INITIEREA UNEI CULTURI IN VITRO LA DAUCUS CAROTA

•Explante de 0,5-3 cm, prelevate din rădăcina de morcov şi sterilizate prin tratament chimic, se
plasează pe mediul B5, care conţine 0,1 mg/l 2,4D (acidul 2,4 diclorfenoxiacetic).
• Pentru iniţierea culturii se utilizează mediul agarizat. Flacoanele cu mediu şi explante sunt
păstrate la întuneric, în camera de creştere a culturilor, la o temperatură constantă de 23-25°C.

•După aproximativ 20-25 zile, biomasa acumulată, constând din calus, este de 4-5 ori mai
mare decât cea de la care s-a pornit (decât mărimea explantului).

•Pentru a obţine o cultură celulară în suspensie, calusul din 2-3 flacoane se transferă în 100 ml
mediu lichid (cu aceeaşi compoziţie ca cel pe care a fost cultivat explantul), într-un flacon de
500 ml. Flaconul se plasează pe un agitator, cu 150 rot/min, la 25° C şi lumină continuă. După
5-7 zile, se înlocuieste mediul uzat cu mediu proaspăt, permiţând o subcultură continuă. O
bună cultură celulară (o suspensie celulară care să aibă nivelul calitativ dorit), se obţine după
4-6 săptămâni. In primele faze de dezvoltare, adică în primele 1-2 săptămâni, este posibilă
înlocuirea a 1/2 sau chiar a numai 1/4 din mediul de cultură uzat cu unul proaspăt.
• In principiu, metodologia utilizată pentru morcov poate fi adaptată, cu unele modificări şi
la alte specii.
• In cazul în care dorim să obţinem culturi celulare de mazăre, putem utiliza explante din
rădăcini sau lăstari. Este indicată suplimentarea mediului de cultură (formula de bază B5) cu 2
g hidrolizat de cazeină şi 1 mg/l 2,4 D (acidul 2,4 diclorfenoxiacetic). Cu toate acestea calusarea
este înceată şi pot fi necesare şi două luni pentru a iniţia o cultură (suspensie celulară). Pentru
grâu, secară şi porumb, calusul se obţine la întuneric, din explante de rădăcină, pe mediu
de formula B5 suplimentat cu 1 mg/l 2,4 D (acidul 2,4 diclorfenoxiacetic).

• 1.EMBRIOGENEZA SOMATICA IN SUSPENSII CELULARE DE DAUCUS CAROTA

• Iniţierea suspensiei celulare din calus de DAUCUS CAROTA

• Materiale si reactivi:

• -rădăcini de morcov;
• -soluţie de NaOCl 3%;
• -apă distilată sterilă;
• -mediul B5 (agarizat şi lichid);
• -bisturiu, spatulă, sită metalică;
Materialul vegetal

•Rădăcina tuberizată de Daucus carota, reprezintă materialul ideal pentru iniţierea

calusului şi, apoi a suspensiilor celulare. Este indicat să se preleve explante din zona
cambială a rădăcinii. Acestea se vor plasa pe mediul nutritiv în care este prezentă o
auxină, de obicei 2,4 D (acidul 2,4 diclorfenoxiacetic). In timp foarte scurt, pe suprafaţa
explantului, apar zone cu intensă diviziune mitotică. Ulterior întregul explant se transformă
într-o masă omogenă de calus. Acesta constituie punctul de plecare pentru iniţierea
suspensiei celulare. Calusul se repartizează conform indicaţiilor date în paginile anterioare,
în flacoanele cu mediu lichid.

•După aproximativ o săptămână de incubare în mediu lichid, în condiţii de agitare,

materialul vegetal este transferat pe mediu proaspat cu ajutorul unei site metalice. Este
indicat, ca la fiecare subcultivare (transfer pe mediu proaspăt), să se procedeze la o
examinare microscopică, pentru stabilirea gradului de viabilitate şi sterilitate a materialului
vegetal.
Inducerea embriogenezei somatice

•Neoformarea embrionilor este posibilă printr-o frecventă repicare a ţesuturilor cu

creştere activă, pe medii cu auxină, apoi transferul inoculilor pe mediu fără auxină.
Metoda este utilizată frecvent, atât pentru obţinerea de embrioni somatici, cât şi pentru
inducerea organogenezei. Un aspect deosebit de important, în acest context, îl constituie
creşterea procentului de embrioni.
•S-a constatat că o plasmolizare puternică, dar de scurtă durată a celulelor în
suspensie (45 de minute, într-o soluţie 1 % zaharoza), a indus o creştere de peste 3
ori a frecvenţei embrionilor somatici, în mediul lipsit de auxină. Se apreciază că
plasmoliza determină întreruperea comunicărilor intercelulare la nivelul agragatelor. In
acest mod, plasmodesmele intercelulare se întrerup şi celulele devin izolate,
situaţie care favorizează declanşarea dezvoltării independente, adică generarea de
embrioni somatici.
•In cazul concret, al speciei Daucus carota, potenţialul embriogen optim este atins după
aproximativ 15 săptămâni de la iniţierea culturii. Potenţialul embriogen descreşte, în
condiţiile prelungirii duratei de cultivare. Sunt 3 ipoteze care explică pierderea acestui
potenţial şi anume:
•-cauze de ordin citogenetic - poliploidia, aneuploidie;
•-cauze fiziologice - alterări ale echilibrului hormonal, sensibilizări celulare la acţiunea
unor factori exogeni (habituaţie). Este situaţia în care se poate produce o blocare a
diferenţierii, fără a se pierde potenţialitatea;
• -cauze combinate, decurgând din sensibilizarea culturii în prezenţa auxinei, cât şi din
creşterea ratei diviziunii celulelor neembriogene concomitent cu prelungirea duratei
de cultură. In mod practic se produce o "competiţie" între celulele neembriogene şi
cele embriogene, care devin din ce in ce mai rare.

• Embriogeneza somatică la Daucus carota, s-au evidenţiat 4 etape ale diferenţierii şi

anume:

• -faza de creştere izodiametrică, caracterizată printr-o diviziune neorientată a celulelor

(când se ajunge la stadiul globular);
• -imprimarea treptată a caracterului de polaritate, faza de distribuire polarizată a
esterazelor (reacţie pusă în evidenţă prin metode histochimice);
• -polaritate progresivă, caracterizată prin diviziuni celulare orientate, când se formează
cotiledoanele şi apexul rădăcinii, apoi se demarchează meristemul apical al tulpinii
(stadiul cordiform şi torpedo);
• -creşterea bipolară, în care meristemele apicale (radicular şi caulinar) se constituie şi
sunt apte de a intra în diviziune.
Embrioni somatici de citrice: a) în stadiul globular,
b) în stadiul cordiform, c) generând o plantulă
Studiile histo-anatomice au reliefat faptul că atât în calus cât şi în suspensii celulare se pot
distinge două categorii de celule:

-celule mari, cu vacuolă mare, lipsite de potenţial embriogenic;

-celule mici, cu citoplasmă densă, aglomerate într-un fel de noduli (noduli embriogeni)
care, la rândul lor, conţin două categorii de celule:

•a.celule centrale, cu o singură vacuolă mare şi nuclei mici, compacţi, număr redus de
amiloplaste şi activitate dehidrogenazică scăzută;
•b.celule meristematice, grupate la periferia nodulilor embriogeni, cu vacuole puţine, cu
nuclei mari, citoplasma densă şi ribozomi numeroşi, intensă activitate dehidrogenazică,
conţinut bogat de ARN şi proteine.
•Pe măsură ce calusul se acumulează se poate observa dezorganizarea nodulilor
embriogenici. Celulele meristematice disociate sunt reagregate în grupuri, ce pot genera
noi centri embriogenici, deci noi noduli.

Dacă grupurile de celule meristematice, apărute în subcultură, vor fi separate şi

transferate pe medii de cultură fără auxină, în zonele lor periferice se vor forma mulţi
embrioni.
Stages of in vitro propagation of Centella asiatica (A) Callus formation, (B)
Callus elongation, (C) Shoot regeneration and (D) Root regeneration.
Centella asiatica (Lucky Leaves)