CURS VIII

CONSERVAREA RESURSELOR GENETICE VEGETALE

CONSERVAREA „IN VITRO” A GERMOPLASMEI

Metodele de conservare „in vitro” la plante vizează o diminuare sau chiar o stopare
temporară a proceselor vitale, cu menţinerea nealterată a zestrei ereditare a inoculilor stocaţi.
Inoculii cultivaţi pe medii aseptice (meristeme, apexuri, embrioni, calus, plantule,
celule, protoplaşi) pot fi conservaţi într-o anumită stare morfofiziologică, cu reluarea activităţii
regenerative, după trecerea lor în condiţii normale, prin aplicarea a mai multor tipuri de tehnici
şi anume:
1) - Conservare la frig, crioconservare, criostocare;
2) - Conservare în condiţii care să imprime inoculilor o creştere lentă;
3) - Creşterea inoculilor în presiune atmosferică scăzută (hipooxic).

1. Crioconservarea
Prin crioconservare se are în vedere o oprire prin îngheţare sau prin frig a
metabolismului, a funcţionalităţii celulare şi a realizării schimburilor dintre celulă şi mediu,
precum şi a celor endocelulare.
Crioconservarea materialelor vegetale, cu păstrarea nealterată a viabilităţii, respectiv
cu asigurarea reluării totale a funcţiilor vitale după dezgheţ, se practică în diferite scopuri.
Crioconservarea materialului biologic vegetal, cultivat „in vitro” prezintă numeroase
avantaje:
a) - posibilitatea stocării, într-un spaţiu mic, a unui număr mare de indivizi, fără a
exista pericolul de contaminare a lor cu agenţi fitopatogeni sau dăunători animali. Materialul
vegetal criostocat poate servi oricând ca material iniţial de propagare extrem de rapidă a
clonelor criostocate. Se poate conserva integral, nealterată, zestrea genetică.
b) - păstrarea inoculilor la temperaturi foarte scăzute poate fi făcută teoretic, pe
timp nelimitat.
c) - inoculii cultivaţi „in vitro” pot fi transportaţi cu uşurinţă de la o ţară la alta,
evitându-se restricţiile impuse de către carantinele fitosanitare (fiind liberi de orice tip de
germeni, cu certificat de sănătate).
Protejarea corespunzătoare a celulelor împotriva daunelor criogenetice prezintă o
foarte mare importanţă. Îngheţarea şi dezgheţarea pot produce distrugeri prin:
- formarea de cristale de gheaţă mari, în interiorul celulelor, fapt care poate
provoca ruperea organitelor celulare sau sfâşierea întregii celule;
- creşterea concentraţiei soluţiilor în interiorul celulelor, pe măsura îngheţării
acestora, prin pierderea treptată a apei din structurile celulare, ceea ce produce o ridicare a
gradului de nocivitate a corpusculilor prezenţi în celulă, mediul endocelular devenind toxic.
Pentru protejarea celulelor împotriva daunelor provocate de câtre congelări (îngheţ)
se adaugă extracelular substanţe numite crioprotectori.
Crioprotectorii micşoreză mărimea cristalelor de gheaţă şi diminuează acţiunea
negativă determinată de concentrarea soluţiilor endo şi extracelulare.
Prin protejarea corectă a ţesuturilor, cu crioprotectori, cristalele de gheaţă formate
endocelular sunt foarte mici, iar membranele celulare, biostructurile şi organitele, rămân
intacte.
 În general criprotectorii trebuie să aibă un grad mare de solubilitate şi o toxicitate
scăzută, să fie uşor permeabil în celule. De obicei substanţele crioprotectoare se dizolvă în
mediul de cultură.
Substanţele folosite frecvent: dimetilsulfoxidul (5-8%), glicerolul (10-20%), manitolul,
sorbitolul, polietilenglicol. Se recomandă adăugarea crioprotectorilor în mod gradat, în
decursul a 30-60 min, pentru a proteja celulele de şocul osmotic.
Păstrarea viabilităţii celulelor este asigurată, în mai mare măsură, atunci când se
foloseşte un amestec de crioprotectori, sau un amestec de crioprotectori cu glucide
(zaharoză), cu sorbitol, sau cu manitol.

Tipuri de criostocare
Sensibilitatea celulelor plantelor la temperaturi scăzute variază în funcţie de specie şi
natura ţesutului.
Modul de preparare al inoculilor în vederea criostocării depinde de natura materialului
vegetal, de starea morfofiziologică a acestuia, de tipul de criostocare ales.
În principal există trei modalităţi de conservare prin frig a materialului biologic inoculat
„in vitro”.
1) criostocarea pe termen lung, la temperaturi scăzute (-196o);
2) criostocare pe termen scurt, la temperaturi de -70-100o ;
3) criostocare temporară, la temperaturi coborâte, dar pozitive (1-9o).
La temperatura azotului lichid activitatea vitală a celulelor este complet blocată,
reacţiile metabolice fiind stopate.
În ultimii ani, numeroase tipuri de inoculi au fost stocate în azot lichid, cu conservarea
deplină a viabilităţii celulare şi cu păstrarea totipotenţialităţii, adică a capacităţii regenerative
de organogeneză şi de embriogeneză somatică.
Conservarea materialului biologic în azot lichid se poate face pe o durată de timp
teoretic nelimitată (având grijă să nu scadă cantitatea de azot lichid din recipientele de
stocare, care trebuie completat periodic).

Metode de criostocare
1) Metoda ultrarapidă de răcire şi de congelare
Seibert (1976) a demonstrat posibilitatea stocării în azot lichid a fragmentelor detaşate
din tulpini de garoafe, tehnica constând în turnarea azotului lichid peste inoculi, după care
recipientele cu inoculi meristematici sunt depozitate în rezervoare speciale conţinând azot
lichid.
Între temperatura de -10 şi -70oC, rata de răcire a explantelor este de 100oC/ min.
Congelarea ultrarapidă împiedică formarea gheţii în celule. Metoda îngheţării ultrarapide se
practică la numeroase specii, îndeosebi la meristemele de garoafe, de cartof, etc.
2) Metoda frigului lent – presupune o îngheţare treptată a materialului vegetal, cu o
rată de răcire variabilă, cel mai des utilizată fiind cea de 0,5 -1 oC/min. Rata de răcire se
aplică până la temperatura de -100oC după care materialul este plonjat direct în azot lichid.
Această tehnică depinde de mai mulţi factori şi anume: rata de răcire; pretratamente şi
folosirea crioprotectorilor; tipul şi stadiul fiziologic în care se află materilul vegetal.
Seibert (1977) a arătat că meristemele de garoafe trebuie congelate cu o rată de
minimum 50 oC/ min.
Sakai (1980) a observat că plonjarea directă a fragmentelor de tulpini de garoafă în
azot lichid nu asigură o supravieţuire corespunzătoare a materialului biologic. În cazul în care
fragmentele au fost îngheţate gradat, până la temperatura azotului lichid s-a realizat
conservarea integrală a capacităţii regenerative a celulelor.
 3) Metoda de stocare la frig, la temperaturi scăzute pozitive (1-9oC)
În condiţiile stocării la frig, fără congelare, procesele vitale sunt mult încetinite, dar nu
sunt stopate complet. De aceea este necesară operarea unor subculturi periodice pentru
reîmprospătarea calităţilor mediilor de cultură.
Bannier şi Steponkus (1976) au realizat un experiment referitor la stocarea calusului
de Chrysanthemum morifolium, pe un mediu de cultură îmbogăţit cu 10% zaharoză, peste 28
de zile, la 3,5oC.
Călirea plantelor la frig, înainte de a explanta meristemele şi de a criostoca este
necesară. Astfel, meristemele de garoafe, prelevate de la plante ţinute la 4 oC - cel puţin trei
zile după crioconservare au regenerat în procent de 100% (Seibert şi Wetherbee,1977).
Un rol important îl are durata de timp scursă din momentul inoculării şi până în
momentul criostocării. Această perioadă de timp trebuie să fie scurtă, dar atât cât este
necesară pentru vindecarea suprafeţelor rănite, în cursul preluării şi fasonării explantelor.
În general s-a constatat că este mai uşor de realizat crioconservarea celulelor izolate
sau chiar a protoplaştilor în comparaţie cu cea a meristemelor apexurilor sau a calusului.
Dezgheţarea
Dezgheţarea inoculilor se face brusc, prin cufundarea recipientelor scoase din
condiţiile de criostocare direct în baia de apă, la 40 oC, timp de 1-2 min.
Încă nu este cunoscută şi înţeleasă în totalitate starea fiziologică care se instalează
după dezgheţarea celulelor, precum şi efectele +/- exercitate de către factorii de mediu, la
inoculii dezgheţaţi.
Practic nu se poate obţine un procent de regenerare egal cu cel care se referă la
supravieţuirea inoculilor după dezgheţ. De exemplu, Seibert şi Wetherbee au arătat în 1977,
că la garoafe 90% din meristeme supravieţuiesc la o săptămână după dezgheţ, dar numai
cca. 70% dintre acestea generează plante. Când procentul de supravieţuire a fost mai mic de
60%, au fost obţinute în final numai 17% plante regenerate.
Stocarea la frig prezintă o mare importanţă în pepinierele industriale (create pentru
culturile „in vitro”) care utilizează tehnici de micropropagare şi de producere în condiţii
aseptice a materialului săditor.
Astfel, pentru perioade mai lungi sau mai scurte de timp, plantele stocate în camere
frigorifice pot fi distribuite pe piaţă în funcţie de cerere, existând astfel posibilitatea de a pune
la dispoziţia consumatorilor cantităţi mari de plante, care în mod normal sunt imposibil de
obţinut prin tehnicile tradiţionale.

2) Conservarea inoculilor prin impunerea unor condiţii de creştere lentă

Creşterea lentă este o altă metodă de conservare a inoculilor cultivaţi „in vitro”, care
însă este mai puţin practicată. În principal, se are în vedere menţinerea culturilor în condiţii
limită de temperatură (1-4oC sau peste 26oC), folosind o presiune scăzută a O2 în recipiente
şi prin administrarea unor tratamente fitohormonale speciale.
Această tehnică poate fi comparată cu metoda tradiţională japoneză Bonsai, de
creştere a arborilor în vase mici, limitate ca volum, procesele de dezvoltare fiind frânate prin
combinarea în aşa fel a condiţiilor ambientale, astfel încât să se producă o reducere la
minimum a creşterii.
La crizanteme au fost stocaţi minibutaşi, formaţi din câte un nod împreună cu frunza
aferentă la temperatura de 6-7oC la întuneric.
După trei zile de la inoculare au fost trecuţi în regim de creştere lentă. După stocarea
lor la frig timp de 2-3 luni, aceştia au fost transferaţi la lumină, la temperatura de 25 oC şi s-a
urmărit capacitatea lor regenerativă.
Procentul de regenerare a fost de 75%, iar regenerarea s-a produs fără formare de
calus, de la nivelul muguraşului situat la axila frunzuliţei.
 3) Conservarea inoculilor prin creşterea acestora în presiune atmosferică
scăzută sau în lipsă de oxigen (hipooxie)
Metoda presupune coborârea presiunii atmosferice în jurul ţesuturilor cultivate „in
vitro”, printr-o scădere a presiunii parţiale a tuturor gazelor atmosferei din recipientele de
cultură, respectiv a aerului cu care este în contact materialul vegetal.
Conservarea materialelor biologice la presiune scăzută se practică în cazul
alimentelor, florilor, butaşilor, etc.
O altă metodă de conservare a plantelor „in vitro” constă în scăderea parţială numai a
oxigenului (hipooxic), înlocuind O2 cu un gaz inert, de exemplu azot. Scăderea parţială a
presiunii oxigenului, în jur de 50 mm Hg în recipientele de cultură, determină o reducere a
creşterii.
După reluarea creşterii în condiţii normale, nu s-a observat nici o modificare fenotipică,
plantele diferenţiate din inoculi ajungând la o maturitate completă.
4) - Deshidratarea inoculilor, la limita de supravieţuire;DE ADAUGAT