CAPITOLUL 1. COMPONENTELE SÂNGELUI.

CARACTERISTICI.

1.1. RECOLTAREA PROBELOR DE SÂNGE

Recoltarea probelor de sânge se face prin metode invazive, ceea ce impune respectarea
unui protocol strict, care se referă la toate aspectele acestui procedeu.
Mediul de lucru. Recoltarea se recomandă să fie făcută în camere sau incinte pregătite
special cu mobilier, luminozitate, temperatură şi condiţii de igienă corespunzătoare.
Pregătirea personalului. Cadrele medicale trebuie să fie pregătite profesional pentru
recoltarea probelor de sânge, să aibă echipament adecvat şi să fie instruite pentru a
realiza o bună comunicare cu pacienţii.
Pregătirea pacientului:
- Recoltarea probelor de sânge se face în condiţii de repaus fizic, psihic şi de comfort
termic.
- Personalul medical va explica pacientului manoperele necesare, utilitatea şi riscurile
pe care le presupun aceste manevre.
- Cadrele medicale trebuie să obţină acordul pacientului pentru orice manoperă înainte
de efectuarea acesteia.
- Cadrele medicale vor obţine, din anamneza pacientului, date pentru identificarea
acestuia şi date cu caracter medical (stări fiziologice particulare, menstruaţie,
graviditate, starea de hidratare, afecţiuni acute, afecţiuni cronice, tratamente
efectuate etc.).
Momentul recoltării probelor de sânge.
În urgenţe, recoltarea probelor de sânge se face în orice moment al zilei.
În cazul investigaţiilor recomandate, se preferă recoltarea sângelui în condiţii bazale:
dimineaţa, după 6-8 ore de post alimentar şi repaus fizic. Un număr restrâns de parametri
biologici pot fi influenţaţi de alimentele care cresc glicemia, lipemia şi potasemia sau de
medicamentele administrate anterior.
În cazul determinării unor parametrii biologici care au ritm circadian cunoscut se
recomandă recoltarea probelor de sânge în condiţii identice şi în acelaşi moment al zilei.

Observaţie! Momentul din zi, poziţia corpului (clinostatism, ortostatism etc.),

momentul faţă de administratrea de alimente sau lichide, efortul fizic, alte situaţii
fiziologice, pot modifica valorile parametrilor determinaţi în sânge de la  5 %
până la  10 %. În consecinţă, recoltarea probelor de sânge se poate efectua
fără restricţii pentru majoritatea probelor biologice, cu excepţia glicemiei,
lipidelor plasmatice şi a potasemiei.

Tipul de sânge recoltat.

Probele de sânge se obţin prin puncţionarea unei vene sau a vaselor capilare. Sângele
capilar se recoltează, la adult, prin înţeparea pulpei degetului inelar sau mijlociu, iar la
sugar şi copilul mic, prin înţeparea feţei plantare a degetului mare de la picior sau a
călcâiului. În anumite afecţiuni (endocardită, vasculite) se înţeapă lobul urechii pentru a
obţine celule endoteliale din capilare. Sângele capilar se foloseşte preferenţial pentru
examinări calitative şi morfologice (frotiuri de sânge), dar poate fi utilizat şi în teste
chimice, imunologice şi hematologice (de exemplu pentru determinarea hematocritului prin
micrometodă).

1
Sângele venos se recoltează prin puncţionarea venelor (flebotomie) de la plica
antecubitală. La nevoie, la sugari se poate recolta şi din vena jugulară, venele de pe faţa
dorsală a mâinii sau venele epicraniene.
Sângele arterial se foloseşte pentru dozarea gazelor (oxigen, dioxid de carbon, gaze rare,
gaze toxice), dozarea bicarbonatului de sodiu, evaluarea echilibrului acido-bazic şi pentru
culturi bacteriologice în septicemii.
Materiale necesare recoltării probelor de sânge:
- degresarea şi dezinfectarea tegumentelor se face cu eter şi alcool 70%;
- puncţionarea vasului de sânge şi recoltarea sângelui se fac cu instrumentar steril:
seringi şi ace de unică folosinţă sau cu sisteme moderne de tip vacutainer,
microtainer etc.;
- alte materiale: vată, garou;
- anticoagulant:
• EDTA este preferat în tehnicile de leucoconcentrare şi de separare a
trombocitelor pentru studii citochimice;
• amestec de oxalaţi Wintrobe: oxalat de amoniu 1,2 g, oxalat de potasiu 0,8 g,
apă distilată 100 ml;
• heparină;
• citrat trisodic.

Observaţie: Tipul de anticoagulant, concentraţia anticoagulantului, cantitatea de

anticoagulant şi cantitatea de sânge sunt dictate de metoda folosită pentru
dozarea fiecărui component investigat în plasmă sau sânge integral.

Tehnica recoltării
- Se pune manşeta tensiometrului proximal de zona aleasă pentru puncţie şi se creşte
presiunea aerului în manşetă, la valori situate între presiunea sistolică şi presiunea
diastolică, cu scopul de a opri circulaţia venoasă, permiţând circulaţia arterială. În
acelaşi scop se poate folosi garoul.
- Se degresează şi se dezinfectează tegumentul.
- Se puncţionează vena, după care se desface manşeta tensiometrului sau garoul şi
se aşteaptă reluarea circulaţiei venoase. Nu se recoltează sânge imediat după staza
venoasă şi se recomandă prelevarea primilor 2 ml de sânge şi îndepărtarea acestora
prin schimbarea seringii folosite.
- Pentru testele de coagulare, se recomandă puncţionarea venei de la prima încercare,
pentru a evita contactul prelungit cu tromboplastina tisulară. Instrumentarul folosit şi
recipientul pentru recoltare trebuie să fie perfect uscate.
Utilizarea probelor de sânge
- Sângele venos se foloseşte pentru teste chimice, imunologice şi hematologice. Se
recomandă efectuarea tuturor testelor necesare din proba de sânge venos, deoarece
folosirea sângelui capilar pentru o parte dintre aceste teste duce la rezultate
neconcordante.
- Examinarea citomorfologică şi funcţională a sângelui se realizează curent din
sângele venos şi din sângele capilar. Nu se recomandă folosirea sângelui venos
recoltat pe anticoagulant, pentru examenul morfologic pe frotiu, deoarece pot apărea:
celule endoteliale, cristale de anticoagulant înglobat în leucocite şi modificări ale
elementelor figurate.
Timpul de prelucrare
- Se recomandă efectuarea testelor din sângele proaspăt recoltat, în special pentru
testele de explorare a hemostazei.
2
 - Sângele se păstrează la 4 – 8°C, timp limitat.
- După refrigerare, sângele va fi readus la temperatura camerei pentru efectuarea
probelor. La temperatura camerei (18 – 26°C) poate fi păstrat maximum 6 ore de la
recoltare.
- Se recomandă efectuarea testelor de coagulare şi numărarea trombocitelor în
interval de 1 oră de la recoltare, a V.S.H.-ului până la 2 ore, iar pentru alte investigaţii
hematologice în maximum 3 ore de la recoltare. Pentru lamele cu frotiuri, se
recomandă evitarea expunerii la umezeală, care produce degradarea celulelor.
Erori de tehnică. În raport cu metoda folosită, pot apărea rezultate fals pozitive sau fals
negative. Exemple:
- tub defect;
- probă de sânge coagulată;
- probă de sânge insuficientă;
- probă de sânge hemolizată;
- metode de determinare efectuate la temperaturi extreme;
- instrumentar defect;
- instrumentar şi aparatură necalibrată.

Studiu individual
Consultând cursul „Fiziologia sângelui”, un dictionar medical şi alte materiale recomandate
în bibliografie, răspundeţi la următoarele cerinţe:
1. Definiţi termenii: puncţie venoasă, flebotomie, garou, probă de sânge hemolizată,
hemostază.
2. Identificaţi cel puţin 4 medicamente care pot influenţa valorile unor constante
sanguine.

3
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Enumeraţi şi explicaţi condiţiile specifice de mediu şi de pregătire a cadrelor medicale

necesare pentru recoltarea probelor de sânge.

................................................................................................................................................
2. În ce constă pregătirea pacientului pentru recoltarea probelor de sânge?

……………………………………………………………………………………………..................
3. Care sunt tipurile de sânge care se pot recolta de la pacienţi?

………………………………………………………………………………………………..............
4. Enumeraţi investigaţiile care pot fi efectuate din probele de sânge.

………………………………………………………………………………………………..............
5. Explicaţi manevrele de facilitare a puncţiei venoase prin aplicarea garoului sau aplicarea
manşetei tensiometrului.

………………………………………………………………………………………………..............
6. Explicaţi de ce se recomandă degresarea şi dezinfectarea tegumentelor.

………………………………………………………………………………………………..............
7. Enumeraţi substanţele folosite ca anticoagulant.

.……………………………………………………………………………………………….............
8. Cum se obţin plasma şi serul din probele de sânge?

………………………………………………………………………………………………..............
9. Care sunt cele mai frecvente greşeli de tehnică întâlnite în recoltarea probelor de
sânge?

………………………………………………………………………………………………..............
10. Ce modificări au loc într-un eşantion de sânge recoltat pe anticoagulant şi păstrat timp
îndelungat?

………………………………………………………………………………………………..............

4
1. 2. PROPRIETĂŢILE FIZICO-CHIMICE ALE SÂNGELUI
Ţesutul sanguin este un ţesut mezenchimal de origine mezoblastică. Este format din două
compartimente: sângele periferic şi organele hematopoietice (măduva osoasă şi organele
limfoide). Sângele periferic este format din plasmă, în proporţie de 55-60% şi elemente
figurate, în proporţie de 40-45%. Elementele figurate ale sângelui sunt eritrocitele,
leucocitele şi trombocitele.
Plasma este mediul fluid care conţine, dizolvate sau în suspensie, numeroase molecule
organice, electroliţi şi elementele figurate.
Apa reprezintă cca. 93% din plasmă, restul fiind substanţe anorganice dizolvate (săruri
minerale, gaze: CO2 şi O2), sau substanţe organice (proteine, lipide, glucide sau combinaţii
ale acestora).
Plasma are rol de transportor, atât pentru elementele celulare sanguine, cât şi pentru
diversele substanţe biologic active pe care le conţine.
Proprietăţi fizico-chimice ale sângelui
Culoarea. Culoarea sângelui este roşie, datorită fierului bivalent din molecula de
hemoglobină (Hb), care absoarbe componentele spectrale violet şi verde şi le reflectă pe
cele roşii. Saturaţia Hb cu oxigen determină o culoare roşu aprins, iar Hb redusă
determină o nuanţă închisă de roşu, mergând până la cianoză în cazul sângelui capilar cu
saturaţie foarte redusă de oxigen.
Temperatura. Temperatura sângelui variază în funcţie de organ şi de intensitatea
activităţii metabolice. De exemplu, în ficat, sângele are cea mai ridicată temperatură (40-
41°C). Căldura specifică a sângelui (număr de calorii necesare pentru a ridica temperatura
la 1 ml de sânge cu 1°C) are valoarea 0,9 kcal/l.
Densitatea. Densitatea sângelui şi a plasmei permit aprecierea rapidă, cu ajutorul
nomogramelor, a hematocritului, a cantităţii de Hb şi a concentraţiei proteinelor
plasmatice. Valorile normale sunt (kg/m3):
- pentru sânge: 1050 – 1070; (bărbaţi: 1057 – 1067, femei 1051-1061);
- pentru plasmă: 1024 – 1030;
- pentru eritrocite: 1090 – 1093.
Diferenţele de densitate dintre eritrocite şi plasmă explică tendinţa eritrocitelor de a
sedimenta în plasmă (VSH).
Vâscozitatea. Vâscozitatea sângelui depinde, în principal, de concentraţia proteinelor şi
numărul elementelor figurate. Are o valoare de 4 – 5 ori mai mare decât a apei, pentru
care s-a stabilit convenţional valoarea 1 (4,3 - 4,7 centipoise pentru sângele integral şi
1,86 centipoise, pentru plasmă).
Factorii care influenţează vâscozitatea sângelui sunt: concentraţia fibrinogenului în
plasmă, hematocritul, diametrul vaselor de sânge, viteza de curgere a sângelui şi
temperatura. Creşterea patologică a vâscozităţii sângelui are drept consecinţă obstrucţia
vaselor şi tromboze locale.
Presiunea osmotică. Presiunea osmotică este presiunea care apare între două soluţii cu
compoziţie diferită, separate printr-o membrană semipermeabilă. Aceasta permite trecerea
solventului şi nu permite trecerea substanţelor dizolvate.
Presiunea osmotică depinde exclusiv de numărul particulelor cristaline dizolvate în soluţie.
Valoarea presiunii osmotice este practic aceeaşi în sânge, plasmă, lichid extracelular şi
mediul intracelular, fiind un factor de bază al homeostaziei organismului. Presiunea
osmotică determină sensul şi intensitatea transferurilor de lichide prin membrane. Apa
trece din mediul cu presiune osmotică mică (hipoton), spre cel cu presiune osmotică mai
mare (hiperton), până la egalizarea presiunilor. Presiunea osmotică modificată determină

5
alterarea integrităţii celulare: în mediu hipoton, celulele se umflă cu apă şi se sparg, în
mediu hiperton se deshidratează şi se zbârcesc.
Valori normale:
- 7,6 – 8,1 atm; 5300 mmHg
- 660 kPa
- 280 – 310 mOsm/l
Indirect, valoarea presiunii osmotice se poate determina prin punctul crioscopic
(temperatura de îngheţ): -0,56 … -0,58°C.
Presiunea oncotică. Presiunea oncotică sau coloid-osmotică reprezintă o parte din
presiunea osmotică şi este determinată de concentraţia proteinelor. De exemplu, în
plasmă, presiunea oncotică este 25 mmHg, iar în lichidul interstiţial este 15 mmHg.
Presiunea hidrostatică. Presiunea hidrostatică este determinată de presiunea sistolică
realizată de contracţia ventriculului stâng şi depinde de sectorul vascular unde se
măsoară. De exemplu: 120 mmHg în artere la plica cotului, 35 - 40 mmHg în capilare şi
10-15 mmHg la extremitatea venoasă a capilarului.
pH-ul. pH-ul se exprimă sub forma logaritmului zecimal cu semn schimbat din concentraţia
ionilor de hidrogen.
Valori normale: 7,38 – 7,42 (38 – 41 nM/l).
Valori extreme ale pH-lui, compatibile cu supravieţuirea: 6,8 – 8.

Studiu individual

Consultând cursul „Fiziologia sângelui” şi materialele recomandate în bibliografie,

răspundeţi la următoarele cerinţe:
1. Definiţi: mediul izoton, hipoton, hiperton.
2. Identificaţi: o soluţie izotonă din organismul uman şi o soluţie izotonă produsă
artificial.
3. Comparaţi valoarea normală a presiunii osmotice a plasmei cu valoarea normală a
presiunii atmosferice.

6
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Care este culoarea sângelui? Explicaţi modificarea culorii în funcţie de compartimentul

vascular (artere, vene, capilare).

...............................................................................................................................................
2. Care sunt valorile normale ale densităţii sângelui, plasmei şi hematiilor?

………………………………………………………………………………………………..............
3. Care este temperatura sângelui? Este un parametru biologic constant? De ce?

………………………………………………………………………………………………..............
4. În ce situaţii creşte vâscozitatea sângelui?

………………………………………………………………………………………………..............
5. Ce consecinţe are creşterea vâscozităţii sângelui asupra parametrilor hemodinamici ai
circulaţiei sanguine?

………………………………………………………………………………………………..............
6. Definiţi presiunea osmotică.

………………………………………………………………………………………………..............
7. Care sunt valorile normale pentru presiunea osmotică?

………………………………………………………………………………………………..............
8. Presiunea hidrostatică a sângelui este un parametru constant? De ce? Daţi exemple.

………………………………………………………………………………………………..............
9. Membrana celulară este o membrană semipermeabilă? Ce semnificaţie are acest
concept?

………………………………………………………………………………………………..............
10. Definiţi pH-ul. Care sunt valorile normale la om?

………………………………………………………………………………………………..............
11. Comentaţi participarea presiunii osmotice la homeostazia organismelor vii.

………………………………………………………………………………………………..............

7
1.3. REACŢII DE IDENTIFICARE A SÂNGELUI
Recunoaşterea prezenţei sângelui sau a urmelor de sânge are o mare importanţă, atât în
medicină curativă, pentru evidenţierea sângelui din diferite produse biologice, cât şi pentru
medicina legală, atunci când este necesar să se clarifice dacă eventualele pete sunt sau
nu de sânge, dacă sângele este sau nu de om, precum şi cărei grupe sanguine îi aparţine.
Acest lucru se realizează folosind metode care permit identificarea sângelui, specia căreia
îi aparţine sângele (om sau animal) şi grupa sanguină, dacă sângele este uman.
Atât în laborator, cât şi pentru munca de teren, criminaliştii sunt puşi în situaţia de a
analiza pete care par a fi de sânge. Aceştia trebuie să răspundă într-un timp relativ scurt,
dacă petele analizate sunt sau nu relevante pentru ancheta în desfăşurare.
Majoritatea testelor folosite pentru identificarea sângelui sunt teste chimice, ele fiind mult
mai rapide decât testele biologice de tip antigen-anticorp. Acestea din urmă, deşi sunt mult
mai specifice, sunt mai greu de executat şi necesită un timp mai lung de aşteptare.
Determinarea prezenţei sângelui se efectuează prin două tipuri de teste:
A. Teste de probabilitate, care au o mare sensibilitate, deoarece dau rezultate pozitive
folosind cantităti infime de sânge, dar au o specificitate redusă, în sensul că mulţi compuşi
oxidanţi (ex. peroxidazele din alte surse decât sângele) pot da aceleaşi rezultate pozitive.
Din acest motiv, pentru un rezultat sigur, este necesară asocierea mai multor reacţii de
probabilitate.
B. Teste de certitudine, cu o mare specificitate, dar care necesită cantităti mai mari de
sânge.

Toate testele încadrate în reacţiile de probabilitate sunt, mai mult sau mai puţin,
dependente de prezenţa hemoglobinei în pata analizată şi, de aceea, vor
genera rezultate pozitive la analiza sângelui animal.

A. Teste de probabilitate
Principiul general: unele substanţe sunt incolore în stare redusă, dar prin oxidare devin
colorate. Oxidarea are loc în prezenţa unui peroxid, ca apa oxigenată şi a unei
peroxidaze, ca hemoglobina, care are o puternică acţiune peroxidazică.
Peroxidazele sunt substanţe cu structură asemănătoare catalazelor, fiind mai puţin
răspândite în regnul animal, dar existente în cantităţi mari în lumea vegetală, mai ales în
frunzele plantelor. Aceste enzime catalizează reacţiile de oxidare realizate de apa
oxigenată (peroxid de hidrogen) sau de alţi peroxizi, ca de exemplu cei rezultaţi
din râncezirea oxidativă a uleiurilor şi grăsimilor, având un rol important în "arderea" unor
deşeuri celulare. Astfel, reactivii utilizaţi în acest tip de reacţii pot da şi reacţii fals pozitive
în prezenţa peroxidazelor din vegetale sau din lapte, a coloranţilor din ţesuturi, a anumitor
săruri (de fier, cupru, nichel, cobalt), a compuşilor oxidanţi (permanganat, bicromat),
precum şi în prezenţa pământului sau a ruginei. Din aceste motive, se consideră că aceste
reacţii au o specificitate redusă.
- Reacţia Adler - reprezintă una dintre cele mai sensibile reacţii de acest gen; în acest
caz, peroxidaza sanguină (hemoglobina) eliberează oxigen activ din peroxid (apa
oxigenată) şi îl trece pe benzidină, oxidând-o într-un derivat colorat. În clinică, proba
ADLER (testul ADLER) reprezintă metoda prin care se permite punerea în evidenţă a
prezenţei sângelui în materiile fecale - hemoragiile oculte în scaun.
În mod normal nu există sânge în materiile fecale. Prezenţa sa indică o afecţiune
sângerândă a tubului digestiv: ulcer gastric sau duodenal, polipi intestinali, rectocolită
ulcero-hemoragică, neoplasm, hemoroizi interni. Există o serie de recomandări
pentru proba ADLER:

8
 • înainte de prelevarea probei se va ţine un regim timp de 3 zile: fără carne,
peşte, medicamente cu fier, hemoglobină, legume verzi;
• se va controla ca scaunul emis să nu fie contaminat cu sânge provenit din
hemoroizi sângerânzi;
• este recomandat ca testul să se repete de 2-3 ori la un interval de 2-3 zile,
menţinând regimul indicat;
• proba se prelevă într-un recipient de plastic sau de sticlă, curat şi uscat.
- Reacţia Guarino - este mai puţin sensibilă, dar are o specificitate mai mare decât
reacţia Adler, motiv pentru care reacţia este folosită în benzi comerciale de
determinare a sângerărilor oculte în materiile fecale (teste denumite gFOBT).
- Reacţia cu luminol. Cea mai răspândită reacţie de catalizare din criminalistică este
cea cu luminol. Luminolul sau 3-aminoftalhidrazina este un compus chimic utilizat de
către poliţia criminalistă pentru a descoperi urmele de sânge şi de către biologi
pentru cercetarea cuprului, fierului şi a cianurii. Principalele componente capabile de
a cataliza această reacţie sunt hemul, diferite metale şi peroxidaza.
Utilizarea luminolului (în soluţie alcalină şi în prezenţa unui agent oxidant) se
bazează pe proprietatea sa de a produce o reacţie chimio-luminescentă albăstruie, la
contactul cu sângele. După reacţia de oxidare, o moleculă de oxigen suplimentar
părăseşte orbita normală şi apoi se întoarce pe aceasta, moment în care are loc
emisia de lumină.
Reacţia are loc sub o lampă care emite lumină cu lungimea de undă de 441- 452 nm.
Reacţia este extrem de sensibilă, fiind capabilă să detecteze prezenţa sângelui în
diluţii de 1:1.000.000. Luminolul nu reacţionează şi nu produce reacţii fals pozitive în
contact cu: plantele, anumite produse chimice de curăţare, anumite metale sau
diferiţi catalizatori.
- Reacţia cu orto-toluidină (bandă de hârtie HEMASTIX). Banda de hârtie
HEMASTIX este impregnată, la unul dintre capete, cu un amestec tamponat de orto-
toluidină şi un peroxid organic. Peroxidul organic, în soluţia acidă a sistemului
tamponat şi în prezenţa hemoglobinei (dar şi a mioglobinei), se descompune cu
eliberare de oxigen, care oxidează orto-toluidina într-un compus albastru.
B. Teste de certitudine
a) Testele cu formare de cristale. Toate aceste teste au ca principiu general formarea
cristalelor derivate din hemoglobină apărând cristale de hemină.
- Reacţia Takayama. Acest test se face la microscop, pe un frotiu de sânge peste
care se adaugă agenţi de cristalizare, observându-se apariţia de cristale derivate din
hemoglobină. Probabil cel mai cumoscut test în SUA şi, posibil, cel mai larg utilizat
de către criminalişti, este testul inventat de Takayama acum aproximativ 80 de ani.
Principiul acestui test este simplu: la încălzirea uşoară a unui frotiu de sânge peste
care se adaugă o soluţie alcalină de piridină se poate observa, la microscop,
formarea de cristale roz de piridină feroprotoporfirinică.
- Reacţia Teichmann. Alături de reacţia Takayama, reacţia Teichmann este una dintre
cele mai cunoscute; aceasta constă în formarea cristalelor de clorhidrat de hematină
(clorhemină), prin reacţia dintre clorura de sodiu şi hematină, în prezenţa acidului
acetic glacial, la cald. Hemoglobina tratată cu acid clorhidric va da naştere la
clorhemină care se prezintă sub formă de cristale rombice, brune - cristalele
Teichmann.
- Reacţia Stryzowski, reacţie analogă ca principiu reacţiei Teichmann, se referă la
punerea în evidenţă a prezenţei sângelui prin formarea cristalelor de iodhidrat de
hematină, care au forma unor prisme mici, romboidale, de culoare roşie, grupate în
diferite forme. Reactivul Stryzowski este format din alcool, apă distilată, acid acetic
glacial şi acid iodhidric.

9
Este general acceptat faptul că un rezultat pozitiv la testele de cristalizare confirmă
prezenţa sângelui. Sensibilitatea acestor teste este de aproximativ 0,001 ml de sânge sau
0,1 mg de hemoglobină per proba analizată. Un rezultat negativ nu arată neapărat că
sângele este absent din probă ci, poate indica un defect de tehnică. Interesant este faptul
că pete de sânge de până la 20 de ani au dat rezultate pozitive la testele de cristalizare.
b) Teste care utilizeaza spectroscopia. Acestea permit identificarea hemoglobinei cu
ajutorul spectrofotometrului, ştiind că hemoglobina produce o bandă de absorbţie în
intervalul 5893 Å – 5269 Å.
c) Teste care utilizează cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC). Această
tehnică poate fi utilizată pentru a confirma prezenţa de sânge. De asemenea, poate fi
folosită pentru a identifica specia de la care provine sângele, ştiindu-se variaţiile inter-
specii ale lanţurilor hemoglobinei. Poate să facă distincţia între hemoglobina fetală şi
hemoglobina adultă, poate fi folosită pentru a estima vârsta unei pete de sânge etc.
d) Determinarea speciei de apartenenţă a sângelui (umană sau animală). Aceasta se
realizează prin mai multe metode dintre care cele mai utilizate sunt cele imunologice.
Reacţia de imunoprecipitare Uhlenhuth se bazează pe formarea complexului antigen-
anticorp; se manifestă prin apariţia unui inel de culoare alb-lăptoasă la zona de contact
dintre serul precipitant anti-om şi maceratul obţinut din pata de sânge.
e) Determinarea grupei de sânge. În medicina legală, determinarea grupei sanguine din
petele de sânge se face prin evidenţierea aglutininelor alfa şi beta (prin metoda Lattes) şi a
antigenelor A, B şi 0 (prin metoda absorbţie-eluţie).
- Prin metoda Lattes se determină aglutininele cu ajutorul eritrocitelor-test A şi B, care
pot fi sau nu aglutinate în prezenţa sângelui; tehnica este simplă, aglutinările citindu-
se la microscop.
- Metoda absorbţie-eluţie se bazează pe proprietatea antigenelor din pete de a
absorbi anticorpii omologi din ser. La ambele metode este bine să se lucreze în
paralel şi cu câte o probă martor, cu sânge cunoscut.
Lucrări practice efectuate în laborator.
A.Teste de probabilitate
Reacţia Adler
Materiale necesare: benzidină; acid acetic glacial; apă oxigenată (3%); material de
cercetat - sânge diluat; stativ cu eprubete.
Tehnica de lucru: se prepară, în momentul folosirii, o soluţie saturată de benzidină în acid
acetic glacial; la câteva picături de reactiv astfel preparat, se adaugă câteva picături de
apă oxigenată şi o picătură de sânge. Se va obţine o colorare a reactivului în albastru
intens.
Reacţia Guarino
Materiale necesare: reactiv Guarino (dimetil-aniliă, acid acetic glacial şi apă distilată); apă
oxigenată; material de cercetat - sânge diluat; eprubetă.
Tehnica de lucru: într-o eprubetă, la câteva picături de reactiv Guarino se adaugă câteva
picături de apă oxigenată şi o picătură de sânge; reactivul se va colora în galben.
Reacţia cu orto-toluidină
Materiale necesare: banda HEMASTIX; urină necentrifugată.
Tehnica de lucru: se amestecă bine urina necentrifugată şi se întroduce capătul
impregnat al benzii în urină; se scoate apoi imediat şi se citeşte în 30 de secunde. Apariţia
culorii albastre, indică prezenţa sângelui în urină.
B. Teste de certitudine
Reacţia Teichmann.

10
Principiul reacţiei Teichmann, una dintre cele mai cunoscute reacţii de cristalizare, constă
în formarea cristalelor de clorhidrat de hematină (clorhemină), prin reacţia dintre clorura de
sodiu şi hematină, în prezenţa acidului acetic glacial, la cald. Hemoglobina tratată cu acid
clorhidric va da naştere la clorhemină, care se prezintă sub formă de cristale rombice,
brune - cristalele Teichmann.
Materiale necesare: sânge; acid acetic glacial cu NaCl 1%; lamă; lamelă; bec de gaz;
microscop.
Tehnica de lucru: se pune o picătură de sânge pe o lamă şi se întinde un frotiu mai gros.
Se usucă la căldură, până la 40 - 45°C (se controlează prin punerea lamei pe mână). Se
adaugă acid acetic glacial cu NaCl şi se acoperă cu lamela. Se încălzeşte până la fierbere.
Culoarea preparatului devine maron-brună datorită formării clorheminei. Răcirea se va
face lent, obţinându-se astfel cristale mari de clorhemină. La microscop, cristalele apar
galben-roşcate sau brune, cu forme de prisme alungite sau romboidale, cu unghiuri
ascutite, izolate sau aşezate în cruce ori în stea (figura 1.1.).

Figura 1.1. Cristale Teichmann.

Studiu individual

1. Folosind un dicţionar medical sau alte materiale didactice, explicaţi următorii

termeni: hemoragie ocultă, peroxid, cristalizare, antigen, anticorp, eluţie.
2. Folosind un motor de căutare explicaţi abrevierea: gFOBT.

11
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Câte tipuri de teste de identificare a sângelui cunoaşteţi?

................................................................................................................................................
2. Enunţaţi principiul general al testelor de probabilitate, folosite pentru identificarea
sângelui.

………………………………………………………………………………………………..............
3. Când recomandăm o probă Adler?

………………………………………………………………………………………………..............
4. Ce culoare se obţine în cazul unei reacţii Adler pozitive şi cum interpretăm acest
rezultat?

………………………………………………………………………………………………..............
5. Care sunt recomandările date pacientului înainte de efectuarea probei Adler?

………………………………………………………………………………………………..............
6. Ce este luminolul şi pentru ce este folosit?

………………………………………………………………………………………………..............
7. Care este principiul reacţiei de identificare a sângelui cu luminol?

………………………………………………………………………………………………..............
8. Ce culoare apare pe banda HEMASTIX dacă proba este pozitivă?

………………………………………………………………………………………………..............
9. Ce culoare şi ce formă au cristalele din reacţia Takayama?

………………………………………………………………………………………………..............
10. Ce culoare şi ce formă au cristalele din reacţia Teichmann?

………………………………………………………………………………………………..............
11. Cât de veche poate fi o pată de sânge pentru ca aceasta să nu mai fie identificată prin
spectroscopie?

……………………………………………………………………………………………..................

12
1.4. PLASMA SANGUINĂ
Definiţia plasmei. Plasma sanguină desemnează fracţiunea lichidă a sângelui. În plasmă
se află în suspensie celulele sanguine: hematii, leucocite şi trombocite. Este formată din
apă (90%), substanţe anorganice dizolvate - săruri minerale (aproximativ 1%) şi diverse
substanţe organice (aproximativ 9%): proteine, lipide, glucide sau combinaţii ale acestora
etc. Plasma serveşte ca vehicul atât pentru elementele celulare sanguine, cât şi pentru
diversele substanţe biologic active (hormoni, anticorpi, factori ai coagulării etc.). Volumul
plasmatic reprezintă 4-5% din greutatea corpului, adică 41 ml/kg corp, ceea ce pentru un
adult de 70 kg înseamnă aproximativ 3500 ml.
Obţinerea plasmei. Plasma sanguină se obţine prin centrifugarea sângelui proaspăt
recoltat pe un anticoagulant până la apariţia a două fracţiuni distincte: sedimentul, format
din elementele figurate şi supernatantul, care reprezintă plasma sanguină (figura 1.2.).
Serul sanguin se obţine prin centrifugarea energică a sângelui recoltat fără anticoagulant
sau prin decantare, după ce sângele integral a fost lăsat să coaguleze la temperatura
camerei, timp de 30-60 minute (figura 1.3.). După acest timp, se obţine o porţiune
inferioară - cheagul (conţine fibrină şi elemente figurante) şi supernatantul limpede, care
reprezintă serul. Serul are o compoziţie asemănătoare cu a plasmei, cu excepţia factorilor
coagulării – fibrinogen, FII, FV, FVIII, care au fost folosiţi pentru formarea coagulului. În
plus, serul conţine cantităţi mari de serotonină rezultată din degranularea trombocitelor în
procesul coagulării.

Figura 1.2. Plasma sanguină obţinută după centrifugarea sângelui.

http://blood-histology.blogspot.com/

13
 Figura 1.3. Serul sanguin
obţinut după coagulare.
http://blood-
histology.blogspot.com/

Plasma şi serul au aceeaşi compoziţie, cu excepţia fibrinogenului şi a altor

factori ai coagulării pe care serul nu-i mai conţine, deoarece s-au consumat în
procesul de coagulare.

Proprietăţile fizico-chimice ale plasmei

Culoarea - plasma este un lichid clar sau uşor gălbui.
Densitatea este conferită mai ales de proteine. Valorile normale variază între 1024-1030
kg/m3. În plasma deproteinizată, densitatea se reduce la 1006. Densitatea sângelui
integral depinde atât de concentraţia proteinelor, cât şi de numărul elementelor figurate.
Presiunea osmotică - presiunea osmotică este presiunea care apare între două soluţii cu
compoziţie diferită, separate printr-o membrană semipermeabilă. Aceasta permite trecerea
solventului şi nu permite trecerea substanţelor dizolvate (figura 1.4.). Presiunea osmotică
depinde exclusiv de numărul particulelor cristaline dizolvate în plasmă, fiind dată în
proporţie de 80% de NaCl. Valoarea presiunii osmotice este practic aceeaşi în sânge,
plasmă, lichid extracelular şi mediul intracelular, fiind un factor de bază al homeostaziei
organismului. Presiunea osmotică determină sensul şi intensitatea transferurilor de lichide
prin membrane. Apa trece din mediul cu presiune osmotică mică (hipoton), spre cel cu
presiune osmotică mai mare (hiperton), până la egalizarea presiunilor şi diluarea mediului
concentrat.
Valori normale: 280-310 mOsm/l; 7,6 – 8,1 atm.; 5300 mmHg; 660 - 770 kPa sau,
exprimată sub formă de temperatură de îngheţ (= punct crioscopic), valoarea este de: -
0,56 … -0,58°C.

O soluţie cu osmolaritate egală cu a plasmei se numeşte izotonică (ex. NaCl

0,9%), cea cu osmolaritate mai mică hipotonă, iar cea cu osmolaritate mai mare
hipertonă.

Presiunea coloid-osmotică sau oncotică este atribuită proteinelor plasmatice. Efectele

acestei presiuni sunt de a menţine apa şi electroliţii în vase şi de a influenţa activ
schimburile hidro-electrolitice la nivel de capilar, atât la nivelul capilarelor din circulaţia
sistemică, cât şi a capilarelor renale. Valori normale: 25 mmHg.
Reacţia sângelui (şi plasmei) - dată de concentraţia ionilor de H+. Valori normale: 7,38 -
7,42. pH-ul sanguin este unul dintre parametrii care caracterizează constanţa mediului

14
intern, menţinerea lui în limite normale realizându-se prin mecanisme biologice
(aparatele: respirator, renal; ficatul; pielea) şi mecanisme chimice (sistemele tampon).

Figura 1.4.

Lucrări practice efectuate în laborator.

Determinarea densităţii sângelui şi plasmei - Metoda Phillips - Van Slyke
Principiul determinării. Determinarea densităţii sângelui sau plasmei se face comparativ,
faţă de o serie de soluţii de sulfat de cupru ale căror densităţi ne sunt cunoscute. Picătura
de plasmă sau sânge se acoperă cu o peliculă de proteinat de cupru care-i permite
plutirea, pentru câteva secunde, în interiorul lichidului, în momentul când densităţile celor
două lichide sunt egale.
Materiale necesare.
- sânge şi plasmă;
- flacoane cu soluţii de sulfat de cupru cu densităţi diferite;
- pipete.
Tehnica de lucru.
Se iau dopurile de la flacoanele cu sulfat de cupru şi se lasă câtva timp la temperatura
camerei. Din eprubeta cu sânge integral, se iau 2 ml cu o pipetă şi se lasă să cadă în
fiecare flacon câte o picătură de sânge de la o înălţime de maximum 1cm de la suprafaţa
lichidului.
Pot exista trei situaţii:
- picătura de sânge se ridică la suprafaţa lichidului, ceea ce înseamnă că densitatea
picăturii e mai mică decât densitatea soluţiei;
- picătura de sânge coboară spre partea inferioară a flaconului, fiind, deci, cu densitate
mai mare decât a soluţiei din flacon;
- picătura de sânge pluteşte în interiorul soluţiei timp de câteva secunde până la ½
min, deci densitatea sângelui este aceeaşi cu densitatea soluţiei din flaconul
respectiv.

15
La fel se procedează şi pentru determinarea densităţii plasmei. Seria de soluţii de sulfat de
cupru cu densităţi cunoscute poate fi folosită la mai multe determinări (după un timp, atât
picăturile de plasmă cât şi cele de sânge integral se vor strânge în partea inferioară a
flacoanelor). În general, soluţiile se vor schimba când depozitul de sânge sau plasmă
depăşeşte 1/4 din volumul total al soluţiei.
Rezultate. Prin această metodă, obţinem două valori: densitatea sângelui integral (DS) şi
densitatea plasmei (DP).
R.A. Phillips şi Van Slyke au construit o nomogramă cu ajutorul căreia, cunoscând
densitatea unei probe de sânge şi a plasmei, se pot obţine valorile hematocritului (Ht) în
%, a hemoglobinei (Hb) în g% şi a proteinelor totale din plasmă în g% (vezi nomograma,
figura1.5.). Metoda permite determinarea proteinemiei şi a Hb cu erori foarte mici.
Valori de referinţă (kg/m3):
- Plasmă: 1027 cu limite între 1024-1030.
- Sânge integral: 1055-1067 -bărbaţi; 1051-1061 -femei;
Variaţiile densităţii plasmei şi sângelui
- Creşteri fiziologice:
• la altitudine, prin splenocontracţie, creşte numărul de eritrocite;
• în efort, prin acelaşi mecanism;
• în deshidratări, prin transpiraţie.
- Creşteri patologice:
• deshidratări - prin diaree, vomă, arsuri - se pierde apă;
• poliglobulii primare sau secundare;
• şoc - în care se produce o concentrare a eritrocitelor, ca urmare a creşterii
permeabilităţii capilare şi trecerii lichidului circulant în interstiţii.
- Scăderi fiziologice:
• la gravide, prin creşterea fracţiunii plasmatice, ca urmare a atragerii apei în vas,
sub acţiunea progesteronului şi a estrogenilor;
• ingerare masivă de lichide.
- Scăderi patologice:
• anemii;
• posthemoragie, la câteva ore de la producerea acesteia, când lichidul interstiţial
este atras în vase, pentru compensarea pierderii de volum şi menţinerea
presiunii arteriale.
Importanţa determinării.
- determinarea densităţii sângelui integral şi a plasmei permit aprecierea rapidă, prin
nomograme, a hematocritului, a cantităţii de Hb şi a concentraţiei proteinelor
plasmatice;
- metoda Van Slyke permite diagnosticul de şoc postoperator, şoc datorat arsurilor
întinse şi şoc posthemoragic. De asemenea, ajută la stadializarea şocului şi
orientarea tratamentului în şoc, anemii, deshidratări etc.

Studiu individual

1. Consultând un dicţionar medical, definiţi următorii termeni: hormon, anticoagulant,

ser, fibrinogen, coagulare, hematocrit, sistem tampon.
2. Consultând un tratat medical, determinati situaţiile patologice în care presiunile
osmotică şi coloid-osmotică intervin în patologia umană.
3. Consultând un tratat medical, determinaţi situaţiile patologice în care există
modificări ale pH-ului sanguin.

16
 Figura 1.5. Graficul Van Slyke şi colab. (Hb - hemoglobină; Ht - hematocrit)
Punctul în care linia care uneşte scala I cu scala a III-a şi intersectează scala a II-a, arată
valoarea hemoglobinei şi hematocritului

17
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Notaţi valorile obţinute pentru densitatea plasmei şi a sângelui integral.

................................................................................................................................................
2. Identificaţi parametrii de care depinde densitatea sângelui integral.

................................................................................................................................................
3. Identificaţi parametrii de care depinde densitatea plasmei.

................................................................................................................................................
4. Indicaţi cum poate fi densitatea sângelui la o gravidă, în ultimul trimestru de sarcină.
Cum numiţi situaţia respectivă şi de ce apare la gravide?

................................................................................................................................................
5. Care este importanţa clinică a determinării densităţii sângelui şi a plasmei?

................................................................................................................................................
6. Notaţi valorile corecte pentru presiunea osmotică.

................................................................................................................................................
7. Notaţi valorile corecte pentru presiunea oncotică.

................................................................................................................................................
8. Notaţi valorile corecte pentru pH-ul sanguin.

................................................................................................................................................
9. Calculaţi volumul plasmatic aproximativ existent în corpul dumneavoastră.

................................................................................................................................................
10. Analizaţi densităţile plasmei la două persoane care au valori diferite ale proteinemiei,
de exemplu 5 g/dl şi 7,5 g/dl.

……………………………………………………………………………………………...............

18
1.5. DETERMINAREA VOLUMULUI SANGUIN
Definiţie. Volumul sanguin total este cantitatea totală a sângelui circulant care ocupă, la
un moment dat, toate compartimentele aparatului cardiovascular (cavităţile cordului,
artere, vene, capilare) şi organele care depozitează sângele (ficat, splină, plexuri
subpapilare).

Volumul sanguin total = Volumul plasmatic + Volumul hematiilor

Metode de determinare
Metode directe. Exanghinare experimentală la animale – metodă preconizată de Welcker.
Metoda constă în recoltarea întregii cantităţi de sânge, urmată apoi de spălarea întregului
arbore circulator cu soluţie izotonică. Se dozează apoi colorimetric cantitatea de Hb din
lichidul de spălare şi din sânge, permiţând astfel calcularea cantităţii totale de sânge.
Metode indirecte.
- Metoda diluţiei. Această metodă se bazează pe principiul diluţiei. Se introduc în
sânge substanţe marker, în cantitate cunoscută; se aşteaptă omogenizarea lor în
sânge şi se recoltează o probă de sânge marcat, în care se determină concentraţia
substanţei marker. Substanţa marker fie se diluează în plasmă, fie se fixează pe
hematii. Dacă într-un volum V se dizolvă o cantitate Q, concentraţia C, a ei, este:
Q
C=
V
Aceste substanţe şi metode sunt prezentate în tabelul 1.1.
- Ecuaţii şi nomograme în care valorile normale ale volumului de sânge sunt
calculate în funcţie de: vârstă, sex, greutate, talie.
- Relaţia dintre volumul de sânge, volumul plasmei şi hematocrit este:

Volum plasmă
Volum sânge =
1 - Hematocrit
Determinarea volumului plasmatic prin metoda cu colorant Albastru Evans
Principiul: Se injectează intravenos o cantitate mică (cunoscută) de soluţie albastru
Evans 0,5%, cantitate care, practic, nu se modifică în cursul investigaţiei, deoarece nu
difuzează în ţesuturi şi se elimină foarte lent. Cunoscând concentraţia ei în plasmă, după
ce s-a omogenizat în tot sângele, înainte de a începe să fie eliminată, se poate afla
volumul plasmei în care s-a diluat substanţa respectivă.
Materiale necesare:
- anticoagulant: amestec Wintrobe sau heparină;
- albastru Evans 0,5% în apă distilată sterilă, conservat la întuneric şi temperatură
scăzută.
Condiţii de determinare a volumului plasmatic. Subiectul este supus în prealabil unei
diete fără grăsimi, timp de 24 de ore înaintea probei, pentru a evita o eventuală lipemie
crescută care modifică rezultatele fotometrice.
Cu 12 ore înainte de probă, subiectul nu se alimentează şi nu bea lichide. De asemenea,
va sta în repaus pe tot acest interval şi în timpul determinării experimentale şi i se va
asigura o stare de echilibru termic. Cantitatea de colorant să nu satureze complet
albumina plasmatică (1 ml colorant la 30 ml albumină).
Tehnica de lucru. Se determină în prealabil o curbă de etalonare, folosind o scară de
diluţii a colorantului albastru Evans 0,5% în plasmă umană proaspătă recoltată pe
anticoagulant. Se folosesc diluţiile: 0,002 mg/ml; 0,004 mg/ml; 0,006 mg/ml; 0,008 mg/ml;
0,01 mg/ml şi se citesc aceste diluţii la spectrofotometru la lungimea de undă λ=640nm.
19
Se reprezintă grafic astfel încât pe abscisă să avem concentraţiile de soluţie Albastru
Evans, iar pe ordonată corespunzător acestora, extincţia lor, trasându-se astfel o curbă
(vezi figura 1.6).

Tabelul 1.1. Substanţe şi metode utilizate pentru determinarea volumului sanguin

- Albastru Evans (T 1824)
- Roşu de Congo
Coloranţi
Substanţe folosite - Roşu de Chicago
I pentru determinarea - Albastru Geigy
volumului plasmatic Izotopi radioactivi - RISA cu I131 sau cu I123
Substanţe - Polivinil – pirolidon
macromoleculare - Dextran
CO
Substanţe folosite - Fe55, Fe59
pentru determinarea
II - Cr51
volumului Izotopi radioactivi
hematiilor - P32
- K42
- Constau în determinarea
impedanţei electrice înainte şi după
Metode fizice injectarea unei substanţe rău
Determinarea conducătoare de electricitate, care
III volumului sanguin creşte impedanţa.
total - Marcarea simultană a plasmei cu
Metoda dublei RISA şi a hematiilor cu Cr51.
marcări

Înainte de administrarea substanţei marker se recoltează pacientului 10 ml sânge pe

anticoagulant şi se centrifughează pentru obţinerea hematocritului, iar supernatantul se
centrifughează într-o altă eprubetă, pentru a obţine plasma martor. Pe acelaşi ac se
injectează 3 ml colorant 0,5%. La sfârşitul injectării se aspiră în seringă sânge şi se
reinjectează cu scopul de a spăla seringa. La 3 minute din momentul în care s-a injectat
tot colorantul, se recoltează prima probă de sânge, 10 ml pe anticoagulant, de la celălalt
braţ. Se centrifughează. Se citeşte la spectrofotometru densitatea optică (extincţia) a
plasmei colorate, folosind pentru cuva de compensaţie sau plasma martor, plasma
obţinută prin recoltarea sângelui înainte de injectarea colorantului. Din extincţia citită, se
poate afla pe curba de etalonare concentraţia substanţei în sânge. Se recomandă citirea la
fotometru imediat după centrifugare întrucât densitatea optică a plasmei colorate scade
rapid.
Tehnica experimentală de determinare a volumului plasmatic cu Albastru Evans
- Se cântăreşte animalul de experienţă (câine).
- Se fixează pe o masă de contenţie în decubit dorsal, legându-i-se membrele. Se face
anestezie generală cu cloraloză 1% (1 ml/kg corp) inj. i.v., după care se incizează şi
se descoperă vena femurală de la plica inghinală de la ambele membre.

20
 0,5

Extincţie λ = 640 nm 0,4

0,3

0,2

0,1

0,0
0,002 0,004 0,006 0,008 0,01

[mg/ml] Albastru Evans

Figura 1.6. Curba de etalonare pentru determinarea volumului plasmatic

prin metoda albastru Evans.

- Se prelevează proba martor de sânge prin puncţie pe vena femurală în care s-a
introdus un cateter adaptabil la o seringă. Se centrifughează sângele recoltat pentru
aflarea hematocritului şi pentru a avea plasma normală, martor.
- Se injectează prin cateter o soluţie de ser fiziologic heparinat pentru a preveni
coagularea sângelui în vas, în cursul experimentului.
- Se injectează rapid colorantul intravenos pe cateter, sol. 0,5% în cantitate de 0,1–0,2
mg/kg.
- Se recoltează probe de sânge de pe cateter, de la vena femurală a celuilalt membru
la 5, 10 şi 15 minute şi se citesc extincţiile lor la spectrofotometru în λ = 640 nm. Se
plasează valorile extincţiilor de la 5, 10 şi 15 minute pe un grafic pe care, punctat,
aducem curba acestor concentraţii la zero (practic, ar coincide cu momentul injectării,
când colorantul are cea mai mare concentraţie în sânge).
- Se citeşte extincţia probei martor (cuva de compensaţie) înainte de injectarea
colorantului.
- Pentru a afla concentraţia probei martor şi a probei de cercetare folosim curba de
etalonare, făcută în prealabil, la care pentru fiecare extincţie corespunde o anumită
concentraţie. Se determină volumul plasmatic cu ajutorul raportului:

Concentraţia probei standard

VP =
Concentraţia probei de cercetat

- Pentru calcularea volumului sanguin total VS folosim relaţia:

VP
VS =  100
100 − 0.87 Ht

21
Valori normale şi variaţii patologice ale volemiei
Valorile normale şi variaţiile patologice sunt redate în tabelele 1.2. şi 1.3.

Tabelul 1.2. Valori normale şi variaţii fiziologice ale volumului sanguin

Bărbaţi Femei
- 76 ml/kgc - 66 ml/kgc
Valori 2
normale - 3000 ml/m - 2500 ml/m2
- 6-8% din greutatea
4-5 l de sânge - 1/12 din - 1/15 din greutatea corpului
în total greutatea corpului
corpului
- nou-născut: 88 ml/kgc;
- scade spre adolescenţă: 70 ml/kgc;
Vârstă
- după pubertate este mai mare la bărbat;
- scade la vârstă înaintată;
- la obezi volumul sanguin este mai mic;
Greutatea
corpului - volumul sanguin este proporţional cu masa
musculară a individului;
- volum scăzut în ortostatism, cu 300 ml; după
30 min. volumul scade cu 15% faţă de
Poziţia corpului decubit;
- volum crescut în clinostatism; în repaus
Variaţii patologic prelungit scade cu 500 ml;
fiziologice - în sarcină, volumul creşte cu 30-50%,
Graviditatea începând din luna a III-a şi este maxim în luna
a IX-a, interesând volumul plasmatic;
- primăvara, vara – volumul sanguin creşte cu
Anotimp 15-20% (în legătură cu termoreglarea);
- toamna, iarna – volumul sanguin scade;
- scăderea presiunii atmosferice creşte volumul
Presiunea
de sânge pe seama volumului globular (la
barometrică
altitudine);
- creşte în efort la sportivi, prin creşterea masei
Activitatea fizică corporale active şi mobilizarea sângelui din
rezervoare.

22
 Tabelul 1.3. Variaţii patologice ale volumului de sânge
normocitemică
- situaţie fiziologică
NORMOVOLEMIE Ht = 45%
oligocitemică
- sindrom posthemoragic faza II
Volum normal de Ht < 35%
sânge policitemică
- leucemie
Ht > 58%
- hipertensiune arterială
normocitemică
- stări postransfuzie cu sânge
integral
Ht = 45%
- hipertiroidism
HIPERVOLEMIE oligocitemică
- ciroze hepatice
- nefrite
Volum crescut de sânge Ht < 35%
policitemică
- boala Vaquez
- leucemii
Ht > 58%
normocitemică - hemoragie – faza acută
- mixedem
Ht = 45% - obezitate
- anemii toxice grave
oligocitemică
- caşexie
HIPOVOLEMIE - TBC
Ht < 35%
- anemii pernicioase
- deshidratări masive
Volum scăzut de sânge
- şoc
policitemică
- arsuri
- transpiraţii excesive
Ht > 58%
- diaree
- vărsături

Studiu individual

Consultând cursul „Fiziologia sângelui” şi materialele recomandate în bibliografie,

răspundeţi la următoarele cerinţe:
1. Definiţi următorii termeni: hipovolemie, hipervolemie, oligocitemie, policitemie,
substanţă marker.
2. Comentaţi utilitatea metodelor de determinare a volumului sanguin în practica
medicală.

23
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Enumeraţi componentele volumului sanguin total.

................................................................................................................................................
2. Care sunt valorile normale ale volumului de sânge ?

………………………………………………………………………………………………..............
.
3. Enumeraţi factorii fiziologici care produc modificări ale volumului de sânge.

………………………………………………………………………………………………..............
.
4. Explicaţi modificările volumului de sânge asociate vârstei, gravidităţii, efortului fizic.

…………………………………………………………………………………………...........…....
5. Explicaţi modalitatea prin care hematocritul influenţează vâscozitatea sângelui în
normovolemii, hipovolemii şi hipervolemii.

…………………………………………………………………………………………...........…....
6. Completaţi valorile corespunzătoare hematocritului în tabelul următor:

normocitemică

Ht =..........
NORMOVOLEMIE oligocitemică

Volum normal de sânge Ht <..........

policitemică

Ht >..........
normocitemică

Ht =..........
HIPERVOLEMIE oligocitemică

Ht <..........
Volum crescut de sânge
policitemică

Ht >..........
normocitemică

Ht =..........
HIPOVOLEMIE oligocitemică

Ht <..........
Volum scăzut de sânge
policitemică

Ht >..........

24
 CAPITOLUL 2. EXPLORAREA SERIEI ERITROCITARE

2.1. NUMĂRĂTOAREA ERITROCITELOR

Eritrocitul sau hematia este elementul final al seriei roşii. Denumirea eritrocitului vine de la
cuvintele greceşti „erithros” - roşu şi de la „kytos” - celulă, denumire care a fost contestată
de-a lungul timpului, datorită absenţei nucleului. Metodele moderne de histochimie,
citochimie şi microscopie electronică, împreună cu argumente de filo şi ontogenie au
consacrat recunoaşterea eritrocitului ca o celulă de sine stătătoare, dar cu o activitate
metabolică restrânsă şi o durată de viaţă limitată.
Rolul principal este transportul O2 de la plămâni la ţesuturi şi a unei părţi din CO2 de la
ţesuturi la plămâni. În plus, prin sistemele tampon pe care le conţine, eritrocitele participă
la menţinerea echilibrului acido-bazic.
Numărarea eritrocitelor se poate realiza prin:
- metode clasice, folosind camere de numărat;
- metode moderne, folosind analizoare automate.
Numărarea eritrocitelor prin metode moderne
- Numărătorul automat bazat pe variaţiile de impedanţă electrică.
Principiul metodei constă în trecerea unui volum definit de sânge, foarte diluat cu soluţie
NaCl 0,9% (1/20 000), printr-un orificiu având diametrul de ordinul zecilor de microni.
Diluţia mare şi orificiul mic, nu permit trecerea a două hematii în acelaşi timp. Între cele
două compartimente se stabileşte un circuit electric prin doi electrozi şi se măsoară
impedanţa. Trecerea hematiilor prin microorificiu determină creşterea bruscă a impedanţei;
variaţiile de tensiune apărute sunt amplificare şi numărate de un numărător de particule şi
sunt afişate digital. Pentru trasarea curbei Price-Jones aparatul este prevăzut cu un
analizator multicanal care numără separat hematiile de diferite mărimi (diametre), reţine
datele în memorie şi trasează curba pe un tub catodic.
- Numărătorul automat bazat pe principiul reflectării luminii de către masa de hematii.
- Numărătorul automat cu sistem optic bazat pe scintilaţiile fiecărei hematii.
Hematiile aflate într-o soluţie foarte diluată trec printr-un tub subţire, puternic luminat
lateral. Scintilaţiile particulelor sunt detectate de un fotomultiplicator, amplificate, numărate
şi afişate digital.
Lucrări practice de efectuat în laborator
Numărătoarea eritrocitelor prin metoda clasică
Principiul metodei: Se numără eritrocitele direct la microscop, cu ajutorul camerei de
numărat, care permite evidenţierea eritrocitelor dintr-un volum şi o diluţie cunoscute.
Materiale necesare
- Alcool pentru dezinfectarea pielii, vată, instrumentar de unică folosinţă, steril, pentru
puncţie venoasă sau capilară.
- Lichid de diluţie: Hayem sau lichid Withby. În lipsa acestora se foloseşte ser
fiziologic. Pe lângă rolul de diluţie, acest reactiv lizează leucocitele şi trombocitele,
pentru ca în cameră să nu apară decât eritrocite.
- Pipetă Potain pentru eritrocite (figura 2.1.). Această pipetă este un tub capilar
prevăzut cu o bulă de diluţie în care se găseşte o perlă roşie, pentru omogenizarea
soluţiei. Pe pipetă se observă trei gradaţii: 0,5; 1; 101. În momentul folosirii se
ataşează un tub de cauciuc pentru aspiraţie.
- Camere de numărat. Orice cameră de numărat (figura 2.2.) are gravate înălţimea
camerei (1/10 mm) şi două cifre (1/400 şi 1/25) care indică a câta parte dintr-un
milimetru pătrat reprezintă pătratul mic şi, respectiv, pătratul mare. Se folosesc
următoarele tipuri de camere:

25
 • Camera Thoma (figura 2.3): are o suprafaţă de 1 mm 2 divizată
prin linii triple în 16 pătrate mari, cu suprafaţa de 1/25 mm 2; la
rândul lor, acestea sunt divizate prin linii simple, în 16 pătrate
mici cu suprafaţa de 1/400 mm2. Această cameră este
destinată numărătorii eritrocitelor.
• Camera Bürker (figura 2.4): are o suprafaţă de 9 mm2 divizată
prin linii triple în 9 pătrate cu suprafaţa de 1 mm 2, la rândul lor
fiind divizate prin linii duble, în 16 pătrate cu suprafaţa de 1/25
mm2.
0,10 mm Lamelă

Figura 2.2. Profilul unei camere de numărat.

Figura 2.1. Pipeta Potain

La intersecţia liniilor duble se delimitează pătrate cu suprafaţa de 1/400 mm 2, care pot fi
folosite pentru numărătoarea eritrocitelor. Această cameră este destinată, în principal,
numărătorii leucocitelor.

Pătrat mic 1/400

Pătrat mare 1/25

Figura 2.3. Reţeaua camerei Thoma.

Figura 2.4. Reţeaua camerei Bürker.

26
 • Camera Bürker-Türck (figura 2.5.): are o suprafaţă de 9 mm2 divizată prin linii
triple în 9 pătrate cu suprafaţa de 1 mm 2. Pătratul din mijloc are un caroiaj tip
cameră Thoma şi este destinat numărătorii eritrocitelor. Restul pătratelor au un
caroiaj tip cameră Bürker şi sunt destinate numărătorii leucocitelor.
• Camera Goreaev (figura 2.6.): prezintă o alternanţă de 16 pătrate cu suprafaţa
de 1/400 mm2, destinate numărătorii eritrocitelor, cu pătrate de 1/25 mm2,
destinate numărătorii leucocitelor.
- Lamela care acoperă camera trebuie să fie perfect plană şi şlefuită, cu o grosime de
aproximativ 0,3 – 0,5 mm.
- Microscop. Se folosesc obiectivul 40 uscat, ocularul 10 sau 7 şi lumină slabă.

Figura 2.5. Reţeaua camerei Bürker-Türck.

Figura 2.6. Reţeaua camerei Goreaev.

Tehnica de lucru. Metoda a fost concepută pentru numărarea eritrocitelor în sângele
capilar. Se recomandă ca recoltarea sângelui să se facă prin puncţionarea degetului
mediu de la mână sau a lobului urechii la adult, sau puncţionarea regiunii calcaneene la
copil, numai în situaţia în care există pipetă Potain sterilă sau de unică folosinţă. Este
preferabil să se recolteze sânge venos prin puncţie venoasă, cu instrumentar steril, iar
pipeta Potain să se încarce din eşantionul de sânge venos recoltat.
27
După dezinfectarea pielii, se înţeapă cu acul steril, suficient de profund ca sângele să
apară spontan la suprafaţa, fără a comprima zona puncţionată. Se îndepărtează prima
picătură de sânge şi se aspiră în pipeta Potain a doua picătură de sânge până la
diviziunea 0,5 (pentru diluţia de 1/200) sau până la diviziunea 1 (pentru diluţia 1/100). Se
aspiră lichidul de diluţie până la diviziunea 101 şi se agită 2 – 3 minute cu pipeta în poziţie
orizontală, pentru omogenizare.
Umplerea camerei: se aşează lamela peste cameră cu atenţie, pentru a obţine o bună
aderenţă între lamelă şi marginile camerei (figura 2.2). Lamela este corect fixată când apar
inelele Newton (inele colorate de refracţie). Se agită din nou pipeta Potain, se lasă să cadă
primele 2 – 3 picături, după care se apropie vârful pipetei de marginea lamelei şi se umple
camera prin capilaritate. Se aşteaptă câteva zeci de secunde pentru sedimentarea
hematiilor. Se va evita: excesul de lichid, formarea bulelor de aer în cameră, pătrunderea
lichidului în şanţurile laterale sau deplasarea lamelei; în aceste condiţii se va repeta
operaţia.
Numărătoarea eritrocitelor: se numără eritrocitele aflate pe suprafaţa a cinci pătrate mari
(1/25 mm2 ) adică un total de 80 pătrate mici (1/400 mm 2); pentru a nu se număra de două
ori elementele situate pe liniile ce delimitează pătratele mici, se vor număra hematiile
aflate numai pe două din laturile pătratului, de exemplu sus şi stânga.
Calcul: numărul de eritrocite găsite pe cele cinci pătrate mari se împarte la 80 (numărul de
pătrate mici din cele 5 pătrate mari) şi astfel se află media pentru un pătrat mic (1/400
mm2). Media se înmulţeşte cu numărul total de pătrate mici cuprinse într-un milimetru
pătrat (400), cu inversul diluţiei folosite (respectiv 100 sau 200) şi cu inversul înălţimii
camerei (10).

 400  10  100(sau 200)

Eritrocite numarate
Numar eritrocite/ mm 3 =
80
Surse de eroare:
- etalonare greşită a pipetelor de diluţie, a camerei de numărat sau lamelă care nu are
suprafaţa plană;
- spălare defectuoasă a materialelor;
- înţepătură superficială, afecţiuni vasculare ale degetelor (edem, cianoză etc.);
- apăsarea degetului pentru obţinerea sângelui (sângele se diluează cu limfă);
- evaporarea, coagularea sau sedimentarea probei de sânge;
- intrarea bulelor de aer în pipetă;
- suspensie neomogenă datorată agitării insuficiente sau aglutinării patologice a
elementelor celulare (autoanticorpi);
- introducerea în camera de numărat a unei cantităţi prea mici sau prea mari din probă;
- existenţa unor leucocitoze mari, care alterează precizia numărătorii;
- metoda folosită (numărătoarea la microscop) poate produce creşteri sau diminuări
false ale numărului de eritrocite.
Factorii care pot modifica numărul de eritrocite
- Temperatura crescută a mediului determină deshidratarea subiectului urmată de
scăderea volemiei şi hemoconcentraţie.
- Recoltarea sângelui venos imediat după staza venoasă, realizată prin aplicarea
garoului, oferă un eşantion de sânge cu hemoconcentraţie.
- Poziţia corpului:
• Ortostatism prelungit: prin creşterea presiunii hidrostatice în teritoriile situate
sub nivelul inimii este favorizată trecerea apei din vase în interstiţiu. Scăderea
volemiei determină apariţia hemoconcentraţiei.
• Clinostatism prelungit - favorizează menţinerea sau creşterea volemiei şi, în
consecinţă, determină un număr scăzut de hematii.

28
 - Stresul produce vasoconstricţie, mobilizarea sângelui din organele rezervor de
sânge, ceea ce determină hemoconcentraţie.
- Stări patologice care modifică volemia:
• Scăderea volemiei (vărsături, diaree, transpiraţii, administrarea unor
medicamente etc.) produce hemoconcentraţie.
• Creşterea volemiei (hiperhidratarea organismului prin ingestie excesivă de
lichide, perfuzii etc.) produce hemodiluţie.
- Tratamente cu medicamente care modifică numărul de hematii sau volemia.
Valori normale şi variaţii fiziologice ale numărului de eritrocite (tabelul 2.1.)
Prin metoda clasică, valorile fiziologice sunt cuprinse între 4 000 000 – 6 000 000 /mm3.
Există variaţii fiziologice în funcţie de vârstă, sex, altitudine, anumite perioade fiziologice
(digestie, efort fizic) şi temperatura mediului.
Persoanele care trăiesc la altitudine mare au valori mai mari ale numărului de eritrocite
(poliglobulie fiziologică de altitudine) decât restul populaţiei, datorită presiunii parţiale mai
mici a oxigenului.
Variaţiile zilnice ale numărului de hematii în legătură cu digestia, efortul fizic şi
termoreglarea, sunt de 10 –15%. În efortul fizic, datorită splenocontracţiei şi trecerii
crescute de lichide în interstiţiu, creşte numărul de hematii (poliglobulie de repartiţie).
Valoarea normală a numărului de hematii este stabilită prin metode statistice, pe loturi de
populaţie, în funcţie de: altitudinea la care trăiesc, specificul morfofiziologic al unor etnii,
expunerea prelungită la unele noxe etc.
Variaţii patologice
Creşterea numărului de eritrocite, în paralel cu creşterea concentraţiei de hemoglobină
şi a hematocritului, poartă numele de poliglobulie; vâscozitatea sângelui este crescută.
Poliglobuliile (eritrozele) se clasifică în:
- relative - poliglobulii prin hemoconcentraţie datorită pierderii de apă (deshidratări prin
transpiraţie, vărsături, febră, şoc, tratament cu diuretice etc.);
- primare – eritremia (policitemia vera sau boala Vaquez);
- secundare – apar prin creşterea secreţiei de eritropoetină, ca răspuns la hipoxia
tisulară cronică, în cazul fumătorilor care au o concentraţie de CO crescută în sânge,
în boli pulmonare obstructive, insuficienţă cardiacă, tumori secretoare de
eritropoetină.
Scăderea numărului de eritrocite, în paralel cu scăderea hemoglobinei şi hematocritului,
poartă numele de anemie. Anemiile se clasifică în:
- anemii prin pierderi de masă eritrocitară – este grupul anemiilor posthemoragice
acute şi cronice;
- anemii prin tulburări de producţie eritrocitară (disfuncţie eritropoetică, mitotică
sau de maturaţie şi diferenţiere):
• anemii carenţiale – apar în absenţa sau aportul redus al unor factori necesari
hematopoezei.
▪ Carenţa de fier, vitamina B6, vitamina C etc., determină producerea
unor hematii mici (microcite), slab colorate (hipocrome), cu încărcare
redusă de hemoglobină (VEM, HEM, CHEM scăzute). Aceste anemii se
numesc şi anemii hipocrome, microcitare.
▪ Carenţa vitaminei B12 şi/sau a acidului folic determină producerea unor
hematii cu diametru şi volum crescut. Aceste hematii se numesc
macrocite sau megalocite şi par mai intens colorate (hipercrome), din
cauza redistribuirii uniforme a hemoglobinei. Indicii eritrocitari VEM şi
HEM cresc, iar CHEM rămâne normal. Aceste anemii se numesc anemii
megaloblastice. În această categorie se încadrează şi anemia
pernicioasă Addison-Biermer.
29
 Pot apărea anemii şi prin carenţe de cupru şi cobalt. Frecvent, există
▪
carenţe complexe, intricate (Fe, vitamina B12, acid folic, proteine, alte
vitamine), acestea fiind întâlnite la pacienţii neoplazici, gastrectomizaţi,
denutriţi, în boli cronice consumptive etc.;
• anemii aplastice – apar în hipoplazii sau aplazii medulare.
- anemii prin distrucţie eritrocitară crescută (hipersplenism) sau prin scăderea
duratei de viaţă a eritrocitelor (anemii hemolitice).

Tabelul 2.1. Variaţiile fiziologice ale numărului de eritrocite, în funcţie de vârstă şi sex
Vârsta
Eritrocite (mil / mm3)
Zile Luni Ani
1 5,1  1
2–3 5,1
4–8 5,1
9 – 13 5,0
14 – 60 4,7  0,9
3–5 4,5  0,7
6 – 15 4,6
1 4,5
2 4,6
3 4,5
4 4,6  0,6
5 4,6
6 – 10 4,7
11 - 15 4,8
bărbaţi 4,9  0,7
Adulţi
femei 4,3  0,6

Studiu individual

Consultând un dicţionar medical şi materialele didactice recomandate, vă rugăm să

explicaţi semnificaţia termenilor: volemie, diluţie, deshidratare, poliurie, pubertate,
climacteriu, hemoconcentraţie, hemodiluţie, anemie, poliglobulie, gastrectomie.
1. Asociaţi termenii: hemoconcentraţie şi hemodiluţie, cu termenii: deshidratare,
vărsături, transpiraţii, poliurie, ingestie de lichide în exces, volemie crescută.
2. Ce efecte au anemia şi poliglobulia asupra vâscozităţii sângelui?
3. Explicaţi de ce sexul idividului influenţează numărul fiziologic de hematii. Aplicaţi
această explicaţie la perioada prepubertară şi postclimacteriu.
4. Explicaţi variaţiile numărului de hematii la nou născut şi sugar.
5. Explicaţi modificarea numărului de hematii la persoanele care se deplasează de la
şes la altitudini de peste 2000 m, comparativ cu persoanele care trăiesc permanent
la altitudini mari.
6. De ce sportivii de performanţă se deplasează la munte pentru antrenamente?
7. Explicaţi modificarea numărului de hematii în condiţii de stres.

30
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Prezentaţi principiul metodei de numărare a hematiilor folosind camera de numărat.

................................................................................................................................................
2. Ce rol are pipeta Potain şi ce diluţii poate realiza?

………………………………………………………………………………………………..............
3. Marcaţi pătratele cu suprafaţa 1/25 mm2 şi 1/400 mm2 pe desenul reprezentând
reţeaua camerei Thoma.

4. Marcaţi pătratele cu suprafaţa de 1 mm2, 1/25 mm2 şi 1/400 mm2 în reţeaua

corespunzătoare camerei Bürker-Türck.

5. Ce înălţime au camerele de numărat Thoma şi Bürker-Türck?

………………………………………………………………………………………………..............
6. Citiţi notaţiile de pe suprafaţa lamei de sticlă-suport al camerelor de numărat.

………………………………………………………………………………………………..............
7. Număraţi hematiile (reprezentate prin cercuri) pe suprafaţa pătratului 1/25 mm 2 al
camerei Thoma prezentat mai jos.

31
8. Enumeraţi soluţiile indicate ca lichid de diluţie. Ce proprietăţi trebuie să aibă lichidul de
diluţie?

………………………………………………………………………………………………..............
9. Care este formula de calcul a numărului de eritrocite? Explicaţi fiecare termen din
formulă.

…………………………………………………………………………………………….................
10. Prin numărarea hematiilor pe suprafaţa a 5 pătrate de 1/25 mm2 ale camerei Thoma s-
au obţinut următoarele rezultate: P1 = 180 hematii; P2 = 215 hematii; P3 = 190 hematii; P4
= 220 hematii; P5 = 195 hematii. Diluţia sângelui a fost 1/100. Calculaţi numărul de
hematii/mm3 şi comentaţi rezultatul.

………………………………………………………………………………………………..............
11. Prin numărarea hematiilor pe suprafaţa a 5 pătrate de 1/25 mm2 ale camerei Thoma
s-au obţinut următoarele rezultate: P1 = 58 hematii; P2 = 60 hematii; P3 = 57 hematii; P4
= 63 hematii; P5 = 62 hematii. Diluţia sângelui a fost 1/200. Calculaţi numărul de
hematii/mm3 şi comentaţi rezultatul.

………………………………………………………………………………………………..............
12. Prin numărarea hematiilor pe suprafaţa a 5 pătrate de 1/25 mm2 ale camerei Thoma s-
au obţinut următoarele rezultate: P1 = 150 hematii; P2 = 165 hematii; P3 = 170 hematii; P4
= 143 hematii; P5 = 172 hematii. Diluţia sângelui a fost 1/200. Calculaţi numărul de
hematii/mm3 şi comentaţi rezultatul.

………………………………………………………………………………………………..............

13. Care sunt valorile normale ale numărului de hematii?

………………………………………………………………………………………………………....

32
2.2. NUMĂRĂTOAREA RETICULOCITELOR
Reticulocitul este o celulă-precursor eritrocitar, situată între stadiul de eritroblast oxifil şi
eritrocitul adult. Denumirea provine de la reţeaua granulo-filamentoasă formată din
ribonucleo-proteine şi organite celulare, care precipită în citoplasmă sub acţiunea
colorantului, în coloraţiile supravitale. Organitele celulare (mitocondrii, ribozomi etc.) şi
ribonucleoproteinele permit reticulocitului să aibă activitate metabolică intensă (sinteze,
degradări) şi să continue sinteza hemoglobinei de la aproximativ 90-95%
(corespunzătoare momentului trecerii reticulocitului în sângele circulant) până la
încărcarea completă a celulei cu hemoglobină. Odată cu maturarea celulei, această reţea
dispare şi reticulocitul devine hematie.
În funcţie de aspectul şi abundenţa reţelei, există patru grade de maturare: gradul I -
elemente tinere, cu reţea foarte evidentă, gradele II, III, la care reţeaua scade progresiv şi
gradul IV, la care există doar urme din reţeaua granulo-filamentoasă.
Reticulocitul are o durată de viaţă de 2 – 4 zile în măduvă şi 1 – 2 zile în sângele circulant.
Trecerea reticulocitului din măduvă în sânge (eritrodiabaza) se face prin mişcări active de
diapedeză, pe care reticulocitul le păstrează în sângele periferic şi, din acest motiv, pot
apărea celule cu diferite forme: ovalară, cu pseudopode, treflă, policiclică.
Transformarea reticulocitului în eritrocit este urmată de pierderea mişcărilor şi a
organitelor, completarea sintezei moleculelor de hemoglobină şi dispariţia antigenelor
celulare HLA.
Criterii morfologice de recunoaştere a reticulocitelor: celule mai mari decât eritrocitele cu
diametrul 8 – 9 microni, volum de 150 microni cubi, fără nucleu, cu citoplasmă de culoare
roz şi policromatofilie difuză sau zonală în cazul coloraţiei panoptice. Din acest motiv,
diferenţierea reticulocitelor de eritrocite este dificilă în coloraţiile uzuale, fiind necesară
folosirea coloraţiilor supravitale.
Se folosesc coloraţiile: albastru briliant de crezil, verde Janus, roşu neutru, albastru de
metilen, care evidenţiază în citoplasmă organite care lipsesc la eritrocitul adult
(mitocondrii, ribozomi, mici mase de feritină, vacuole etc.), care se colorează
metacromatic şi ribonucleoproteine, care precipită în timpul colorării.
Metode de evidenţiere şi numărare. Numărul de reticulocite se poate determina folosind:
- Numărătoarea la microscop, pe frotiuri cu coloraţie supravitală, din sânge proaspăt.
- Numărătoarea automată: analizor automat, pe principiul citometriei în flux cu
fluorescenţă şi laser.
A. Metoda cu soluţie alcoolică de albastru briliant de crezil
Materiale necesare
- albastru briliant de crezil, soluţie 1% în alcool absolut;
- cameră umedă (cutie Petri cu hârtie de filtru umezită);
- microscop cu obiectiv cu imersie;
- instrumentar sterilizat pentru recoltat sânge;
- lamă pentru efectuarea frotiului.
Tehnica de lucru Pe lamă se întinde un strat subţire din soluţia albastru briliant de crezil
şi se lasă la uscat. Se întinde apoi un frotiu de sânge proaspăt recoltat peste stratul de
colorant. Se plasează lama în camera umedă un minut, după care se usucă la aer. Se
examinează la obiectivul cu imersie, numărându-se reticulocitele întâlnite la o mie de
eritrocite.
B. Metoda cu albastru briliant de crezil în ser fiziologic
Materiale necesare
- albastru briliant de crezil, soluţie 1% în ser fiziologic;
- oxalat de sodiu, soluţie 1% în ser fiziologic;

33
 - eprubete de centrifugă, eventual parafinate;
- microscop cu obiectiv cu imersie;
- instrumentar sterilizat pentru recoltat sânge;
- lamă pentru efectuarea frotiului.
Tehnica de lucru. Într-o eprubetă se pun trei picături de colorant, douăsprezece picături
de oxalat de sodiu 1% (sau orice anticoagulant) şi două picături de sânge proaspăt. După
30 de minute amestecul se centrifughează timp de 3 minute, iar din sediment se întind pe
lamă frotiuri foarte subţiri. Metoda este mult mai sensibilă decât metoda anterioară,
permiţând decelarea reticulocitelor până la gradul IV. Numărătoarea reticulocitelor se face
cu obiectivul de imersie numărând reticulocitele întâlnite la 1000 de eritrocite.
Valori normale ale numărului de reticulocite. Numărul normal de reticulocite, la adult,
este cuprins între 0,5 – 1,5 % de eritrocite, maximum 2 % eritrocite. În cifre absolute,
valorile normale sunt 20 000 – 80 000/mm3 (în medie 50 000 – 60 000 /mm3).
În practica medicală este necesară corectarea numărului de reticulocite în funcţie de
hematocrit. Numărul de reticulocite calculate procentual dintr-un număr scăzut de hematii
(anemii) oferă un rezultat fals crescut.
%Reticulocite corectat = (%Reticulocite determinat) x (Hematocrit pacient/Hematocrit normal).
Indicele de producţie reticulocitară
Indicele de producţie reticulocitară (IPR) este un indicator al capacităţii regenerative a
măduvei hematogene, cu o bună semnificaţie clinică.
Indicele de producţie reticulocitară (IPR) se calculează folosind:
- % Reticulocite corectat;
- Timpul de maturaţie a cărui valoare este funcţie de hematocrit (tabelul 2.2.).

Tabelul 2.2. Relaţia hematocrit – timp de maturaţie a

reticulocitelor
Hematocrit Timp de maturaţie [zile]
45 % 1
35 % 1,5
25 % 2
15 % 2,5

IPR =(%Reticulocite corectat) /( Timp de maturaţie)

Valori normale:
- IPR = 2 – 3
- IPR > 2 corespunde anemiilor hiperregenerative
- IPR < 2 corespunde anemiilor hiporegenerative
Variaţii fiziologice
La copil, în prima zi de viaţă, valorile se situează la 6 % (300 000 /mm 3) şi reprezintă
reticulocitoza fiziologică a nou-născutului. Din prima săptămână de viaţă, valorile scad
rapid, pentru ca la 3 luni să ajungă la o valoare de 0,5 %. Existenţa unor valori mai mari în
această perioadă de vârstă, pledează pentru o pierdere eritrocitară (hemoragie sau
hemoliză crescută).
Variaţii patologice
Determinarea numărului de reticulocite are o valoare practică mare, fiind indispensabilă în
toate formele de anemii. Numărul reticulocitelor reflectă activitatea proliferativă a
măduvei hematogene. În interpretarea cifrelor trebuie avut în vedere raportul existent
între numărul de reticulocite şi numărul de hematii şi durata de viaţă a acestora. Un număr
normal de reticulocite într-o anemie arată o producţie medulară nesatisfăcătoare. Durata

34
de viaţă a hematiilor este scăzută în anemiile hemolitice şi, în acest caz, un număr normal
de reticulocite indică, de asemenea, o producţie medulară scăzută.
- Scăderea numărului de reticulocite (reticulopenie) indică o producţie medulară
scăzută. Se întâlneşte în:
• Hipoplazie sau aplazie medulară de diverse cauze (iradiere, administrare de
substanţe citotoxice, transformarea sau invazia malignă a măduvei, hemopatii).
• Carenţa unor factori necesari hematopoezei (Fe, vitamina B12, acid folic,
proteine, alte vitamine). În acest tip de anemii, administrarea elementului
carenţial duce la creşterea reticulocitelor în sângele periferic, fenomen numit
criză reticulocitară, spre deosebire de tipul anterior de anemii, la care acelaşi
tratament determină creşteri nesemnificative ale reticulocitelor (măduvă
hiporeactivă, areactivă). Apariţia crizei reticulocitare arată existenţa măduvei
reactive cu potenţial hematoformator bun (cauza anemiei este extra medulară)
şi eficienţa tratamentului antianemic.
• Anemiile din unele boli cronice.
• Anemiile feriprive din infecţiile prelungite.
- Creşterea numărului de reticulocite (reticulocitoză) indică o activitate hematogenă
crescută. Un număr mărit de reticulocite în sângele periferic apare:
• în anemiile hemolitice;
• în stări posthemoragii acute sau în hemoragii cronice;
• după tratamentul anemiilor carenţiale;
• la femeile gravide izoimunizate prin sarcină;
• în hipersplenism;
• după tratamentul cu eritropoetină.
Importanţa determinării numărului de reticulocite în practica medicală. Această
investigaţie hematologică se recomandă în următoarele situaţii:
- Evaluarea capacităţii regenerative a măduvei hematogene în anemii hemolitice,
anemii posthemoragie, anemii carenţiale etc.
- Evidenţierea răspunsului măduvei hematogene la tratament, în anemii carenţiale prin
fenomenul “criză reticulocitară”.
- Evaluarea eritropoezei după transplant medular.
- Evaluarea eritropoezei după transplant renal.
- Evaluarea eritropoezei în tratamentele cu eritropoetină.
- Monitorizarea eritropoezei în cursul administrării medicamentelor toxice medulare.
- Monitorizarea hipoplaziilor şi aplaziilor medulare.
- Stabilirea momentului optim pentru recoltarea celulelor stem după tratament cu factor
de creştere sau chimioterapie.
- Diagnosticarea hemoragiilor oculte şi anemiilor hemolitice corpusculare.

Studiu individual

1. Consultând un dicţionar medical, cursul „Fiziologia sângelui” şi materialele indicate

în bibliografie, vă rugăm să definiţi următorii termeni: ARN, ribozom, coloraţie
supravitală, eozinofil, bazofil, antigene celulare HLA.
2. Care sunt coloraţiile supravitale? Prin ce mecanism acţionează aceşti coloranţi?
3. Ce este reticulocitul? Ce modificări suferă reticulocitul în cursul maturizării sale?
4. Care sunt valorile normale ale numărului de reticulocite la copil şi adult?
5. Ce semnificaţie au termenii: reticulocitoză, criză reticulocitară, reticulopenie?

35
 FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Ce este reticulocitul?

................................................................................................................................................
2. Descrieţi aspectul morfologic al reticulocitului pe care îl vedeţi pe frotiul colorat cu
albastru de metilen.
………………………………………………………………………………………………..............
3. În care compartimente ale sistemului hematologic se găseşte reticulocitul şi care este
durata vieţii acestuia?
................................................................................................................................................
4. Care sunt metodele de identificare ale reticulocitului?

................................................................................................................................................
5. Prezentaţi comparativ aspectul reticulocitului şi al eritrocitului pe frotiul efectuat din
sângele periferic şi colorat M.G.G.?

................................................................................................................................................
6. Care sunt componentele reţelei reticulare evidenţiată prin coloraţii supravitale? Ce
semnificaţie are dispariţia acestora din citoplasma reticulocitului, în cursul transformării în
eritrocit?

................................................................................................................................................
7. Care sunt valorile normale ale numărului de reticulocite la copil şi adult?

................................................................................................................................................
8. În ce situaţie apare reticulocitoza? Dar reticulopenia?

................................................................................................................................................
9. Ce este criza reticulocitară?

................................................................................................................................................
10. Analizaţi şi interpretaţi următoarele seturi de explorări hematologice la pacienţii P1, P2
şi P3. Calculaţi numărul de reticulocite exprimat ca număr reticulocite/mm3 şi apreciaţi
existenţa reticulocitozei sau a reticulopeniei.

P1: Nr. hematii = 5 mil/mm3, Hb = 12 g %, Ht = 40 %, Nr reticulocite = 1 % hematii

P2: Nr. hematii = 3 mil/mm3, Hb = 9 g %, Ht = 30 %, Nr. reticulocite = 0,2 % hematii

P3: Nr. hematii = 4 mil/mm3, Hb = 10 g %, Ht = 36 %, Nr. reticulocite = 3 % hematii

................................................................................................................................................

36
2.3. DETERMINAREA HEMATOCRITULUI
Definiţie. Etimologic, hematocrit înseamnă volumul hematiilor. Hematocritul este
fracţiunea din volumul total al sângelui, ocupată de hematii, exprimată procentual. Mai
poate fi definit ca raportul dintre plasmă şi elementele figurate ale sângelui, exprimat
procentual, ţinând cont că, în mod normal, volumul leucocitelor şi trombocitelor nu
depăşeşte 1 %. Germanii exprimă acest parametru şi în litri de eritrocite /litri sânge.
Este un triaj obligatoriu pentru investigaţia incipientă a oricărui bolnav împreună cu
determinarea hemoglobinei şi a numărului de hematii. Este o determinare de urgenţă în
stările de şoc.
Hematocritul depinde de numărul total de eritrocite (masa eritrocitară), de volumul
eritrocitar mediu şi volumul plasmatic.
Principiul metodei. Prin centrifugarea sângelui recoltat pe anticoagulant se separă
hematiile de plasmă şi apoi se evaluează valoarea procentuală a masei de hematii.
Citirea rezultatelor. În tubul cu sânge centrifugat se
observă (figura 2.7.):
- un strat inferior: masa eritrocitară;
Plasmă - un strat mediu: leucocite şi trombocite (se
observă numai în patologie);
- un strat superior: plasma.
Leucocite
Uneori, între stratul de leucocite şi
H eritrocite, se poate observa un strat
negru – stratul Bramberger, format din
eritrocite modificate de către enzimele
Hematii leucocitare.
h În anemiile hipocrome, limita dintre leucocite şi
eritrocite este ştearsă, puţin evidentă, pentru că
eritrocitele hipocrome au greutate specifică mai mică
decât cele normocrome şi apropiată de cea a
leucocitelor.
Fig. 2.7. Tub Pentru calcularea hematocritului, se măsoară
înălţimea totală a coloanei de lichid şi se notează cu
H, apoi se măsoară înălţimea coloanei de eritrocite şi se notează cu h. Hematocritul se
calculează cu ajutorul relaţiei:
h
Hematocrit = 100 [%]
H
Lucrări practice efectuate în laborator.
Determinarea hematocritului prin micrometodă. Se foloseşte echipamentul Janetzki
(sau alte echipamente similare).
Materiale necesare:
- instrumentar steril de unică folosinţă pentru puncţie venoasă sau puncţie capilară;
- centrifugă (model TH-11 Janetzki sau similară) cu un rotor special pentru a putea
cuprinde un mare număr de tuburi;
- tuburi de hematocrit (diametrul de 1 mm şi lungime de 50 mm) din sticlă subţire,
negradate, heparinate în interior;
- suport pentru păstrarea tuburilor de hematocrit între momentul recoltării şi al
centrifugării;
- riglă pentru citirea rapidă a hematocritului.

37
Tehnica de lucru
Se recoltează sânge capilar prin puncţionarea pulpei degetului sau sânge venos. După
umplerea tubului, capetele se închid la flacără sau cu plastilină şi se aşează în suportul de
păstrare până în momentul centrifugării. După terminarea recoltărilor, tuburile sunt aşezate
radiar pe suportul special amenajat, fixat pe rotorul centrifugii. Se centrifughează timp de
30 de secunde la 3000 rot/min, după care tuburile se scot şi se citesc cu ajutorul riglei ce
însoţeşte aparatul (figura 2.8.).
Tubul de hematocrit se pune în ghidajul A al riglei de citire şi se potriveşte cu ajutorul
butonului B, astfel ca limita inferioară a coloanei de hematii să coincidă cu linia de zero a
riglei, iar limita superioară a plasmei să coincidă cu linia de 100.
Se citeşte limita superioară a coloanei de hematii, gradaţia corespunzătoare reprezentând
valoarea hematocritului exprimată în procente.

100

A 90

80

70
60
100 50

80 40

60 30

40 20

20 10
0 0

Figura. 2.8. Riglă pentru citirea hematocritului

Corectarea rezultatelor. Corectarea rezultatelor este necesară deoarece:

- după centrifugare, printre hematii rămâne un volum de plasmă reprezentând 5% din
volumul eritrocitar;
- în cazul unui număr crescut de leucocite şi/sau trombocite este necesară scăderea
grosimii acestui strat din valoarea hematocritului;
- hematiile din sângele venos au volum mai mare decât hematiile din sângele arterial;
- utilizarea unui alt anticoagulant (în afara heparinei şi amestecului Wintrobe) poate
produce ratatinarea hematiilor.
Pentru calculul hematocritului sângelui total se va corecta hematocritul venos găsit,
conform formulei:
Ht somatic = Ht venos x 0,96 x 0,91 x 1,09 în care:
- 0,96 – factor de corecţie pentru plasma aflată printre hematii după centrifugare;

38
 - 0,91 – factor de corecţie pentru volumul hematiei din sângele arterial faţă de hematia
din sângele venos;
- 1,09 – factor de corecţie pentru anticoagulantele care ratatinează hematiile (are
valoarea 1 pentru heparină şi amestecul Wintrobe).
- În cazul tehnicii prezentate de noi, factorul global de corecţie este 0,87.
Determinarea hematocritului se poate realiza şi prin metode moderne, cu un
analizor automat. Se determină numărul de eritrocite/litru de sânge prin măsurarea
intensităţii luminii reflectate de masa de eritrocite aflate într-un volum de sânge predefinit
si se calculeaza folosind formula hematocritului.
Erori de determinare a hematocritului. Determinarea hematocritului poate fi afectată de:
- exces de anticoagulant;
- tipul de anticoagulant;
- sângele arterial are un Ht cu 2% mai mic decât Ht din sângele venos;
- analizoarele automate pot da valori fals crescute;
- situaţii patologice care cresc (în mod fals) valoarea hematocritului: reticulocitoză,
leucocitoză mare, prezenţa de crioglobuline, macrotrombocite;
- situaţii patologice care scad (în mod fals) valoarea hematocritului: hemoliză in vitro,
autoaglutinare, microcitoză.
Valorile normale şi variaţiile fiziologice ale hematocritului. Aceste valori sunt
prezentate în tabelul 2.3.

Tabelul 2.3. Valorile normale şi variaţiile fiziologice ale hematocritului

Teritoriul Efort Emoţii,
Sex Vârstă Altitudine Sarcină
circulator fizic stres
Nou
născut:
56 %
Sânge
1 lună: arterial:
Bărbaţi: 44,6 % 45 %
46  5%
Ht Ht crescut
6 luni:
crescut prin
36,2 % Sânge venos: Ht Ht scăzut prin
prin scăderea
47 % crescut hemodiluţie
contracţia pO2 în aerul
1 an:
splinei inspirat
Femei: 32 %
40  5% Sânge
4 ani: splenic:
37 % 70 – 80 %

12 ani:
40 %

Variaţii patologice ale hematocritului

- Scăderea hematocritului apare în anemii şi în situaţiile în care creşte volumul
plasmatic (hemodiluţie).
- Creşterea hematocritului apare în poliglobulii şi în situaţiile în care scade volumul
plasmatic.

39
 Valorile extreme ale hematocritului se asociază cu stări patologice cu risc
vital:
- Ht < 20% : se asociază cu hipoxie severă care determină insuficienţă
cardiacă şi deces;
- Ht > 60%: se asociază cu creşterea accentuată a vâscozităţii sângelui,
tromboze locale şi coagularea spontană a sângelui.

Importanţa clinică a determinării hematocritului. Determinarea hematocritului se

recomandă în:
- Stări patologice în care se modifică numărul de hematii (anemii, poliglobulii).
- Stări patologice în care se modifică volemia.
- Stări post hemoragie.
- Stări de şoc.

Studiu individual

1. Consultând un dicţionar medical, cursul “Fiziologia sângelui” şi materialele

recomandate în bibliografie, vă rugăm să definiţi următorii termeni: volemie,
hipovolemie, hipervolemie, normocitemie, oligocitemie, policitemie, factor de
corecţie, coeficient, indice, raport, exprimare procentuală.
2. Ce variaţii fiziologice ale hematocritului cunoaşteţi? Cum se explică?
3. Cum influenţează numărul de hematii valoarea hematocritului?

40
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Prezentaţi principiul metodei de determinare a hematocritului.

................................................................................................................................................
2. Prezentaţi succesiunea etapelor corespunzătoare modului de lucru pentru determinarea
hematocritului prin micrometodă.

………………………………………………………………………………………….…….............
.
3. Explicaţi necesitatea corectării hematocritului citit. Care sunt indicii de corecţie utilizaţi?

………………………………………………………………………………....................................
4. Care sunt valorile normale ale hematocritului?

………………………………………………………………………………....................................
5. Ce valoare are hematocritul plasmei?

………………………………………………………………………………....................................
6. Care sunt parametrii biologici de care depinde hematocritul?

………………………………………………………………………………....................................
7. Ce relaţii există între hematocrit şi vâscozitatea sângelui?

………………………………………………….……………………………...................................
8. Explicaţi variaţiile fiziologice ale hematocritului în funcţie de vârstă şi sex.

………………………………………………………………………………....................................
9. Explicaţi variaţiile hematocritului în funcţie de altitudine.

………………………………………………………………………………....................................
10. Explicaţi modificările hematocritului produse de efortul fizic.

………………………………………………………………………………....................................
11. În ce situaţii concrete recomandaţi determinarea hematocritului la un pacient?

………………………………………………………………………………....................................
12. Cum explicaţi importanţa procedurii „de luare de sânge” pacientului, aplicată foarte
frecvent în trecutul medicinei?

………………………………………………………………………………....................................

41
2.4. DOZAREA HEMOGLOBINEI

Hemoglobina (Hb) reprezintă elementul esenţial pentru principala funcţie fiziologică a

eritrocitului – funcţia respiratorie, reprezentând aproximativ 95% din proteinele solubile ale
hematiei, şi aproximativ 35% din greutatea totală a acesteia. Hb este sintetizată în celulele
nucleate ale seriei eritrocitare din măduva osoasă, în cursul celor 6 - 8 zile de maturare ale
acestora; o mică cantitate se sintetizează şi în reticulocit.
Hemoglobina este o cromoproteină cu greutate moleculară de 64.458 daltoni, formată
dintr-o componentă proteică - globina şi o grupare prostetică - hemul, o metaloporfirină
ce conţine fier bivalent (Fe2+), de culoare roşie.
Începând din viaţa embrionară şi până la adult se întâlnesc diferite tipuri de Hb (tabelul nr.
2.4.), care se deosebesc între ele prin structura lanţurilor polipeptidice ce alcătuiesc
monomerii, grupul prostetic fiind identic.

Tabel nr. 2.4. Tipuri de hemoglobină

Structura Proporţia (%)

moleculară
Tipul de Vârsta la
hemoglobină (lanţurile de care apare Nou
Adulţi
globină născuţi
caracteristice)

Portland   0 0
Numai în
Gower I  viaţa 0 0
embrionară
Gower II  0 0

Fetală (F)    80 <1

Şi la nou
A1  născut şi la 20 97
adult
A2    < 0,5 ~ 2,5

- HbA1 reprezintă aproximativ 95 - 98% din Hb adultului, este formată din 2 lanţuri  a
câte 141 aminoacizi (aa) şi din 2 lanţuri  a câte 146 aa.
- HbA2 este prezentă la adult în proporţie de 1 - 3% din totalul Hb şi este formată din 2
lanţuri  şi 2 lanţuri , ultimile diferind de cele  prin ultimii 10 aa din secvenţa de
146.
- HbF persistă la populaţia de culoare (20 - 30% din totalul Hb), la polpulaţia greacă
(11 - 19% din totalul Hb) şi la tipul elveţian (1 - 6%). Persistenţa ei nu este asociată
cu tulburări clinice. Lanţurile  diferă de cele  prin secvenţa de 39 de aminoacizi de
la capătul lanţului de 146.
- HbG1 are 4 lanţuri (2ζ şi 2ε) şi a fost evidenţiată la embrionul foarte tânăr (în primele
25 - 30 zile); HbG2 este alcătuită din 2 lanţuri  şi 2 lanţuri  şi persistă în primele 3
luni de viaţă embrionară. Cantitatea de HbG scade odată cu creşterea fătului; când
acesta atinge 10 cm lungime, Hb embrionară dispare.
Molecula de Hb are o structură cuaternară, care rezultă din aranjarea a 4 monomeri,
fiecare alcătuit dintr-o grupare hem, legată la un lanţ polipeptidic, astfel încât formează o
structură globulară compactă. Spre suprafaţa externă prezintă 4 cavităţi, numite pliurile
sau pungile hemului, care adăpostesc câte o grupare hem.
42
Hemul este gruparea prostetică a Hb şi reprezintă 4% din greutatea moleculară a Hb. Este
alcătuit dintr-o protoporfirină (inel tetrapiloric) la care se leagă un atom de Fe2+, în centrul
inelului tetrapiloric.
Prezenţa şi structura Hb în eritrocit conferă acestuia o serie de proprietăţi fiziologice,
printre care cea mai importantă este transportul O 2. În mod normal, sângele conţine în
medie 15 g Hb/100 ml sânge. Capacitatea de fixare a O2 de către Hb (în condiţii de
completă oxigenare) este de 1,34-1,35 ml O2 pentru 1 g de Hb, deci cele 15 g% de Hb vor
transporta 20,9 ml O2, din care numai 4,5 ml vor fi cedaţi ţesuturilor.
Hb liberă în plasmă, rezultată din liza hematiilor, este transportată de haptoglobină (o 2
glucoproteină sintetizată în ficat).
Metode de dozare a hemoglobinei
Metodele de măsurare a concentraţiei Hb în sânge sunt:
- metode colorimetrice directe - metoda Sahli, de colorometrie vizuală;
- metode prin colorimetrie fotoelectrică - prin măsurarea culorii în funcţie de puterea de
absorbţie a luminii de către o soluţie, într-o regiune specifică a spectrului vizibil.
- metode computerizate
Dozarea spectofotometrică a hemoglobinei
Principiul metodei: Fericianura de potasiu transformă fierul feros al hemoglobinei în fier feric, formând
methemoglobina, care în combinaţie cu cianura de K formează cianmethemoglobina, a cărei extincţie este
citită la spectrofotometru.
Materiale necesare:
- instrumentar steril pentru recoltarea sângelui;
- pipetă pentru Hb cu gradaţia 20 mm3;
- pipeta Pasteur gradată;
- eprubete, stativ;
- spectrofotometru de tip spekol sau hemoglobinometru electronic;
- soluţie etalon standard de Hb - soluţie de cianmethemoglobină 0,06 g%, conform etalonului
internaţional şi livrată de Centrul de Hematologie Bucureşti;
- soluţie Drabkin compusă din: fericianură de potasiu 0,2 g/l, cianură de potasiu 0,05 g/l şi bicarbonat de
sodiu 1 g/l.
Tehnica de lucru: Cu pipeta specială de Hb se recoltează sânge 0,02 ml (20 mm 3) pe anticoagulat sau din
pulpa degetului şi apoi se adaugă peste 5 ml soluţie Drabkin, pipetat în prealabil într-o eprubetă. Se lasă 30
minute la temperatura camerei pentru obţinerea compusului de cianmethemoglobină.
Citirea şi exprimarea rezultatelor: La un spectrofotometru se citeşte extincţia standardului (preparat din
hemoglobină umană) la lungimea de undă  = 540 nm sau se citeşte după echilibrare cu apă distilată la
hemoglobinometru electronic.
Concentraţia soluţiei din eprubeta standard este cunoscută, fiind scrisă pe eticheta eprubetei. Se citeşte
extincţia probei şi se introduce în formula:
Hb (g%) = (Ex. probei x Conc. std) / Ex. std.
Metodele computerizate de determinare a Hb se bazează pe determinări colorimetrice, cu diluţie de 1/400 cu
un diluent special. Agentul de lizare distruge hematiile şi intră în reacţie cu Hb, formând
cianmethemoglobina, care are absorbţie maximă la 540 nm. Timpul de lizare pentru Hb este dependent de
agentul de lizare.

Lucrări practice de efectuat în laborator

1. Metoda colorimetrică SAHLI
Principiul metodei: Se compară colorimetric o soluţie de clorhidrat de hemină, preparată
din sângele de cercetat, cu un etalon de culoare al aparatului, stabilit dintr-o cantitate
normală de Hb (16 g Hb/100 ml sânge).
Materiale necesare:
- materiale pentru puncţia capilară: ace sterile, vată, alcool - eter;
- soluţie HCl N/10;
- pipetă capilară pentru Hb, cu un singur reper la 20 mm 3;
- apă distilată;

43
 - hemoglobinometrul Sahli (figura 2.9.). Hemoglobinometrul Sahli este alcătuit dintr-
un stativ dedicat, cu 3 eprubete:
• 2 eprubete laterale care conţin substanţa etalon (clorhemină în glicerină) de culoare
brună sau 2 baghete de sticlă de aceeaşi culoare;
• eprubeta centrală în care se lucrează proba şi care este gradată de jos în sus de la
10 la 140 (unităţi Sahli). Diviziunea 100 corespunde, conform etalonării cu o
concentraţie de 16 g Hb%. Deseori eprubeta prezintă şi o a doua scară de diviziuni,
în g Hb%. Stativul de susţinere al eprubetelor are un perete posterior de sticlă
mată, facilitând compararea soluţiilor. Aparatului îi sunt ataşate pe lângă pipeta de
Hb şi o pipetă pentru apă distilată şi o baghetă pentru omogenizare.

25
24
23
22
21
20
19
18
17
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2

Figura 2.9. Hemoglobinometrul Sahli

Tehnica de lucru:
În eprubeta centrală se pipetează soluţie de HCl N/10 până la prima diviziune, notată cu
10. Cu pipeta capilară de Hb se adaugă 20 mm3 sânge recoltat prin puncţie capilară.
Se introduce pipeta la fundul tubului gradat şi se dă drumul sângelui în HCl N/10. Se
curăţă capilarul pipetei de sânge prin aspirare şi golire succesivă.
Se agită eprubeta pentru o bună omogenizare a amestecului. După 5 minute amestecul
devine de culoare brună, datorită formării clorhidratului de hemină.
Se diluează treptat cu apă distilată, picătură cu picătură, omogenizând cu bagheta sau
prin răsturnare, după adăugarea apei distilate, până în momentul când culoarea probei de
cercetat este identică cu cea a etalonului. Se citeşte gradaţia de pe tub.
Citirea şi exprimarea rezultatelor:
Citirea se face întotdeauna pe tub la nivelul meniscului inferior. Pentru eprubetele care nu
au scara de diviziune în g%, calculul se face astfel: dacă diviziunea 100 corespunde
conform etalonării cu 16 g Hb%, atunci cifra găsită (85 de exemplu) va corespunde la x g
Hb.
100.....................................16 g
85.......................................x g
x = 85 x 16g / 100 = 13,6 g Hb% ml sânge.

44
Metoda poate prezenta o eroare de  15%, datorată:
- materialului deteriorat sau erori de etalonare ale aparatului;
- tehnicii deficitare;
- diluţiei incorecte prin cantitate mai mare de apă distilată;
- citirii la lumina artificială;
- acuităţii vizuale a examinatorului.
2. Dozarea hemoglobinei cu analizorul fotometric HemoCue
Analizorul fotometric HemoCue este un dispozitiv mic, “de buzunar”, folosit în condiţii de
urgenţă, în ambulatoriu sau la domiciliu, care permite obţinerea rapidă şi corectă a
concentraţiei de hemoglobină. Foloseşte cantităţi mici de sânge (10 µL) capilar, arterial
sau venos, care se introduce într-o microcuvă din plastic, de unică folosinţă.
Principiul metodei. Este comun tuturor determinărilor fotometrice. În urma reacţiei dintre
hemoglobină şi reactivul uscat din microcuvă se formează un derivat al hemoglobinei
(azid-methemoglobină), care absorbe lumina cu lungime de undă de 537 nm.
Metoda de lucru este simplă şi rapidă. (figura nr. 2.10.). După obţinerea unei picături de
sănge, se aplică microcuva pe picătură, aceasta umplându-se prin capilaritate, la nivelul
unei cavităţi mici a acesteia. Această cavitate, de dimensiuni foarte mici (m) conţine un
reactiv care se dizolvă la contactul cu sângele. Se şterge orice exces de sânge din părţile
laterale ale microcuvei, după care se introduce în suportul special din analizor. Rezultatul
apare pe ecranul aparatului în aproximativ un minut.

Figura nr.2.10.
Sursa: http://www.hemocue.com

Folosind această tehnică se poate măsura nu numai concentraţia hemoglobinei, dar şi

valoarea concentraţiei altor substanţe dizolvate în mediu lichidian (glucoză, lipide
sanguine, albumină urinară).
Valori normale ale concentraţiei de Hb:
- Femei: 12 - 15 g/dl (121 - 151 g/l, sau 7.5 - 9.3 mmol/l)
- Bărbaţi: 13,8 – 18 g/dl (138 - 182 g/l, sau 8.5 - 10.6 mmol/l)
- Hb liberă (în plasmă): 1 - 5 mg/dl (0,01 - 0,05 g/l)
Variaţii fiziologice:
Există variaţii fiziologice în funcţie de vârstă, sex, altitudine, anumite perioade fiziologice
(digestie, efort fizic, sarcină) şi temperatura mediului.
- în funcţie de sex: mai mare la bărbaţi, după pubertate datorită hormonilor androgeni,
care stimulează eritropoieza (estrogenii deprimă eritropoieza);
- în funcţie de vârstă: nou-născutul are un număr mai mare de eritrocite datorită
poliglobuliei fiziologice (transfuzia de sânge matern prin cordonul ombilical), după 6 –
12 săptămâni scade până la valori de anemie, datorită înlocuirii HbF cu HbA, iar
după 6 luni creşte, atingând valoarea de la adult la 12 ani. La bătrâni scade (chiar la
valori de anemie) prin scăderea producţiei de eritropoietină, reducerea măduvei
osoase hematogene etc.;

45
 - în sarcină scade, prin hemodiluţie, până la valori de 11 - 14 g/dl (110 -120 g/l, sau 6.8
- 7.4 mmol/l);
- persoanele care trăiesc la altitudine mare au valori mai mari ale concentraţiei
hemoglobinei (prin poliglobulie fiziologică de altitudine, datorată presiunii parţiale mai
mici a oxigenului);
- în efortul fizic moderat, concentraţia Hb creşte, datorită creşterii numărului de
hematii, prin pierderea de apă în interstiţiu şi hemoconcentraţie, splenocontracţie
(hematocritul splenic este de 70 – 80%) şi stimularea citodiabazei; în efortul fizic
intens concentraţia Hb scade datorită scăderii numărului de hematii, prin eritroliză
(hemoglobinuria paroxistică de efort, cunoscută şi ca hemoglobinuria de marş);
- activitatea intelectuală, stresul, emoţiile cresc temporar numărul de hematii, deci şi
concentraţia Hb, ca urmare a secreţiei crescute de adrenalină şi cortisol;
- creşterea temperaturii determină creşterea concentraţiei de Hb, consecutivă creşterii
numărului de eritrocite, prin splenocontracţie
- variaţiile zilnice ale numărului de hematii în legătură cu digestia, starea de repaus şi
postura sunt de maximum 10%.
Variaţii patologice
- Creşterea concentraţiei de hemoglobină şi a hematocritului, în paralel cu a
numărului de eritrocite, poartă numele de poliglobulie.
- Scăderea concentraţiei de hemoglobină şi hematocritului, în paralel cu scăderea
numărului de eritrocite, poartă numele de anemie.

Studiu individual

1. Consultând un dicţionar medical, cursul “Fiziologia sângelui” şi materialele

recomandate în bibliografie, vă rugăm să definiţi următorii termeni: cromoproteină,
grupare prostetică, protoporfirină, legatură covalentă, legatură coordinativă,
methemoglobină, extinţie, măduvă osoasă hematogenă.
2. Cum influenţează numărul de hematii valoarea concentraţiei hemoglobinei?
3. Care sunt parametrii sanguini care se modifică în anemii, şi care este sensul
acestei modificări?
4. Care este concentraţia hemoglobinei la o fetiţă de 9 ani, comparativ cu un băiat de
aceeşi vârstă?
5. Precizaţi în termeni de comparaţie, concentraţia hemoglobinei la un bărbat de 80 de
ani, comparativ cu unul de 30 de ani.

46
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Prezentaţi principiul metodei de dozare a hemoglobinei prin metoda colorimetrică Sahli.

................................................................................................................................................
2. Care sunt tipurile de hemoglobină cunoscută, începînd cu viaţa embrionară?

………………………………………………………………………………....................................
3. Care sunt valorile normale ale concentraţiei sanguine a hemoglobinei?

………………………………………………………………………………....................................
4. Care este capacitatea de fixare a O2 de către Hb (în condiţii de completă oxigenare)?

………………………………………………………………………………....................................
5. Care sunt variaţiile patologice ale concentraţiei de hemoglobină?

………………………………………………………………………………....................................
6. Explicaţi variaţiile fiziologice ale concentraţiei hemoglobinei în funcţie de vârstă şi sex.

………………………………………………………………………………....................................
7. Explicaţi variaţiile concentraţiei hemoglobinei în funcţie de altitudine.

………………………………………………………………………………....................................
8. Explicaţi modificările concentraţiei hemoglobinei produse de efortul fizic.

………………………………………………………………………………....................................
9. În ce situaţii concrete recomandaţi determinarea concentraţiei hemoglobinei la un
pacient?

………………………………………………………………………………....................................
10. Ce modificări temporare ale parametrilor eritrocitari credeţi că au loc în orele care
urmeză după ce aţi donat o unitate (500 ml) de sânge?

………………………………………………………………………………....................................

47
2.5. DETERMINAREA VITEZEI DE SEDIMENTARE A HEMATIILOR
Definiţie. Viteza de sedimentare a hematiilor (VSH) este reprezentată de lungimea
coloanei de cădere a hematiilor prin plasmă, într-un anumit interval de timp. V.S.H. este
influenţat de factori eritrocitari, plasmatici, fizici şi chimici, care sunt prezentaţi în tabelul
2.5.

Tabelul 2.5. Factorii care influenţează V.S.H.

- creşterea volumului hematiilor

cresc V.S.H.
- scăderea numărului de hematii

A. Factori
eritrocitari - creşterea suprafeţei relative a hematiilor
(platicite)
scad V.S.H.
- creşterea numărului de hematii (poliglobulii)
- forma hematiilor (poikilocitoze)

- creşterea cantităţii de globuline şi fibrinogen

cresc V.S.H.
- creşterea colesterolului în plasmă
B. Factori
plasmatici
- creşterea cantităţii de albumine
scad V.S.H. - creşterea acizilor şi sărurilor biliare în plasmă
- creşterea lecitinei în plasmă

- înclinarea tubului
cresc V.S.H.
- temperatura crescută
C. Alţi factori
- citrat trisodic în cantitate mare produce diluţie
scad V.S.H.
- temperatura scăzută

Lucrări practice efectuate în laborator.

Metoda Westergreen
Principiul metodei: se apreciază lungimea de cădere a hematiilor prin plasmă, într-un
interval de timp de 1 oră şi la 2 ore.
Materiale necesare:
- instrumentar de puncţie venoasă: ac şi seringă sterilă de unică folosinţă, garou, vată,
alcool;
- eprubete, capsule de porţelan;
- pipete Westergreen (divizate de la 0 – 200 mm, cu diametrul de 2,5 – 3 mm);
- stativ pentru pipetele Westergreen (figura 2.11.), cu fir de plumb pentru verticalităţi;
- pipete gradate de 1 şi 2 ml;
- soluţie anticoagulantă de citrat trisodic 3,8%.

48
Tehnica de lucru
- Într-o eprubetă cu 0,4 ml citrat trisodic 3,8% se adaugă 1,6 ml sânge recoltat prin
puncţie venoasă (fără stază realizată de garou).
- Se amestecă bine conţinutul şi se aspiră în pipeta Westergreen, până la diviziunea
zero. Se închide cu indexul partea superioară a pipetei. Capătul inferior al pipetei se
pune pe dopuri de cauciuc aflate la partea inferioară a stativului, iar capătul superior
se fixează în dispozitivul de strângere.
- Se controlează verticalitatea stativului şi se notează ora la care s-au fixat pipetele.
- Stativul va fi menţinut la o temperatură constantă de 22°C.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 2.11. Dispozitivul Westergreen

Citirea rezultatelor
Se face la 1 oră şi la 2 ore, urmărind limita de separare dintre hematiile sedimentate şi
plasmă. Se măsoară înălţimea coloanei de plasmă.
Surse de eroare în determinarea V.S.H.
- Creşterea temperaturii determină creşterea V.S.H. Între 20 – 27°C, variaţiile sunt de
mică importanţă şi determinarea se poate face la temperatura camerei. La
temperaturi în afara acestor limite se recomandă ca stativul să fie introdus la
termostat, la temperatura de 22°C.
- Înclinarea tubului faţă de verticală, la metoda Westergreen, poate modifica valorile
reale.
- În cazul pacienţilor cu crioglobulinemie, temperatura camerei prea mică induce erori
determinate de gelificarea plasmei, ceea ce împiedică sedimentarea hematiilor. Se
recomandă efectuarea V.S.H.-lui la termostat, la 37°C.
- Păstrarea sângelui mai mult timp, determină modificări care se reflectă în valoarea
V.S.H. Se recomandă efectuarea testului imediat după recoltarea sângelui.
- Proporţia dintre anticoagulant şi sânge trebuie respectată, pentru a nu dilua
suplimentar proba.

49
Valorile normale şi variaţiile fiziologice ale V.S.H. Datele sunt prezentate în tabelul 2.6.

Tabelul 2.6. Valorile normale şi variaţiile fiziologice ale V.S.H.

la 1 oră la 2 ore
Valori
bărbaţi: 7 – 9 mm bărbaţi: 10 – 12 mm
normale
femei: 8 – 10 mm femei: 12 – 16 mm

nou născut: 1 – 2 mm datorită numărului crescut de hematii

0 – 5 ani: 9 – 12 mm -

4 – 15 ani: 0 – 20 mm
Variaţii
vârstnici: uşoară creştere
fiziologice
menstră:VSH crescut până
la 35 mm
sarcină:VSH crescut
vagotonici: VSH scăzut
-
datorită numărului scăzut de hematii şi
concentraţiei crescute a fibrinogenului
-
datorită scăderii hematocritului şi
creşterii fibrinogenului şi α-globulinelor
-

Modificările patologice ale V.S.H. sunt prezentate în tabelul 2.7.

Tabelul 2.7. Modificările patologice ale V.S.H.

- stări infecţioase acute (infecţii acute localizate,
septicemii)
- stări infecţioase cronice (reumatism, TBC)
- stări inflamatorii acute
Creşteri ale
- necroze (infarct miocardic) şi distrucţii tisulare
V.S.H.
- anemii
- stări post-iradiere
Variaţii
- colică renală
patologice
- boli maligne (tumori, boală Hodgkin etc.)
- policitemie
- stază cardiacă
Scăderi ale - stări alergice
V.S.H. - stări caşectice grave
- anemie drepanocitară
- icter prin hepatită, hiperbilirubinemii

Semnificaţia biologică a vitezei de sedimentare a hematiilor (V.S.H.)

- V.S.H. este o metodă cu sensibilitate şi fidelitate relative, fiind un indicator clinic
nespecific. Este un semnalizator al stării patologice, în mod special al proceselor
inflamatorii şi are semnificaţie în contextul clinic.
- Organismul răspunde la o afecţiune acută (infecţie, traumatism etc.) sau la
acutizarea unei afecţini cornice prin eliberarea rapidă, în câteva ore, a citokinelor
inflamatorii. Sub influenţa acestora, ficatul sintetizează şi secretă proteine suport
pentru răspunsul organismului la traumă. V.S.H.-ul este modificat predominant de

50
 structura proteică a plasmei (exemplu: cresterea c% fibrinogenului ) şi secundar de
numărul, forma şi suprafaţa hematiilor.
- Ca element de urmărire în dinamică a unui proces patologic, creşterea V.S.H.
semnifică acutizarea bolii, iar scăderea sa semnifică regresiunea bolii.
- În bolile acute, creşterea V.S.H. are valoarea unei evoluţii favorabile a reacţiei
imunologice, iar absenţa creşterii sale se corelează cu un sistem imunitar areactiv.
- În bolile cronice, creşterea V.S.H. arată că procesul inflamator este activ. În bolile
caşectice, scăderea sa poate indica epuizarea mecanismelor reactive.
- Prin urmare, V.S.H. nu evidenţiază prezenţa infecţiei, a inflamaţiei sau a altor stări
patologice, ci modul în care organismul răspunde la acestea, fiind un test
nespecific.

Importanţa determinării V.S.H. în practica medicală.

Creşterea V.S.H. reprezintă răspunsul nespecific al organismului şi indică:
• Răspunsul organismului in prezenţa unui proces inflamator.
• Severitatea inflamaţiei.
• Acutizarea unei afecţiuni cronice.
• Evoluţia în dinamică a răspunsului organismului la o traumă.

Studiu individual

1. Consultând un dicţionar medical şi materialele didactice, vă rugăm să definiţi

următorii termeni: sedimentare, hematie, eritrocit, globulă roşie, inflamaţie, infecţie,
infestare, citokine, boală malignă, caşexie.
2. Caracterizaţi mărimile fizice: viteză şi densitate.
3. De ce sedimentează hematiile?
4. Cum influenţează numărul de hematii valoarea VSH-ului?

51
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Prezentaţi principiul metodei Westergreen pentru determinarea vitezei de sedimentare a

hematiilor şi modul de lucru.

................................................................................................................................................
2. Care sunt valorile normale ale V.S.H. ?

………………………………………………………………………………………………..............
3. Enumeraţi factorii eritrocitari care modifică V.S.H.

………………………………………………………………………………………………..............
4. Explicaţi mecanismul prin care fiecare factor eritrocitar modifică V.S.H.

………………………………………………………………………………………………..............
5. Enumeraţi factorii plasmatici care modifică V.S.H.

………………………………………………………………………………………………..............
6. Explicaţi mecanismul prin care fiecare factor plasmatic modifică V.S.H.

………………………………………………………………………………………………..............
7. Explicaţi de ce valoarea V.S.H. la bărbaţi este mai mică decât la femei.

………………………………………………………………………………………………..............
8. Explicaţi de ce temperaturile scăzute pot modifica unele componente ale plasmei cu
repercusiuni asupra valorii V.S.H. şi vâscozităţii sângelui.

………………………………………………………………………………………………..............
9. Explicaţi cum se modifică valoarea V.S.H. şi valoarea hematocritului în cazul expunerii
organismului la temperaturi crescute.

………………………………………………………………………………………………..............
10. Explicaţi creşterea valorii V.S.H. în infecţii şi inflamaţii.

……………………………………………………………….........................................................
11. În cazul infestării organismului cu paraziţi, creşterea valorii V.S.H.-ului este specifică?

………………………………………………………………………………………………..............
12. Prezentaţi şi comentaţi semnificaţia clinică a valorii V.S.H.

………………………………………………………………………………………………..............

52
2.6. DETERMINAREA DIAMETRULUI ERITROCITAR.
CURBA PRICE - JONES

Majoritatea eritrocitelor (2/3) au diametrul de aproximativ 7,2 µm, restul prezintă o uşoară
deviere peste şi sub această valoare (între 6,6 - 7,7 µm). Se pot observa unele hematii cu
un diametru mai mare de 9 µm (macrocite) sau mai mic de 6 µm (microcite); fenomenul
este numit anizocitoză fiziologică.
Diametrul eritrocitar poate fi apreciat de către un examinator experimentat printr-o simplă
inspecţie a frotiului; determinarea cu exactitate se face, însă, cu ajutorul micrometrelor
(ocular şi obiectiv).
- Micrometrul ocular (figura nr. 2.12.) este o lentila de sticlă care are inscripţionată o
scală gradată şi care poate fi plasată în ocularul microscopului. Se utilizează pentru a
măsura dimensiunile obiectelor mărite de către microscop. Mărimea fizică a
diviziunilor de pe scală depinde de gradul de mărire al microscopului.
- Micrometrul obiectiv (figura nr. 2.13.) este utilizat pentru etalonarea celui ocular (se
plasează pe măsuţa microscopului şi se suprapun cele două scale) (figura. 2.14.).

Figura 2.12. Micrometrul ocular

Figura 2.13. Micrometrul obiectiv

Figura 2.14. Suprapunerea celor două scale

53
 Figura 2.15. Etalonarea micrometrului ocular
(sursa Creative Commons)

Utilitatea practică a determinării diametrului eritrocitar

Determinarea diametrului eritrocitar are utilitate practică pentru că numeroase anemii sunt
însoţite de modificarea diametrului şi, în consecinţă, a volumului eritrocitar.
Alături de dozarea hemoglobinei, a numărului de eritrocite, leucocite, trombocite şi
dozarea hematocritului (volumul total al hematiilor), determinarea diametrului eritrocitar
face parte din examinarea sanguină completă, care furnizează informaţii despre
celularitatea sanguină a pacienţilor.

Lucrări practice efectuate în laborator.

1. Determinarea diametrului eritrocitar
Principiul determinării
Cu ajutorul unui micrometru ocular se măsoară diametrul unui număr cunoscut de
eritrocite (cel puţin 100), pe un frotiu colorat prin tehnica May-Grünvald-Giemsa.
Materiale necesare:
- micrometru ocular;
- micrometru obiectiv sau o cameră de numărat cu caroiaj Thoma;
54
 - frotiu de sânge colorat;
- microscop cu obiectiv cu imersie.
Tehnica de lucru:
Etalonarea micrometrului ocular se poate face în două feluri:
- cu ajutorul micrometrului obiectiv, pe care îl aşezăm pe platina microscopului.
- Se introduce micrometrul ocular în ocularul microscopului; se observă câte diviziuni
de pe micrometrul ocular se suprapun peste diviziunile micrometrului obiectiv,
avându-se în vedere că o diviziune de pe micrometrul obiectiv are 10 µm. Valoarea
unei diviziuni de pe micrometrul ocular se află aplicând regula de trei simplă.
- cu ajutorul camerei Thoma - se foloseşte acelaşi procedeu, avându-se în vedere că
o latură a unui pătrat mic are 50 de µm.
Măsurarea diametrului eritrocitar. Se păstrează micrometrul ocular, etalonat, în ocularul
microscopului; pe platina microscopului se pune frotiul de cercetat; se examinează cu
obiectivul cu imersie, punând ulei de cedru şi schimbând câmpurile în sens vertical; se
măsoară diametrul a cel puţin 100 de hematii.
Rezultate şi interpretare:
Se transformă diviziunile oculare în µm. Diametrul eritrocitar mediu (DEM) se calculează
făcând media aritmetică a diametrelor găsite.
Valoarea normală a mediei este de 7,2 µm, cu limite între 6,6 – 7,7 µm.
2. Curba Price-Jones
Cecil Price-Jones (1863 – 1943), hematolog britanic, a dezvoltat în 1910 o metodă pentru
măsurarea directă a diametrelor eritocitare pe un frotiu de sânge periferic şi redarea
rezultatelor sub forma unui grafic care exprimă distribuţia acestora. În 1924 a raportat
prezenţa anizocitozei în anemia pernicioasă, iar în 1933 a publicat un studiu despre
diametrul eritrocitar.
Curba reprezintă un grafic obţinut din variaţiile de mărime ale eritrocitelor sanguine.
Actualmente, curba este realizată automat de către analizorul de hematologie.
Înscrierea curbei se face cu ajutorul unui sistem de coordonate: pe abscisă notăm
diametrul, cu diviziuni din 0,5 în 0,5 µm, iar pe ordonată notăm numărul procentual de
eritrocite corespunzător fiecărui diametru. Este recomandabil să se determine diametrul
unui număr mai mare de 100 de eritrocite (figura nr. 2.16.).
Baza curbei se întinde, în mod normal, între 5 şi 9 µm, curba având aspectul unui turn
central a cărui arie reprezintă 60 – 70% din totalitatea eritrocitelor, flancat de două zone
laterale care reprezintă 30 – 40% din totalitatea eritrocitelor (15–20% pentru fiecare zonă).
Vârful turnului central se situează la 7,2 µm şi corespunde diametrului eritrocitar mediu
(DEM).
Variaţii fiziologice ale diametrului eritrocitar
La nou-născut, în primele două săptămâni, majoritatea eritrocitelor au diametrul de 8 – 8,2
µm. La un an, diametrul eritrocitelor scade la 7 µm, pentru a atinge valorile adultului între 2
şi 9 ani. Curba Price-Jones este, deci, deviată la dreapta la nou-născut (macrocitoza
fiziologică a nou-născutului).
Variaţii patologice ale diametrului eritrocitar
Scăderea diametrului eritrocitar mediu, cu devierea curbei Price-Jones la stânga şi cu
vârful în jurul valorii de 6 µm, se întâlneşte în microcitozele din: anemia cu sferocite
(microsferocitoza ereditară sau boala Minkowski-Chauffard), anemia feriprivă etc.
Creşterea diametrului eritrocitar mediu, cu devierea curbei Price-Jones la dreapta, cu
vârful în jurul valorii de 9 µm, se întâlneşte în macrocitozele şi megalocitozele din: anemiile
megaloblastice cum ar fi anemia Biermer, anemiile din nefropatii cronice, anemia

55
aplastică, anemia gravidică, intoxicaţii cu benzen sau aur (în urma tratamentelor cu săruri
de aur), expunere la radiaţii.

Figura 2.16. Curba Price-Jones

Curbă Price-Jones cu două vârfuri, unul la stânga şi altul în zona normală, întâlnită în
microcitoze transfuzate (adică la care s-au făcut transfuzii cu sânge normal), sau unul la
dreapta şi altul în zona normală, întâlnită în macrocitoze sau megalocitoze transfuzate.
Curbă Price-Jones cu implantare largă – apare în anizocitozele secundare anemiilor
grave, în care diametrul eritrocitar poate varia între 5 şi 10 µm sau mai mult, de ex. în
thalasemia majoră, anemia Biermer, anemia hemolitică congenitală.

Studiu individual

1. Consultând un dicţionar medical sau materialele didactice, vă rugăm să definiţi

următorii termeni: macrocit, microcit, anizocitoză, micrometru, etalonare,
anemie pernicioasă, anemie aplastică, anemie hemolitică.

56
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. La etalonarea micrometrului ocular, presupunem că 20 de diviziuni ale acestuia se

suprapun peste o diviziune a celui obiectiv. Ce diametru are o hematie la care s-au
măsurat 15 diviziuni oculare?

……………………………………………………………………………………...……………...….
2. Se determină diametrul eritrocitar la 45 de hematii şi se defectează microscopul. Pentru
a realiza o curbă Price-Jones vrem să determinăm diametrul a 100 hematii. Este suficient
să mutăm frotiul de sânge periferic la un alt microscop şi să continuăm măsurarea
diametrelor?

................................................................................................................................................
3. Se măsoară diametrul a 100 hematii şi se obţin următoarele valori:
• 10 hematii - 7,3 µm
• 5 hematii - 6,7 µm
• 3 hematii - 5,8 µm
• 1 hematie - 5 µm
• 1 hematie - 5,6 µm
• 25 hematii - 7,8 µm
• 30 hematii - 8 µm
• 20 hematii - 8,9 µm
• 5 hematii - 9,5 µm
În spaţiul liber din dreapta schiţaţi curba Price-Jones.
Este o curbă fiziologică?

................................................................................................................................................
4. Ce informaţii vă oferă un diametrul eritrocitar mediu de 9,3 µm ?

................................................................................................................................................
5. Ce informaţii vă oferă un diametru eritrocitar mediu de 6 µm ?

................................................................................................................................................
6. Cu ce alte constante eritrocitare directe puteţi corela diametrul eritrocitar, pentru un
eventual diagnostic?

................................................................................................................................................
7. Care este constanta eritrocitară directă cu care se corelează perfect diametrul
eritrocitar? Dar cea indirectă?
................................................................................................................................................

8. Ce înţelegeţi prin macrocitoza fiziologică a nou-născutului?

................................................................................................................................................
9. Ce este anizocitoza fiziologică? Cum aţi explica prezenţa ei?

................................................................................................................................................
10. Care sunt limitele fiziologice ale diametrului eritrocitar mediu?
................................................................................................................................................

57
2.7. INDICII ERITROCITARI INDIRECŢI

După modul de determinare, indicii sau constantele eritrocitare pot fi directe (măsurabile
prin metode specifice): diametrul hematiei, hematocritul, numărul de hematii, concentraţia
de hemoglobină etc., sau indirecte (derivate), cum ar fi volumul eritrocitar mediu,
hemoglobina eritrocitară medie etc., obţinute prin calcul matematic, pe baza constantelor
eritrocitare directe.
Indicii eritrocitari reprezintă o formă de exprimare a constantelor eritrocitare prin raportarea
valorii găsite la valoarea considerată normală. Valorile anormale indică prezenţa anemiei
şi îi pot identifica tipul morfologic.
Constantele şi indicii eritrocitari dau informaţii utile asupra tipul morfologic şi cromic al
unei anemii. În practică sunt folosiţi numai o parte dintre ei, restul fiind utilizaţi doar în
cercetarea ştiinţifică.
Deoarece se calculează pe baza valorilor obţinute la numărătoarea eritrocitelor, la
determinarea hematocritului şi a hemoglobinei, rezultă că gradul de exactitate al lor
depinde de preciziile determinărilor anterioare.
Indicii eritrocitari indirecţi sau derivaţi
a) Volumul eritrocitar mediu (VEM) – reprezintă volumul ocupat de un singur eritrocit. Se
obţine după formula:

Ht x 10
VEM =
E

Unde Ht = hematocritul %, E = numărul de eritrocite/mm3 (în milioane);

Prin metoda automată, VEM este determinat prin împărţirea sumei volumelor eritrocitare la
numărul de eritrocite.
- Rezultatele se exprimă în microni cubi (µ3) sau femtolitri (fl).
- La adult, valorile normale sunt cuprinse între 80 – 100 fl (valori mai mari la nou-
născuţi, precum şi la vârstnici; valori mai mici la copii şi adolescenţi până la 18 ani).
Valori patologice se întâlnesc în:
- macrocitoză (peste 100 µ3): sarcină, alăptare, copii în perioada de creştere etc.);
- megalocitoză (120 – 140 µ3): deficit de vitamină B12 sau de acid folic;
- microcitoză (valori sub 80 µ3): anemia feriprivă hipocromă, anemia din infecţiile
cronice etc.
Dezavantajul calculării VEM constă în folosirea numărului de eritrocite, a cărui determinare
implică eroarea inerentă metodei (± 11%).
b) Hemoglobina eritrocitară medie (HEM) reprezintă încărcarea medie cu hemoglobină
a unui eritrocit. Se exprimă în micro-micrograme (µµg) sau picograme (pg). Se calculează
după formula:
Hb x 10
HEM =
E
- Unde Hb = hemoglobina în g % ml sânge, E = numărul de eritrocite/mm3 (în
milioane).
Valori normale: 30 µµg (pg), cu variaţii între 26 – 34 µµg.
Valori patologice se întâlnesc în:
- megalocitoză, anemia regenerativă (observată, de exemplu, în timpul tratamentului
cu fier a anemiei feriprive), la nou-născut - HEM peste 34 µµg = „hipercromie” (vezi
explicaţia de la pagina 59);

58
 - anemii microcitare - HEM sub 26 µµg = hipocromie;
- anemii normocitare - sunt, de obicei, normocrome.
Această constantă este mai puţin exactă, fiindcă se calculează din hemoglobină şi număr
de eritrocite, a căror determinare este supusă erorilor.
c) Concentraţia de hemoglobină eritrocitară medie (CHEM) reprezintă concentraţia
medie a hemoglobinei în procente, sau grame de hemoglobină conţinute în 100 ml masă
eritrocitară. Se calculează după formula:

Hb x 100
CHEM =
Ht

Valori normale: 34 % (34 g la 100 ml masă eritrocitară cu variaţii între 32 – 36 %), sau se
pot exprima în g/dL (32 – 36 g/dL sau 320-360 g/L).
Semnificaţie clinică – VEM este un indice extrem de valoros în clasificarea anemiilor, dar
HEM şi CHEM, de obicei, nu aduc în plus informaţii relevante clinic. Totuşi, au un rol
important în controlul de calitate al laboratorului, deoarece aceşti indici variază foarte puţin
de la o zi la alta pentru un specimen dat, dacă pacientul nu este transfuzat.
Datorită comportamentului similar al volumului eritrocitar şi conţinutului în Hb al fiecărui
eritrocit în parte, CHEM rămâne constant în multe afecţiuni hematopoietice.
În practică se preferă utilizarea acestei constante, la al cărei calcul se foloseşte
hematocritul.
Valori patologice se întâlnesc în:
- anemiile microcitare, hipocrome (anemia feriprivă, unele talasemii) în care CHEM
scade sub 32 %, ceea ce exprimă o încărcare redusă a eritrocitului cu hemoglobină;
- creşteri peste 36 % nu se pot întâlni, eritrocitul având, în mod normal, o saturaţie
maximă cu hemoglobină (creşterea în continuare a concentraţiei de Hb ar duce la
precipitarea acesteia). În plus, creşterea volumului eritrocitului influenţează şi
creşterea hematocritului, valoarea raportului rămânând constantă. Rezultă că
noţiunea de „hipercromie”, prin prisma acestei constante, este falsă.
d) Grosimea eritrocitară medie (GEM):
Valorile normale sunt: 1,7 – 2,5 µ. Valori patologice se întâlnesc în sferocitoză (peste 2,5
µ) şi în platicitoză (sub 1,7 µ). Are valoare practică redusă.
e) Suprafaţa eritrocitară medie (SEM):
Valori patologice: scade în microcitoză, creşte în macrocitoză. Este utilizată în cercetarea
ştiinţifică.
f) Lărgimea distribuţiei eritrocitare (RDW – red blood cell distribution width) este un
indice eritrocitar care cuantifică heterogenitatea volumului celular (gradul de anizocitoză).
RDW este calculat de analizorul automat, atunci când există două sau mai multe “peak”-
uri (vârfuri) şi lărgime de distribuţie anormală pe curba de distribuţie eritrocitară. Distribuţia
VEM într-o probă este prezentată sub forma unui grafic în care pe abscisă se proiectează
volumul eritrocitar, iar pe ordonată frecvenţa relativă.
Deviaţia standard a mărimii eritrocitelor x 100
RDW = ————————————————————-
VEM
Valori normale: 11,5-14,5 % coeficient de variatie (CV) a volumului eritrocitar.
RDW este util în caracterizarea iniţială a anemiilor, în particular a anemiei microcitare.
- RDW este util în diferenţierea beta-talasemiei minore necomplicate, în care VEM este scăzut, iar RDW
normal, de anemia feriprivă, în care VEM este scăzut, iar RDW crescut (creşterea RDW este un semn
precoce în deficitul de fier).

59
 - RDW este uşor crescut în beta-talasemia minoră cu anemie uşoară .
- RDW permite diferenţierea între anemia din bolile cronice (VEM normal/scăzut, RDW normal) şi
anemia feriprivă incipientă (VEM normal/scăzut, RDW crescut).
RDW crescut: anemia feriprivă, anemia megaloblastică, diferite hemoglobinopatii (ex. β-talasemia), anemia
hemolitică imună, reticulocitoza marcată, prezenţa de fragmente eritrocitare, aglutinare, dimorfism eritrocitar
(inclusiv pacienţii transfuzaţi sau cei trataţi recent pentru deficienţe nutriţionale).
RDW normal: anemia din bolile cronice, β-talasemia heterozigotă, anemia hemoragică acută, anemia
aplastică, sferocitoza ereditară, boala cu Hb E, siclemia.
Nu există o cauză cunoscută pentru RDW scăzut.
g) Indicele de culoare (IC) este cunoscut şi sub denumirea de valoare globulară.
Reprezintă conţinutul mediu în hemoglobină al unui eritrocit în comparaţie cu conţinutul în
hemoglobină al unui eritrocit normal.
- Valorile normale: 0.85 – 1,15.
- Valori patologice: sub 0,85 indică o hipocromie, peste 1,15 indică o hipercromie (noţiune falsă: o
încărcare suplimentară cu hemoglobină are loc odată cu creşterea volumului eritrocitar, concentraţia
rămânând, însă, aceeaşi).
h) Indicele de sfericitate (IS) este raportul dintre DEM şi GEM.
- Valori normale: 3,1 – 3,7.
- Valori patologice: peste 3,7 indică o platicitoză; sub 3,1 indică o sferocitoză.
Alţi indici folosiţi în cercetarea ştiinţifică: indicele de volum, indicele de saturaţie, indicele
de elipticitate etc.
Importanţa practică a indicilor eritrocitari
Permit precizarea tipului morfologic şi cromic al unei anemii, atât prin valorile găsite, cât şi
prin confruntarea acestor valori cu aspectul eritrocitelor pe frotiul de sânge.
Întrucât determinarea hematocritului şi a hemoglobinei comportă cele mai mici erori,
putem considera CHEM ca cea mai precisă dintre constantele eritrocitare.

Studiu individual

Consultând un dicţionar medical sau materialele didactice, vă rugăm să definiţi

următorii termeni: cromie, morfologie, sferocitoză, platicitoză, a cuantifica,
analizor automat, deviaţie standard, talasemie, aglutinare, dismorfism, deficienţă
nutriţională.

60
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Care este cea mai precisă dintre constantele eritrocitare? De ce?

................................................................................................................................................
2. De ce este falsă noţiunea de hipercromie prin prisma CHEM?

................................................................................................................................................
3. Copil în vârstă de 10 ani, prezintă Ht = 43%, E = 4,2 mil/mm3, VEM = 102,3 µ3. Valorile
sunt fiziologice? Vă gândiţi să-i recomandaţi şi alte teste hematologice?

................................................................................................................................................
4. Care este indicele eritrocitar care vă cuantifică gradul de anizocitoză?

................................................................................................................................................
5. Ce constante şi indici eritrocitari ar fi utili pentru a diferenţia o anemie post-hemoragică
de una feriprivă?

................................................................................................................................................
6. Sugar în vârstă de 11 luni, alimentat exclusiv lactat (diversificarea alimentaţiei se face,
normal, între 4 şi 6 luni de viaţă), prezintă discretă paloare. Ce teste hematologice
recomandaţi? Dar regim alimentar?

................................................................................................................................................
7. Ce înţelegeţi prin anemie normocromă normocitară? În ce situaţii ar putea să apară?

................................................................................................................................................
8. Tânăr motociclist, fără probleme de sănătate în antecedente, în urma unui accident
rutier pierde aproximativ 1litru de sânge; este transfuzat imediat, conform grupei şi Rh-ului.
La 2 zile după transfuzie i se recoltează sânge pentru teste sanguine uzuale. Cum credeţi
că vor fi rezultatele testelor?

................................................................................................................................................
9. Cum denumiţi o hematie normală din punct de vedere al culorii, formei şi mărimii?

................................................................................................................................................
10. Dacă la un pacient găsiţi valori ale : HEM = 24 µµg şi CHEM = 33%, cum le
interpretaţi?

................................................................................................................................................
11. Pacientă cu varsta de 65 ani, prezintă valori ale Hb = 10 g%, Ht = 33%, E = 3,3
mil/mm3. Sunt valori fiziologice? Recomandaţi şi alte analize de laborator? Este cazul să
instituiţi vreun tratament?

................................................................................................................................................

61
2.8. DETERMINAREA REZISTENŢEI OSMOTICE A HEMATIILOR
Definiţie. Hemoliza reprezintă distrugerea eritrocitelor şi eliberarea consecutivă a
conţinutului (hemoglobină) în fluidul de dispersie (plasma). Termenul provine din cuvintele
greceşti “aima” (aima, haema, hemo), care înseamnă sânge şi “lusis” (lusis, lysis, liză)
care înseamnă a elibera, termen acceptat şi ca distrugere.
Hemoliza fiziologică este un proces fiziologic prin care hematiile îmbătrânite sunt
fagocitate şi dezintegrate de sistemul monocit-macrofag, iar constituenţii eritrocitari
eliberaţi sunt metabolizaţi şi eliminaţi sau refolosiţi. Pe parcursul vieţii intravasculare,
solicitările permanente la care sunt supuse eritrocitele (fizice sau chimice) determină
modificări structurale şi funcţionale care permit recunoaşterea lor de către fagocite printr-
un fenomen de chimiotactism pozitiv. Apar:
- modificări de formă (tendinţă la sfericitate, scăderea ATP);
- scăderea deformabilităţii, care nu-i mai permite eritrocitului să reziste trecerii prin
capilar, în special cel splenic;
- scăderea rezistenţei osmotice şi mecanice;
- alterări biochimice care interesează structura şi funcţionalitatea membranei sau
metabolismului celular.
Mecanismele exacte prin care sunt recunoscute eritrocitele îmbătrânite sunt încă incerte.
Distrugerea hematiilor îmbătrânite are loc preponderent extravascular (90%), în special la
nivelul capilarelor măduvei osoase hematogene şi, în proporţie mai mică la nivelul splinei
şi ficatului (datorită particularităţilor anatomice – diametrul mic al capilarelor şi traseu
sinuos). Elementele eritrocitare eliberate urmează căi diferite de metabolizare: globina se
transformă în aminoacizii constituenţi care intră în fondul comun metabolic, iar hemul este
convertit în pigmenţi biliari (bilirubină neconjugată).
Hemoliza patologică reprezintă liza prematură a hematiilor cu defecte. Consecinţa
distrucţiei eritrocitare premature este anemia hemolitică, aceasta având multiple cauze:
Anemii hemolitice de cauză eritrocitară (intracorpusculară) pot fi cauzate de:
- alterării structurale ale membranei eritrocitare;
- unor defecte enzimatice;
- alterării hemoglobinei (hemoglobine patologice).
Anemii hemolitice de cauză extraeritrocitară (extracorpusculare) pot fi cauzate de:
- unor agenţi infecţioşi (malaria);
- administrării unor medicamente (sulfonamide, penicilină);
- factori traumatici (proteze valvulare);
- alterării endoteliului vascular (vasculite);
- alterării mediului de suspensie prin substanţe chimice (toxine animale şi vegetale);
- hipersplenism;
- anticorpi antieritrocitari (anemii hemolitice autoimune, erori transfuzionale).
Evaluarea hemolizei.
Dezintegrarea experimentală a eritrocitelor a fost efectuată in vitro, prin procedee dintre
cele mai diverse:
- agenţi fizici: agitare mecanică, ultrasunete, încălzirea sângelui la 48°C;
- agenţi fizico-chimici: scăderea presiunii osmotice a mediului de suspensie;
- agenţi chimici: acizi, baze, săpunuri, cloroform, alcool;
- agenţi biologici: anticorpii antieritrocitari.
Dintre metodele folosite la ora actuală, pentru evaluarea hemolizei, cele mai utilizate sunt:
determinarea rezistenţei mecanice, a rezistenţei acide (testul Ham), teste care pun în
evidenţă prezenţa anticorpilor antieritrocitari precum şi determinarea rezistenţei osmotice.

62
Lucrări practice de efectuat în laborator.
Determinarea rezistenţei osmotice a hematiilor
Eritrocitele îşi menţin forma de disc biconcav şi integritatea într-o soluţie izoosmotică
(izotonică), care are aceeaşi presiune osmotică cu a plasmei (figura. 2.17.). Suspendarea
eritrocitelor într-o soluţie hipotonă (presiune osmotică mai mică decât a plasmei) este
urmată de hemoliză, deoarece mediul fiind hipotonic, iar conţinutul eritrocitar hipertonic,
egalizarea presiunii osmotice se face prin pătrunderea apei în eritrocite (gradient de apă).
Ca urmare, acestea se umflă, devin sferice, membrana se rupe şi hemoglobina este
eliminată în soluţie. Suspendarea eritrocitelor într-o soluţie hipertonă (presiune osmotică
mai mare decât a plasmei) este urmată de ieşirea apei din hematii, care se ratatinează (se
zbârcesc).

Figura. 2.17. Comportamentul unor celule (eritrocite),

în funcţie de presiunea osmotică a mediului în care sunt suspendate

Principiul determinării. Hemoglobina iese prin membrana lezată a hematiilor, când

acestea sunt puse într-un mediu hipoton. Determinarea rezistenţei osmotice a hematiilor
înseamnă identificarea concentraţiei unei soluţii de NaCl (grame %) la care hemoglobina
începe să părăsească hematiile mai puţin rezistente (rezistenţa minimă) şi concentraţiei
unei soluţii de NaCl (grame %) la care toate hematiile sunt hemolizate (rezistenţa
maximă).
În acest scop se folosesc soluţii de NaCl de concentraţii descrescânde (cu 0,05%)
cuprinse între 0,9 gr NaCl% şi 0,05 gr NaCl%.
Materiale necesare: stativ cu eprubete de hemoliză, pipete gradate, sânge defibrinat,
soluţie de NaCl 0,9%, apă distilată.
Tehnica de lucru
- se iau 18 eprubete mici de hemoliză, se numerotează de la 1 la 18 şi se aşează în
stativul de eprubete;
- în fiecare eprubetă se pune un amestec de soluţie de NaCl 0,9 grame % şi apă
distilată, după protocolul din tabelul 2.7.;
- se omogenizează prin agitare;
- se lasă eprubetele în repaus absolut timp de 1 oră la temperatura camerei.
Citirea rezultatelor:
- În primele eprubete hematiile sedimentează (zonă roşie opacă la fundul eprubetei),
iar supernatantul este incolor, transparent, datorită faptului că ele rezistă la o uşoară
scădere a presiunii osmotice.

63
 - Prima eprubetă în care supernatantul este uşor colorat în roz, indică hemoliza
primelor hematii, cele mai puţin rezistente; este identificată astfel rezistenţa minimă,
exprimată în concentraţia în gr% a soluţiei de NaCl din eprubeta respectivă.
- Se caută în continuare eprubeta care nu mai prezintă sediment, în care tot conţinutul
este intens colorat în roşu, ceea ce indică hemoliza tuturor hematiilor, chiar şi a celor
mai rezistente; este identificată astfel rezistenţa maximă, exprimată în concentraţia
în gr% a soluţiei de NaCl din eprubeta respectivă.

Tabelul 2.7. Protocolul de diluţie a soluţiei de NaCl 0,9 grame %

Nr. Eprubetă E1 E2 E3 E4 E5 .......... E17 E18
NaCl 0,9g%
1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 .......... 0,2 0,1
(ml)
Apă distilată
- 0,1 0,2 0,3 0,4 .......... 1,6 1,7
(ml)
Sânge 2-3 picături în fiecare eprubetă

Interpretarea rezultatelor
Valori normale:
- Hemoliza începe la concentraţia de 0,45 gr% NaCl (0,40 - 0,50 gr% NaCl), când
hemolizează hematiile cele mai puţin rezistente (hematiile îmbătrânite), reprezentând
Rm (rezistenţa minimă).
- Hemoliza se termină la o concentraţie de 0,35 gr% NaCl (0,30 - 0,40 gr% NaCl),
când toate hematiile sunt hemolizate, reprezentând RM (rezistenţa maximă). Între
Rm şi RM se întinde câmpul rezistenţei globulare.
Valori patologice:
Rezistenţa osmotică scăzută (fragilitate eritrocitară crescută) o întâlnim în:
- anemiile hemolitice congenitale (anemia Minkowski-Chauffard sau sferocitoză
ereditară);
- anemiile hemolitice dobândite (din hepatita epidemică, intoxicaţii cu benzen, stări de
acidoză).
Rezistenţa osmotică crescută (fragilitate eritrocitară scăzută) se întâlneşte în:
- platicitoză (anemia Cooley);
- anemia feriprivă;
- mai rar, în anemia pernicioasă, după transfuzii de sânge, după splenectomie, în
icterul obstructiv, în afecţiuni hepatice.
Stabilirea unei curbe de hemoliză
Se face prin dozarea spectrofotometrică a hemoglobinei din fiecare eprubetă, considerând
martor negativ eprubeta în care nu există hemoglobină în supernatant, iar martor pozitiv
eprubeta cu hemoliză completă. Se determină extincţia şi se stabileşte cantitatea de
hemoglobină existentă în fiecare supernatant, în intervalul martor negativ – martor pozitiv.
Pe ordonată se înscriu concentraţiile în hemoglobină, iar pe abscisă concentraţia în gr%
NaCl (figura 2.18.).

64
 Figura nr. 2.18. Curba de hemoliză normală şi patologică

Studiu individual

1. Consultând un dicţionar medical sau materialele didactice, indiferent de disciplina

de la care provin, vă rugăm să definiţi următorii termeni: chimiotactism, presiune
osmotică, malarie, hipersplenism, splenectomie, spectrofotometrie, supernatant,
fragilitate eritrocitară, fragilitate capilară, anticorpi antieritrocitari.
2. Calculaţi concentraţia de NaCl în gr% din fiecare eprubetă (1-18) folosită.
3. Asociaţi următorii termeni: rezistenţa osmotică crescută, rezistenţa osmotică
scăzută, fragilitate eritrocitară crescută, fragilitate eritrocitară scăzută.

65
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Ce reprezintă hemoliza fiziologică? Dar cea patologică?

................................................................................................................................................
2. Unde are loc distrugerea hematiilor îmbătrânite?

………………………………………………………………………………………………..............
3. Indicaţi câteva cauze ale hemolizei patologice.

................................................................................................................................................
4. Ce se întâmplă cu hematiile suspendate într-o soluţie hipotonă? Dar hipertonă?

................................................................................................................................................
5. Ce reprezintă rezistenţa osmotică minimă? Dar cea maximă?

................................................................................................................................................
6. Care sunt valorile rezistenţei osmotice eritrocitare minimă? Dar cea maximă?

................................................................................................................................................
7. În ce situaţie apare creşterea rezistenţei osmotice?

................................................................................................................................................
8. În ce situaţie apare scăderea rezistenţei osmotice?

................................................................................................................................................
9. Ce valori ale rezistenţei osmotice minime şi maxime asociaţi cu: rezistenţa osmotică
crescută, rezistenţa osmotică scăzută, fragilitate eritrocitară crescută, fragilitate eritrocitară
scăzută?

................................................................................................................................................
10. Interpretaţi următorul buletin de analiză: VEM = 80 μ3, HEM = 27 µµg, Rm = 0,70 gr%
NaCl şi RM = 0,50 gr% NaCl.

................................................................................................................................................

66
2.9. GRUPELE SANGUINE.
Definitie. Societatea Internaţională de Transfuzie (International Society of Blood
Transfusion –ISBT) defineşte un sistem de grup sanguin prin prezenţa unuia sau mai
multor antigene, codificate de o genă situată într-un singur locus, sau pe mai multe gene
omologe, strâns legate între ele.
SISTEMUL 0AB şi Rh
La om au fost identificate, până acum, 30 de sisteme de grup sanguin şi au fost descrise
peste 600 de antigene. Dintre acestea, cele mai importante sunt sistemele 0AB şi Rh.
Importanţa lor derivă din puterea antigenică mare, care se poate exprima prin accidente
posttransfuzionale, în cazul sistemului 0AB, sau incompatibilitate materno-fetală, în cazul
sistemului Rh.
În anul 1901, Landsteiner descoperă că aglutinarea şi hemoliza hematiilor în accidentele
transfuzionale se datorează prezenţei pe membrana hematiilor a unor polizaharide cu
proprietăţi antigenice. Landsteiner a descris pe hematiile speciei umane trei antigene
notate cu: A şi B, cu o capacitate antigenică mare şi un antigen 0 numit şi H, cu o
capacitate antigenică foarte redusă. Grupele sanguine cărora le corespund aceste
antigene au fost notate cu 0, A şi B. Grupa AB a fost descoperită în anul 1902 de
Decastele şi Struli şi confirmată în 1907 de Janski, care notează grupele cu I, II, III, IV.
Astăzi cele 2 nomenclaturi au fost unificate, sistemul 0AB fiind notat cu 0(I), A(II), B(III) şi
AB(IV), literele reprezentând antigenele fixate pe membrana hematiilor.
Introducerea în sângele unui individ a unor antigene străine generează un conflict imun, în
urma căruia se formează anticorpi. Atacul acestora asupra hematiilor care conţin
antigenul străin duce la aglutinarea şi liza hematiilor. Din acest motiv, antigenele
respective se mai numesc şi aglutinogeni, iar anticorpii - aglutinine.
Anticorpii din sistemul 0AB sunt naturali, adică nu se formează în urma unui conflict
imun, ci în urma unor reacţii de sensibilizare la substanţe asemănătoare din alimente,
bacterii, virusuri, în cursul primului an de viaţă. Anticorpii sunt imunoglobuline din clasa M,
cu greutate moleculară mare, care nu traversează placenta şi nu determină
incompatibilitate materno-fetală. Anticorpii din sistemul 0AB se numesc anti-A sau alfa şi
anti-B sau beta; prezenţa lor în plasma unor indivizi ai speciei umane respectă regulile
serologice ale lui Landsteiner:
- Legea excluderii reciproce - la acelaşi individ NU pot coexista antigenul şi anticorpul
omolog (specific sau corespunzător), de exemplu: antigenul A cu anticorpul anti-A
(alfa). Prezenţa lor ar duce la aglutinarea hematiilor şi distrugerea acestora prin
hemoliză, situaţie incompatibilă cu viaţa.
- În sistemul 0AB, anticorpul compatibil cu antigenul este întotdeauna prezent în ser,
de exemplu: antigenul A cu anticorpul anti-B (beta).
De cele mai multe ori, anti-A şi anti-B sunt detectabili la 3-6 luni după naştere, iar la
vârsta de 5 ani, titrul acestora atinge un maximum care se mentine în toată perioada
adultă.
În funcţie de prezenţa (sau absenţa) pe membrana eritrocitară a antigenelor, indivizii
speciei umane se împart în 4 grupe: 0, A, B şi AB (tabel 2.8.).
Subgrupele sistemului sanguin 0AB. Antigenele A şi B au mai multe variante
determinate genetic, adică mai multe subgrupe. Aceste variante apar ca urmare a unor
mutaţii la nivelul genelor A şi B, determinate de substituţii de aminoacizi la nivelul
transferazelor. Se traduc printr-o slabă exprimare a antigenelor A şi B. Cele mai
importante sunt subgrupele A, notate A1 şi A2. Mai există şi alte subgrupe A, de
importanţă mai mică: Aint., A3, Am, Ax etc. Şi grupa B poate să aibă mai multe subgrupe:
B1, B2, B3 etc.

67
 Tabel 2.8. Grupele sanguine în sistem 0AB
Frecvenţa
Grupa Antigene pe
Anticorpi în plasmă medie în
sanguină eritrocit
România
0 - Anti-A (alfa), anti-B (beta) 36%
A A Anti-B (beta) 41%
B B Anti-A (alfa) 16%
AB A,B Nu au 7%

Subgrupa A1 – se întâlneşte la 80% dintre subiecţii de grupă A. Este formată dintr-un

antigen comun A şi un antigen propriu A1, care împreună constituie un complex antigenic
AA1. Factorul A1 are antigenitatea cea mai puternică şi a mai fost numit şi “A tare”.
Subgrupa A2 – este prezentă la 20% dintre subiecţii de grup A. Are antigenitate scăzută,
motiv pentru care se mai numeşte şi "A slab". Nu provoacă boală hemolitică prin imunizare
maternă şi nici accidente posttransfuzionale în cazul unor transfuzii repetate administrate
celor cu grupă A1 sau A1B.
Cele două atribute, “tare” şi “slab” se referă la modul în care aglutinina anti-A (alfa) din
plasma indivizilor de grup B sau 0 reacţionează cu cele 2 antigene: aglutinare puternică şi
rapidă cu A1 = A “tare” şi slabă şi lentă cu A2 = A “slab”.
Existenţa subgrupelor A1 şi A2 duce la existenţa a 2 subgrupe principale şi pentru grupa
AB, respectiv A1B şi A2B.
Cunoaşterea subgrupelor are importanţă teoretică şi practică: un antigen A sau B slab
poate să nu dea reacţie de aglutinare cu serurile test anti-A sau anti-B. Din acest motiv:
- un individ A2 sau A3 devine fals 0;
- un individ A2B sau A3 B devine fals B.

Pentru a exclude un accident posttransfuzional prin incompatibilitate de

subgrup se impune:
- determinarea grupelor sanguine prin ambele metode: de determinare a
antigenelor de pe eritrocite şi de evidenţiere a anticorpilor din plasmă;
- executarea probei majore de compatibilitate in vitro Jeanbreau.

Importanţa determinării grupelor din sistemul 0AB

Stabilirea compatibilităţii transfuzionale între donator şi primitor, cu scopul evitării
accidentelor posttransfuzionale imediate. Este necesar ca, sângele administrat să nu
conţină antigene în plus faţă de sângele primitorului. Aceste antigene ar putea provoca
aloimunizare şi accidente cu ocazia unor transfuzii ulterioare.
- Pentru efectuarea unei transfuzii sigure s-a impus respectarea a două reguli,
cunoscute şi sub numele de legi ale transfuziei. În cazul transfuziilor sub 500 ml
(până la 1/10 din volumul sanguin al primitorului), trebuie să existe compatibilitate
între antigenele donatorului şi anticorpii primitorului. Pentru această situaţie,
donatorul care îndeplineşte condiţia este cel cu grupă 0RhD-, deoarece pe
eritrocitele sale nu se găsesc antigene. Anticorpii anti-A şi anti-B ai donatorului de
grup 0 sunt ignoraţi, deoarece aceştia se diluează în proporţie de peste 1/10 în
sângele primitorului, ceea ce duce la scăderea sau pierderea activităţii lor.

68
 Compatibilitatea pentru transfuzia sub 500 ml este redată în figura nr. 2.19.,
schema fiind stabilită de Ottenberg. Din această schemă se observă că grupa 0
este considerată donator universal, iar grupa AB primitor universal.
În cazul în care se administrează doar plasmă, compatibilitatea trebuie să fie
inversă faţă de schema Ottenberg, adică între anticorpii donatorului şi antigenele
primitorului. În această situaţie, grupa AB este donator universal, deoarece nu are
anticorpi, iar grupa 0 este primitor (figura 2.20)
- În cazul transfuziilor care necesită cantităţi mai mari de 500 ml, compatibilitatea
trebuie să fie inversă, adică între anticorpii donatorului şi antigenele primitorului,
deci sângele transfuzat trebuie să fie izogrup. În tabelul 2.9. sunt prezentate
schematic caracteristicile grupelor sanguine din sistemul 0AB, precum şi
aplicabilitatea celor două legi.
Pentru studiul şi prevenirea bolii hemolitice a nou născutului, datorată
incompatibilităţii antigenice între eritrocitele mamei şi eritrocitele fătului.
Incompatibilitatea materno-fetală în sistem 0AB este foarte rară şi mai puţin gravă decât
cea produsă prin izoimunizare anti-Rh. În această situaţie apar, în urma unor procese de
aloimunizare, anticorpii de tip imun sau aloanticorpii anti-A sau anti-B, de exemplu, mama
0 cu un făt A sau B. Aceşti anticorpi sunt imunoglobuline (Ig) de tip G, cu GM mică,
asemănătoare celor din sistem Rh, care pot trece bariera placentară.
Pentru a facilita donarea de sânge şi transplantul de organe
În medicina legală:
- pentru stabilirea paternităţii sau maternităţii;
- pentru identificarea victimelor sau agresorilor. În aceste situaţii, determinarea
grupelor sanguine este înlocuită tot mai mult cu analiza ADN.

Figura 2.19. Schema Ottenberg

Posibilităţi de transfuzie în sistemul 0AB
- cantităţi mai mici de 500 ml sânge.
Grupa 0 este donator universal,
deoarece nu are antigene.
Grupa AB este primitor universal
deoarece nu are anticorpi.

Figura 1.20. Schema compatibilităţii

plasmatice.
În cazul administrării plasmei
compatibilitatea trebuie să fie inversă faţă
de schema Ottenberg, adică între
anticorpii donatorului şi antigenele
primitorului.
În această situaţie, grupa AB este
donator universal, deoarece nu are
anticorpi, iar grupa 0 este primitor
universal, deoarece nu are antigene.

69
 Tabelul 2.9. Profilul imunologic al grupelor sanguine din sistemul 0AB. Compatibilitatea
transfuzională.
Antigene Anticorpi
Grupa pe eritrocit în plasmă Cui donează? De la cine primesc?
(aglutinogene) (aglutinine)
Grupei 0
Anti-A (α) Sub 500 de ml la
0 - De la 0
Anti-B (β) toate grupele =
donator universal
De la A
Grupei A
A A Anti-B (β) Sub 500 de ml, de la
Sub 500 de ml, la AB
0
De la B
Grupei B
B B Anti-A (α) Sub 500 de ml, de la
Sub 500 de ml, la AB
0
De la AB
Sub 500 de ml, de la
AB A, B - Grupei AB
toate grupele =
primitor universal

Înaintea oricărei transfuzii:

- Se determină grupa primitorului în sistemul 0AB şi Rh.
- Se alege un donator izogrup în sistemul 0AB şi Rh.
- Se face obligatoriu proba de compatibilitate directă, chiar dacă se
cunosc grupele donatorului şi primitorului.

SISTEMUL Rh
Până la descoperirea sitemului antigenic Rh, se produceau multe accidente
posttransfuzionale, chiar în cazul în care exista compatibilitate donator-primitor în sistemul
0AB. De asemenea, nu se ştia de ce, unele femei năşteau copii cu anemie hemolitică şi
tulburări neurologice severe. Cauza acestor anomalii a fost elucidată prin descoperirea de
către Landsteiner şi Wiener a unui antigen prezent pe hematiile de maimuţă Macacus
Rhesus, pe care l-au numit Rh şi care, ulterior, a fost evidenţiat şi pe hematiile umane.
Sistemul Rh cuprinde 6 antigene notate C, D, E, c, d, e. Din punct de vedere practic, cel
mai important este antigenul D, deoarece are cea mai mare putere antigenică, fiind
răspunzător de unele accidente posttransfuzionale şi de 95% dintre cazurile de
incompatibilitate materno-fetală. Persoanele care au acest antigen pe hematii sunt RhD+,
proporţia lor fiind de cca. 80-85% din totalul populaţiei albe. La populaţia neagră, procentul
de RhD pozitiv se apropie de 100%.
Spre deosebire de sistemul 0AB, în sistemul Rh nu se găsesc în plasmă anticorpi
naturali. Ei sunt de tip imun şi numai în cazuri excepţionale - deleţie parţială sau totală -
sunt de tip natural. Sunt imunoglobuline G cu GM mică, care trec prin membrana
placentară şi atacă hematiile fetale. Cea mai mare frecvenţă o au anticorpii cu specificitate
anti-D, deoarece factorul D este cel mai imunogen.
Sinteza de anticorpi anti-Rh apare în următoarele situaţii:
- Mamă RhD- care are o sarcină cu făt RhD+ (caracterul Rh+ este dominant şi se
moşteneşte de la tată). În această situaţie, dacă mama este la prima sarcină şi nu a

70
 avut în antecedente nici transfuzii cu sânge Rh+, nici avort în lună mare (>4 luni),
copilul se naşte fără nicio suferinţă datorată sistemului Rh. În timpul naşterii,
ruperea vilozităţilor coriale face posibilă pătrunderea hematiilor Rh + ale fătului în
circulaţia maternă. Deoarece este un antigen străin, sistemul imunitar al mamei va
reacţiona prin sinteză de anticorpi anti-D, de tip Ig G. La următoarea sarcină cu făt
Rh+, anticorpii din sângele mamei trec bariera placentară, se fixează pe eritrocitele
fătului şi produc aglutinarea şi hemoliza acestora. Boala care apare prin
incompatibilitate materno-fetală se numeşte eritroblastoză fetală sau boala
hemolitică a nou-născutului şi se caracterizeaza prin anemie hemolitică, icter şi
hepatomegalie.
- Imunizarea mamei RhD- care pierde o sarcină după luna a patra (imunizarea
mamei prin avort).
- În urma unei transfuzii de sânge RhD+ la persoane RhD-. În acest caz,
accidentul posttransfuzional nu va avea loc la prima transfuzie incompatibilă. După
prima transfuzie se va declanşa un răspuns imun cu producerea de anticorpi anti
– D (în 7 - 10 zile). La o nouă transfuzie incompatibilă, anticorpii formaţi anterior vor
ataca hematiile RhD+ ale donatorului şi va apărea hemoliza.

Profilaxia eritroblastozei fetale

- Se determină Rh-ul gravidei, iar dacă acesta este negativ, şi Rh-ul
tatălui biologic.
- Mamei RhD- i se va administra ser anti-RhD în primele 48 – 72 de ore
după naştere. Anticorpii se fixează pe hematiile fetale pătrunse în
circulaţia maternă, le aglutinează şi le hemolizează, inhibând astfel
sinteza de anticorpi anti-Rh, de către sistemul imun al mamei.
- Femeile RhD- izoimunizate prin sarcină pot da naştere la mai mulţi
copii sănătoşi, dacă li se face profilaxia corectă.

Cum evităm incompatibilitatea transfuzională în sistemul Rh?

- Se determină prezenţa sau absenţa factorului D la primitor.
- Se va executa, obligatoriu, şi proba de compabilitate directă,
Jeanbreau.

Lucrări practice efectuate în laborator.

Recomandări pentru determinarea grupului sanguin 0AB
- înaintea unei transfuzii;
- înaintea unei proceduri invazive sau chirurgicale potenţial asociate cu complicaţii
hemoragice care ar putea necesita transfuzii;
- monitorizarea imunohematologică antepartum şi postnatală a mamei şi copilului;
- la donatorii de sânge;
- pentru compatibilitatea de grup 0AB în transplantul de rinichi şi inimă.
Determinarea corectă a grupelor sanguine presupune atât evidenţierea antigenelor prin
metoda Beth-Vincent, cât şi a anticorpilor prin metoda Simonin.

71
1.Determinarea antigenelor. Metoda Beth-Vincent.
Principiul metodei. Se evidenţiază reacţia de aglutinare dintre antigenul (aglutinogenul) şi
anticorpul (aglutinina) corespunzătoare, folosind ser hemotest care conţine aglutinine
cunoscute şi sânge de la persoana testată.
Materiale necesare:
- seruri hemotest care conţin anticorpi anti-A, anti-B, anti-AB, preparate şi
controlate de centre speciale, prezentate în flacoane închise, cu etichete sau
conţinut diferit colorat;
- lame de sticlă cu godeuri;
- baghete de sticlă, pipete, ace de unică folosinţă, alcool, vată;
- sânge de cercetat.
Tehnica de lucru.
- pe o lamă cu godeuri, uscată şi curată se pune, de la stânga la dreapta, câte o
picatură de ser în fiecare godeu, întotdeauna în ordinea anti-A, anti-B, anti-A,B.
Sunt de preferat lamele cu godeuri marcate cu grupa respectivă. Marcajul se poate
face şi cu un creion special;
- se recoltează sânge din pulpa degetului sau din vena de la plica cotului, după
dezinfectarea prealabilă cu alcool;
- se ia o mică picătură de sânge cu bagheta sau cu colţul unei lame şi se amestecă
cu serul test anti-A;
- se ia o altă picătură de sânge - cu altă baghetă sau alt colţ al lamei şi se amestecă
cu serul test anti-B, operaţia repetându-se şi pentru serul test anti-A,B. Când se
foloseşte sânge din venă, se pune cu pipeta câte o picătură de sânge pe lamă,
lângă fiecare picătură de ser hemotest şi se omogenizează cu baghete diferite sau
colţuri diferite ale unei lame de sticlă. Raportul de volum între picătura de sânge şi
serul hemotest trebuie să fie de 1/10 - 1/20. Aceste precauţii sunt necesare pentru
a evita artefactele de aglutinare: pseudoaglutinarea dată de fibrinogen, când se
foloseşte mult sânge sau inhibiţia aglutinării prin exces de eritrocite.
- se agită lama prin mişcări de basculare, după care se face citirea în următoarele 3 -
4 minute, cel mult 10 minute.
La citire se apreciază prezenţa aglutinării, adică adunarea în grupe a hematiilor sau
absenţa acesteia, în acest caz amestecul rămânând uniform colorat, netransparent (figura
2.21.).
Rezultate şi interpretare
1. Aglutinare în picăturile cu ser anti-A şi anti-AB. Aglutinina anti-A aglutinează
hematiile care conţin antigen omolog, adica A. Indivizii care au pe hematii doar antigen
A fac parte din grupa A.
2. Aglutinare în picăturile cu ser anti-B şi anti-AB. Aglutinina anti-B aglutinează
hematiile care conţin antigen omolog, adica B. Indivizii care au pe hematii doar antigen
B fac parte din grupa B.
3. Aglutinarea în toate picăturile denotă prezenţa ambelor antigene. Indivizii care au pe
hematii ambele antigene fac parte din grupa AB.
4. Absenţa aglutinării în cele trei picături: sângele testat nu are niciun antigen omolog
aglutininelor anti-A şi anti-B. Indivizii care nu au antigene pe hematii sunt de grupa 0.

Pentru această metodă prezenţa aglutinării în ultima picătură trebuie să

fie însoţită de aglutinare în cel puţin încă o picătură. Serul anti-AB este
folosit ca martor.

72
 Anticorpii conţinuţi de serul hemotest
Anti-A Anti-B Anti-A, Anti-B Grupa rezultată în urma determinării

Grupa A

Grupa B

Grupa AB

Grupa O

Figura 2.21. Determinarea antigenelor prin metoda Beth-Vincent.

2. Determinarea anticorpilor (aglutininelor). Metoda Simonin.

Principiul metodei. Se evidenţiază reacţia de aglutinare dintre antigenul (aglutinogenul) şi
anticorpul (aglutinina) corespunzătoare, folosind hematii test 0, A, B şi ser de la subiectul
al cărui sânge trebuie testat. Deoarece hematiile test 0 nu conţin antigene, se folosesc ca
martor negativ sau pot lipsi din această determinare.
Materiale necesare.
- plasmă sau ser care trebuie testat;
- hematii test 0, A şi B;
- lamă godată;
- lame de sticlă sau baghete pentru omogenizare, pipete.
Tehnica de lucru.
- pe o placă se pun cu o pipetă 3 picături de plasmă sau ser de cercetat, lângă care
se adaugă câte o picătură de hematii test, în ordinea 0, A, B. Şi la această metodă,
picătura de hematii trebuie să fie de 10 - 20 ori mai mică decât cea de ser.
- se omogenizează pe rând toate picăturile, folosind de fiecare dată alt colţ al lamei
sau altă baghetă.
- citirea rezultatelor se face după 2 - 4 minute evidenţiindu-se prezenţa sau absenţa
aglutinării (figura 2.22.).
Interpretarea rezultatelor urmează aceeaşi logică ca la determinarea antigenelor, cu
menţiunea că acum se cunosc antigenele şi urmează să fie identificaţi anticorpii.

73
 Antigenele prezente pe hematiile test
- A B Grupa rezultată în urma determinării
Grupa 0.
Antigenele A şi B sunt atacate de
anticorpii omologi, adică de anti-A şi
anti-B. Grupa care are în plasmă ambii
anticorpi este 0.
Grupa A
Antigenul B este atacat de anticorpul
omolog, adică de anti-B. Grupa care are
în plasmă acest anticorp este A.
Grupa B
Antigenul A este atacat de anticorpul
omolog, adică de anti-A. Grupa care are
în plasmă acest anticorp este B.
Grupa AB
Cele două antigene nu interacţionează
cu nici un anticorp. Înseamnă că în
plasma acestor indivizi nu există
anticorpi omologi.

Figura 2.22. Determinarea antigenelor prin metoda Simonin.

3. Determinarea compatibilităţii sanguine directe - proba Jeanbreau.

Proba este obligatorie în orice transfuzie, chiar dacă se cunosc grupele sanguine ale
donatorului şi primitorului, precum şi în cazuri de urgenţă când nu dispunem de seruri
hemotest pentru determinarea grupei.
Importanţa ei este dată de faptul că sângele transfuzat poate conţine şi alte antigene sau
alţi anticorpi, în afara celor din sistemul 0AB şi Rh, care nu se determină în mod curent.
Principiul metodei. Se stabileşte compatibilitatea între donator şi primitor prin punerea în
contact a hematiilor donatorului cu serul sanguin al primitorului.
Tehnica de lucru. Metoda serologică.
- din sângele primitorului se obţine ser prin centrifugare;
- pe o lamă de sticlă se pune o picătură de ser de la primitor şi o picătură de 10 - 20
ori mai mică de sânge de la donator;
- se omogenizează cu colţul unei lame de sticlă şi se citeşte după 3 - 4 minute.
Rezultate şi interpretare.
- absenţa aglutinării (amestec omogen) – există compatibilitate între donator-primitor
şi transfuzia se poate face;
- prezenţa aglutinării înseamnă incompatibilitate între donator-primitor şi transfuzia
NU se face.
Dacă citirea este incertă, testul se repetă după 8 - 10 minute!
Pentru determinarea subgrupelor A1, A2 şi A1B, A2B se utilizează alte metode, bazate fie
pe neutralizarea parţială a aglutininei anti-A din serul de grup B, cu ajutorul peptonei Witte
(conţine substanţe specifice grupei A), fie prin folosirea unor substanţe specifice anti-A
extrase din plante (fitoaglutinine).

74
4. Determinarea factorului RhD.
Recomandări pentru determinarea factorului Rh:
- înaintea unei transfuzii;
- înaintea unei proceduri invazive sau chirurgicale potenţial asociate cu complicaţii
hemoragice care ar putea necesita transfuzii;
- monitorizarea imunohematologică antepartum şi postnatală a mamei şi copilului;
- la donatorii de sânge.
În testarea de rutină a grupului sanguin nu se indică determinarea altor antigene Rh în
afara factorului RhD. Determinarea fenotipului Rh complet este indicată la donatorii de
sânge, trebuie luată în considerare în cazul transfuziilor la fetiţe şi femei aflate la vârsta la
care sunt fertile şi la pacienţii transfuzaţi.
Metode de determinare
- hemaglutinare pe lamă cu ser anti-D monoclonal;
- aglutinare şi gel-filtrare pe carduri cu microtuburi care conţin un gel impregnat cu
reactivul specific antigenului eritrocitar de determinat.
Principiul lucrării. Se pun în contact aglutininele anti-RhD cu sângele de cercetat şi se
urmăreşte prezenţa sau absenţa aglutinării.
Materiale necesare:
- ser test anti-RhD;
- hematii martor de grup 0, RhD+;
- hematii martor de grup 0, RhD-;
- sânge de testat;
- lamă godată;
- lamă de sticlă sau baghetă pentru omogenizare.
Tehnica de lucru (figura 2.23.)
- se pune cate o picătură de ser anti-RhD+ pe o lamă, în toate cele 3 godeuri.
- se adaugă o picătură de 10 ori mai mică de sânge, în ordinea:
• sânge cu hematii martor de grup 0, RhD+ în primul godeu;
• sânge cu hematii martor de grup 0, RhD-, în al 2-lea godeu;
• sânge care conţine hematiile de cercetat, în ultimul godeu.
- se omogenizează cele două picături cu colţul unei lame sau cu vârful unei baghete
de sticlă.
Interpretarea rezultatelor: prezenţa aglutinării = RhD+; lipsa aglutinării = RhD-

Ser anti-RhD+ Ser anti-RhD+ Ser anti-RhD+ Rh rezultat în urma

Hematii martor Hematii martor Hematii de cercetat determinării
grup 0, RhD + grup 0, RhD -

Rh(D)+

Rh(D)-

Figura 2.23. Determinarea grupului sanguin în sistemul Rh

75
 Dacă un nou-născut prezintă anemie hemolitică şi Rh-ul mamei nu se
cunoaşte (teoretic o asemenea situaţie nu ar trebui să existe), explorarea
imunologică urmăreşte evidenţierea în serul mamei a anticorpilor anti-
RhD. Evidenţierea anticorpilor anti-RhD se face prin testul Coombs
indirect.

Erori în determinarea grupelor din sistemul 0AB. Determinarea corectă a grupelor

sanguine este un act de mare responsabilitate umană şi medicală, erorile fiind urmate de
grave accidente posttransfuzionale care pot duce la decesul pacientului transfuzat. Cele
mai frecvente erori sunt:
- nerespectarea ordinii în care se pun picăturile de ser test sau eritrocite test;
- folosirea unor seruri hemostat de provenienţă nesigură sau alterate; hemotestul
alterat aglutinează eritrocitele tuturor grupelor sanguine, fenomen numit
panaglutinare;
- nerespectarea raportului volumetric;
- neomogenizarea picăturilor de sânge şi ser imediat după aplicare;
- neomogenizarea continuă prin înclinarea lamei până la apariţia hemaglutinări
pentru a evita pseudoaglutinarea;
- citirea rezultatelor la mai mult de 8 - 10 minute (uscarea lamei poate duce la
pseudoaglutinare);
- temperatura scăzută produce aglutinarea “a frigore”, fals pozitivă.

Studiu individual

1. Consultând un dicţionar medical sau materialele didactice, indiferent de disciplina

de la care provin, vă rugăm să definiţi următorii termeni: godeu, antigen, anticorp,
aloimunizare, aloanticorpi, izoimunizare, hemaglutinare, pseudoaglutinare, „a
frigore”, fitoaglutinină, metodă serologică, conflict imunologic, ser hemotest,
panaglutinare.
2. Următorii subiecţi au grupele sanguine:
-
subiectul 1: 0, Rh D+
-
subiectul 2: AB, Rh D+
-
subiectul 3: A, Rh D+
-
subiectul 4: A, Rh D-
-
subiectul 5: B, Rh D+
Să se stabilească cui poate dona sânge, fiecare dintre aceşti subiecţi.
3. În tabelul de mai jos înscrieţi cu DA sau NU compatibilitatea dintre donator şi
primitor, în cazul administrării de plasmă.

Primitor Donator
0 A B AB
0
A
B
AB

76
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Care sunt produsele de sânge pe care le-aţi folosit pentru identificarea antigenelor?

................................................................................................................................................
2. Care este principiul metodelor de identificare a grupelor sanguine?

………………………………………………………………………………………………..............
.
3. Pe lamele de mai jos, notaţi serurile adăugate pe fiecare godeu. Haşuraţi godeurile
corespunzătoare grupelor A şi 0, determinate prin metoda Beth-Vincent. Argumentaţi de
ce aveţi aglutinare în godeurile respective.

................................................................................................................................................

...............................................................................................................................................

4. Haşurati godeurile în care aţi avut aglutinare la determinarea în laborator a propriei

grupe sanguine.

................................................................................................................................................
5. Care sunt produsele de sânge pe care le-aţi folosit pentru identificarea anticorpilor?

................................................................................................................................................
6. Pe lamele de mai jos, notaţi hematiile test adăugate pe fiecare godeu. Haşuraţi
godeurile corespunzătoare grupelor A şi 0, determinate prin metoda Simonin. Argumentaţi
de ce aveţi aglutinare în godeurile respective.

................................................................................................................................................

................................................................................................................................................
7. Care grupă este considerată donator universal, în ce condiţii şi de ce?

77
................................................................................................................................................
8. Care grupă este considerată primitor universal, în ce condiţii şi de ce?

................................................................................................................................................
9. Dintre lamele de mai jos alegeţi-le pe acelea care corespund grupelor B şi AB,
determinate prin metoda Beth-Vincent.

................................................................................................................................................
10. Dintre lamele de mai jos alegeţi-le pe acelea care corespund grupelor B şi AB,
determinate prin metoda Simonin.

................................................................................................................................................
11. Un subiect cu grupa sanguină A, RhD- are nevoie urgentă de transfuzie în cantitate de
cel puţin 1 l de sânge. Ce sânge alegeţi ?

................................................................................................................................................
12. In godeurile lamei de mai jos adaugati materialele necesare pentru determinarea Rh-
ului. Haşuraţi cercurile in care ar aparea aglutinare, daca Rh-ul ar fi pozitiv.

................................................................................................................................................
13. În ce situaţii apar anticorpii din sistemul Rh?

................................................................................................................................................
14. Ce fel de imunoglobuline sunt anticorpii din sistemul Rh? Ce consecinţe are prezenţa
lor?

................................................................................................................................................

78
15. În tabelul de mai jos înscrieţi cu DA sau NU compatibilitatea dintre donator şi primitor
în sistemul 0AB şi Rh.

Donator
Primitor
0 Rh- 0Rh+ A Rh- A Rh+ B Rh- B Rh+ AB Rh- AB Rh+
0Rh-
0Rh+
A Rh-
A Rh+
B Rh-
B Rh+
AB Rh-
AB Rh+

................................................................................................................................................

79
 CAPITOLUL 4. EXPLORAREA SERIEI PLACHETARE ŞI A
HEMOSTAZEI
Hemostaza este un mecanism protector, de apărare împotriva hemoragiilor spontane sau
induse, care are ca rezultat oprirea sângerării şi refacerea vasului.
Hemostaza se realizează cu participarea activă a peretelui vascular şi a unor factori
plasmatici, plachetari şi tisulari, care formează la nivelul leziunii vasculare un cheag roşu
sau coagul care opreşte hemoragia.
La finalul acestui proces se reface peretele vascular, se repermeabilizează vasul şi se
reia fluxul circulator. Hemostaza fiziologică necesită un perete vascular integru morfologic
şi funcţional, un număr normal de plachete şi o funcţionalitate normală a acestora, precum
şi o cantitate normală de factori plasmatici ai coagulării.
4.1. Plachetele
Plachetele sau trombocitele sunt fragmente anucleate de citoplasmă megacariocitară, cu
diametrul de 2 - 4 μ şi o durată medie de viaţă de 10 zile. Deşi sunt « pitice» din punct de
vedere morfologic, plachetele sunt dotate cu un echipament enzimatic bogat şi cu un
aparat mitocondrial activ. Această dotare le conferă calitatea de a fi, nu numai
transportori ai unor substanţe, ca unele amine vasoactive sau factori plasmatici ai
coagulării, dar şi elemente celulare active metabolic, capabile de sinteză, la nivelul lor
sintetizându-se prostaglandine şi factori proprii plachetari care intervin în hemostază.
Membrana plachetară este sediul unui număr mare de receptori integrinici şi non-
integrinici care permit intervenţia plachetelor în hemostază prin procese de adeziune,
eliberare, agregare, retracţie. Plachetele activate capătă proprietăţi procoagulante, factorii
proprii participând sub formă de cofactori în cascada coagulării (fosfolipidul plachetar), dar
şi în fibrinoliză.
Stadializarea hemostazei, cu tot caracterul ei artificial, subliniază participarea dominantă,
într-o anumită etapă, a unora dintre aceşti factori şi permite clasificarea testelor de
laborator.
Cei mai mulţi autori prezintă hemostaza ca o succesiune de 3,4 sau 5 etape:
1. Etapa vasculo - plachetară
2. Coagularea
3. Retracţia cheagului
4. Fibrinoliza
1. Etapa vasculo – plachetară sau hemostaza primară. Este declanşată de lezarea
vasului care răspunde rapid, prin vasoconstricţie locală reflexă, întreţinută secundar de
aminele vasoactive eliberate de plachete, ca tromboxanul A2 (TxA2) sau de endoteliul lezat
- endotelina.
Vasoconstricţia are rolul de a scădea volumul de sânge pierdut prin vasul lezat. Aproape
simultan, plachetele activate aderă la colagenul expus, prin intermediul factorului von
Willebrand (vW). Interacţiunea plachete – vW - colagen atrage la nivelul leziunii mai
multe plachete. Acestea îşi modifică forma şi se degranulează, eliberând factorii conţinuţi
în granule: ADP, serotonină, fibrinogen, TxA2 etc. Factorii plachetari eliberaţi facilitează
agregarea altor plachete şi vasoconstricţia, iar prin fosfolipidul plachetar (PL) participă la
activarea factorilor coagulării.
În continuare, aderarea plachetelor între ele, proces numit agregare este amplificată de
legarea fibrinogenului de receptorii glicoproteici membranari. Se formează punţi
interplachetare, care solidarizează plachetele. În urma aderării, agregării şi degranulării se
formează cheagul alb plachetar care obturează rapid breşa vasculară.
106
 Activarea în exces a plachetelor sanguine va duce la formarea de trombi
vasculari. Pentru a deprima activarea plachetelor, la pacienţii cu tendinţă
spre tromboză se administrează aspirină.
- Scăderea numărului sau deficienţele funcţionale ale plachetelor duc la
sângerări, cu prelungirea timpului de sângerare.

2. Coagularea. Este un proces autoactivat, desfăşurat în cascadă, la care participă factori

plasmatici, numiţi factori ai coagulării, factori plachetari - PL şi factori tisulari – tissue factor
(TF). Acest proces se finalizează cu formarea cheagului de fibrină insolubilă, care
consolidează cheagul alb plachetar.
Factorii plasmatici ai coagulării II, VII, IX şi X sunt sintetizaţi sub formă de proenzime în
ficat, în prezenţa vitaminei K, ei făcând parte din complexul protrombinic. Factorii I, V, VIII
şi XIII sunt activabili prin proteoliză, realizată de trombină, iar factorii XI, XII, kininogenul cu
greutate moleculară mare - HMWK şi prekalicreina sunt activaţi de suprafeţe rugoase şi
colagen, motiv pentru care sunt numiţi şi factori de contact (tabelul 4.1.). Factorii coagulării
sunt indicaţi prin numere romane şi litera F (factor) în faţă, de exemplu FVIII. Formele
active au la final un a, de exemplu FVIIIa.
Prezentată foarte schematizat coagularea înseamnă transformarea unei proteine
plasmatice numită fibrinogen în fibrină sub acţiunea unei enzime numită trombină.
Trombina, enzima cheie a coagulării nu se găseşte în plasmă ca atare, ci sub formă
inactivă de protrombină. Activarea ei de către un complex de factori, numit activatorul
protrombinei sau protrombinază ocupă cea mai mare parte a coagulării şi necesită
activarea în cascadă a numeroase alte proteine ale coagularii.

Figura 4.1. Schema redusă a coagulării

Formarea activatorului protrombinei se poate face pe două căi diferite, atât ca timp, cât şi
ca factori implicaţi, dar cu importanţă egală. Cele 2 căi se întâlnesc pentru a activa FX,
după care, coagularea se desfăşoară pe o cale unică, comună.
- Calea extrinsecă sau calea factorului tisular: se declanşează prima şi are o durată
de 12-14 secunde. Ţesuturile lezate eliberează o proteină numită factor tisular (TF),
care are rol de receptor pentru FVII. În momentul legării de TF, FVII se activează.
Complexul TF-FVIIa-Ca2+ va activa FX (figura 4.2.).
- Calea intrinsecă sau calea activării prin contact. Presupune contactul unor factori
ai coagulării cu elemente ale endoteliului lezat, în principal cu colagenul. Factorii de
contact care declanşează coagularea prin această cale sunt: FXII, kininogenii cu
greutate moleculară mare - High Molecular Weight Kininogen (HMWK) şi
precalikreina. Se formează un complex: FXII-HMWK-prekalicreină care se leagă de
colagen, ceea ce va duce la activarea FXII. Acelaşi complex, dar cu FXIIa, va
cataliza activarea lui FIX. FIXa se leagă de FVIII (activat în afara cascadei coagulării
de trombină) şi împreună cu fosfolipidul plachetar şi ionii de calciu, formează un
107
 complex numit tenază: FVIIIa-FIXa-PL-Ca2+. Tenaza va activa FX şi din acest
moment, coagularea va urma o cale finală, comună. Factorul Xa se leagă de FV
(activat în afara cascadei coagulării de trombină) şi împreună cu fosfolipidul plachetar
şi ionii de calciu formează un complex numit protrombinază, care transformă
protrombina în trombină activă: FXa-FVa-PL-Ca2+.
Cele trei etape ale coagulării sunt:
1) Formarea activatorului protrombinei numit protrombinaza.
2) Trombinoformarea - formarea trombinei active din protrombină, sub acţiunea
protrombinazei.
3) Fibrinoformarea - transformarea fibrinogenului în fibrină, sub acţiunea enzimatică a
trombinei.

Activarea în exces a coagulării va duce la creşterea riscului de formare a

trombilor în vasele noastre, cu posibilitatea apariţiei infarctului acut de
miocard sau a accidentelor vasculare cerebrale trombotice.
- Pentru a preîntâmpina evenimentele trombotice, la pacienţii cu tendinţă
spre tromboză, sau la cei care au avut deja evenimente trombotice se
administrează inhibitori de vitamină K (Dicumarine). Deficitul unor factori ai
coagulării, de exemplu de FVIII (hemofilia A) are drept consecinţă apariţia
sângerărilor, cu prelungirea timpilor de coagulare.
- Aceste deficienţe se tratează prin administrarea factorului deficitar.

3. Retracţia cheagului
Retracţia cheagului urmată de expulzia serului este consecinţa scurtării prelungirilor
plachetare prin intervenţia unei proteine contractile numită trombostenina. Este
dependentă de numărul şi funcţionalitatea plachetelor. Deficitul de trombostenină
determină trombastenia Glanzmann, în care această etapă a hemostazei este alterată.
4. Fibrinoliza
Reprezintă un proces antitrombotic esenţial, care constă în scindarea enzimatică a fibrinei,
cu formarea unor fragmente care nu mai pot constitui o reţea coerentă de fibrină.
Scindarea se produce sub acţiunea unei enzime proteolitice numită plasmină, care se află
în plasmă sub formă inactivă, de plasminogen. Acţiunea sa se află sub dublul control al
unui sistem activator şi altul inhibitor, între care se stabileşte un permanent echilibru. Un
astfel de cuplu este activatorul tisular al plasminogenului - tPA (Tissue plasminogen
activator) şi inhibitorul acestuia PAI-1 (inhibitorul activatorului tisular al plasminogenului).
tPA-uman obţinut prin tehnica de recombinare DNA este folosit în scop terapeutic, el
lizând trombii din arterele coronare şi cerebrale, dacă se administrează în primele 120
minute de la producerea infarctului. Dimpotrivă, valorile crescute de PAI-1 sunt corelate cu
tromboza la nivelul coronarelor şi vaselor cerebrale şi este citat ca factor agravant al
ateromatozei.

Reţineţi
Fibrinoliza ineficientă faciliteză formarea trombilor vasculari. Din acest motiv,
la pacienţii care au suferit un infarct acut de miocard se administrează o
substanţă trombolitică, de exemplu tPA-recombinat uman! Exacerbarea
fibrinolizei duce la sângerări severe datorate distrugerii (digerării sau lizei)
factorilor coagulării de natură proteică de către plasmină!

108
Figura. 4.2. Schema coagulării şi a fibrinolizei. Linia punctată reprezintă interrelaţiile
coagulare – fibrinoliză. Kininogen HMW - high molecular weight kininogen.

109
 Tabel 4.1. Factorii procoagulanţi şi anticoagulanţi - caractere generale

Concentraţia Dependenţa
Factorul Sinteză Roluri principale în coagulare
plasmatică de vit. K
FI 200-400 Substrat pentru formarea
ficat - fibrinei
Fibrinogen mg/dl
Transformă fibrinogenul în
FII fibrină.
10- 20 mg/dl ficat +
Protrombina Activează factorii V, VIII, XI,
XIII, proteina C şi plachetele.
Factorul Cofactor - receptor pentru VII.
- ţesuturi -
tisular
Cofactor, intervine în toate
Ca++ 9 - 11 mg/dl ubicvitar -
etapele hemostazei.
FV Cofactor, receptor pentru X cu
0,5 - 1 mg/dl ficat, CE - care formează protrombinaza.
Proaccelerina
Nedenumit, vechiul nume al lui
FVI - - -
Va.
Activează X şi IX. Iniţiază
FVII
0,2 mg/dl ficat + coagularea prin mecanism
Proconvertina extrinsec.
FVIII Cofactor pentru IX. Participă la
1-2 mg/dl ficat, CE - activarea X pe cale intrinsecă.
AntihemofilicA
FIX Proenzimă. Face parte din
0,5 - 0,7
Antihemifilic B ficat + complexul numit tenază.
mg/dl Activează X pe cale intrinsecă.
Christmas
Proenzimă. Face parte din
FX 0,6 - 0,8
ficat + complexul numit
Stuart- Prower mg/dl
protrombinază. Activează II.
FXI Proenzimă. Activează IX.
0,4 mg/dl ficat? -
Rosenthal
FXII Proenzimă. Factor de contact.
1,5 - 4,7 Activează XI.
Hageman ficat? -
mg/dl

FXIII Transglutaminază. Stabilizează

Stabilizator al 1 -4 mg/dl ficat - fibrina.
fibrinei
Prekalikreină Proenzimă. Activează XII şi
(PK) clivează HMWK în kinine.
5 mg/dl ficat -
Factor
Fletcher
HMWK Cofactor la activarea XII, XI şi
Factor 2,5 mg/dl ficat? - a prekalicreinei.
Fitzgerald
f vW (von ficat, CE Cofactor. Leagă plachetele de
- - endoteliu.
Willebrand) plachete

110
 Tabel 4.1. Factorii procoagulanţi şi anticoagulanţi - caractere generale

Concentraţia Dependenţa
Factorul Sinteză Roluri principale în coagulare
plasmatică de vit. K
PL. Cofactor. Participă la toate
Fosfolipidul - plachete - etapele coagulării.
plachetar.
Proenzimă. Sub formă activă
Plasminogen 10-15 mg/dl CE - de plasmină lizează
fibrinogenul şi fibrina.
Inhibitor al coagulării prin
Proteina C 0,4 mg/dl ficat +
inactivarea Va şi VIIIa.
Proteina S 1,5 mg/dl ficat, CE - Cofactor al proteinei C.
Serin proteaza inhibitorie
efectivă în prezenţa heparinei.
Antitrombina
ficat - Inhibă: trombina şi formele
III
active ale factorilor IXa, Xa,
XIa şi XIIa.
TFPI. Inhibă activitatea complexului
Inhibitorul căii TF- VIIa
CE -
mediate de
factorul tisular

4.2. Investigarea hemostazei primare - etapa vasculo-plachetară

Pentru a obţine informaţii despre hemostaza primară se explorează:
- Vasele, prin:
• testul garoului
• timpul de sângerare
- Plachetele sanguine, prin:
• numărarea plachetelor
• timp de sângerare
• aprecierea morfologiei plachetare
• retracţia cheagului
• testarea funcţionalităţii plachetelor – teste de aderare şi agregare
- Factorul von Willebrand - dozare
a). Testul garoului sau proba Rumpel-Leede - apreciază rezistenţa capilarelor la
compresiunea realizată cu un garou sau manşeta unui tensiometru. Ca urmare a
compresiunii şi a blocării întoarcerii venoase, pot apărea rupturi ale capilarelor, cu atât mai
numeroase şi mai precoce, cu cât rezistenţa lor mecanică este mai mică sau funcţiile
plachetare sunt mai alterate. Prin capilarele cutanate rupte, sângele extravazează şi se
exprimă prin transparenţa pielii sub forma unor pete mici, roşii-violacee, numite peteşii.
Un număr mare de peteşii înseamnă un rezultat pozitiv. Testul este pozitiv în afecţiuni
vasculare, în trombocitopenii sau trombocitopatii. Deoarece este greu de standardizat,
acest test are mai mult valoare istorică.
b). Timpul de sângerare (TS) - metoda Duke. Reprezintă timpul de curgere a sângelui
dintr-o plagă înţepată sau incizată, în condiţii standard.
Materiale necesare: bisturiu sau ac obişnuit, vată, alcool, hârtie de filtru, cronometru.

111
Tehnica de lucru: se dezinfectează lobul urechii; se înţeapă sau se incizează; se
porneşte cronometrul. Dacă incizia este corect făcută, picăturile de sânge apar spontan.
Se şterg picăturile apărute din 30 în 30 de secunde, deoarece eliberarea de factor tisular
ar putea declanşa coagularea prin mecanism extrinsec. Când hârtia nu se mai pătează,
se opreşte cronometrul. Proba se repetă şi la cealaltă ureche şi se face o medie a celor 2
valori.
Valori – Interpretare.
- Normal, TS este de 2 - 5 minute, semnificaţie patologică având-o doar creşterea
peste 8 minute.
- Creşterea TS, în afara erorilor de tehnică, este întâlnită în anomalii ale peretelui
vascular, în scăderi ale numărului de trombocite sau alterări ale funcţiei lor, în
insuficienţa hepatică. În cele mai multe coagulopatii, TS este normal.
c). Numărarea plachetelor - se poate face direct, în camera de numărat = metoda
Feissly-Ludin, sau prin metode automate.
- Valori normale: 150.000 - 400.000/mm3
• Creşterea numărului de trombocite se defineşte prin termenii de trombocitoză şi
trombocitemie, ambii reflectând creşterea numărului peste 400.000-
500.000/mm3.
• Scăderea numărului de plachete sub 100.000/mm3 (sub 50.000/mm3 după alţi
autori) se numeşte trombocitopenie.
- Variaţii fiziologice:
• Scăderi: la femei, mai ales în perioada premenstruală; la nou-născuţi, la
bătrâni, la trecerea bruscă din clinostatism în ortostatism.
• Creşteri: postprandial, mai ales după ingestia de carne; după efort fizic; la
altitudine (prin splenocontracţie); după expunerea la ultraviolete; în teritoriul
circulaţiei pulmonare; după: naştere, intervenţii chirurgicale, traumatisme cu
alterări tisulare. Răspunsul este maximum la 7-10 zile şi este proporţional cu
gradul de distrucţie celulară.
- Variaţii patologice
• Trombocitopeniile. Apar ca urmare a unei producţii reduse la nivel medular, de
exemplu în inhibiţiile medulare datorate iradierii sau administrării de citostatice
sau prin distrugerea lor în periferie, de către anticorpii antiplachetari, sau în
cursul unor infecţii.
• Scăderea numărului de plachete sub 100.000/mm 3 induce sindroame
hemoragipare caracterizate clinic prin apariţia unor pete hemoragice
subcutanate - purpura trombocitopenică, iar paraclinic se constată prelungirea
timpului de sângerare, test de fragilitate capilară pozitiv, consum de protrombină
redus - prin deficit de PL plachetar, retracţie deficitară a cheagului.
• Trombocitozele. Sunt secundare unor reacţii inflamatorii; afecţiunilor maligne -
limfoame, boală Hodgkin etc; bolilor hematologice - anemie posthemoragică,
feriprivă, hemolitică etc.
• Trombocitopatiile - definesc alterarea funcţională a plachetelor, numărul şi
durata de viaţă rămânând normale. Pot fi congenitale - boala von Willebrand
(deficit de factor VIII/vW), trombastenia Glanzmann (deficit de trombostenină)
sau dobândite: medicamente, hepatită cronică, hemodializă cronică etc.
d). Volumul trombocitar mediu (VTM) – indică uniformitatea de mărime a populaţiei
trombocitare. Este util în diagnosticul diferenţial al trombocitopeniei.
Metoda de determinare: este calculat de analizorul automat după următoarea formulă:
112
 PCT (Plachetocrit) (%)
VTM (fL) = ————————————- x1000
Nr. trombocite (x103/μL)
De asemenea, analizorul automat calculează lărgimea distribuţiei trombocitare (PDW),
asemănător cu calcularea lărgimii distribuţiei eritrocitare.
Valori de referinţă
- VTM = 7.4-13 fL sau μm3.
- PDW = 8-16,5 coeficient de variaţie (CV) a volumului trombocitar.
Semnificaţie clinică – VTM poate fi utilizat, împreună cu PDW, pentru diagnosticul
diferenţial al trombocitopeniei prin producţie scăzută de trombocite, de cea asociată cu o
distrucţie plachetară crescută.
- VTM crescut: trombocitopenie prin distrucţie periferică crescută; hipertiroidism; boli
mieloproliferative; la fumătorii aterosclerotici (creşterea VTM la fumători a fost
propusă ca factor de risc pentru ateroscleroză), deficit de B12 şi/sau acid folic; în
trombocitozele din bolile mieloproliferative. Este normal în trombocitozele reactive
(infecţii, tumori, boli inflamatorii etc.).
- VTM scăzut: alterarea producţiei de trombocite: hipoplazia megakariocitară, anemia
aplastică, chimioterapie. Odată cu ameliorarea tabloului clinic şi refacerea după
chimioterapie, VTM creşte înaintea creşterii numărului de trombocite.
e). Aprecierea morfologiei plachetare. Se apreciază mărimea, forma, tinctorialitatea,
structura şi capacitatea de aglutinare pe frotiul de sânge periferic. În mod normal,
plachetele sunt grupate în plaje de 15 - 20. Aspectul izolat se întâlneşte în trombocitopenii
şi mai frecvent în trombocitopatii. Centrul apare mai închis la culoare - aspectul mai palid
se întâlneşte în deficit de granule, mai ales de corpi denşi, iar periferia, hialoplasma, este
mai deschisă la culoare.
f). Retracţia cheagului (RC). Ca şi timpul de sângerare, RC este direct dependentă de
numărul de plachete, dar şi de funcţionalitatea lor - deficitul de trombostenină alterând
această fază a hemostazei.
Valori de referinţă - la 4 ore: 48-64%, iar pentru cheagul plasmatic, peste 85%. În
hemofilii, RC este normală.
g). Testarea funcţionalităţii plachetelor
- teste de adeziune plachetară - apreciază capacitatea de retenţie a plachetelor pe
sticlă;
- teste de agregare a plachetelor sub acţiunea unor agenţi agreganţi ca: ADP,
trombină, colagen, epinefrină, ristocetin, acid arahidonic;
- teste de explorare a factorilor plachetari şi a capacităţii de eliberare a
acestora: fosfolipid plachetar 4, beta-tromboglobulină, Tx. A2 etc.
4.3. Explorarea coagulării
Datorită tehnicilor moderne, explorarea coagulării s-a simplificat foarte mult în ultimii ani.
Actualmente, putem obţine informaţii semnificative pentru diagnostic prin efectuarea
urmatoarelor teste:
- Timpul de tromboplastină parţial activat (Activated Partial Thromboplastin Time -
aPTT)
- Timpul de protrombină sau timp Quick (TQ) şi derivatul acestuia International
Normalised Ratio (INR)
- Timpul de trombină (TT)
- Dozarea fibrinogenului
- Dozarea separată a factorilor coagulării
- Depistarea unui anticoagulant circulant
113
Cu ajutorul primelor 4 teste se explorează calea intrinsecă (aPTT), calea extrinsecă (TQ,
INR) şi calea finală, comună (TT, aPTT, TQ, fibrinogen).
a). Timpul de tromboplastină parţial activată - aPTT (clasic, timpul de cefalină caolin)
Evaluează activitatea factorilor implicaţi pe calea intrinsecă şi comună a coagulării.
Recomandări pentru efectuarea testului
- detectarea deficienţelor congenitale sau dobândite ale factorilor de coagulare care
intervin în calea intrinsecă: XII, XI, IX şi VIII, HKMW, PK;
- monitorizarea tratamentului cu heparină nefractionată şi inhibitori trombinici (hirudin,
argatroban);
- suspectarea prezenţei de inhibitori, ca de exemplu anticoagulant lupic;
- evaluarea preoperatorie a riscului hemoragic.
Principiul metodei. Se determină timpul de coagulare al unei plasme oxalatate şi
deplachetate în prezenţa unei soluţii de cefalină. Cefalina este o tromboplastină parţială cu
acţiune similară fosfolipidului plachetar. Adaosul de cefalină face ca acest timp să nu fie
dependent de numărul sau disponibilitatea de fosfolipid plachetar. Prin urmare, este
normal în sindroamele hemoragipare de cauză plachetară.
Materiale necesare
- seringi, ace, vată, alcool
- sânge venos
- vacutainere cu oxalat sau citrat de sodiu
- cefalină
Metoda – automată, coagulometrică.
Exprimarea rezultatelor - în secunde. Valori de referinţă.
- Normal: 26 - 40 s
- Interval terapeutic: în cursul heparinoterapiei: de 1.5 - 2.5 ori valoarea nivelului de
control. Proba de sânge pentru aPTT se recoltează la 3 ore după, sau cu o oră
înainte de administrarea heparinei.
- Valori critice – aPTT >70 s = risc de sângerare spontană.
Interpretarea rezultatelor
- Prelungirea aPTT semnifică un deficit al factorilor care intervin în mecanismul
intrinsec al coagulării XII, XI, IX şi VIII, HKMW, PK. Este prelungit în hemofilii,
parahemofilii, dar şi în deficitul sever de FI, FII şi V.
- Nu depistează deficienţele de factori VII sau XIII.
- Scurtarea timpului nu are relevanţă clinică semnificativă.
b). Timpul de protrombină sau timpul Quick (TQ). Evaluează activitatea factorilor
implicaţi pe calea extrinsecă şi comună a coagulării: VII, X, V, FII şi I. Factorii coagulării II,
VII, IX şi X sunt sintetizaţi în ficat sub influenţa vitaminei K. Din acest motiv, TQ evaluează
atât activitatea factorilor de coagulare dependenţi de vitamina K (mai puţin IX), a factorului
V şi a fibrinogenului, cât şi funcţia de sinteză proteică a ficatului (figura 4.3.).
Recomandări pentru efectuarea testului
- TQ este testul cel mai comun utilizat pentru monitorizarea terapiei anticoagulante
orale, cu inhibitori ai vitaminei K, care fac parte din clasa dicumarinelor (ex.
warfarină, sintrom, trombostop); acest timp este sensibil la trei din cei patru factori ai
coagulării dependenţi de vitamina K (II, VII, X);
- screeningul deficientelor congenitale sau dobândite ale factorilor II, V, VII, X şi
fibrinogenului;
- prezenţa inhibitorilor faţă de factorii de coagulare respectivi;
- deficit de vitamina K;
- monitorizarea funcţiei de sinteză proteică a ficatului;
- screeningul preoperator al hemostazei.
114
Principiul metodei. În prezenţa tromboplastinei tisulare şi a clorurii de calciu, plasma
normală coagulează într-un interval de 12-16 secunde, scurtcircuitând prima fază a
coagulării.
Metoda - coagulometrică
Exprimarea rezultatelor
- ca timp de coagulare – în secunde;
- ca procent (%) din activitatea normală = activitatea protrombinică (AP);
- ca raport protrombinic (PR = PT pacient în sec/PT plasmă normală în sec);
- ca International Normalized Ratio sau INR. INR reprezintă un raport între TQ al
pacientului şi TQ al plasmei normale standardizate ISI (International Sensitivity
Index).
INR = (TQ pacient/TQ plasmă normal)ISI.
Valori de referinţă
- 12 - 16 secunde.
- Activitate protrombinică: 80-100%.
- INR: 0,8 – 1,2
• La pacienţii cu tromboze venoase profunde, fibrilaţie atrială (FA), accident
vascular cerebral trombotic (AVC), infarct miocardic acut, INR trebuie mentinut
între 2–3;
• La cei cu valve mecanice cardiace între 3 – 4 ;
• Pentru prevenţia episoadelor trombotice între 1,5 - 1,9;
• Valori peste 4 - risc de hemoragii;
• INR peste 6 - valori critice: risc mare hemoragic, mai ales la pacienţii cu boli
gastro-intestinale, HTA, boli renale, cerebro-vasculare, tratament cu
antiagregante sau alte medicamente care potenţează efectele anticoagulante;
• Valori sub 2 protecţie inadecvată împotriva trombozei. Dozele de anticoagulant
nu sunt suficiente, cu excepţia situaţiilor în care anticoagulantele se
administrează preventiv.

- INR este util numai pentru pacienţii cu terapie anticoagulantă orală şi nu

are valoare pentru diagnosticul sau tratamentul celor cu TQ prelungit din
alte motive.
- Pentru controlul tratamentului anticoagulant, testarea trebuie facută cel
puţin o dată pe lună.

Interpretare. Alungirea TQ:

- deficit congenital sau dobândit al factorilor II, V, VII, X, foarte rar în deficitul de FIX
varianta Bm ;
- anticoagulante orale în scop terapeutic - antivitamine K ;
- hipofibrinogenemie - sub 80 mg/dl;
- afecţiuni hepatice, cu insuficienţă de sinteză a factorilor dependenţi de vit. K.
Se interpretează în corelaţie cu aPTT (tabelul 4.2.). TQ prelungit şi ceilalţi timpi de
coagulare normali = deficit de FVII.
c). Timpul de trombină (TT)
Reprezintă timpul necesar coagulării unei plasme citratate şi deplachetate la care se
adaugă trombină şi calciu. Prin adaosul de trombină sunt ocolite calea intrinsecă,
extrinsecă şi comună a coagulării, motiv pentru care TT reflectă, în principal, interacţiunea
dintre trombina exogenă şi fibrinogenul endogen.

115
Recomandări pentru efectuarea testului
- investigarea cauzei unui TQ sau aPTT prelungit;
- diagnosticarea coagulării intravasculare diseminate (CID);
- disfibrinogenemii, hipo-/afibrinogenemii;
- monitorizarea tratamentului cu activatori ai plasminogenului (streptokinaza şi
urokinaza).
Metoda – coagulometrică.
Valori de referinţă: ≤ 21s. Valori critice: > 60s.
Interpretare. Prelungit în hipofibrinogenemie, disfibrinogenemie sau afibrinogenemie; în
prezenţa produşilor de degradare ai fibrinogenului sau ai fibrinei; în tratamentul cu
heparină şi cu activatori ai plasminogenului, în afectiuni hepatice severe, în boli maligne.

Tabel 4.2. Analiza comparativă a timpului Quick şi a aPTT

(N - timp normal; P - timp prelungit)
TQ aPTT Deficit Atitudine
Se investighează faza I-a a coagulării, prin
N P FVIII,IX,XI,XII
dozări de factori
P N FVII -
Se investighează faza I-a şi a II-a prin
P P FI,II,V,X
dozarea factorilor implicaţi

Figura 4.3. Factorii investigaţi prin TQ

d). Dozarea fibrinogenului. Se poate face prin metode cromatografice sau imunologice.
Valori normale: 200-400 mg/dl
Explorarea iniţială, corectă a hemostazei trebuie să fie făcută prin teste care să
intereseze: plachetele, calea intrinsecă, calea extrinsecă şi calea comună. Cele mai multe
informaţii se obţin prin interpretarea coroborată a aPTT, TQ şi TT (tabel 4.3.).
Prezenţa inhibitorilor coagulării se suspectează în situaţia în care timpii de coagulare
alteraţi nu se corectează prin adaos de plasmă normală.
116
 Tabel. 4.3. Explorarea iniţială a coagulării
aPTT TQ TT Interpretare
Normal Crescut Normal Deficit de FVII sau inhibitor specific al FVII
Crescut Normal Normal Deficit în FXII, XI, VIII, IX, PK sau inhibitori
Crescut Crescut Normal Deficit pe calea comună sau a mai multor
factori cu excepţia căii comune; inhibitori sau
tratament anticoagulant
Crescut Crescut Crescut Anomalie globală a coagulării sau izolată a
fibrinoformării

4.4. Explorarea fibrinolizei

A. Metode indirecte - pun în evidenţă consecinţele fenomenului litic asupra factorilor
coagulării şi fibrinolizei.
- cercetarea (dozarea) fibrinogenului plasmatic şi a altor factori ai coagulării II, V, VII,
degradaţi în timpul fibrinolizei.
- dozarea produşilor de degradare ai fibrinogenului - PDF
- dozarea produşilor de degradare ai fibrinei: D-dimeri (D-D)
- dozarea plasminogenului.
• Dozarea produşilor de degradare ai fibrinei: D-dimerii.
D-dimerii sunt fragmente de fibrină generate în urma acţiunii plasminei asupra
coagulului de fibrină. Creşterea lor este un marker, fie al stării de
hipercoagulabilitate (cantitate mare de fibrină), fie al fibrinolizei endogene
exacerbate. D-dimerii sunt mai specifici pentru fibrinoliză decât PDF, care
detecteaza în plus şi produşii degradării directe a fibrinogenului.
Metode de determinare (cantitative): latex-aglutinare automată cu detectie
fotometrică sau metode imunologice – ELISA. Valorile normale depind de
metoda practicată.
Cresteri ale D-dimerilor sunt asociate cu: CID (fibrinoliza secundară);
tromboze arteriale sau venoase; tromboembolism pulmonar; infarctul acut de
miocard; accidentul vascular cerebral trombotic.
D-dimerii mai sunt asociaţi cu trombofilia subclinică, cu stări maligne, ca
neoplasmul mamar sau ovarian, cu insuficienţa hepatică, cu infecţiile severe.
Valori crescute de DD, considerate fiziologice pot fi întâlnite în sarcina normală,
în terapia cu estrogeni, contraceptive orale, la persoane vârstnice, după
traumatisme şi stres postoperator.
B. Metode directe - evidenţiază creşterea puterii fibrinolitice a plasmei sau a serului de
cercetat faţă de diferite substraturi proteice.
- Timpul de liză al cheagului propriu - se urmăreşte timpul în care cheagul de sânge
integral sau plasmatic se lizează - liză completă în primele 60 minute = sindrom
fibrinolitic supraacut; liză completă după 60 minute = fibrinoliză subacută
- Timpul de liză al euglobulinelor = testul von Kaulla - valori normale: >3ore.
- Timpul de liză al altor substraturi - cazeină, esteri, arginină, lizină.
Explorarea hemostazei înaintea unei intervenţii chirurgicale. Alături de alte investigaţii
paraclinice, testele de hemostază sunt obligatorii pentru siguranţa actului operator. Din
păcate, de multe ori această explorare se limitează doar la teste cum ar fi timpul de
sângerare şi timpul de coagulare pe lamă, o astfel de conduită fiind periculoasă.

117
Se impune o baterie de teste care să vizeze toate fazele hemostazei: număr de plachete,
timp de sângerare, aPTT, TQ, TT.
4.5. Metode moderne de explorare a hemostazei
a). Metode enzimatice
Principiul. Activitatea serinproteazelor plasmatice poate fi determinată urmărind acţiunea
lor clivantă asupra unui substrat sintetic marcat, care poate elibera fragmente active optic
= cromofori, capabile să absoarbă lumină. Cantitatea de cromofor eliberată este direct
proporţională cu activitatea enzimei.
Cea mai nouă dintre metodele enzimatice este metoda amidolitică. Prin această metodă
se explorează:
- Timpul de protrombină. Se utilizează un substrat sintetic marcat (preparat comercial
care mimează substratul original) asupra căruia acţionează enzimatic trombina.
Rezultă un marker activ optic-cromofor a cărui eliberare este direct proporţională cu
activitatea protrombinei.
- Timpul parţial de tromboplastină activată.
- Se dozează factorii plasmatici ai coagulării : VII, VIII, X, XI, XII, XIII ; plasminogenul şi
antitrombina III (ATIII).
b). Metode imunologice
- Metoda nefelometrică. În general, această metodă permite determinarea
concentraţiei particulelor dintr-o suspensie prin dispersia luminii. Prin această metodă
poate fi determinat timpul de protrombină şi poate fi dozat fibrinogenul. Principiul
determinării timpului de protrombină constă în formarea unui complex antigen
(protrombina din plasmă) - anticorp (preparat in vitro), care produce dispersia luminii
când o rază laser trece prin soluţie. Actualmente, această metodă este complet
automatizată.
- Radioimmunoassay - RIA. Utilizează marcarea cu radioizotopi (125I, 131I, 3H, 14C,
32P). Radioimunoanaliza se bazează pe reacţia reversibilă imunochimică dintre

antigen (Ag) şi anticorp (Ac), din care rezultă un complex imun solubil Ag-Ac.
Legarea Ag-Ac este o reacţie cu o înaltă specificitate, deoarece un anumit Ac nu
poate lega decât Ag faţă de care a fost sintetizat. Între cele două proteine, cea de
determinat şi cea marcată radioactiv, va exista o competiţie pentru legarea de
anticorp. Cu cât cantitatea de proteină de determinat va fi mai mică, cu atât
cantitatea de anticorpi legaţi de proteina marcată va fi mai mare, iar radioactivitatea,
măsurată de un contor pentru radiaţii gamma, mai mare.
Principiul şi tehnica este comună şi altor determinări, cum ar fi cele hormonale. Prin
această metodă se măsoară o serie de proteine plachetare cum ar fi: f4, beta-
tromboglobulina, PGE2, TXB2, dar şi fibrinogenul.

Studiu individual

1. Utilizând un dicţionar medical sau alte materiale de documentare explicaţi

înţelesul următorilor termeni: aderare, agregare, degranulare plachetară,
vasoconstricţie, substanţă proagregantă, trombofilie, tromboembolism, citostatic,
boală congenitală, investigaţie paraclinică, tromboză, anticoagulant, dicumarine,
serin protează, cofactor, proenzimă.
2. Explicaţi de ce în următoarele condiţii creşte numărul de plachete: efort fizic,
după naştere, după intervenţii chirurgicale.

118
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Care este rezultatul hemostazei primare?

................................................................................................................................................
2. Care sunt evenimentele majore ale hemostazei primare?

………………………………………………………………………………………………..............
3. Schiţaţi reacţiile din cascada coagulării pe cale extrinsecă.

................................................................................................................................................
4. Schiţaţi reacţiile din cascada coagulării pe cale intrisecă.

………………………………………………………………………………………………..............
5. Definiţi hemostaza fiziologică.

................................................................................................................................................
6. Care sunt explorările paraclinice adresate hemostazei primare?

………………………………………………………………………………………………..............
7. Care sunt testele efectuate pentru explorarea hemostazei?

………………………………………………………………………………………………..............
8. Definiţi fibrinoliza.

................................................................................................................................................
9. Care este numărul normal de trombocite? Definiţi trombocitopenia.

………………………………………………………………………………………………..............
10. Care este valoarea timpului de sângerare?

………………………………………………………………………………………………..............
11. Care sunt valorile de referinţă pentru aPTT. Interpretaţi valoarea de 75 secunde pentru
acest timp al coagulării.

………………………………………………………………………………………………..............
12. Care sunt valorile de referinţă pentru timpul de protrombină Ouick, în toate formele de
exprimare.

………………………………………………………………………………………………..............

119
13. Interpretaţi următoarele valori pentru INR
INR = 1; INR > 7; Tratament cu dicumarine (sintrom) şi INR = 1,7

………………………………………………………………………………………………..............
14. Care sunt factorii coagulării exploraţi de timpul de protrombină Quick?

………………………………………………………………………………………………..............
15. Care sunt situaţiile în care timpul de protrombină Quick este prelungit?

………………………………………………………………………………………………..............
16. Cum interpretaţi prelungirea TQ, combinată cu a aPTT. Ce investigaţii mai cereţi?

………………………………………………………………………………………………..............
17. Cum explorăm hemostaza înaintea unei intervenţii chirurgicale?

………………………………………………………………………………………………..............
18. Ce informaţii obţinem în urma dozării produşilor de degradare ai fibrinei: D-dimerii?

………………………………………………………………………………………………..............
19. Care este concentraţia normală a fibrinogenului? Interpretaţi o valoare a acestuia de
50 mg/dl. Ce repercusiuni credeţi că va avea această valoare asupra timpilor de
coagulare?

………………………………………………………………………………………………............
20. Care este consecinţa unei hemostaze exacerbate? Cum preveniţi o astfel de situaţie?

………………………………………………………………………………………………..............

120
 CAPITOLUL 3. EXPLORAREA SERIEI LEUCOCITARE
3.1. EXPLORAREA MĂDUVEI OSOASE
Studiul măduvei osoase reprezintă un examen de mare valoare în diagnosticul
hemopatiilor. Diagnosticul, precum şi monitorizarea multor boli hematologice depind de
examinarea măduvei osoase hematogene (MOH), mai ales când procesul patologic îşi are
originea la acest nivel. Examenul citologic al măduvei osoase se poate corela cu
examenul histologic al biopsiei osteo-medulare. De asemenea, acesta poate fi completat
cu efectuarea unor coloraţii speciale în vederea evaluării depozitelor de fier (coloraţia
Perls / cu albastru de Prusia), a diagnosticului diferenţial al leucemiilor acute (coloraţii
citochimice pentru mieloperoxidază, esteraze nespecifice, PAS) şi cu studii citogenetice
sau moleculare.
Examenul citologic al măduvei osoase se practică pentru diagnosticul unor afecţiuni,
precum: anemia megaloblastică, mielomul multiplu, investigarea unei citopenii, leucemiile
acute, sindroamele mielodisplazice etc.
Prelevarea măduvei osoase se face prin puncţie medulară: la adult, locurile de elecţie
sunt sternul (spaţiul II intercostal), creasta iliacă, apofizele vertebrelor lombare; la copil
este preferabilă puncţionarea platoului tibial, a crestei iliace. Măduva este aspirată cu o
seringă de 10 - 20 ml, fără anticoagulant, cantitatea recoltată fiind de 0,2 - 2 ml, din care
se efectuează minimum 5 frotiuri. În cazul puncţionării, se apreciază duritatea osului,
grosimea tablei osoase şi aglomeraţia de grunji din aspiratul medular. Cercetarea celulelor
se face prin strivirea grunjilor pe lame. Indicaţiile puncţiei aspiratoare: toate procesele
patologice ce au loc la nivel medular.
Citirea frotiului medular (mielograma)
Mielograma reprezintă exprimarea procentuală a celulelor seriilor medulare din
frotiul de măduvă osoasă hematogenă. Pentru o imagine de ansamblu se începe cu o
examinare cu obiectiv slab (x10, x20). Apoi interesează dacă se păstrează sau nu
aspectul heterogen, normal, al măduvei.
Frotiul medular poate fi evaluat conform următoarelor criterii:
- celularitatea – dacă măduva este normocelulară, hipercelulară sau hipocelulară;
- eritropoieza – evidenţierea proeritroblaştilor, eritroblaştilor (Ebl), raportul granulo-eritroblastic;
- granulopoieza – evidenţierea tuturor precursorilor granulocitari, alături de formele mature
nesegmentate şi segmentate, neutrofile / eozinofile / bazofile; celulele mieloide reprezintă elementul
predominant din măduvă, celulele mature fiind cele mai numeroase;
- megacariopoieza – evidenţierea megacariocitelor bazofile, granulare şi trombocitogene
(megacariocitele reprezintă tipul celular cel mai puţin abundent din măduvă, < 1%);
- limfocitele – sunt de obicei limfocite mici (limfocitele şi plasmocitele sunt cele mai uniform distribuite
în măduvă);
- monocitele din măduvă sunt identice cu cele din sângele periferic, macrofagele (histiocitele)
medulare fiind celule mari, cu raportul nucleu-citoplasmă scăzut;
- celulele non-hematopoietice ce pot fi întâlnite pe frotiu sunt reprezentate de: adipocite, celule
stromale, celule reticulare, osteoblaşti, osteoclaşti (toate aceste celule reprezintă < 1% din
celularitatea medulară);
- celulele atipice sunt reprezentate de celule blastice, celule mielomatoase, limfomatoase sau de
celule carcinomatoase.
Caracterele morfologice ale seriilor leucocitare medulare
Precursorii seriei granulocitare
- Mieloblastul - celula granulocitară “cap de serie”; se găseşte numai în MO; d = 10-18 , nucleu
rotund/ovalar, ocupă aproape toată celula, prezintă 2 - 3 nucleoli de culoare albastru deschis,
cromatină fină, difuză, citoplasmă puţin abundentă, bazofilă (colorată în albastru), de aspect hialin
sau spongios. Microscopia electronică (ME) evidenţiază o celulă slab diferenţiată, cu numeroşi
ribosomi liberi, cantitate redusă de reticul endoplasmic şi aparat Golgi puţin dezvoltat, mitocondrii
mici şi numeroase.

80
 - Promielocitul – d = 12-25 , nucleu rotund/ovalar, voluminos, deseori excentric, nucleoli mai puţin
vizibili, cromatină difuză; în citoplasmă apar granulaţiile primare. ME evidenţiază mitocondrii mai
puţin numeroase, aparat Golgi dezvoltat, ergastoplasmă mai abundentă.
Granulaţiile primare sunt bogate în peroxidază, dense, de formă sferică sau alungită, prezentând o
incluziune cristalină. Culoarea roşie vie a granulaţiilor azurofile se explică prin prezenţa
mucopolizaharidelor sulfate. Granulaţiile "toxice" ce apar în neutrofile, în caz de infecţii sau
inflamaţii, sunt granulaţii primare persistente.
- Mielocitul – d = 12-18 ; nucleu excentric, rotund/ovalar, cromatină grunjoasă, nucleoli mici sau
invizibili, citoplasmă slab bazofilă; apar granulaţiile secundare de la granulocitul matur. ME
evidenţiază reticul endoplasmic şi poliribosomi în cantitate redusă, ce explică scăderea bazofiliei;
mitocondrii mici, puţine, zona aparatului Golgi de asemenea, mult redusă.
- Metamielocitul – d = 10-18 , nucleu în formă de potcoavă, fără nucleoli, cromatină mai densă,
citoplasma roz-pal cu granulaţii specifice terţiare, în cele 3 direcţii (neutrofil, eozinofil, bazofil). ME
evidenţiază reticul endoplasmic şi poliribosomi mai puţini, datorită încheierii sintezei de proteine.
Metamielocitul este caracterizat de incapacitatea de diviziune. El suferă un proces ireversibil de
maturare, ce constă în elongarea nucleului, urmată de segmentare.
Unii autori descriu un stadiu intermediar între metamielocit şi polimorfonuclearul neutrofil, numit
"band form". Această celulă poate trece în circulaţie prin diapedeză şi reprezintă 1 - 4% din
granulocitele sanguine.
Precursorii seriei limfo-plasmocitare
- Limfoblastul are diametru de 12-18 , nucleu sferoidal, cu cromatină dispusă în travee fine, egale şi
cu un singur nucleol; citoplasma este redusă, bazofilă, cu halou perinuclear şi agranulară.
- Prolimfocitul (limfocitul tânăr) este treapta ulterioară de maturaţie în seria limfocitară; are 9-12 ,
nucleul cu structură cromatiniană mai densă decât limfoblastul, nucleolul mai puţin vizibil, citoplasmă
bazofilă, cu halou perinuclear.
- Imunoblaştii sunt celule mari, care derivă din limfocitul activat. Aceste celule au capacitatea de a
evolua fie spre plasmablaşti, fie spre limfocitele de memorie.
- Plasmablaştii au un nucleu sferoidal, situat excentric, cu structură cromatiniană densă; citoplasma
este intens bazofilă. Ei vor evolua spre plasmocit, în unele cazuri printr-un stadiu intermediar de
limfoplasmocit.
Precursorii seriei monocito-macrofagice
- Monoblaştii seamănă, la nivel medular, cu mieloblaştii şi nu pot fi diferenţiaţi. Apar în măduvă la
pacienţii cu leucemie monocitară. Sunt celule cu aspect blastic, tinere, cu nucleu mare cu cromatină
fină, granulară şi uniform dispersată, cu nucleoli prezenţi.
- Promonocitele sunt celule proliferative cu capacitate de diviziune, ele dând naştere monocitelor.
Acestea stau în măduvă doar 32 ore, după care trec în sânge. Diametrul promonocitelor variază
între 10 şi 20 , nucleul este mare, rotund sau ovalar, uneori incizat, cu nucleoli. Nucleul are
capacitatea de sinteză a ADN-ului, deci şi de mitoză. Citoplasma este intens bazofilă, fără granulaţii
azurofile.
Pentru o corectă diferenţiere se folosesc reacţiile citochimice (valabile şi pentru monocit). Celulele
conţin mieloperoxidază, la fel ca şi linia granulocitară, dar în cantităţi mai mici. Reacţiile citochimice
se evidenţiază prin prezenţa fosfatazei acide, mai ales cea esterazică, care are specificitate pentru
linia monocitară, deoarece este inhibată de florura de sodiu, lucru care nu se produce în cazul
esterazelor din linia granulocitară.
În microscopia electronică, în citoplasma promonocitelor se evidenţiază ribosomi şi aparat Golgi bine
dezvoltat, cu margini ondulate şi microvili. Celulele au capacitate de fagocitoză. Citochimic conţin
esteraze, peroxidaze, fosfatază acidă şi arilsulfatază.
Formula medulară reprezintă raportul procentual al elementelor seriilor medulare:
granulocitară, eritrocitară, megacariocitară şi reticulo-histiocitară (tabelul nr. 3.1).
Aspecte patologice ale mielogramei
Hiperplazia medulară se poate manifesta pe toate liniile celulare (sindroamele
mieloproliferative) sau pe una sau două linii, ca de exemplu:
- pe linia granulocitară - leucemia granulocitară cronică, leucemia acută (LA)
mieloblastică, LA promielocitară, LA mielomonocitară;

81
 - pe linia roşie - anemia megaloblastică, anemia hemolitică, anemia feriprivă,
poliglobulia etc;
- pe linia megacariocitară: trombocitemii, trombocitopenii de cauză periferică,
megacarioblastoză malignă.
Infiltraţia limfocitară a măduvei poate să apară în leucemia limfatică cronică, LA
limfoblastică, aplazia medulară.

Tabelul nr. 3.1. Formula medulară normală

(Perkins S. Medulograma – valori de referinţă. În Wintrobe's Clinical
Hematology, 11th Edition, Lippincot, Wiliams&Wilkins, Philadelphia, 2004).
Media (%) Limite (%)
Seria neutrofilică (total) 53,6% 49,2-65
Mieloblast 0,9 0,1-1,5
Promielocit 3,3 2,1-4,1
Mielocit 12,7 8,2-15,7
Metamielocit 15,9 9,6-24,6
Nesegmentat 12,4 9,5-15,3
Segmentat 7,4 6-12
Seria eozinofilică (total) 3,1 1,2-5,3
Mielocit 0,8 0,2-1,3
Metamielocit 1,2 0,4-2,2
Nesegmentat 0,9 0,2-2,4
Segmentat 0,5 0-1,3
Bazofile şi mastocite 0,1 0-0,2
Seria eritroidă (total) 25,6 18,4-33,8
Proeritroblast 0,6 0,2-1,3
Eritroblast bazofil 1,4 0,5-2,4
Eritroblast policromatofil 21,6 17,9-29,2
Eritroblast oxifil 2 0,4-4,6
Limfocite 16,2 11,1-23,2
Plasmocite 1,3 0,4-3,9
Monocite 0,3 0-0,8
Megacariocite 0,1 0-0,4
Celule reticulare 0,3 0-0,9
Raport granulo/eritroid 2,3 1,5-3,3

82
3.2. EXPLORAREA SÂNGELUI PERIFERIC
Leucocitele sunt elemente celulare mobile şi circulante care posedă capacitatea de
recunoaştere şi distrugere a agenţilor patogeni pătrunşi în organism, prin mecanisme
specifice fiecărui tip de leucocit. Ele sunt celule nucleate, de mărimi diverse, cu sau fără
granulaţii în citoplasmă, acestea colorate în funcţie de afinitatea tinctorială a conţinutului.
Se împart în două grupe principale: granulocite şi a-/non-granulocite. Granulocitele sunt
denumite astfel datorită prezenţei în citoplasmă a granulaţiilor distincte şi se identifică trei
tipuri de granulocite, în funcţie de afinităţile de colorare pe frotiul de sânge: neutrofile,
eozinofile şi bazofile. De asemenea, aceste celule sunt denumite şi leucocite
polimorfonucleare datorită nucleului multilobulat. Non-granulocitele (limfocitele şi
monocitele) conţin, în general, granulaţii citoplasmatice distincte şi au nucleu non-lobulat,
fiind denumite şi leucocite mononucleare.
Leucocitele reprezintă un amestec heterogen a 3 serii şi anume: seria granulocitară;
seria monocitară; seria limfocitară.

Lucrări practice de efectuat în laborator

Numărătoarea leucocitelor
1. Numărătoarea clasică a leucocitelor în camere de numărat
Principiul lucrării. Numărătoarea leucocitelor constă în numărarea directă, la microscop,
a leucocitelor aflate într-un volum cunoscut de lichid, diluat într-o proporţie cunoscută, cu
ajutorul unor pipete speciale (Potain). Diluţia se face cu un lichid special care lizează
eritrocitele, păstrând numai elementele nucleate.
Materiale necesare
- materiale pentru puncţie capilară (ace, alcool, eter, vată);
- pipetă pentru diluţia leucocitelor (Potain);
- cameră de numărat (Bürker, Goreaev, Bürker-Türck);
- lamelă de sticlă;
- microscop cu obiectiv uscat 40 sau 20 şi ocular 10 sau 7;
- lamelă perfect plană şi şlefuită, cu o grosime de aproximativ 0,3 - 0,5 mm;
- lichid de diluţie Türck, care determină liza hematiilor (acid acetic glacial 1 ml; apă
distilată 100 ml; albastru de metilen 1%, 1-2 picături).
Pipeta Potain pentru leucocite este formată dintr-un tub capilar cu 10 gradaţii, cu notaţiile
0,5 şi 1, prelungit cu o bulă de diluţie. Deasupra bulei se poate citi notaţia 11. Diluţia
sângelui recoltat până la 0,5 este de 1/20 şi recoltat până la 1 este de 1/10. Capacitatea
reală a pipetei este de 11 volume, dar diluţia este 1/10 şi 1/20, datorită faptului că un
volum de diluent rămâne în tubul capilar şi nu diluează sângele (figura. 3.1). Pipetele
trebuie să fie neciobite, curate şi perfect uscate. După întrebuinţare, se spală cu apă de
robinet (la nevoie cu amestec sulfo-cromic şi iarăşi cu apă de robinet), apoi cu apă distilată
şi se usucă la căldură uscată.

11 1 0.5
Figura 3.1. Pipeta Potain pentru leucocite

Camere pentru numărarea leucocitelor:

- Camera Bürker are o suprafaţă de 9 mm2, împărţită în 9 pătrate de câte 1 mm 2,
delimitate prin linii triple. Fiecare milimetru pătrat este împărţit prin linii duble în 16

83
 pătrate cu suprafaţa de 1/25 mm2. La întretăierea liniilor duble se înscriu pătrate
mici, care reprezintă 1/400 dintr-un milimetru pătrat; acestea pot fi folosite pentru
numărătoarea eritrocitelor; în principal, această cameră este destinată numărătorii
leucocitelor.
- Camera Bürker-Türck are o suprafaţă de 9 mm2 şi reţeaua sa este gradată după
tipul Türck, combinat cu Thoma. Suprafaţa de 9 mm 2 este mărginită pe toate laturile
de o linie triplă şi este împărţită în 9 pătrate de 1 mm 2 prin linii triple. Pătratul din
mijloc este de 1 mm2, de tip Thoma, folosit pentru numărătoarea eritrocitelor.
Pătratele din colţuri sunt împărţite prin linii duble, în 16 pătrate de 1/25 mm2 şi
servesc la numărătoarea leucocitelor.
- Camera Goreaev are un cadrilaj în care alternează pătrate mici de 1/400 pentru
eritrocite, în grupuri de 16, cu pătrate pentru leucocite (a se vedea camerele de
numărat de la eritrocite).
Tehnica de lucru:
- Recoltarea sângelui. După înţeparea pulpei degetului, prima picătură se sterge, a
doua se aspiră în pipetă până la diviziunea 0,5 sau 1, citirea făcându-se cu pipeta
în poziţie verticală. Se poate folosi şi sânge venos recoltat pe EDTA.
- Diluarea sângelui. În pipeta Potain cu bilă albă (pentru numărătoarea elementelor
albe) montată pe un tub de cauciuc cu „mundstuck”, se aspiră sângele şi apoi
lichidul de diluţie până la diviziunea 11. Pipeta se aşează în poziţie orizontală, se
astupă cele două capete cu degetul mare şi cel mijlociu şi se agită pentru
omogenizare (aproximativ 1 minut).
- Umplerea camerei de numărat. Se aruncă primele 2 - 3 picături din pipetă pe o
hârtie de filtru. Pe marginea camerei de numărat, acoperită cu o lamelă perfect
aplicată, se pune o picătură de amestec şi se lasă să pătrundă prin capilaritate.
- Este de preferat să se introducă dintr-o dată atâta lichid încât spaţiul dintre lamă şi
lamelă să fie umplut în întregime, fără ca lichidul să treacă în şanţurile laterale sau
ca lamela să se deplaseze; în caz contrar, se repetă operaţia după spălarea şi
ştergerea camerei. Se aşteaptă câteva minute pentru sedimentarea elementelor pe
cadrilaj.
- Numărătoarea leucocitelor. Se numără leucocitele pe o suprafaţă de 4 mm 2, în
pătratele din colţuri, în camera Bürker-Türck, respectând regula de numărare pe
două laturi pe colţ (stânga şi sus sau dreapta şi jos). Se numără inclusiv elementele
care se găsesc pe, şi între liniile duble.

Nr. leucocite/mm3 = N (mm2) x inversul D x inversul Î

N (mm2) = media pe mm2 a numărului de leucocite (ex. pe 4 mm2 s-au găsit 140
leucocite, pe 1 mm2 vor fi 140  4 = 35 leucocite);
D = diluţia 1/10 sau 1/20;
Î = înălţimea camerei de numărat = 1/10 mm.
(în exemplul de mai sus: Nr. leucocite = 35 x 20 x 10 = 7000 leucocite/mm3).

Valori normale ale numărului de leucocite

- adult = 4000 – 9000/mm3 (μl);
- nou - născut = 12000 - 20000/mm3 (μl)
- sugar = 8000 - 12000/mm3 (μl)

84
Surse de erori:
- datorate aparatelor: etalonare greşită a pipetelor de diluţie, a camerelor de numărat (a cadrilajului
sau înălţimii); lamela de acoperire fără o suprafaţă perfect plană sau o spălare defectuoasă a
materialului folosit;
- datorate tehnicii de lucru: legate de felul recoltării sângelui (înţepătură superficială sau în regiuni
puţin vascularizate, edem al degetelor, compimarea degetului ce duce la diluţia sângelui),
coagularea, sedimentarea probei de cercetat; erori de pipetare şi diluare; erori mari pot apărea prin
intrarea bulelor de aer în pipetă sau o suspensie neomogenă prin agitare insuficientă;
- datorate examinatorului: modul diferit de numărătoare pe cadrilaj, oboseală după multe examinări.
La numărătoarea leucocitelor pot surveni erori mari, când în sângele periferic există eritroblaşti,
deoarece aceştia nu sunt lizaţi de soluţia de acid acetic glacial folosită pentru numărătoare şi în
camera de numărat nu pot fi deosebiţi de leucocite.
Pentru a obţine numărul real de leucocite se determină pe frotiul de sânge colorat MGG, numărul de
eritroblaşti la 100 leucocite şi se face un calcul de corecţie:

Nr. leucocite corectat = (Nr. leucocite determinat x 100) / (100 + Nr. eritroblaşti la 100 leucocite)

Exemplu: elemente nucleate numărate în cameră = 7200/mm3; eritroblaşti pe frotiul colorat MGG =
20 la 100 leucocite;
120 elemente nucleate...............................100 leucocite
7200 elemente nucleate.................................x leucocite
Nr. leucocite/mm3 = (7200 x 100)/120 = 6000
Eritroblastoza se întâlneşte la nou-născut, iar la adult în cazul unei activităţi eritropoietice crescute, ca
răspuns la o hemoragie masivă sau în hemopatii grave (anemie hemolitică, eritroleucemie, leucemii acute şi
cronice).
Când numărul de leucocite este redus, se efectuează concentratul leucocitar. În acest fel se obţine un
număr crescut de granulocite şi mononucleate (limfocite şi monocite), alături de eventualele celule anormale
trecute în sângele circulant.

Indicaţiile pentru determinarea numărului de leucocite: evaluarea

infecţiilor, inflamaţiilor, necrozelor tisulare, intoxicaţiilor, alergiilor, bolilor
mieloproliferative şi limfoproliferative acute şi cronice, tumorilor maligne,
depresiei medulare (iradiere, medicamente citotoxice, imunosupresoare,
antitiroidiene etc.).

2. Metodele computerizate de numărare a leucocitelor. Leucocitele sunt determinate

de analizorul automat (după ce hematiile sunt lizate, iar leucocitele sunt colorate cu o
substanţă fluorescentă cu afinitate pentru acizii nucleici) prin metoda de citometrie în flux
cu fluorescenţă, utilizând LASER semiconductor. Metodele computerizate de numărare a
leucocitelor se bazează pe principiul Coulter pentru numărătoarea particulelor.
Diluţia sângelui se face în proporţie de 1/400 cu un diluent special. Agentul de lizare are
rolul de a distruge hematiile şi de a reduce volumul leucocitelor. Numărul de particule
numărate sunt determinate de numărul de impulsuri generate, care, înainte de a fi
contorizate, sunt divizate de o constantă.
Sursele de eroare sunt determinate de cantitatea de lizant necorespunzătoare şi timpul de
lizare. În unele maladii cu număr crescut de reticulocite, nucleul lor nu se mai lizează şi se
adaugă la numărul total de leucocite.
Variaţii ale numărului de leucocite
Se pot datora creşterii sau scăderii elementelor unei singure serii sau a numărului absolut
din toate seriile, păstrându-se proporţia între ele, aceste detalii evidenţiindu-se prin
efectuarea formulei leucocitare. Creşterea numărului de leucocite peste valorile normale
poartă numele de leucocitoză, iar scăderea, leucopenie.

85
Leucocitoza fiziologică. Este, de obicei, determinată de creşterea procentului de
neutrofile. Se întâlneşte în următoarele situaţii:
- la nou-născuţi şi copii numărul de leucocite este mai crescut, cu scăderea treptată
şi atingerea valorilor de la adult între 18 - 21 ani;
- la copil, prin creşterea numărului de limfocite;
- postprandial - această creştere este de fapt o urmare a variaţiilor circadiene, cu
creşteri diurne şi scăderi nocturne, determinate de activităţile fizice şi intelectuale şi
secreţia glandelor endocrine;
- în variaţii climatice şi sezoniere: căldura şi radiaţiile solare intense, lumina artificială
şi ultravioletă determină limfocitoză;
- în sarcină, la naştere, în perioada de lactaţie, la menstruaţie (în sarcină apare
leucocitoză uşoară, neutrofilia se accentuează cu apropierea termenului; în travaliu
apare neutrofilie uneori pronunţată, cu normalizarea valorilor după 4 - 5 zile);
- în efort muscular, emoţii, frică, durere;
- exerciţiile fizice intense determină leucocitoză marcată, de obicei pe seama
neutrofilelor segmentate (se datorează trecerii neutrofilelor marginale în circulaţie),
dar poate fi prezentă şi limfocitoza; normalizarea survine în mai puţin de o oră;
gradul leucocitozei se corelează cu intensitatea efortului şi nu cu durata sa;
- crizele convulsive determină creşterea numărului de leucocite.
Leucocitoza patologică

Leucocitoza (nr. de leucocite > 10 000/µl sau > 10x109/l) se datorează, de

obicei, unei creşteri a numărului de neutrofile sau limfocite; mai rar celelalte
clase de leucocite determină creşterea numărului absolut de leucocite. O
creştere proporţională a tuturor tipurilor de leucocite se datorează
hemoconcentraţiei.

Infecţiile reprezintă cauza majoră de leucocitoză. O infecţie acută tipică se

caracterizează printr-o fază de atac neutrofilică, o fază reactivă monocitică şi
o fază de recuperare limfocitico-eozinofilică. În infecţiile cronice poate
persista oricare din aceste trei faze. Infecţiile virale şi unele infecţii
bacteriene (febra tifoidă) nu urmează în mod normal acest curs. Gradul
leucocitozei depinde de severitatea infecţiei, vârsta şi rezistenţa pacientului,
precum şi de rezerva medulară.

Leucocitoza patologică se întâlneşte în următoarele situaţii:

- infecţiile acute cu bacterii pirogene (strepto şi stafilococice), la adult fiind însoţite de
neutrofilie, iar la copil leucocitoza se întâlneşte şi în fazele cronice ale acestor
infecţii, însă însoţite de limfo şi monocitoză;
- tulburări metabolice (gută, uremie, acidoză metabolică);
- hemoragii sau hemolize acute;
- intoxicaţii cu medicamente (digitale, corticoizi) sau cu metale grele (Hg);
- medicamente: cloroform, chinină, factori de creştere etc;
- arsuri, necroze tisulare, distrucţii sau rupturi musculare (“crush syndrom”);
- infarct miocardic sau pulmonar;
- boli maligne nehematologice (în special carcinomul bronşic);
- leucemii, policitemia vera, boli mieloproliferative;
- hemoragii în cavităţi închise (ulcer perforat, sarcină extrauterină).

86
Leucopenia fiziologică
Se întâlneşte la vârstnici şi la populaţia de rasă neagră. Unele persoane pot prezenta o
leucopenie permanentă, fără să aibă însă nici o manifestare patologică.

Leucopenia apare când numărul de leucocite < 4000/µl sau < 4x109/l.
Valori cuprinse între 2500 – 4000 /µl sunt considerate bordeline, în timp ce
valorile  2500/ µl sunt cert anormale.

Leucopenia patologică. Apare în următoarele situaţii:

- infecţii virale, infecţii bacteriene severe;
- hipersplenism;
- febră tifoidă, bruceloză;
- boli medulare primitive: leucemie (aleucemică), anemie megaloblastică, sindroame
mielodisplazice, anemie aplastică, boli congenitale (anemia Fanconi);
- boli medulare secundare: granuloame, metastaze;
- după intoxicaţii cu benzol, alcool, droguri; după administrări îndelungate de
antihistaminice, antipiretice, antitiroidiene, antimalarice, analgezice, sulfamide;
- iradieri cu radiaţii ionizante, raze X;

Valorile critice: număr de leucocite  500 /µl, respectiv > 30000 /µl.

Interferenţe:
- Număr fals crescut de leucocite: prezenţa de eritrocite rezistente la liză (la nou-născuţi,
reticulocitoză), prezenţa de eritroblaşti circulanţi în număr mare, de trombocite gigante (pot fi
numărate ca leucocite), prezenţa de crioglobuline (la temperatura camerei se formează cristale
proteice care sunt numărate ca leucocite; dispar după încălzirea probei la 37 0C), paraproteinemia,
prezenţa de aglutinine la rece.
- Număr fals scăzut de leucocite: prezenţa de leucocite alterate (chimioterapie, sepsis) – nu sunt
incluse în numărătoare.

Studiu individual

1. Consultând un dicţionar medical şi materialele didactice recomandate, vă rugăm să

explicaţi semnificaţia termenilor: crioglobuline, chimioterapie, sepsis, fluorescenţă,
EDTA; agranulocitoză; leucocitoză; leucopenie; parazitoze; boală mieloproliferativă;
inflamaţie; valoare bordeline; crush syndrom;
2. La numărarea leucocitelor pe fiecare dintre cele 4 patrate cu S de 1 mm2 s-au găsit:
31 de leucocite; 43 de leucocite; 39 de leucocite şi 33, de leucocite pe ultimul
pătrat. Diluţia este de 1/20, iar înălţimea camerei de numărat este de 1/10 mm.
Calculaţi care este numărul de leucocite/mm3.

87
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Ce sunt leucocitele şi ce rol au?

................................................................................................................................................
2. Cum se clasifică leucocitele şi care sunt seriile reprezentative?

………………………………………………………………………………………………..............
3. Care sunt progenitorii şi precursorii seriei granulocitare?

................................................................................................................................................
4. Care sunt progenitorii şi precursorii seriei limfo-plasmocitare?

................................................................................................................................................
5. Care sunt progenitorii şi precursorii seriei monocito-macrofagice?

................................................................................................................................................
6. Care este principiul numărătorii leucocitelor prin metoda clasică şi prin metode
computerizate?

................................................................................................................................................
7. Care sunt valorile normale ale numărului de leucocite?

................................................................................................................................................
8. Ce se înţelege prin leucocitoză şi enumeraţii câteva situaţii când apare ?

................................................................................................................................................
9. Ce se înţelege prin leucopenie şi enumeraţi câteva situaţii când apare?

................................................................................................................................................
10. Care sunt valorile critice ale numărului de leucocite?

..............................................................................................................................................

88
3.2.1. Examinarea frotiului de sânge periferic şi tehnica executării formulei
leucocitare
Examinarea atentă a frotiului bine executat este o parte importantă a evaluării bolilor
hematologice. Un diagnostic specific poate fi sugerat de hemoleucograma automată, dar
există unele afecţiuni care pot avea număr normal de celule şi morfologie celulară
anormală. Frotiul de sânge este un mijloc valoros în diagnosticul şi evaluarea unei anemii,
a anomaliilor eritrocitare ereditare, a infecţiilor, inflamaţiilor, leucemiilor, bolilor limfo- şi
mieloproliferative etc. şi trebuie examinat de către un medic specialist.
Indicaţii - semnale de avertizare ale analizorului: deviere la stânga, limfocite atipice,
blaşti, eritroblaşti, agregare trombocitară etc.
Evaluarea eritrocitelor pe frotiu:
- se impune în cazul în care nu se aplică “regula lui 3”:

Nr. Er. (x106/µl) x 3 = Hb (g/dl) x 3 = Ht (%);

- în anumite situaţii, precum: anemia normocromă normocitară cu reticulocitoză, anemia macrocitară

cu RDW crescut, anemia microcitară hipocromă cu număr crescut de eritrocite, se impune
analizarea frotiului sanguin pentru aprecierea morfologiei eritrocitelor;
- în caz de creştere a valorilor hemoglobinei (eritrocitoză): Hb >19 g/dl la bărbat şi >18 g/dl la femeie.
Evaluarea leucocitelor pe frotiu:
- când există leucocitoză >13000/mm3 la adult cu neutrofilie şi leucocitoză la copil peste valorile
admise; limfocitoză la adult >5000/µl şi la copil; eozinofilie >1500/µl; monocitoză >1300/µl;
neutropenie < 1000/µl; pancitopenie;
- în cazul detectării unor celule anormale.
Evaluarea trombocitelor pe frotiu:
- când analizorul a indicat <100x103/µl sau >1x106/µl se impune verificarea pe frotiu a numărului de
trombocite;
- când VTM - volumul trombocitar mediu - este cresut; dacă acesta corespunde prezenţei unor
trombocite gigante sau prezenţei de agregate trombocitare (ce ar putea interfera cu numărul de
trombocite şi de leucocite) se analizează morfologia trombocitară;
Se face la început examinarea frotiului cu obiectiv uscat, cu mărire mică (x 10 sau x 20)
pentru alegerea zonelor potrivite. Se apreciează distribuţia celulară, se poate face o
estimare a numărului de leucocite, precum şi a prezenţei de celule anormale (blaşti,
eritroblaşti), agregate trombocitare, aglutinarea eritrocitelor/rulouri.
Apoi, pe frotiu se pune o picătură de ulei de cedru şi se fixează poziţia microscopului
folosind obiectivul cu imersie, diafragmul deschis şi condensatorul sus. Marginea frotiului
se examinează în zig-zag şi se începe cu extremitatea frotiului (în sensul lungimii). Lama
se deplasează într-o singură direcţie. Pe măsură ce se întâlnesc leucocitele în câmpul
microscopic se notează pe un tabel, făcut în prealabil, care cuprinde cele 5 tipuri de
leucocite. Fiecare tip celular este evaluat pentru anomalii cantitative şi calitative. De
asemenea, se analizează şi modificările morfologice ale eritrocitelor şi trombocitelor.
Semnificaţia clinică
1. Aprecierea eritrocitelor pe frotiu.
Constă în evaluarea acestora pentru variaţii de mărime, distribuţia hemoglobinei şi
prezenţa de incluzii intracelulare. Se examinează porţiunea din frotiu unde eritrocitele nu
se suprapun. Acestea sunt de formă rotundă, cu diametru de 7 - 8 µ şi o zonă palidă
centrală care nu depăşeşte 1/3 din diametrul celulei.
Pot fi depistate următoarele anomalii morfologice eritrocitare:
- microcite: eritrocite cu diametru < 6 µ, asociate cu VEM scăzut;
- macrocite: eritrocite cu diametru > 9 µ, fără zonă palidă centrală, asociate cu VEM crescut;
- macroovalocite: eritrocite cu diametru >9 µ, ovale;
- anizocitoză: variaţia anormală a mărimii eritrocitelor, asociată cu RDW crescut;
- hipocromie cu zona palidă centrală mai accentuată în anemiiile microcitare;

89
 - eritrocite “în semn de tras la ţintă” (codocite): prezintă zonă centrală şi o ramă periferică de
hemoglobină, cu un inel palid între ele; sunt caracteristice talasemiilor, bolilor hepatice, icterului
obstructiv;
- ovalocite (eliptocite): celule alungite, ovalare, caracteristice eliptocitozei ereditare (> 25% din
eritrocite) şi anemiei feriprive;
- hematii “în picătură” (dacriocite): celule sub formă de lacrimă, caracteristice mielofibrozei, talasemiei,
anemiei megaloblastice;
- hematii “în seceră” (drepanocite): celule bipolare, spiculate, ascuţite la capete, caracteristice anemiei
falciforme;
- leptocite: celule plate, subţiri, hipocrome, caracteristice bolilor hepatice obstructive, talasemiilor,
anemiei feriprive;
- stomatocite: zona centrală palidă sub formă de fantă/cupă/gură, caracteristice stomatocitozei
ereditare, bolilor hepatice, alcoolismului, anemiei hemolitice imune;
- schizocite: fragmente celulare, apar în anemii hemolitice microangiopatice, valvulopatii severe /
proteze valvulare, arsuri severe, anemie feriprivă severă, anemie megaloblastică, posttransplant
medular;
- echinocite (eritrocite crenelate): celule spiculate; pot fi artecfate sau apar în uremie, carcinom
gastric;
- acantocite: celule cu prelungiri, fără zona palidă centrală, datorate alterării lipidelor din structura
membranei eritrocitare; apar în a-β-lipoproteinemie, ciroza hepatică, hemoliză, malabsorbţie;
- celule “muşcate” (degmacite) cu lipsa unei zone semicirculare dintr-o margine; apar în deficit de G-6-
PDH;
- inele Cabot: incluzii circulare, fine, bazofile; apar postsplenectomie, în anemii hemolitice şi
megaloblastice;
- punctaţii bazofile: incluzii punctiforme bazofile, caracteristice intoxicaţiei cu plumb, talasemiilor,
diverselor anemii;
- corpii Howell-Jolly: incluzii dense, sferice, bazofile, de regulă unice; apar în anemii hemolitice,
megaloblastice, talasemie, anemie falciformă, postsplenectomie;
- hematii în rulouri: agregate sub formă de “fişic de monede”; apar în paraproteinemie;
- eritroblaşti: eritrocite nucleate; apar în anemii hemolitice, boli mieloproliferative, hematopoieză
extramedulară, în orice anemie severă;
- incluzii parazitare: în malarie, leishmanioză.
2. Aprecierea leucocitelor pe frotiu constă în analizarea morfologică şi distribuţia lor. O
estimare aproximativă a numărului de leucocite se face prin examinare cu un obiectiv de
putere mică şi calcularea după formula:
Nr. Leucocite = [(nr. mediu de leucocite / câmp) : 4] x 103 /µl
Devierea la stânga a formulei leucocitare dată de prezenţa de precursori mieloizi (mieloblaşti, promielocite,
mielocite, metamielocite) se întâlneşte în reacţii leucemoide, carcinoame, sindroame mieloproliferative
cronice etc.
Tabloul leucoeritroblastic (prezenţa de eritroblaşti şi precursori mieloizi) se întâneşte în următoarele situaţii:
- măduvă osoasă normală: nou-născuţi, infecţii severe, hemoliză acută, hemoragie severă, anemie
feriprivă severă, anemie megaloblastică, boli hepatice, boli cardiace şi pulmonare cronice;
- infiltrare medulară: boli mielo- şi limfoproliferative, sindroame mielodisplazice, metastaze medulare.
Anomalii morfologice ale neutrofilelor:
- hipersegmentare nucleară (> 5% neutrofile cu 5 lobi, > 1% cu 6 sau mai mulţi lobi): în anemia
megaloblastică, infecţii cronice;
- neutrofile hipo/-agranulare: boli asociate - sindroame mielodisplazice;
- granulaţii toxice: granulaţii grosolane, purpurii/negre; boli asociate: infecţii bacteriene, administrare
de factori de creştere granul-monocitari;
- granulaţii azurofile mari şi numeroase: anomalia constituţională Alder;
- vacuolizări citoplasmatice: apar în infecţii, după chimioterapie etc;
- incluzii citoplasmatice mari: anomalia May-Hegglin;
- anomalia Pelger-Huët: nucleu hiposegmenat cu 1 sau 2 lobi, cu formă de clopot; anomalia poate fi
ereditară sau dobândită (leucemia mieloidă cu metaplazie mieloidă, mixedem, mielom multiplu,
reacţii medicamentoase – colchicină);
- corpii Döhle: incluzii citoplasmatice mici, albastre/gri, izolate sau grupate, situate la periferia celulei;
apar în sarcină, infecţii, arsuri, boli mielodisplazice.

90
Anomalii morfologice ale limfocitelor
- limfocite reactive: celule mari (diametru 10 – 30 ), citoplasmă abundentă, margini neregulate,
număr crescut de granulaţii azurofile, nucleu oval/reniform/neregulat, localizat excentric, uneori cu
cromatină laxă şi nucleol proeminent; sunt întâlnite în: mononucleoza infecţioasă, hepatita A, unele
infecţii virale (rubeolă, rujeolă, varicelă, oreion), după transfuzii multiple, reacţii alergice, infecţie HIV,
tuberculoză, sifilis, toxoplasmoză, malarie etc;
- umbre nucleare: artefacte care reprezintă nuclei dezintegraţi proveniţi din limfocite fragile; sunt
caracteristice leucemiei limfocitare cronice;
- limfocite cu incizuri nucleare (forma Rieder): tusea convulsivă, leucemia limfatică cronică, după
splenectomie;
- limfo-plasmocite, celule Türk: celule medii/mari, citoplasmă moderată, intens bazofilă, cu o arie clară
perinucleară, nucleu rotund, cu cromatină condensată, grosolană, densă, uneori cu nucleoli; pot
apare ocazional pe frotiuri normale, de obicei sunt asociate cu limfocitele reactive;
- plasmocite: celule cu raport nucleo-citoplasmatic scăzut, citoplasmă intens bazofilă, uneori albastru-
gri, frecvent cu vacuole (aspect de celulă Mott, dacă acestea sunt numeroase), cu zonă clară
adiacentă nucleului, cromatină densă, uneori cu aspect de  spiţă de roată; apar în condiţii benigne:
infecţii bacteriene şi virale cronice, alergii, hipersensibilizări, imunizări, condiţii de gamaglobuline
serice crescute, mononucleoză infecţioasă, boli de colagen şi în condiţii maligne: mielom multiplu,
leucemia cu plasmocite, unele neoplazii;
- celule leucemice: celule blastice (mieloblaşti, limfoblaşti, monoblaşti), promielocite atipice;
prolimfocite; celule păroase (hairy cells); celule limfomatoase.

Tabloul leucoeritroblastic la adult, prezenţa de celule atipice indică

prezenţa unei boli medulare severe şi trebuie evaluate în continuare
prin examen de măduvă osoasă.

3. Aprecierea trombocitelor pe frotiu

Pe frotiul de sânge periferic, numărul de trombocite poate fi estimat prin prezenţa lor în
grupuri de 8 - 20 pe câmpul de imersie (≈ 1 trombocit la 10 - 30 eritrocite exclude
trombocitopenia). Trombocitele (plachetele sanguine) au diametru de 2 - 4 µ, formă
rotundă-ovalară, sunt fragmente citoplasmatice de culoare albastru-deschis cu granulaţii
mici azurofile (roşu-purpuriu) difuze.
Anomalii morfologice trombocitare:
- agregate trombocitare: date de prezenţa de microcheaguri în probă, aglutinare determinată de
EDTA;
- macrotrombocite: diametru > 4 µ; apar în purpura trombocitopenică idiopatică şi în situaţiile când
creşte VTM (volumul trombocitar mediu): boli mieloproliferative, hipertiroidism, după splenectomie;
- trombocite gigante: au diametrul asemănător eritrocitelor; sunt caracteristice sindroamelor
mieloproliferative;
- trombocite agranulare: apar colorate gri/albastru-pal în sindroamele mielodisplazice şi în hairy cell
leukemia (leucemia cu celule păroase);
- trombocite cu forme bizare, cu granulaţii grosolane: apar în faza preleucemică a sindroamelor
mieloproliferative;
- fragmente de megacariocite circulante: apar în sindroamele mieloproliferative.

91
3.2.2. Morfologia leucocitelor
Granulocitul neutrofil
- celulă de 10 -15 m;
- nucleul este format din mai mulţi lobi (2 - 5) uniţi printr-un filament de cromatină;
poate fi în potcoavă sau sub forma literei S; nu prezintă nucleoli; se colorează în
violet; raportul nucleu/ citoplasmă (N/C) este în favoarea C;
- citoplasma este acidofilă, colorată în roz, cu conţinut mare de glicogen, cu granulaţii
numeroase, fine, colorat brun:
• granulaţiile primare apar din stadiul de promielocit şi, apoi se reduc ca
număr, conţin: fosfatază acidă, mieloperoxidază (enzimă specifică liniei
mieloide, ce se evidenţiază printr-o reacţie citochimică), elastază, catepsina
G, lizozim;
• granulaţii secundare apar din stadiul de mielocit, conţin: fosfatază alcalină
(FAL), lactoferină, transcobalamine;
• granulaţii terţiare apar din stadiul de metamielocit, conţin fosfatază acidă,
arilsulfatază, lipsite de peroxidaze.
Granulocitul eozinofil
- celulă de 10-15 m;
- nucleul este bilobat, cel mai frecvent (aspect în desagă), dar poate avea şi 3 lobi;
raportul N/C în favoarea C; cromatină densă; fără nucleoli;
- citoplasma conţine granulaţii mai mari decât ale neutrofilului, rotunde, egale, nu
acoperă nucleul, roşu-portocalii, cu aspect de icre de manciuria; granulaţiile
conţin: fosfatază acidă; peroxidaze specifice; proteine bazice (formează cristalele
Charcot-Leyden);  glucuronidază; oligoelemente (Mg, Mn, Fe, Cu).
Granulocitul bazofil
- celulă de 10 - 13 m; durată de viaţă de 8 - 12 zile;
- nucleul are 2 - 3 lobi, cromatină densă, nucleoli absenţi, raportul N/C în favoarea C;
se colorează violet şi este greu vizibil;
- citoplasma este acidofilă, cu granulaţii mari, inegale, metacromatice, de culoare
neagră, care acoperă nucleul (comparate cu petele de cerneală); sunt solubile în
apă, de aceea pot fi îndepărtate în timpul colorării, în locul lor rămânând spaţii
goale, rotunde, colorate roşu deschis. Granulaţiile bazofilului conţin:
mieloperoxidază; heparină; histamine; SRSA (slow reacting substance of
anaphylaxy); kalicreină; factorul chemotaxic al eozinofilelor; factorul de activare al
plachetelor sanguine.
Mastocitele se maturează în mod obişnuit în afara măduvei osoase sau circulaţiei
– în general în ţesutul conjunctiv şi cavităţile seroase. Bazofilele şi mastocitele
diferă semnificativ în ceea ce priveşte fenotipul de suprafaţă, forma şi structura
nucleului: bazofilele au, în general, mai puţine granule şi o morfologie mai omogenă
decât mastocitele. Există diferenţe în ceea ce priveşte mediatorii stocaţi şi cei nou
sintetizaţi după activare. În mastocite, proteinazele sunt conţinute în cantitate
abundentă.
Limfocitul
- celulă cu diametrul de 7 - 9 m (limfocit mic) sau de 9 - 12 m (limfocit mare);
- formarea lor durează 18 - 30 ore, rămân în sânge în jur de 10 ore, după care se
reînoiesc;
- nucleul este mare, rotund sau uşor reniform, raportul N/C în favoarea N, cromatina
nucleară dispusă în mase grosolane, amorfe, suprapuse, fără nucleoli;

92
 - citoplasma este bazofilă, ca o bandă perinucleară, redusă cantitativ; poate prezenta
granulaţii rare, azurofile, numite plasmozomi.
- Limfocitele sunt celule capabile de a se combina cu un antigen, datorită unor
receptori membranari specifici (imunoglobulinele de membrană specifice limfocitelor
B; receptorul T, specific limfocitelor T). Identificarea limfocitelor T şi B se face prin
anticorpi monoclonali.
Plasmocitele.
- sunt celule sferice sau eliptice, cu nucleu situat excentric şi cromatina nucleară în
blocuri dense, dispusă în "spiţă de roată" sau în "carapace de broască ţestoasă".
Citoplasma bazofilă poate fi văzută uneori doar ca un halou citoplasmatic, în rest ea
având o tentă roşietică, datorită prezenţei în citoplasmă a unor vacuole mari,
colorate în albastru-violet, roşu sau incolore. Aceste vacuole sunt saci
ergastoplasmici, care conţin imunoglobuline, fiind numite "corpi Russell".
Monocitul
- celulă mare (diametrul de 15 - 20 m); se află în circulaţie 16 - 36 ore, după care
intră în ţesuturi;
- nucleul este mare, reniform sau incizat, de regulă excentric, rar rotund sau
neregulat, fără nucleoli, cromatina nucleară fină, laxă;
- citoplasma este abundentă, bazofilă, colorată albastru cenuşiu, fină, cu aspect
pieptănat, cu numeroase vacuole şi granule, care dau aspect de sticlă mată;
granulaţii azurofile, foarte fine, multe, pulverulente, de culoare roz;
- pe membrană există receptori pentru insulină, IgG şi fracţiunea C 3 a
complementului; granulaţiile conţin fosfatază alcalină leucocitară, peroxidază,
esteraze, lizozim, lipază.
Macrofagul reprezintă varianta tisulară a monocitului, raport 400/1 faţă de
monocitele circulante; trăiesc 2 - 3 luni; se diferenţiază în funcţie de condiţiile locale;
are formă neregulată, citoplasmă abundentă cu granule şi vacuole.

93
3.2.3. Formula leucocitară
Formula leucocitară constă în diferenţierea numărului total de leucocite circulante
în cele 5 tipuri de leucocite, exprimate procentual şi respectiv în număr absolut.
Actualmente este de preferat raportarea fiecărui tip de leucocite în valori absolute.
Formula leucocitară este efectuată automat de către analizorul de hematologie. Există
însă situaţii în care este necesară efectuarea manuală a formulei leucocitare:
- număr de leucocite prea mic / prea mare;
- prezenţa de celule anormale semnalizate de analizor prin anumite mesaje de
avertizare / eşecul analizorului de a indica formula.
În aceste situaţii, se efectuează numărătoarea microscopică pe frotiul de sânge venos
(sânge recoltat pe EDTA, heparina putând determina modificări ale leucocitelor) sau pe
frotiul de sânge capilar. Formula leucocitară reprezintă raportul procentual în sângele
periferic al elementelor figurate aparţinând seriilor granulocitară, limfocitară şi monocitară,
după numărarea a cel puţin 200 de elemente, pe un frotiu de sânge colorat panoptic cu
coloraţia May-Grünwald-Giemsa.
Formula leucocitară normală (la adult)
Se numără 100 / 200 elemente şi se face procentajul fiecărei clase de elemente.
Cifra absolută reprezintă numărul fiecăruia dintre elemente pe mm 3. Exemplu: pentru un
număr de leucocite de 6200/mm3, dacă formula arată 70% neutrofile segmentate, cifra
absolută se calculează după regula de trei simple. Dacă la 100 elemente se găsesc 70
neutrofile segmentate, pentru 6200 se găsesc 4340/mm3.

FORMULA LEUCOCITARĂ NORMALĂ (la adult)

Granulocite neutrofile:
- nesegmentate NN = 1- 4% (100 - 240/mm3)
- segmentate NS = 62 - 68% (3720 - 4000/mm3)
Granulocite eozinofile EO = 1 - 3%, 4% (100 - 180/mm3)
Granulocite bazofile B = 0 - 1% (0 - 60/mm3)
Limfocite L = 20 - 30% (1200 - 2000/mm3)
Monocite M = 4 - 8% (240 - 480/mm3)

Modificări cantitative ale claselor de leucocite

Neutrofilia:
- fiziologică: nou-născut, gravide;
- patologică:
• infecţii acute localizate/generalizate (bacterii, virusuri, fungi, paraziţi);
• inflamaţii acute/generalizate (artrite, vasculite, boli de colagen);
• intoxicaţii cu substanţe toxice sau medicamente;
• după hemoragii, hemolize acute, iclusiv cea posttransfuzională;
• leucemie granulocitară cronică;
• tumori maligne datorate necrozelor şi/sau suprainfecţiei.
Neutropenia se clasifică în: uşoară, moderată şi severă. Agranulocitoza reprezintă o
formă severă de neutropenie cu absenţa totală a neutrofilelor circulante. Cauze de
neutropenie:

94
 - infecţii bacteriene (febra tifoidă, paratifoidă); virale (gripa, rujeola, hepatita, SIDA);
cu protozoare (malaria, toxoplasmoza);
- afectarea măduvei hematogene prin radiaţii, substanţe chimice toxice sau
medicamente;
- stări caşectice şi debilitate: malnutriţie, alcoolism.

Neutropenia severă se asociază cu risc crescut de infecţii cu localizare

orală (ulcere, periodontită), cutaneo-mucoasă (piele, perirectal, genital), iar
neutropenia prelungită cu infecţii sistemice (gastrointestinale, hematogene).

Eozinofilia se întâlneşte în:

- stări alergice (astm bronşic, urticarie, dermatita atopică, sensibilizarea la aspirină,
alergii medicamentoase – penicilină, tetraciclină);
- infestări parazitare cu ascarizi, oxiuri, protozoare (scabia, trichomonas, giardia);
- boli dermatologice (psoriazis, eczeme, dermatoze alergice);
- boli neoplazice: sindromul hipereozinofilic idiopatic – rar;
- boli gastro-intestinale: boală Crohn, colită ulcerativă;
- tulburări funcţionale ale splinei sau după splenectomie.
Cele mai mari valori ale numărului de eozinofile apar în sindromul hipereozinofilic
idiopatic, leucemia cu eozinofile, trichineloză şi dermatita herpetiformă.
Eozinopenia se întâlneşte în:
- scăderea mielopoiezei sau aplazie medulară;
- secreţie exagerată sau administrare de corticoizi ;
- la cei cu cardiopatie ischemică, apariţia eozinopeniei arată iminenţă de infarct;
- în stările de stress - prin hipersecreţie de glucocorticoizi;
Bazofilia se întâlneşte în:
- leucemia granulocitară cronică şi alte sindroame mieloproliferative cronice
(policitemia vera, metaplazia mieloidă cu mielofibroză); nivelul bazofiliei are valoare
prognostică, iar criza bazofilică anunţă faza blastică terminală din leucemia
granulocitară cronică;
- niveluri crescute de IgE din reacţiile inflamatorii din colitele ulceroase, artrita
reumatoidă, urticarie;
- stări alergice;
- după administrare de estrogeni sau medicamente antitiroidiene;
- intoxicaţia cu plumb.
Bazopenia (rară); se întâlneşte în:
- hipertiroidism;
- după administrare de glucocorticoizi sau ACTH;
- stările de stress (sarcină, infarct miocardic), şoc.
Prezenţa de precursori mastocitari în sânge:
- astm bronşic;
- şoc anafilactic;
- mastocitoză sistemică;
- urticaria pigmentosa;
- leucemia cu mastocite;
- insuficienţă corticosuprarenaliană;
- boli hepatice şi renale cronice;
- osteoporoză.

95
Limfocitoza se clasifică în:
- reactive accentuate:
• infecţii virale (tuse convulsivă, mononucleoza infecţioasă), când se asociază
cu plasmocitoză şi monocitoză;
- reactive moderate:
• alte boli infecţioase acute (rujeolă, varicelă, hepatită) sau cronice (TBC,
sifilis);
• leucemii, limfoame-modificări numerice şi atipii celulare; în leucemia limfatică
cronică (LLC) se ating cifrele maxime ale limfocitozei.
• tulburări de metabolism (rahitism, hipertiroidism);
Limfopenia se întâlneşte în:
- producţie scăzută dobândită (radiaţii, malnutriţie, citostatice, boala Hodgkin, boli
endocrine) sau congenitală (imunodeficienţă cu deficit de limfocite B, T sau mixt);
- distrucţii crescute sau pierderi (boli autoimune, infecţii virale şi în special SIDA);
- lupus eritematos sistemic (sunt prezenţi anticorpi anti-limfocitari care produc liza
complement mediată a limfocitelor);
- tuberculoza avansată (miliară); scăderea marcată a celulelor CD4+;
- administrare de ACTH/corticoizi; tumori hipofizare secretoare de ACTH; boala
Cushing.
Apariţia de rare plasmocite în sângele periferic nu este un fenomen patologic.
Creşterea numărului de plasmocite poartă numele de plasmocitoză.
Plasmocitoza se întâlneşte în:
- unele boli infecţioase la copil (rubeola, rujeola, scarlatina, varicela, mononucleoza
infecţioasă, hepatita epidemică);
- unele stări alergice;
- ciroză;
- mielomul multiplu (plasmocitom);
- leucemia cu plasmocite.
Monocitoza apare extrem de variabilă, chiar de la o oră la alta, datorită unei reactivităţi
reticuloendoteliale. Se întâlneşte în:
- unele boli infecţioase (mononucleoza infecţioasă, febra tifoidă, tifosul exantematic);
- endocardita bacteriană lentă;
- unele hemopatii (leucemia mielomonocitară; limfoame maligne, boli
mieloproliferative; mielomul multiplu; boala Hodgkin);
- boli neoplazice nehematologice (ovar, sân, tract gastrointestinal);
- unele reacţii medicamentoase.
Monocitopenia (extrem de rară):
- toate situaţiile cu insuficienţă renală;
- după tratament cu cortizon (Prednison) – tranzitoriu;
- infecţia cu HIV.

Studiu individual

1. Consultând un dicţionar medical şi materialele didactice recomandate, vă rugăm să

explicaţi semnificaţia termenilor: leucemie; aplazie medulară; sindroame
mieloproliferative; boală Chron; mielomul multiplu; mononucleoza infecţioasă; boala
Cushing; boli autoimune; malnutriţie; imunodeficienţă; metaplazia mieloidă;
mielofibroză; trichineloză.
2. Documentaţi-vă şi aflaţi până la ce procent din formula leucocitară pot ajunge
eozinofilele în infestarea cu trichinela. În ce condiţii apare această infestare?

96
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Ce este formula leucocitară, cum se efectuează?

................................................................................................................................................
2. Care este formula leucocitară normală la adult?

................................................................................................................................................
3. Cum recunoaşteţi neutrofilele, la microscopul optic; care este procentul şi numărul
absolut în formula leucocitară? Indicaţi 2 - 3 situaţii când se modifică valoarea normală.

................................................................................................................................................
4. Cum se numeşte scăderea procentului de neutrofile în formula leucocitară şi cu ce se
asociază scăderea marcată a lor? De ce?

................................................................................................................................................
5. Cum recunoaşteţi la microscopul optic eozinofilele, care este procentul şi numărul
absolut în formula leucocitară ? Indicaţi 2 - 3 situaţii când se modifică valoarea normală.

................................................................................................................................................
6. Cum recunoaşteţi la microscopul optic bazofilele? Care este procentul şi numărul
absolut în formula leucocitară ? Indicaţi 2 - 3 situaţii când se modifică valoarea normală.

...............................................................................................................................................
7. Cum recunoaşteţi la microscopul optic limfocitele, care este procentul şi numărul
absolut în formula leucocitară ? Indicaţi 2 - 3 situaţii când se modifică valoarea normală.

................................................................................................................................................
8. Cum recunoaşteţi la microscopul optic monocitele, care este procentul şi numărul
absolut în formula leucocitară ? Indicaţi 2 - 3 situaţii când se modifică valoarea normală.

................................................................................................................................................
9. Analizaţi următoarele formule leucocitare, subliniaţi valorile care nu sunt normale şi
precizaţi câteva posibilităţi de diagnostic.
a. Pacient, 24 ani: L=16000/mm3; NN=3%, NS=74%, E=2%, B=0%, Lf=16%, M=5%.
b. Pacient, 1 an: L=11000/mm3; NN=1%, NS=46 %, E=3%, B=0%,Lf=45%, M=5%.
c.. Pacient, 16 ani: L=8600/mm3; NN=1%, NS=58%; E=14%, B=0%; Lf=21%, M=6%.
d. Pacient, 34 ani: L=19400/mm3; Mielocite=1%, Metamielocite=2%; NN=6%, NS=72%,
E=2%, B=1%, Lf=12 %, M=4%.
e. Pacient, 4 ani: L=14900mm3; NN=2%, NS=45 %, E=4%, B=0%, Lf=35%, M=14%; 6
plasmocite/100 leucocite.

................................................................................................................................................

97
3.2.4. Formula Arneth şi indicele Schilling
Formula Arneth
În anul 1904, Arneth clasifică granulocitele după numărul lobilor nucleului. Această
clasificare reprezintă împărţirea pe vârste a granulocitelor: cu cât un element este mai
evoluat, mai matur, numărul lobilor nucleului este mai mare şi invers.
Cele 5 clase sunt caracterizate prin:
- nucleu uşor încurbat;
- nucleu cu 2 lobi legaţi printr-un filament de cromatină;
- nucleu cu 3 lobi;
- nucleu cu 4 lobi;
- nucleu cu 5 lobi.
Valorile normale se referă la raportul procentual între cele 5 clase (se numără 100
granulocite):
- I - 5%
- II- 30%
- III - 45%
- IV - 18%
- V - 2%, neutrofil bătrân înainte de dezintegrare.
Dacă în sânge predomină elementele tinere, cu nucleul puţin evoluat, se vorbeşte de o
deviere la stânga. Dacă predomină seriile evoluate, cu nucleul cu mai multe segmente, se
vorbeşte de o deviere la dreapta.
În cazuri de infecţii febrile, grave, măduva este stimulată, în prima clasă fiind 50% din
totalul elementelor, dispărând clasele IV şi V, acestea reprezentând o deviere la stânga a
formulei leucocitare. În devierile la dreapta, datorate carenţelor de vitamina B 12 şi acid folic
apar celule mari cu diametrul de 20 , nucleu hipersegmentat cu 6-10 lobi.
Indicele de deviere nuclear Schilling
În mod normal, în sângele periferic se găsesc elementele finale, granulocitele segmentate
şi nesegmentate, în timp ce în devierile la stânga, consecutiv unor infecţii grave în care
numărul de leucocite este foarte crescut, putând chiar simula o reacţie leucemoidă, în
periferie apar elemente tinere, care se găsesc normal numai în măduvă. Ele nu au fost
incluse în formula Arneth, de aceea şi Schilling a propus un indice, numit indice de
deviere nuclear. El reprezintă raportul dintre suma mielocitelor, metamielocitelor şi
granulocitelor nesegmentate, faţă de procentul granulocitelor segmentate. Acest raport
este egal cu 4/64 (1/16). Creşterea valorii acestui raport se datorează apariţiei elementelor
tinere şi corespunde devierilor la stânga ale formulei Arneth.
Indicele de deviere nuclear (Schilling) = (a+b+c) / d = 1 / 16
a. mielocit;
b. metamielocit;
c. granulocit nesegmentat;
d. granulocit segmentat, indiferent de numărul lobilor.
Mielocitul este o celulă cu dimensiuni între 12-18 , cu nucleu rotund sau ovalar, cu
citoplasma cu granulaţii diferenţiate. Nucleul prezintă grămezi de cromatină nete, structura
fiind grosolană, fără nucleoli. Citoplasma este acidofilă, iar granulaţiile sunt cele
caracteristice clasei respective de granulocite (neutrofilului): brune, fine şi foarte
numeroase.
Metamielocitul are dimensiuni de 10-18 , prezintă grămezi de cromatină mai grosolane,
mai dense şi mai bine delimitate. Nucleul devine reniform, cu convexitatea tangentă la
suprafaţa celulei. Citoplasma are granulaţii asemănătoare neutrofilului.

98
3.2.5. Parametrii unui buletin de hemoleucogramă efectuat pe un analizor automat
de hematologie
Buletinul de hemoleucogramă prezentat este efectuat pe un analizor automat de
hematologie, ABX MICROS 60. Datele oferite sunt:
- WBC, LYM%, LYM, MON%, MON, GRA%, GRA
- RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, RDW-SD
- PLT, MPV, PDW, PCT
- Curbele de distribuţie WBC, RBC, PLT (histograme).
Traducerea din limba engleză.
- WBC=număr total de celule albe;
- LYM%, LYM, MON%, MON, GRA%, GRA (limfocite, monocite, granulocite
procent şi valoare absolută)
- RBC=număr total de celule roşii;
- HGB=hemoglobina;
- HCT=hematocritul;
- MCV=volumul mediu eritrocitar;
- MCH=cantitatea de hemoglobină medie;
- MCHC=concentraţia de hemoglobină eritrocitară medie;
- RDW-SD=lăţimea distribuţiei eritrocitare;
- PLT=număr de plachete;
- MPV=volum mediu plachetar;
- PDW=lăţimea distribuţiei plachetare;
- PCT=plachetocrit
Principii de măsurare
Detecţia RBC/WBC/PLT – variaţia de impulsuri generate de trecerea celulelor prin apertura calibrată.
Măsurarea HGB – hemoglobina eliberată de celulele roşii lizate se combină cu cianura de potasiu pentru a
forma compusul cromogen, cianmethemoglobina. Acest compus este măsurat prin spectrofotometrie în
partea optică a camerei de măsură WBC, la o lungime de undă de 550 nm.
Determinarea HCT – prin integrare numerică a volumului celulelor, MCV. Înălţimea impulsului generat de
trecerea celulei prin apertură este direct proporţional cu volumul celulei.
În afara parametrilor hemoleucogramei, unele analizoare pot detecta celulele anormale sau imature, afişând
diferite mesaje de avertizare generate de localizarea anormală a populaţiilor celulare.
Astfel, legat de leucocite pot afişa modificări anormale legate de procentul şi valoarea absolută a numărului
de leucocite şi a claselor de leucocite, precum şi suspiciuni când apar blaşti, granulocite imature, deviere la
stânga, limfocite atipice sau precursori eritrocitari nucleaţi.
Legat de eritrocite apar modificări anormale (dismorfism eritrocitar pe histogramă; anizocitoză – modificarea
RDW-SD; microcitoză, macrocitoză – modificarea VEM-ului; hipocromie – modificarea CHEM; anemie –
modificarea Hb; eritrocitoză – modificarea numărului de eritrocite).
Suspiciuni legate de eritrocite: aglutinare eritrocitară (modificarea numărului de eritrocite, a CHEM-ului şi
HEM-ului); turbiditate/interferenţă (modificarea CHEM-ului); deficit de fier (modificarea VEM-ului, CHEM-ului,
RDW-SD); defect de hemoglobină (modificarea RDW-SD, VEM-ului); fragmente eritrocitare.
Legat de trombocite apar modificări anormale: trombocitopenie, trombocitoză (modificarea numărului de
trombocite); suspiciuni – aglutinarea trombocitelor.
Studiul distribuţiei celulelor se face prin analizarea a 256 canale de măsurare pentru celulele albe şi roşii
şi 128 canale pentru plachete, cu domeniile următoare: WBC=30-460fl; RBC=25-300fl; PLT=2-33fl.
Distribuţia celulelor albe dezvăluie 3 subpopulaţii de leucocite (în cazul analizorului prezentat), alte
analizoare chiar toate cele 5 categorii de leucocite. Ca principiu se bazează pe studiul volumetric al
leucocitelor după utilizarea unor reactivi pentru diluţie şi liză (diluentul conservă şi pregăteşte membrana
celulară pentru reacţia de diferenţiere, iar soluţia de liză acţionează diferit asupra membranelor
citoplasmatice).
Se analizează înălţimea fiecărui impuls provenit de la apertură şi se obţine o curbă, pe axa Y = numărul de
celule, pe axa X = volumul acestor celule. Populaţia de celule poate fi împărţită în: limfocite între 30-100fl;

99
monocite între 100-150fl; granulocite între 150 şi maximul volumului. Limfocitele, monocitele şi granulocitele
sunt exprimate procentual şi în valoare absolută.
Distribuţia celulelor roşii detectează anomalii eritrocitare legate de anizocitoză.
RDW (lăţimea distribuţiei celulelor roşii) permite evaluarea lăţimii curbei de distribuţie în relaţie cu numărul
celulelor şi cu volumul mediu.
RDW = k x SD/MCV
k= constanta sistemului; SD = deviaţia standard determinată în concordanţă cu studiul statistic al distribuţiei
celulelor; MCV = volumul mediu al celulelor roşii.
Distribuţia de volum a plachetelor – arată numărul de plachete, detectează anomaliile şi alertează în
eventualitatea existenţei unei populaţii de celule care nu sunt plachete (schizocite, microcite etc).
Plachetele sunt numărate între un prag jos situat la 2fl şi un prag sus variabil care este în concordanţă cu
populaţia microcită prezentă în zona de analiză a plachetelor.
Măsurarea MPV (volum mediu plachetar) - este direct derivat din analizarea curbei de distribuţie a
plachetelor. MPV se exprimă în m3 sau fl.
Calculul PCT (plachetocrit): PCT%=PLT(103/l)xMPV(fl)/10000.
Măsurarea PDW (lăţimea distribuţiei plachetare) derivă din curba plachetelor – reprezintă lăţimea curbei,
între 15% din numărul plachetelor începând cu 2fl şi 15% din numărul plachetelor, începând cu pragul sus
variabil.

Tabelul 3.2. Sisteme de unităţi utilizate

Standard SI
WBC 3
10 /mm 3 109/l
RBC 106/mm3 1012/l
PLT 103/mm3 109/l
HCT % l/l
HGB g/dl mmol/l
MCV m 3 fl
MCHC g/dl mmol/l
MPV m3 fl

100
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Analizaţi următoarele buletine de hemoleucogramă:

1.

2.

101
3.

...............................................................................................................................................

102
3.3. IDENTIFICAREA SUBCLASELOR DE LIMFOCITE ŞI ALTE METODE DE
EXPLORARE A SERIEI LEUCOCITARE
Populaţia limfocitară reprezintă baza celulară a răspunsului imun specific, element
fundamental în apărarea antimicrobiană. Mecanismele implicate în apărarea
antimicrobiană sunt:
1. Umorale.
În acest caz, calea efectorie este reprezentată de proteine sintetizate de plasmocit.
Această celulă (plasmocitul) reprezintă elementul final de maturare şi diferenţiere al liniei
B. Linia limfoidă B îşi are originea în celula stem limfoidă, ontogeneza sa având loc fie în
măduva osoasă hematogenă, pentru mamifere, fie la nivelul bursei lui Fabricius, în cazul
păsărilor. Plasmocitul este celula finală ce are cea mai mare capacitate de a sintetiza în
cantitate crescută anticorpi (imunoglobuline).
2. Celulare.
Acestea se bazează pe limfocitele T. Limfocitele T au fost împărţite, în raport de rolul lor în
imunitate, în limfocite T helper şi T supresor. Prima categorie de limfocite ajută
limfocitul T supresor (citotoxic) şi limfocitul B în derularea răspunsului imun.
Limfocitul T supresor (citotoxic) are capacitatea de a recunoaşte anumite proteine străine
existente pe suprafaţa celulelor proprii, şi ulterior să determine citoliza acestor celule (cel
mai frecvent celulele infiltrate viral).
A mai fost descrisă o altă linie limfoidă (natural killer, NK) a cărei origine este
controversată (la nivelul celulei stem limfoide sau la nivelul celulei stem pluripotente).
Celulele NK sunt capabile de a distruge celulele anormale (tumorale sau cele infectate
viral), fără a fi obligatorie recunoaşterea originii comune a celor 2 celule.
Limfocitele nu pot fi diferenţiate între ele prin microscopie optică şi nici prin microscopie
electronică. Identificarea subtipurilor limfoide se poate face prin tehnicile de rozetare şi
prin anticorpi monoclonali. Determinarea markerilor de pe suprafaţa celulară se poate face
cu imunoseruri sau anticorpi monoclonali, ultima metodă câştigând din ce în ce mai mult
teren în ultimul timp.
Anticorpii monoclonali sunt imunoglobuline (Ig) identice din punct de vedere structural, ce
au capacitatea de a recunoaşte un singur epitop (un singur determinant antigenic). Atât
markerul de suprafaţă, cât şi anticorpii monoclonali specifici au fost notaţi cu 2 litere (CD)
de la “cluster differentation”.
Evidenţierea unui anumit CD sau a unei anumite constelaţii de CD poate determina
identificarea nu numai a liniei celulare, cât şi a stadiului de diferenţiere şi maturare a unei
populaţii. CD au fost împărţite în mai multe clase, dar importante rămân:
- panantigenele T - markeri de suprafaţă identificaţi numai pe suprafaţa limfocitelor T
(CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8);
- panantigenele B - markeri identificaţi numai pe linia B (CD19, CD20, CD21, CD22).
Diferenţierea între limfocitul T helper şi T supresor se bazează pe identificarea, în primul
caz, a markerului CD4, iar în al doilea caz a markerului CD8.
Tehnici de imunocitologie
Testul rozetelor. Pentru evaluarea subclaselor majore de limfocite în sângele periferic se utilizează testul
rozetelor, metodă care foloseşte doi markeri de suprafaţă: testul rozetelor E, de aderare a eritrocitelor de
berbec pe suprafaţa limfocitelor T; decelarea imunoglobulinelor de suprafaţă (SIg), pentru limfocitele B,
evidenţiate cu un ser antiglobulină umană, marcat cu fluoresceină, citirea făcându-se în lumină ultravioletă
(microscop cu fluorescenţă).
Testul rozetelor E. Rozetarea este un fenomen de imunoaderenţă ce se realizează cu celulele vii în condiţii
optime de temperatură şi pH. Metoda se bazează pe principiul că eritrocitele de oaie se leagă specific de
limfocitele T.

103
Limfocitele din sângele periferic, separate şi incubate la 370C cu o soluţie de gelatină şi ser fiziologic,
amestecate cu o suspensie de eritrocite de berbec 2% în ser de viţel, lăsate la 0 - + 40C, aşezate între lamă
şi lamelă formează rozete (limfocit de care aderă cel puţin 3 eritrocite de oaie). Rozetele sunt foarte fragile,
dezintegrându-se rapid la agitaţie mecanică uşoară; EDTA deprimă rozetarea. Unele enzime ca tripsina,
fosfolipaza A distrug receptorii limfocitari pentru eritrocite, altele, precum neuramidaza şi papaina
favorizează formarea rozetelor.
Se stabileşte procentul de limfocite care au format rozete, din totalul limfocitelor de pe lamă. Ele reprezintă
60 - 80%.
Testul rozetelor EAC se bazează pe proprietatea limfocitelor B de a exprima pe suprafaţă receptori pentru
componenta C3 a complementului şi pentru porţiunea FC de imunoglobuline. Eritrocitele tratate pentru a fixa
imunoglobuline (A - antigen) şi complement (C) sunt puse în contact cu limfocitele separate din sângele
periferic, formând rozete prin aderare. Procentul de rozete EAC (eritrocit - antigen - complement) redă pe cel
al limfocitelor B, normal la adult fiind de 20 - 30%. Testul se utilizează pentru stabilirea filiaţiei leucemiilor
cronice.
Testele de transformare blastică a limfocitelor se bazează pe capacitatea limfocitelor de a se transforma
blastic în contact cu antigenul sensibilizat (transformare specifică), dar şi în prezenţa unor substanţe
mitogene de tipul phitohemaglutininei - PHA (transformare nespecifică). Scăderea reactivităţii la mitogeni
este importantă în sindroamele imunodeficitare pe linia limfocitelor T (limfoproliferări maligne, infecţia cu
virus HIV şi SIDA), cancere, radioterapie, tuberculoză.
Testele de înaltă performanţă (citometria de flux - “flow-cytometry”) sunt metode imunologice ce aduc
informaţii priviind nivelul cantitativ al celulelor implicate în imunitate prin :
- mărimea şi complexitatea structurală a celulei, prin măsurarea împrăştierii razei laser;
- prezenţa unor receptori de suprafaţă pe baza decelării fluorescenţei de membrană, asigurată de
anticorpii monoclonali marcaţi cu substanţă fluorescentă, care au specificităţi pentru anumiţi markeri
celulari.
Celulele pe care s-au fixat anticorpii monoclonali sunt numărate în flowcitometru prin microscopia în
fluorescenţă. Citometrul de flux permite mai întâi realizarea „porţilor” celulare, pe baza împrăştierii frontale
şi laterale a luminii - laser: limfocite, macrofage, granulocite. Se analizează una „din porţi” pentru testarea
proporţiei de celule care exprimă diferiţi markeri.
Prin citometrie de flux se pot determina histograme ale unei populaţii celulare heterogene, prin raportarea
unei linii celulare la un marker specific, precum: CD14+, pentru macrofage; CD19+, pentru limfocitele B
totale; CD3+, pentru limfocitele T totale; CD4+, pentru limfocitele T helper; CD8+/CD11b+, pentru cele T
supresoare; HLA-DR+/CD3+, pentru limfocitele T activate; CD16+/CD56+, pentru celulele NK etc.
Procentul normal de limfocite T este de 60 - 80% din celulele mononucleare din sângele periferic; dintre
acesta 70% sunt T „helper” (CD4) şi 30% sunt T supresor/citotoxic (CD8). Raportul de limfocite CD4/CD8
este 1,5 - 3,5.
Anticorpii monoclonali pot determina, prin identificarea anumitor markeri de suprafaţă, subtipurile de leucemii
acute limfoblastice, fapt ce are implicaţii prognostice.
Scăderea raportului CD4/CD8 denotă o imunosupresie, ce poate fi întâlnit în unele limfoproliferări maligne.
Dacă valoarea devine subunitară, imunosupresia este accentuată, fapt frecvent întâlnit în SIDA (infecţia cu
virusul HIV). Creşterea populaţiei de limfocite T 4, scăderea T8 şi creşterea procentuală a limfocitelor B şi a
plasmocitelor sunt sugestive pentru diagnosticul de boală autoimună.
Determinarea antigenelor leucocitare (HLA). Antigenele de histocompatibilitate reprezintă amprenta
genetică a individului, exprimată pe toate celulele organismului, dar cu densitate maximă pe suprafaţa
leucocitelor.
Antigenele HLA fac parte din complexul major de histocompatibilitate (CMH), fiind definite ca un ansamblu
de gene existente pe braţul scurt al cromozomului 6 la om şi pe cromozomul 17 la şoarece, ele fiind
implicate în unele aspecte majore ale răspunsului imun.
Determinarea antigenelor HLA a cunoscut o dezvoltare rapidă, datorită rolului său în transplantarea de
organe şi ţesuturi, în compatibilitatea transfuzională, corelarea cu diferite boli, teste de paternitate. Aceste
antigene au rol determinant în respingerea allogrefelor, prin mecanisme similare celor ce determină liza
leucocitară şi plachetară, transfuzate la primitori imunizaţi.
Au fost identificate relaţii strânse între anumite afecţiuni şi anumite grupe HLA (HLA B27 - spondilita
ankilopoetică). Antigenele HLA au implicaţii majore în răspunsul imun, fiind capabile să moduleze răspunsul
faţă de antigenele străine.
În cunoaşterea acestui sistem polimorf de antigene, se aplică metode serologice (tehnica de
limfocitotoxicitate), studii biochimice (tehnici de electroforeză în gel) şi celulare. Actual, tehnicile de biologie
moleculară sunt din ce în ce mai des utilizate, ele confirmând tehnicile folosite ulterior şi oferiind o nouă
perspectivă asupra polimorfismului acestui grup de gene.

104
Explorarea computerizată a sângelui periferic şi a măduvei osoase hematogene
Tehnica actuală a permis crearea unor aparate care, prin tehnica fluxului continuu,
efectuează măsurători rapide pe un număr mare de celule. Se pot efectua măsurători
clasice: numărătoarea eritrocitelor, leucocitelor, trombocitelor, dozarea Hb, a Ht, VEM,
CHEM, HEM, alături de formula leucocitară, volumul plachetar mediu. Diferitele categorii
de leucocite sunt clasate, după criterii citochimice şi optice, ţinând seama de activitatea
peroxidazică şi de talia celulei. Pot fi detectate anomalii citochimice dintr-o serie de boli în
care sunt implicate leucocitele (sindroamele mieloproliferative), precum şi deficite în
activitatea peroxidazică.
Microscopia fluorescentă foloseşte o substanţă fluorescentă, iar ca sursă luminoasă o lampă U.V. cu
vapori de Hg, permiţând date exacte privind mărimea, forma, constituţia chimică a celulei, detalii ce pot
diferenţia celula normală de cea leucemică.
Microscopia electronică “scranning” evidenţiază în relief, imagini şi componente celulare. Astfel, se poate
urmări arhitectura suprafeţei leucocitelor, permiţând identificarea limfocitelor T şi B, a monocitelor.
Metode citoenzimatice:
- reacţia peroxidazelor. Peroxidazele celulare descompun apa oxigenată şi eliberează oxigenul, care
va oxida benzidina; apare un precipitat galben brun la nivelul granulaţiilor peroxidazo-pozitive din
citoplasmă. Peroxidazele sunt prezente în celulele seriei granulocitare, începând de la mieloblast;
reacţia este slab şi inconstant pozitivă în monocite; limfocitele, eritrocitele şi celulele reticulo-
histiocitare nu conţin peroxidaze, reacţia fiind deci negativă.
- reacţia esterazelor pentru diferenţierea leucemiilor acute monocitare şi granulocitare de cele
limfoide, prin tratarea monocitelor şi granulocitelor cu NaCl.
- determinarea FAL (fosfatazei alcaline leucocitare), o enzimă lizozomală prezentă în neutrofilele
mature; se evidenţiază prin metoda histochimică cu -glicerofosfat.
- determinarea muramidazei leucocitare (lizozimul), crescut în LA monocitară.
- determinarea fosfatazei şi  glucuronidazei specifice limfocitului T.
- determinarea nucleonidazei specifică limfocitului B.
Metode citochimice pentru identificarea substanţelor chimice şi enzimatice din celule cu ajutorul unor reacţii
de culoare.
- reacţia PAS de evidenţiere a glicogenului; apare sub forma unor granule colorate în roşu - purpuriu;
normal seria granulocitară conţine mult glicogen, limfocitele nu conţin glicogen, dar poate să apară
în leucemii. Este o reacţie utilă în diagnosticul leucemiilor acute şi în aprecierea eficacităţii
tratamentului aplicat
- reacţia cu negru Sudan B pentru evidenţierea lipidelor. Granulaţiile sudanofile, negre - verzui, apar
în seria granulocitară odată cu granulaţiile specifice acestei serii. Mieloblaştii au puţine granulaţii
pozitive, iar elementele tinere intermediare şi segmentatele sunt intens pozitive.
- reacţia pentru evidenţierea ADN-ului (reacţia Feulgen) este utilă în studiul eritropoiezei patologice.
ADN-ul apare colorat roşu-violet la nivelul substanţei nucleare: cromatina nucleară, corpi Jolly,
resturi nucleare, umbre nucleare.
- reacţia pentru evidenţierea ADN şi ARN se face cu verde metil-pironină; nucleii (ADN) apar coloraţi
în verde, în timp ce citoplasma şi nucleolii (ARN-ul citoplasmatic şi nucleolar) apar coloraţi roz.
- reacţii de evidenţiere a substanţelor anorganice - reacţia Perls pentru hemosiderină apreciază
rezervele de Fe neheminic şi ajută la diferenţierea anemiilor feriprive (hemosiderină absentă) de
anemiile hipocrome, datorate blocării sintezei hemului (anemii din infecţii, neoplazii, talasemii), în
care Fe neheminic este mult crescut.
Metode citogenetice (determinarea cariotipului). Utilizarea metodelor de bandare a făcut posibilă
identificarea unor anomalii cromozomiale numerice (monosomii, trisomii) sau structurale (cromozomi
markeri) cu caracter sistematizat, în anumite categorii de boli. În bolile hematologice anomaliile
cromozomiale oferă elemente de diagnostic şi de prognostic. În leucemia granulocitară cronică (LGC) apare
cromozomul Ph1 (Philadelphia) rezultat din translocaţia t (9; 22).
Tehnici de biologie moleculară:
- analiza secvenţelor de ADN, prin utilizarea de proprietăţi particulare ale unor enzime bacteriene
numite endonucleaze de restricţie.
- tehnica “Southern blot pentru detectarea în genomul uman a secvenţelor particulare de ADN.
- tehnica “Northern blot” şi “Western blot pentru detectarea secvenţelor specifice de ARN şi a
moleculelor proteice.
- reacţia de polimerizare în lanţ, PCR pentru clonarea unor fragmente de ADN din regiuni selectate
ale genomului.

105