Sangele - materia prima pentru

laboraorul de biologie/biochimie clinica

LP1
Sef Lucrari Dr. Florin Iordache
 Sângele – structură și funcții
• Cele mai multe teste de laborator în biochimie, hematologie, imunologie se
realizează pe probe de sânge! Reprezinta “oglinda” functionarii /
metabolismului tuturor celulelor.
• Sângele, respectiv plasma și/sau serul constituie materialul biologic primordial
pentru efectuarea diferitelor tipuri de analize biochimice.
• Sângele reprezintă un țesut fluid constituit 2 faze: faza fluidă denumita plasmă
si faza solidă reprezentată de elementele figurate: eritrocite, leucocite și
trombocite aflate în suspensie în plasma sangvină.
• Elementele figurate ale sângelui constituie aproximativ 40-45% din volumul
sangvin, iar plasma 55-60%.
 Condiții de recoltare a sângelui

Pentru determinări biochimice se folosește numai sânge venos. Astfel

recoltarea sângelui se face prin puncție venoasa. Recoltarea sângelui se
face, de preferința, în aceleași condiții, de obicei dimineață, înainte de
hrănire sau adăpare.
Zona de unde urmează a se recolta sângele se dezinfectează cu alcool și
după caz se înlătura parul prin tundere sau radere. Recoltarea de
realizează din regiuni bogat vascularizate.
 Condiții de recoltare a sângelui
Sangele poate fi recoltat cu sau fara anticoagulant!
Pentru analizele de biochimie pot fi folosite probe de:
- sange integral
- plasma
- ser
Ordinea recomandata pentru utilizarea vacutainerelor la recoltarea de sange venos
de la acelasi pacient este:
1. recipientele pentru hemocultura;
2. tuburile fara aditivi;
3. tuburile ce conţin citrat;
4. tuburile ce conţin heparina;
5. tuburile ce conţin EDTA.
 Tuburile de recoltare sterila a
sangelui = vacutainere

Colour of the cap Continut Utilizare

Verde Heparin sodium Coagulation tests, cytogenetics tests
Verde deschis Heparin-lithium Lymphoblastic transformation,
plasma, cytogenetics
Albastru Citrat de sodiu 1:9 Coagulation tests
Negru Citrat de sodiu 1:4 VSH
Rosu Fara anticoagulant Biochimie, serologie, imunologie
Galben Gel separator coagulant Biochimie, serologie, imunologie
Portocaliu Gel coagulant Biochimie, serologie, imunologie
Gri Oxalat de potasiu/ Florura de sodiu Glucoza plasmatica, etanol, lactat

Mov EDTA/EDTAK2/EDTAK3 Hematologie, biologie moleculară,

unele teste imunochimice.
 Anticoagulanți
Pentru efectuarea analizelor biochimice pe plasma, sângele trebuie sa fie recoltat
pe anticoagulanți, care sunt substanțe ce au proprietatea de a inhiba coagularea
sângelui. Cei mai utilizate anticoagulanți sunt:
Oxalatul de potasiu. Acesta inhiba coagularea sângelui prin blocarea ionilor de
calciu din sânge sub forma de oxalat de calciu insolubil.

Se utilizează o soluție de oxalat de potasiu de 20%, in raport de 0,01 cm3

anticoagulant pentru 1 cm3 sânge recoltat.
Soluția de oxalat de potasiu prezinta dezavantajul producerii hemolizei în
concentrații mari, nu se utilizează pentru determinări referitoare la echilibrul
acido-bazic, nu se utilizează pentru dozarea potasiului și a calciului, interfera cu
determinarea unor enzime (LDH – lactat dehidrogenaza).
 Anticoagulanți
• Citratul de sodiu. Mecanismul de acțiune este identic cu cel al oxalatului, și anume blocarea
ionilor de calciu din sânge. Dezavantajele acestui anticoagulant sunt similare cu cele ale
oxalatului. Citratul de sodiu se utilizează pentru determinarea vitezei de sedimentare a
hematiilor (VSH).
• EDTA (etilendiamintetracetat sare disodică). Acesta se complexează cu ionii de calciu din
sânge blocând astfel procesul de coagulare. Cantitatea folosita este de 1 mg EDTA pentru
1cm3 sânge recoltat. Acest anticoagulant se utilizează în pentru efectuarea hemogramei.
• Fluorura de sodiu (NaF). Acțiunea anticoagulantă se exercita prin legarea ionilor de calciu
sub forma de florură de calciu (insolubilă). Fluorura de sodiu inhiba glicoliza în eritrocite, și
astfel se utilizează pentru dozarea glicemiei.
• Soluția ACD (acid citric-dextroza). Se utilizează pentru conservarea mai îndelungata a
sângelui. Soluția ACD are următoarea compoziție raportata la 100 cm3: 4,7 g acid citric, 16 g
citrat trisodic, 25 g glucoza. Se folosește în raport de 1 volum soluție ACD/4 volume de sânge.
• Heparina. Reprezintă un anticoagulant natural prezent în sânge. Acționează prin inhibarea
activării protrombinei, astfel încât fibrinogenul nu mai este transformat in fibrina. Heparina
care exista în sânge în concentrații mici are un efect stabilizator asupra trombocitelor.
Plasma vs. ser
 Plasma vs. ser
Serul sau plasma trebuie separate de celulele din sange cat mai rapid, pentru a
reduce riscul producerii unor rezultate eronate; se recomanda astfel o limita
maxima de 2 ore din momentul recoltarii probei.

Vacutainerele care contin gel separator si un activator de coagulare

realizeaza o mai bună izolare a celulelor din sange si permit pastrarea serului si
dupa centrifugare in tuburile primare, dar si in perioada postanalitica (de
stocare).
 Plasma vs. ser
Avantajele utilizarii plasmei:
- eliminarea etapei formării coagulului;
- timpul de centrifugare se poate scurta prin creșterea vitezei de rotație;
- cantitate mai mare de proba, se obtine cu aproximativ 15-20% mai multă
plasmă decat ser;
- eliminarea interferentelor ce pot aparea prin coagularea post-centrifugare,
mai ales daca probele au fost centrifugate inaintea finalizarii acestui proces,
ceea ce nu se produce niciodata în plasma;
- risc scazut de aparitie a hemolizei si trombocitolizei fata de ser.
 Plasma vs. ser
Avantajele utilizarii serului:
- la electroforeza proteinelor migrarea este alterata la probele de plasmă
datorită prezenței fibrinogenului (apare un peak fals in regiunea γ);
- anticoagulantul poate interfera cu metoda de dozare atunci când
anticoagulantul este citrat sau EDTA care sechestează cofactorii
enzimatici metalici;
- cand se foloseste plasma heparinizata, litiul sau amoniul din
anticoagulant pot interfera cu metodele de determinare a acestora.
 Erorile aparute pe parcusul analizei pot duce la
rezulate eronate
Erorile pot fi:
1. Erori sistematice – aplicarea greşită a metodei sau a modului de calcul, etalonarea
incorectă a aparatelor de măsură, pregătirea greşită a reactivilor
2. Erori întâmplătoare – variaţii de temperatură, umiditate, presiune, intensitate a luminii
3. Erori personale – măsurarea greşită a volumelor de reactivi, omiterea unor reactivi in
reactie, nesesizarea ieşirii din domeniul de sensibilitate a metodei, etc.
- 46-68% din erori apar în faza pre-analitică (recoltarea, conservarea, identificarea
probei, calitatatea probei –hemolizată, icterică, lipemică)
- 18-47% în etapa post-analitică (interpretarea rezultatelor)
- fiecare laborator ar trebui să-şi înregistreze erorile într-o manieră structurată, prin
identificarea proprilor slăbiciuni şi a măsurilor de remediere, verificare cu alte laboratoare
din tara si strainatate (control inter-laboratoare si controale externe).
 Factori preanalitici care conduc la obtinearea unor
rezultate eronate

1. Timpul de contact al plasmei sau serului cu celulele sangvine

- peste 2 ore – scade glicemia, glucoza fiind consumată de celule, cresc potasiul și
LDH-ul care sunt eliberate din celulele din sange
- peste 6 ore – se modifica sideremia, albuminele, bicarbonatul, clorul, proteinele
totale, HDL-colesterolul, LDL colesterolul.
- peste 48 ore – se modifica proteinele totale, albuminele, enzimele (fosfataza
alcalina, ALT, GGT, CK), creatinina, uree, acid uric, bilirubina, trigliceride, colesterol,
toți ionii, T3,T4.
 Factori preanalitici care conduc la obținearea unor
rezultate eronate
2. Refrigerarea și congelarea

Temperatura de refrigerare încetinește metabolismul celular și stabilizeaza compușii

termolabili.

Congelarea, urmata de decongelare determina distrugerea celulelor și compromite

analiza acestora.

Pentru dozarea K se recomanda pastrarea probelor la temperatura camerei,

încetinirea glicolizei la temperaturi scăzute favorizeaza eliberarea K din celule și
obținerea de valori fals crescute.

Pentru evaluarea unor hormoni precum PTH, ACTH, gastrina, catecolamine și acid
lactic se recomanda pastrarea probelor pe gheața.
 Factori preanalitici care conduc la obținearea
unor rezultate eronate
3. Centrifugarea
- centrifugarea înainte de incheierea procesul de coagulare poate conduce la probe improprii
pentru evaluările spectrofotometrice; în general timpul de așteptare este de 30 minute la
temperatura camerei, dar daca pacientul este în tratament cu anticoagulante poate dura mai
mult;
- pentru a obține plasma necesară testelor de coagulare, centrifugarea trebuie sa se faca la mai
puțin de 30 de minute de la recoltare;
- depășirea timpului de centrifugare: 5-10 minute și a vitezei – aproximativ 300g poate determina
hemoliza
- anumite analize utilizeaza sângele integral, deci nu trebuie centrifugat (hemoglobina glicozilata,
testele genetice, dozarea plumbului)
 Factori preanalitici care conduc la obținearea unor
rezultate eronate
4.Transportul/transferul probelor
- daca laboratorul și locul de recoltare se află în aceeași clădire sau în
apropiere, transportul se face în recipiente speciale termoizolante (pungi sau
containere) în condiții ambientale daca nu se precizeaza expres refrigerarea sau
păstrarea pe gheața
- pentru analizele de biochimie, mai ales în cazul transportului la distanța este
preferabil transportul serului sau plasmei și nu al sângelui integral;
- transportul la distanța al probelor congelate destinate dozării unor hormoni,
markeri tumorali, imunologici se va face numai în gheața carbonica; decongelarea
în timpul transportului conduce la obținerea de rezultate eronate.
 Chimia umeda vs. chimia uscata

Cele mai multe metode de dozare a diferiților analiti din probele de ser/plasma sunt
spectrofotometrice si sunt realizate in 2 moduri:
-fie folosesc reactivi lichizi - chimie umedă
-fie folosesc reactivi impregnaţi pe un suport - chimie uscată
 Chimia umeda

Aceasta tehnologie implica:

- folosirea reactivilor sub forma lichida; serul/plasma este
amestecat cu reactivii specifici si apoi sunt intodusi in
analizorul de biochimie umeda unde se face citirea
- riscul de contaminare intre probe este mai mare fata de
chimia uscata
- este nevoie de curățarea cuvetelor/eprubetelor refolosibile
- implica verificarea stabilitatii reactivilor utilizați
 Chimia uscata
Aceasta tehnologie implica:
- folosirea reactivilor fixati pe un suport
format din mai multe straturi care permit
o distribuire mai precisa a moleculelor
din proba si un contact mai ferm cu
reactivii specifici
- aceste suporturi se mai numesc si
carduri si dupa picurarea unei catitati
mici de sange/plasma/ser se introduce
in analizoarele de biochimie uscata.
 Chimia uscata: avantaje

• rezultate excelente de înaltă calitate, reducând totodată costurile

• gamă dinamică largă
• mărime mică a probei
• interferență redusă cu alte componete ale probei
• 95% eficiență raportabilă a rezultatelor
• intervenție minimă a operatorului
• fără prepararea reactivilor, fara deșeuri de reactivi
• stabilitate mare
• spațiu minim de depozitare
• mai rapid și mai precis
• risc redus de infecție
 Chimia uscata: dezavantaje

• costul ridicat al instrumentelor

• sunt utilizate de obicei pentru un număr mare de probe, nu se
preteaza pentru laboratoare mici sau medii
• cost ridicat de întreținere/mentenanta