortizolul, parathormonul au un ritm circadian

propriu. Insulina prezintă concentrații mai
mari dimineața decât în cursul zilei, iar
răspunsul glucozei la secreția de insulină
prezintă valorile cele mai mari dimineața.
 Ciclul menstrual

Concentrația plasmatică a celor mai mulți hormoni feminini și a altor hormoni este influențată de
ciclul menstrual/Excreția catecolaminelor urinare este crescută la mijlocul ciclului și rămâne
crescută pe durata fazei luteale. Concentrația plasmatică a colesterolului și trigliceridelor este cea
mai crescută la mijlocul perioadei, când concentrația de hormoni estrogeni este maximă.

Proteinele totale și concentrația albuminei scade în timpul ovulației, nivelul seric al calciului
corelându-se cu modificările albuminei. Fibrinogenul plasmatic scade la menstruație comparativ
cu creatinina și acidul uric care au valorile cele mai mari în această perioadă. Concentrația
plasmatică a fierului poate fi scăzută la începutul menstruației.
2. STILUL DE VIAȚĂ

 Dieta

O dietă cu un conținut crescut de grăsimi determină creșterea

trigliceridelor, dar poate reduce nivelul acidului uric. Dieta cu conținut
crescut de carbohidrați determină scăderea concentrației VLDL-
colesterolului, colesterolului și trigliceridelor și proteinelor.

 Fumatul

Fumatul poate influența multe teste de laborator. Nicotina determină

creșterea concentrației epinefrinei plasmatice și creșterea excreției urinare
a catecolaminelor și metaboliților acestora. Fumatul poate determina
creșterea glicemiei cu 10 mg/dl, creștere care poate persista o oră.
 Concentrația plasmatică a glucozei este mai crescută la fumători comparativ cu
indivizii nefumători.
 Concentrația plasmatică a colesterolului, trigliceridelor și LDL colesterolului este mai
mare, iar HDL-colesterolul este mai mic la fumători, comparativ cu nefumători.
Numărul eritocitelor este crescut la fumători. Nivelul seric al vitaminei B12 este
redus la fumători, iar scăderea este invers proporțională cu concentrația tiocianatului.
 Consumul de alcool

Consumul cronic de alcool determină modificarea activității

enzimelor serice. De exemplu creșterea concentrației serice
a gama-glutamiltransferazei este un marker al consumului
persistent de alcool.

 Consumul de droguri

Consumul de droguri determină modificări ale testelor de

laborator. Morfina determină creșterea amilazei, lipazei,
transaminazelor, fosfatazei alcaline și a concentrației serice
a bilirubinei.

.
De asemenea determină creșterea concentrației gastrinei, TSH și prolactinei, iar norepinefrina, insulina
sunt crescute. Amfetaminele cresc concentrația acizilor grași liberi.

Heroina determină creșterea colesterolului, T4 și potasiului.

Canabisul determină creșterea concentrației plasmatice a sodiului, potasiului, ureei, clorului și insulinei,
precum și scăderea uratului, glucozei și creatininei
 3. ADMINISTRAREA MEDICAMENTELOR

 Diferite medicamente administrate sub formă injectabilă intramuscular pot determina,

prin afectarea musculară locală creșteri ale enzimelor serice (creatinkinaza și lactic-
dehidrogenaza), care pot persista câteva zile. Administarea diureticelor poate
determina reducerea concentrației potasiului și sodiului.
 B. ERORI ANALITICE NECONTROLABILE
1. FACTORII BIOLOGICI

 Vârsta

Unele variabile biologice sunt în funcție de vârstă, din acest motiv

interpretarea rezultatelor trebuie să țină seama de intervalul de referință
corespunzător vârstei.

 Sexul

Până la pubertate între bărbați și femei sunt puține diferențe în ceea ce

privește testele de laborator. După pubertate, la bărbați datorită masei
musculare mai dezvoltate, enzimele musculare vor avea niveluri mai
crescute comparativ cu femeile. La menopauză nivelul fosfatazei alcaline
este mai mare comparativ cu bărbații.
 Concentrația albuminei, calciului și magneziului este mai marer la bărbați comparativ
cu femeile. Hemoglobina este mai scăzută la femei. Sideremia și feritina sunt scăzute
la femei înainte de menopauză, datorită pierderilor de sânge din timpul perioadei
menstruale. Bărbații prezintă niveluri crescute ale colesterolului și LDL
colesterolului și concentrați scăzute ale HDL-colesterolului.
 Rasa

Intervalul de valori de referință variază în funcție de grupul

etnic.

Metabolismul carbohidraților și lipidelor este diferit la rasa

neagră față de cea albă.

Polulația neagră are o toleranță mai mică la glucoză

comparativ cu rasa albă.

După vârsta de 40 de ani nivelul seric al colesterolului și

trigliceridelor este mai mare la rasa albă comparativ cu rasa
neagră.

Concentrația serică a hemoglobinei este mai mare la rasa albă

decât cea neagră.
2. FACTORII DE MEDIU
 Altitudinea

La indivizi care trăiesc la altitudine

ridicată, se observă o creștere a
hemoglobinei serice datorită reducerii
PO2 atmosferic.

Creșterea numărului de eritrocite

determină creșterea turnoverului
nucleoproteinelor având drept consecință
creșterea excreției acidului uric.
 Temperatura

Transpirația determină pierderea

de minerale, microelementelorde,
sare și apă, obicei fară modificări
ale concentrației sodiului și
clorului