UNIVERSITATEA „AL. I.

CUZA”
FACULTATEA DE BIOLOGIE
PROGRAMUL DE INVĂŢĂMÂNT LA DISTANŢĂ

CULTURI IN VITRO

LUCRARI PRACTICE
Smaranda Vantu
 CUPRINS
INTRODUCERE…………………………………………………………………………3
LUCRAREA 1
IMPLICAŢII TEORETICE ŞI APLICATIVE ALE CULTURILOR “IN VITRO”……5
LUCRAREA 2
PRINCIPALELE TIPURI DE CULTURI IN VITRO………………………………….10
LUCRAREA 3
INITIEREA UNEI CULTURI IN VITRO LA DAUCUS CAROTA…………………..12
LUCRAREA 4
INDUCEREA ORGANOGENEZEI IN CULTURI DE CALUS DE
PAPAVER SOMNIFERUM…………………………………………………………….14
LUCRAREA 5
IZOLAREAŞI CULTIVAREA PROTOPLASTILOR
LA PAPAVER SOMNIFERUM………………………………………………………...15
LUCRAREA 6
DETERMINAREA CALITATIVĂ A ALCALOIZILOR IN
SUSPENSII CELULARE DE PAPAVER SOMNIFERUM
PRIN METODA CROMATOGRAFIEI IN STRAT SUBŢIRE………………………..18
LUCRAREA 7
METODE DE OBTINERE A PLANTELOR HAPLOIDE…………………………….21
LUCRAREA 8
CULTURA IN VITRO DE ENDOSPERM SI EMBRIONI…………………………… 24
LUCRAREA 9
CULTURA IN VITRO DE MERISTEME………………………………………………26
LUCRAREA 10
METODE CITOLOGICE SI HISTOLOGICE DE
ANALIZA A MATERIALULUI VEGETAL CULTIVAT “IN VITRO”………………...27
BIBLIOGRAFIE………………………………………………………………………….29

2
 INTRODUCERE
Legităţile în conformitate cu care se derulează procesele biologice, cu întreaga lor amplitudine
de variabilitate, au suscitat interesul şi au polarizat atenţia investigatorilor din toate timpurile.
Treptat dar temeinic, s-a ajuns la concluzia că viaţa nu reprezintă doar un specific, un stadiu
superior în evoluţia materiei universale, ci un fenomen aparte. Altfel spus viaţa este şi altceva decât
materie.
In ultimele decenii, prin investigaţii, experimente şi observaţii de mare complexitate s-au putut descifra
unele dintre caracteristicile specifice vieţii.
S-a definitivat, astfel, concepţia în conformitate cu care, în contextul materiei vii, un rol de prim
ordin revine informaţiei.
Concomitent s-a conchis că informaţia unui sistem este dependentă de gradul de organizare
internă a acestuia, de nivelul pe care-l atinge integrarea şi interconexarea părţilor componente. S-a
definitivat, astfel, concepţia heterogenităţii interne optime, ca precondiţie a asigurării integralităţii
maxime şi a conţinutului informaţional maxim.
Dar, spre a surprinde cât mai multe din intimităţile structurale şi funcţionale ale unui sistem viu,
metodologiile şi aparatura clasică s-au dovedit insuficiente şi, deci, ineficiente. Se impunea, ca o
necesitate stringentă, disocierea unui sistem viu in parţile sale componente, dar cu posibilitatea
reasocierii lor, concomitent cu modelarea şi simularea structurală şi funcţională a întregului şi a părţilor
componente.
Disocierea unui sistem din etapa individuală de organizare a materiei vii, de pildă, în
subsistemele componente - celule în cazul de faţă, a permis redarea tuturor gradelor de libertate
celulelor şi cunoaşterea comportamentului lor în noua ipostază (căci nu se pot compara celulele
reprezentând indivizi unicelulari cu celulele "eliberate" dintr-un individ pluricelular), cât şi comportarea
individului în procesul pierderii integralităţii (dediferenţierea tisulară, celulară) sau în cel al reconstituirii
integralităţii (rediferenţierea urmată de organogeneză sau embriogeneză).
Deci, fără a face o demonstraţie pro domo şi fără a prezenta o listă a problematicii aferente, am
subliniat cauzele care explică, măcar parţial, apariţia noului şi modernului domeniu de investigaţii
biologice - CULTURILE IN VITRO.
Funcţie de nivelul asupra căruia se exercită intervenţia, biotehnologiile se aplică la nivelul
organismelor întregi, organelor, ţesuturilor, celulelor sau chiar la nivel molecular.
Utilitatea culturilor de celule şi ţesuturi se poate remarca prin posibilităţile pe care le oferă în
studiul şi valorificarea abaterilor comportamentale ale celulelor, prin fenomenele cu totul particulare
care apar în condiţiile cultivării "in vitro". Biotehnologia - noţiune complexă, reflectând un domeniu
concret al activităţii umane, defineşte ansamblul tehnologiilor neconvenţionale şi nepoluante de
producere a unor substanţe utile, prin utilizarea intensivă a potenţialului genotipic al organismelor vii,
fenotipizat în capacităţi fiziologo-biochimice de sinteză, biotransformare, degradare, fermentaţie etc. In
fond, totalitatea activităţilor umane din agricultură, industria alimentară, zootehnie, farmacie, cosmetică,
presupune aplicaţii ale metodelor biotehnologice soldate cu obţinerea de alcooli, principii active
medicamentoase, substanţe cu rol alimentar, coloranţi.
In acest context, culturilor in vitro le revine un rol de prim ordin şi li se intrevăd şi implicaţii
teoretice dintre cele mai profunde.
Rolul şi implicaţiile practice ale culturilor "in vitro" pot fi redate schematic astfel:

3
 CULTURI IN VITRO LA PLANTELE SUPERIOARE

MICROPROPAGARE CREARE DE NOI GENOTIPURI MULTIPLICARE

embrioni mutageneză calus
organe hibridare somatică celule
ţesuturi inginerie genetică protoplaşti
celule embrioni somatici
protoplaşti
embrioni somatici
M R M B
U E U I
L G L O
T E T T
I N I R
P E P A
L R L N
I A I S
C R C F
A E A O
R R R
E E M
A
C R
E E
L
U
L
A
R
Ă

CLONAREA ŞI GENERAREA DE PLANTE SĂNĂTOASE

PLANTE REGENERATE

MATERIALE NECONVENŢIONALE

4
 LUCRAREA 1
1. IMPLICAŢII TEORETICE ŞI APLICATIVE ALE CULTURILOR IN VITRO
Încă de la debutul cercetărilor din domeniul culturilor in vitro s-a întrezărit posibilitatea utilizării
lor pentru multiplicarea unor soiuri sau chiar indivizi, cu calităţi productive de excepţie.
Primele încercări în acest sens, au fost efectuate de Morel în 1963 la specii de Cymbidium
(orhidee). In orice caz, necesităţile horticulturii au impus folosirea pe scară largă a acestei metode şi
aici s-au obţinut cele mai multe şi valoroase rezultate.
Prin culturile de meristeme radiculare, caulinare sau din muguri axilari, urmată de regenerare s-
au obţinut plante identice cu planta donatoare - adică multiplicarea masivă a unui anumit individ
valoros.
La inceput s-a recurs la micropropagarea unor clone de orhidee, apoi metoda s-a extins şi
asupra altor specii ornamentale : Begonia, Chrysanthemum, Gerbera. In prezent există cca 200 specii
la care se poate asigura multiplicarea şi propagarea prin metoda culturilor "in vitro". Principala
problemă care a fost rezolvată prin această metodă este obţinerea într-un ritm cât mai rapid, la un preţ
cât mai scăzut a unor copii conforme cu planta donatoare (clonarea), deci menţinerea calităţilor
genotipului supus micromultiplicării, parametrii imposibil de atins prin metodele tradiţionale. La pomii
fructiferi introducerea unui nou soi în cultură, prin practicile tradiţionale, presupunea o durată de câţiva
ani, în timp ce prin micropropagare se realizează o scurtare considerabilă a perioadei de formare a
unui stoc de plante (Morel, 1962).
Este cunoscut faptul că, prin metodele clasice de înmulţire vegetativă există neajunsul de a
vehicula din planta donatoare de material de inmulţire, către planta nou formată o serie de boli, astfel
încât planta nou formată este chiar de la inceputul vieţii tarată de prezenţa germenilor fitopatogeni.
Tehnica culturilor de meristeme, în scopul devirozării a fost pusă la punct, încă din 1962 de către Morel
şi Martin.
O altă pistă pe care se dezvoltă cu succes cercetările şi aplicaţiile, este aceea a "haploidiei",
adică a culturii de antere, polen, ovule. Pe această cale se pot produce plante haploide şi, ulterior, prin
diploidizarea lor, se obţin indivizi perfect homozigoţi (linii izogene). Pe această direcţie, sunt rezultate
notabile la cartof, tutun, orez.
Plantele haploide se obţin fie pornindu-se de la cultura de polen, fie de la cea de antere.
Evident, că prima pistă este mult mai eficientă în rata de apariţie a haploizilor.
De asemenea, prin culturile in vitro, se constată o revigorare a cercetărilor ce au ca scop
obţinerea de mutante cu certe valori practice. In timp s-au obţinut şi selecţionat mutante deosebit de
valoroase la cartof (caracterizate prin rezistenţa la atacul cu Phytophtora infestans), la sfecla de zahăr
(cu rezistenţa la atacul unor virusuri), mutante auxotrofe (cele ce nu se pot dezvolta pe medii
minimale).
O direcţie relativ recentă dar deosebit de promiţătoare şi modernă totodată, este aceea a
crioconservării (cunoscută şi sub numele de crioprezervare).
Unele linii celulare sau chiar indivizi, care prezintă valoare (fie teoretică, fie aplicativă), nu pot fi
păstrate un timp prea lung ca atare şi nici nu pot fi stocate în stadiul de sămânţă. Fiind foarte utile
pentru bancile de gene şi indispensabile pentru iniţierea unor investigaţii ulterioare, ele sunt conservate
ca atare, prin menţinerea la temperaturi scăzute. La ora actuală sunt puse la punct metode pentru
crioprezervarea protoplaştilor, celulelor sau meristemelor.
Tentativele de manipulare a materialului genetic având ca ţel final obţinerea de noi genotipuri,
şi-au găsit în metoda culturilor "in vitro" un teren extrem de productiv. Incadrate sub genericul de
inginerie genetică, respectivele cercetări vizează, în principal, transferarea unor gene de la un individ la
altul, cei doi indivizi aparţinând la aceeaşi specie, la specii diferite din acelaşi gen sau chiar la genuri
diferite.
Pentru ca scopul sa fie atins se impun doua condiţii şi anume:
- gena ce urmează a fi transferată trebuie să poată fi integrată în genotipul gazdei;
- gena transferată şi integrată în noul genotip trebuie să fie functională, adică să fie aptă de a
asigura transcripţia şi translaţia informaţiei pe care o conţine.

5
 In contextul acestui proces un rol de prim ordin îi revine vectorului. In majoritatea cazurilor,
drept vectori genici s-au utilizat plasmidele Ti, din Agrobacterium tumefaciens sau virusul mozaicului
tutunului.
Cu utilitate practică imediată este tentativa de a asigura producerea substanţelor biologic
active, în special din categoria metaboliţilor secundari, prin metoda culturilor "in vitro".
Se ştie că plantele sunt un izvor nesecat de produşi alcaloidici, terpenici, glicozidici, vitamine ,
hormoni, produşi cu largă utilizare în farmacie, cosmetică sau pur şi simplu în alimentaţie. In cazul
plantelor intacte, acumularea unor astfel de substanţe este asigurată de prezenţa unor ţesuturi sau
organe specializate. De pildă, chinina se acumulează în scoarţa plantelor (din specii de Cinchona). In
cazul culturii de celule sau ţesuturi in vitro acest lucru nu mai este posibil. In plus, prin cultura in vitro,
cu timpul celulele îşi pierd capacitatea biosintetică pe care o etalau în cazul individului integral. Pe de
altă parte însă, în cazul culturii in vitro se poate exercita o presiune selectivă eficientă, succesiunea
generaţiilor fiind mult mai rapidă (comparativ cu succesiunea indivizilor in vivo). Se cunosc deja
exemple în care, prin selecţie, s-au obţinut cantităţi suficient de mari de substanţe utile (comparabile,
ca preţ de cost, cu cele din vivo).
In acest sens putem cita producerea de acid rosmarinic şi antrachinona (Zenk şi colab, 1975-
1977). In Japonia se produce ubiquinona, medicament folosit în tratamentul bolilor de inimă, prin
cultivarea unor linii celulare de Nicotiana tabacum, în bioreactoare de mare capacitate (Ikuta şi colab,
1976).
Un alt aspect, deosebit de promiţător, al culturilor "in vitro" îl constituie realizarea
biotransformării unor compuşi cu utilitate practică. Spre exemplu, s-a asigurat obţinerea metil-digoxinei
din metil-digitoxina, prin hidroxilare, în culturi de Digitalis lanata (Reinhard şi Alferman, 1980).
In sfârşit, dar nu în ultimul rând, culturile in vitro prezintă un mare interes şi deosebită
importanţă pentru biologia teoretică. De la cercetările din acest domeniu se aşteaptă elucidarea unor
aspecte privind procesele fiziologo-biochimice la nivel celular, diviziunea celulară, diferenţierea
celulară, rolul fitohormonilor, totipotenţa celulară. Prin investigaţii asupra protoplaştilor se aşteaptă
elucidarea unor probleme vizând formarea pereţilor celulari.
Evident,toate acestea reprezintă doar o parte din problematica pe care o incumbă abordarea
studiilor pe culturi de celule, ţesuturi sau organe.

1.1. RECOMANDARI PRIVIND CONDITIILE DE LUCRU, SUBSTANTELE SI

APARATURA NECESARE PENTRU INITIEREA CULTURILOR IN VITRO

In vitro, tradus ad literam, înseamna în sticlă. Prin urmare, orice cultură artificială de organe,
ţesuturi sau celule, realizată în condiţii de asepsie totală, pe medii nutritive adecvate, în vase de sticlă
(cutii Petri, baloane Erlenmeyer), reprezintă o cultură "in vitro". Se impune, deci o precizare: cultura de
organe, ţesuturi sau celule nu se poate realiza decât "in vitro" (cu toate condiţiile menţionate), fapt
pentru care expresia cultura de celule in vitro este o sinonimie ce trebuie evitată.
Asigurarea asepsiei totale se impune ca o condiţie sine qua non deoarece atât explantele, cât
şi mediul nutritiv, sunt surse şi condiţii propice dezvoltării bacteriilor, virusurilor, ciupercilor.
Prin urmare atât sursa de material vegetal, din care se vor preleva eşantioane, pentru
experimente, cât şi recipientele de sticlă cu mediul nutritiv, trebuiesc supuse unei pregătiri speciale şi
anume sterilizarea. Deci, fără a pretinde o succesiune strictă a operaţiunilor (fiecare persoană poate
lucra într-o concepţie proprie) se impun următoarele operaţiuni:

a. Pregătirea sticlăriei şi a instrumentarului

Intr-un laborator de culturi de celule şi ţesuturi se pot utiliza toate tipurile de recipiente din sticlă.
Vasele cu capacitate de 1-2 l sunt necesare in prepararea mediilor de cultură. Flacoanele Erlenmeyer
de diferite capacităţi (50, 100, 150, 200, 500 ml) servesc ca recipiente de cultură. Acestea vor fi bine
spălate şi uscate în etuvă. Flacoanele astfel pregătite vor fi obturate cu dopuri de vată, înfăşurate cu
tifon.

6
 In tehnicile de culturi in vitro se lucrează cu instrumentar de tip chirurgical : pense, bisturie,
spatule. Ele sunt sterilizate prin autoclavare înainte de folosire.

b. Prepararea mediului de cultură şi sterilizarea prin autoclavare .

Pentru mai multă siguranţă şi mai puţine operaţiuni, recomandăm repartizarea mediului în
vasele de cultură imediat după preparare şi sterilizarea (autoclavarea) în respectivele vase. Alţi autori
recomandă sterilizarea mediului ca atare, concomitent sau succesiv cu a vaselor, în care va fi
repartizat ulterior, în boxa cu flux laminar. Alteori, se recomandă sterilizarea mediului, repartizarea în
vasele de cultură, si, apoi, resterilizarea. Nu suntem adepţii acestui mod de lucru, deoarece prin
sterilizări repetate se provoacă alterări calitative ale vitaminelor, fitohormonilor şi chiar ale glucidelor
folosite în compoziţia mediului.

c. Prelevarea şi sterilizarea explantelor

Sterilizarea explantelor se efectuează, de obicei cu agenţi chimici de tipul hipoloritului de sodiu

sau calciu (soluţie 3%-4%. Durata tratamentului variază în funcţie de specia luată în studiu sau de
originea explantului (epiderma, mezofil, ţesut palisadic). Când este posibil se recomandă obţinerea de
plante sterilizate, prin germinarea de seminţe sterilizate în hipoclorit de sodiu de concentraţie 4% timp
de 10-12 minute,pe hârtie de filtru, de asemenea sterilizată, plasată în flacoane Erlenmeyer sau cutii
Petri.
Plantulele astfel obţinute pot fi plasate ca atare pe mediul de cultură, sau de la caz la caz,pot fi
separate în hipocotil şi cotiledoane, pot servi pentru obţinerea oricărui tip de explant. Se impune înca o
menţiune. Uneori este imposibilă obţinerea unui explant steril, pe ambele căi menţionate, infecţia
fungică, bacteriană sau virală fiind adânc penetrată în organismul vegetal sau în întreaga samânţă.
Evident, în respectivele situaţii sterilizarea ca proces nu mai are nici un efect. Totuşi, pentru obţinerea
de calus liber de infecţii există şi în aceste cazuri o cale şi anume - utilizarea explantelor din vârful
meristematic de creştere al tulpinii. In funcţie de tipul de dezinfectant folosit, tipul de tratament, originea
explantului şi mediul de cultură utilizat,se poate vorbi despre o rată de calusare şi o rată de
supravieţuire a calusului.

Modalităţi de asigurare a asepsiei explantelor

Nr.
Tipul explantului Pretratament Sterilizare Postratament
crt.

Etanol(96%) Ca(OCl)10% spălare de 3ori cu apă

1. Seminţe
10sec 10-20 min distilată sterilă

Etanol(96%) spălare cu apă distilată

2. Fructe NaOCl 3%
10sec. sterilă

Etanol(96%) NaOCl 3% spălare cu apă distilată

3. Tulpină
10 sec. 5-30 min. sterilă

Organe de spălare cu apă de NaOCl 3% spălare cu apă distilată

4.
depozitare robinet 10-30 min. sterilă

HgCl2 O,1% spălare de mai multe ori cu

5. Frunze Etanol(96%)
1 min. apă distilată

Sterilizarea propriu-zisă, atât a instrumentarului şi recipientelor, cât şi a mediului, se efectuează

la autoclav, la o temperatură de 120 0C şi o presiune de o atmosferă, timp de 20-25 min. Se poate
efectua şi o tindalizare, adică o sterilizare discontinuă (fracţionată), mai ales pentru mediile agarizate.

7
In acest caz mediile sunt "topite" de 3 ori consecutiv, la temperatura de 100 o C, pe baie de apă. După
fiecare etapă de fierbere, mediile ramân 24 de ore la temperatura camerei pentru a permite germinarea
sporilor eventualelor microorganisme care au supravieţuit sau au suprainfectat mediul.
Sunt şi procedee prin care sterilizarea se obţine prin filtrare.In aceste cazuri, substanţele
termolabile (în special fitohormonii), sunt sterilizate prin filtre bacteriene.
Este indicat ca sticlăria în care va fi plasat mediul de cultură, pipetele pensetele, ansele,
spatulele să fie presterilizate, fie prin autoclavare la 120-130o C, timp de 20-30 minute, fie prin
menţinerea în etuvă, la 1800C timp de o oră. Toate se pot păstra în casolete sau tuburi metalice.

d. Plasarea explantelor sterilizate pe mediul de cultură, în boxa cu aer steril în flux

laminar.

Lucrul propriu-zis (transferul explantelor, subcultivarea calusului, extragerea de probe pentru

analiza se efectuează în boxa sterilă (boxa în care se asigură aflux de aer, sub presiune, trecut în
prealabil prin filtre microbiene). Este ceea ce, în terminologia uzuală se cunoaste sub numele de boxă
cu aer în flux laminar.
Este indicat să se iradieze boxa (din timp în timp şi mai ales înainte de a se lucra) cu o lampă
UV timp de 20-30 min.
Un alt aparat, utilizat în cazul culturilor pe mediu lichid, este agitatorul rotativ sau liniar, care se
caracterizează prin mişcări oscilatorii (în plan orizontal sau în plan elipsoidal) cu frecvenţa de 115-120
rot./ min.

1.2. PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURA

Reactivii utilizaţi:
1.apa se recomandă să fie dublu distilată;
2.sărurile minerale trebuie să fie cu un inalt grad de puritate. Uneori este indicată recristalizarea
hormonilor de creştere. Spre exemplu, acizii naftalenacetic şi 2,4-D, sunt purificaţi şi decoloraţi cu
charcoal, apoi sunt recristalizaţi din soluţie de etanol.
3.Hidrolizatul de cazeină este un supliment organic utilizat, în concentraţie de 0,05-0,2 %
4.Aminoacizii nu sunt necesari în mod obligatoriu.
5.Restul ingredientelor, din mediul de cultură(macronutrienţi, micronutrienţi, vitamine), se
utilizează după cum urmează:
Pentru mediul B5 (mediul de bază, stabilit de Gamborg în 1968) se prepară soluţii stoc, de
micronutrienţi, în următoarele cantităţi:
Micronutrienţi mg/100 ml H2O
MnSO4 H2O 1000
H2BO3 300
ZnSO4 7H2O 200
Na2MoO4 25
CuSO4 5H2O 2,5
CoCl2 6H2O 2,5
Toate cantităţile precizate, cântărite la balanţa analitică, se dizolvă, în ordine, în 100 ml apă
distilată. Soluţia stoc astfel preparată se păstrează în flacon de culoare închisă, bine închis, la frigider.
Vitaminele, se pregătesc asemenea micronutrienţilor, în urmatoarele cantităţi:
Vitamina mg/100 ml apă distilată
Acid nicotinic 100
Thiamina HCl 1000
Piridoxina HCl 100
Totul se păstrează la frigider.
Clorura de calciu (CaCl22H2O) se prepară separat, în cantitate de 15 g/100 ml apă distilată.
Iodura de potasiu (KI), în cantitate de 75 mg/100 ml apă distilată se prepară, de asemenea
separat.

8
 Soluţia stoc de 2,4D se prepară astfel: Se dizolvă 50 mg 2,4 D în 2-5 ml etanol, încălzindu-se
uşor şi diluându-se cu apa distilată, până ce se atinge volumul de 100 ml. Se stochează la frigider.

Prepararea mediului Gamborg :

In 500 ml apă distilată, se dizolvă în ordine:
NaH2PO4 H2O 150 mg
KNO3 2500
(NH4)2SO4 134
MgSO4 7H2O 250
Sucroza 20-25 g
- câte 1 ml din soluţiile stoc de clorură de calciu, iodură de potasiu, micronutrienţi, vitamine şi 2
ml din soluţia stoc de 2,4 D şi 5 ml din soluţia stoc de FeEDTA.
Se completează cu apa distilată, în balon cotat, până la 1000 ml. Se reglează pH-ul la valoarea
de 5,5 (cu soluţii de KOH 0,2 N sau HCl 0,2 N). Se adaugă 6-8 g agar şi se autoclavează, conform
precizărilor anteriare. Fără îndoială, atât mediul Gamborg, cât şi cele de altă formulă (MS, White,
Erikson) poate fi modificat, în funcţie de scopul cercetării, prin variaţii ale concentraţiei fitohormonilor
(2,4 D, IAA, NAA, BAP).
Pentru prepararea mediului MS se procedează astfel:
Micronutrienţi mg/100 ml
H2BO3 620
MnSO4 4H2O 2230
ZnSO4 4H2O 860
Na2 MoO4 2 H2O 25
CuSO4 5 H2O 2,5
CoCL2 6 H2O 2.5
Toate celelalte soluţii stoc se prepară după formula folosită în cazul mediului B 5
Macroelementele se adaugă astfel:
NH4NO3 1200 mg/l
KNO3 1900 mg/l
MgSO4 7H2O 370 mg/l
KH2PO4 170 mg/l
FeEDTA 40 mg/l
Sucroza 30 g/l
Din soluţiile stoc de clorură de calciu, iodură de potasiu, vitamine, micronutrienţi se ia câte 1 ml
iar din soluţia stoc de 2,4 D 2 ml. Se execută aceleaşi operaţiuni, în aceeaşi succesiune, ca pentru
pregătirea mediului Gamborg. Se ajustează pH-ul la 5,8.
Pentru pregătirea mediului Erikson, urmându-se aceleaşi reguli de preparare, se vor lua
următoarele cantităţi de substanţe:
NH4NO3 1200 mg/l
KNO3 1900 mg/l
MgSO4 7H2O 370 mg/l
KH2PO4 340 mg/l
FeEDTA 40 mg/l
Sucroza 30 g/l
Din soluţiile stoc de micronutrienţi, vitamine, iodură de potasiu se adaugă câte un mililitru, iar
din soluţia stoc de clorură de calciu 2 ml. Din soluţia de 2,4 D se adaugă l ml. Se ajustează pH-ul la
5,8.
PREGATIREA MATERIALULUI VEGETAL
Germinarea seminţelor în condiţii aseptice

Se recomandă mai multe metode pentru germinarea seminţelor în condiţii de asepsie, pentru a
obţine plantute sterilizate. Ne vom rezuma la una dintre acestea: se introduc seminţele în alcool etilic
70%, pe un agitator (shaker, menţionat anterior), timp de 2 min. Se îndepărtează alcoolul şi se
introduce hipoclorit de sodiu, 2-3%. Se menţine flaconul pe agitator, timp de 10-20 minute. Se
9
îndeparteaza seminţele care plutesc (deoarece, cu siguranţă sunt goale şi, deci, nu vor germina). In
cazul în care se presupune că seminţele sunt puternic infectate se poate repeta tratamentul cu
hipoclorit. După aceste operaţiuni este indicată spălarea seminţelor cu apă distilată sterilă. Ulterior
acestei operaţii, seminţele se dispersează pe hârtie de filtru, îmbibată cu apă distilată, într-o cutie Petri
sau un flacon Erlenmeyer, totul autoclavat în prealabil. Este bine ca vasul Petri să fie ermetic închis cu
pelicula de parafilm. In unele lucrări de specialitate se precizează că germinarea seminţelor poate fi
asigurată pe vată, în eprubete, închise cu parafilm. Cele mai multe seminţe germinează bine în condiţii
de întuneric, la temperatura de 23-25o C. Este avantajos să se utilizeze mai puţine seminţe per flacon,
deoarece dacă o singură sămânţă este infectată, se va transmite infecţia tuturor celorlalte din vasul
respectiv. Când seminţele au germinat, plantutele rezultate pot fi utilizate ca atare, sau se pot
fragmenta, utilizând hipocotilul, cotiledoanele. Alteori, pentru inducerea calusului se pot utiliza explante,
din plante crescute în condiţii naturale: porţiuni din rădăcină, tulpină, ramuri, muguri, frunze, flori.
Explantele se vor trata cu alcool etilic 7O%, timp de 1-3 minute, apoi se vor spăla de 2-3 ori cu apă
distilată sterilă. Dacă este vorba de rădăcini, tuberculi, bulbi, după imersare în alcool etilic, se
recomandă tratarea cu hipoclorit de sodiu, timp de 15-20 minute. Din experienta proprie recomandăm
tratarea, atât în cazul seminţelor cât şi în cazul explantelor, doar cu hipoclorit de sodiu 3% timp de 15-
25 minute (in funcţie de mărimea seminţelor sau a explantelor).

LUCRAREA 2
PRINCIPALELE TIPURI DE CULTURI IN VITRO
Cultivarea ţesuturilor şi celulelor vegetale are la bază metode similare celor din microbiologie.
Primele culturi "in vitro" au fost cele în regim staţionar sau, altfel spus, culturile statice, care sunt
caracterizate prin utilizarea substratului nutritiv solid, obţinut pe seama unor agenţi de gelificare ca :
agarul, gelatina sau silicagelul. Această modalitate de cultivare, de la începuturile dezvoltării tehnicilor
"in vitro" şi până astăzi, ramăne de bază, în investigaţiile experimentale, cu toate că determină un
caracter limitat al reacţiei explantului la factorii inductivi ai mediului. In esenţă este vorba despre
contactul redus al calusului sau al explantului cu substratul nutritiv, având ca rezultat accesul diferenţiat
al celulelor la substanţele mediului de cultură.
Alternativa pentru acest neajuns este cultivarea ţesuturilor şi celulelor vegetale pe medii lichide,
în regim de agitare continuă, sistem care asigură utilizarea mai eficientă a nutrienţilor din mediu,
schimburi gazoase mai echilibrate.
Suspensiile celulare sunt iniţiate prin utilizarea fragmentelor de calus friabil şi cultivarea lor pe
medii lichide.
Culturile celulare în suspensie sau suspensiile celulare reprezintă ansamblul celulelor şi
agregatelor celulare, care cresc într-un mediu nutritiv lichid, în condiţii de agitare continuă. In timpul
incubării, cantitatea materialului celular creşte şi ajunge la un punct de maximă acumulare, moment în
care este necesară subcultivarea sa. Astfel de culturi pot fi propagate timp nelimitat, prin subcultivări
periodice (7 zile). Exprimarea numărului de celule dintr-o suspensie celulară funcţie de durata incubării
poate fi reprezentată grafic prin modelul creşterii exponenţiale (Wilson şi Street, 1971), care cuprinde o
fază lag, urmată de faza de creştere exponenţială, faza creşterii liniare, faza accelerării negative a
creşterii şi faza staţionară. Tehnica generală de păstrare şi perpetuare a suspensiei celulare este
subcultivarea în faza staţionară. Perioada cuprinsă de la iniţierea culturii pană la atingerea fazei
staţionare, poate fi caracterizată prin : densitatea celulară iniţială, durata fazei lag şi rata de creştere
celulară. Densitatea iniţială a inoculului trebuie să fie cuprinsă între 0,5-2,5 x 105 celule/ ml mediu ,
valoare care creşte în timpul incubării culturilor ajungand la 1-4 x 106 celule/ ml mediu.
Principalii indicatori ai creşterii unei suspensii celulare sunt estimaţi prin: numărarea celulelor,
determinarea volumului celular total (packed cell volume), greutatea substanţei proaspete (cell fresh
weight), greutatea subsanţei uscate (cell dry weight) şi conţinutul de proteine.

Numărul celulelor

Operaţia preliminară numărării celulelor este separarea lor din agragatele celulare. In acest
scop sunt tratate cu acid cromic 5-15% (Street, 1960) sau supuse unui tratament cu pectinază.
10
Operaţia propriu-zisă de numărare se realizează cu ajutorul unei camere de numărat celule de tip
Fuchs-Rosenthal.

Volumul celular total

Este determinat prin transferarea unui volum de suspensie celulară într-un tub conic gradat, de
centrifugă, de 15 ml şi centrifugarea la o turaţie de 2000 rot/min., timp de 5 minute. Se exprimă în ml
sediment celular/ ml mediu.

Greutatea substanţei proaspete

Suspensiile celulare sunt filtrate prin sita de nylon, apoi celulele sunt spălate şi uscate la pompa
de vid, după care urmează cântărirea.

Greutatea substanţei uscate

Suspensiile celulare sunt filtrate prin sita de nylon, apoi sunt menţinute la 60 oC, timp de 12 ore.
Răcirea se execută într-un desicator, care conţine silicagel, după care materialul vegetal este cântărit.
Atât greutatea substanţei proaspete. cât şi a celei uscate, sunt exprimate în raport cu unitatea de
volum şi la 106 celule.

Indicele mitotic

Durata ciclului mitotic poate fi evaluată prin numărarea celulelor. Intervalul de timp, în care o
populaţie celulară îşi dublează numărul de celule, este considerat durata unei generaţii. Sincronizarea
parţială sau completă a diviziunilor celulare, în culturi de celule vegetale este necesară în scopul
studierii metabolismului celular, pentru determinarea lungimii ciclului mitotic total.
Eriksson(1966) a elaborat o metodă bazată pe tratamentul suspensiilor celulare cu 5
aminouracil sau hidroxiuree, ca agenţi sincronizatori ai culturii. Tratamentul cu aceste substanţe
inhibitoare ale sintezei ADN ului, se aplică în culturi în vârstă de o zi, obţinute din linii celulare
subcultivate regulat şi durează 12-14 ore, funcţie de agentul sincronizator folosit.
După tratament, celulele sunt spălate de două ori în mediul nutritiv proaspăt şi transferate în
flacoane cu mediu proaspăt. Se iau probe pentru fixare, în diferite intervale de timp de la aplicarea
tratamentului. Se foloseşte fixatorul Carnoy. Apoi se îndepărtează fixatorul prin centrifugare. Urmează
hidroliza cu HCl 1N, la 60oC,timp de 5 minute. Celulele sunt centrifugate pentru îndepărtarea HCl şi
sunt colorate cu orceină lactopropionică (1g orceină în 100 ml dintr-un amestec în părţi egale de acid
propionic/acid lactic.
Pentru determinarea indicelui mitotic se numără minimum 1000 de celule pentru fiecare probă.
Nr. celulelor mitotice
IM = x 100
Nr. total de celule analizate
Agentul sincronizator este eficace când produce un indice mitotic cel puţin dublu faţă de cel
constatat la martor.
Tehnica culturii celulelor în suspensie presupune mai multe sisteme de culturi: sistemul de
agregate celulare pe agitator rotativ, sistemul închis de cultură continuă, sistemul deschis de cultură
continuă.

1. Sistemul de agragate celulare pe agitator rotativ se realizează prin transferul calusului

într-un mediu lichid, agitat continuu. In cazul acestui tip de cultură, cu volum fix al mediului nutritiv,
biomasa creşte prin diviziune celulară, astfel încât unele substanţe nutritive, cât şi cantitatea de oxigen
pot deveni factori limitativi ai culturii. De aceea se impune subcultivarea periodică a suspensiilor
celulare, la interval de 7 zile.

11
 2. Sistemul închis de cultură continuă este sistemul în care componenţii nutritivi necesari
sunt suplimentaţi printr-un flux continuu de mediu proaspăt. Acest tip de sistem se utilizează atât
pentru obţinerea metaboliţilor primari cât şi a celor secundari.

3. Sistemul deschis de cultură continuă implică echilibrarea mediului nou introdus cu

recoltarea unui volum egal de cultură. In categoria sistemelor deschise intră chemostatele, în care
mediul nutritiv este introdus în doze calculate şi turbidistatele, in care densitatea celulară este
menţinută în anumite limite.

Tehnici ale clonării celulare

Culturile celulare în suspensie se caracterizează, de obicei, printr-o mare heterogenitate atât

sub aspect morfologic, cât şi biochimic. Diversitatea genetică, reflectată în numărul şi morfologia
cromosomilor este un fenomen frecvent semnalat la nivelul culturilor celulare în suspensie. În scopul
obţinerii unor populaţii celulare omogene, care să prezinte stabilitate genetică, au fost elaborate diferite
tehnici prin care se cultivă celule izolate, a căror evoluţie ulterioară poate fi mai bine controlată şi
dirijată.

1. Metoda suportului nutritiv (Hildebrandt ,1977) constă în plasarea celulelor izolate pe o

hârtie de filtru, plasată la rândul ei deasupra unei mase de calus, care acţionează ca o sursă de hrană.
Celula plasată pe hârtia de filtru se poate divide formând, după câteva săptămâni, o mică colonie.

2. Metoda culturii în picătură (Hildebrandt,1977) constă în cultivarea unei celule într-o

picătură de mediu lichid,înconjurată de ulei mineral, pe o lamă microscopică. Se pune câte o picătură
de ulei de parafină pe fiecare latură a picăturii de mediu, iar peste cele două picături de parafină se
aşează câte o lamelă sterilă. A treia lamelă este plasată peste mediul de cultură care conţine celula şi
face legătura între cele două lamele laterale. Celula creşte şi se divide în această picătură de mediu,
fără ca acesta să fie schombat. Parafina permite schimbul de oxigen şi împiedecă pierderea apei din
mediu.

3. Metoda "plating-ului" a fost elaborată de Bergmann, în 1960 şi constă în amestecarea unui

mililitru dintr-o suspensie celulară cu 9 ml mediu nutritiv, ce conţine 0,5 % agar, la temperatura de
40oC. După amestec, cei 10 ml sunt trecuţi în vase Petri . După solidificarea mediului, evoluţia fiecărei
celule din suspensia celulară poate fi urmărită prin examinarea microscopică. De regulă coloniile
celulare încep să se formeze după aproximativ 1-2 săptămani de cultură. Plăcile Petri sunt incubate la
25oC şi întuneric. Declanşarea diviziunii celulare depinde în mare măsură de densitatea celulelor
etalate în vasele Petri. Densitatea minimă este de 1 x 103 celule/ ml.

LUCRAREA 3
3. INITIEREA UNEI CULTURI IN VITRO LA DAUCUS CAROTA

Explante de 0,5-3 cm, prelevate din rădăcina de morcov şi sterilizate prin tratament chimic, se
plasează pe mediul B5, care conţine 0,1 mg/l 2,4D. Pentru iniţierea culturii se utilizează mediul agarizat.
Flacoanele cu mediu şi explante sunt păstrate la întuneric, în camera de creştere a culturilor, la o
temperatură constantă de 23-25o C.
După aproximativ 20-25 zile, biomasa acumulată, constând din calus, este de 4-5 ori mai mare
decât cea de la care s-a pornit (decât mărimea explantului).
Pentru a obţine o cultură celulară în suspensie, calusul din 2-3 flacoane se transferă în 100 ml
mediu lichid (cu aceeaşi compoziţie ca cel pe care a fost cultivat explantul), într-un flacon de 500 ml.
Flaconul se plasează pe un agitator, cu 150 rot/min, la 25 o C şi lumină continuă. După 5-7 zile, se
înlocuieste mediul uzat cu mediu proaspăt, permiţând o subcultură continuă. O bună cultură celulară (o
suspensie celulară care să aibă nivelul calitativ dorit, se obţine după 4-6 săptămâni. In primele faze de

12
dezvoltare, adică în primele 1-2 săptămâni, este posibilă înlocuirea a 1/2 sau chiar a numai 1/4 din
mediul de cultură uzat cu unul proaspăt.
In principiu, metodologia utilizată pentru morcov poate fi adaptată, cu unele modificări şi la alte
specii.
In cazul în care dorim să obţinem culturi celulare de mazăre, putem utiliza explante din rădăcini
sau lăstari. De această dată este indicată suplimentarea mediului de cultură (formula de bază B 5) cu 2
g hidrolizat de cazeină şi 1 mg/l 2,4 D. Cu toate acestea calusarea este înceată şi pot fi necesare şi
două luni pentru a iniţia o cultură (suspensie celulară). Pentru grâu, secară şi porumb, calusul se obţine
la întuneric, din explante de rădăcină, pe mediu de formula B 5 suplimentat cu 1 mg/l 2,4 D.

3.1. EMBRIOGENEZA SOMATICA IN SUSPENSII CELULARE DE DAUCUS CAROTA

Iniţierea suspensiei celulare din calus de DAUCUS CAROTA

Materiale si reactivi
- rădăcini de morcov;
- soluţie de NaOCl 3%;
- apă distilată sterilă;
- mediul B5 (agarizat şi lichid);
- bisturiu , spatulă, sită metalică;

Materialul vegetal

Rădăcina tuberizată de Daucus carota, reprezintă materialul ideal pentru iniţierea calusului şi,
apoi a suspensiilor celulare. Este indicat să se preleve explante din zona cambială a rădăcinii. Acestea
se vor plasa pe mediul nutritiv în care este prezentă o auxină, de obicei 2,4 D. In timp foarte scurt, pe
suprafaţa explantului, apar zone cu intensă diviziune mitotică. Ulterior întregul explant se transformă
într-o masă omogenă de calus. Acesta constituie punctul de plecare pentru iniţierea suspensiei
celulare. Calusul se repartizează conform indicaţiilor date în paginile anterioare, în flacoanele cu mediu
lichid.
După aproximativ o săptămână de incubare în mediu lichid, în condiţii de agitare, materialul
vegetal este transferat pe mediu proaspat cu ajutorul unei site metalice. Este indicat, ca la fiecare
subcultivare (transfer pe mediu proaspăt), să se procedeze la o examinare microscopică, pentru
stabilirea gradului de viabilitate şi sterilitate a materialului vegetal.

Inducerea embriogenezei somatice

Neoformarea embrionilor este posibilă printr-o frecventă repicare a ţesuturilor cu creştere

activă, pe medii cu auxină, apoi transferul inoculilor pe mediu fără auxină. Metoda este utilizată
frecvent, atât pentru obţinerea de embrioni somatici, cât şi pentru inducerea organogenezei. Un aspect
deosebit de important, în acest context, îl constituie creşterea procentului de embrioni.
S-a constatat, de pildă, că o plasmolizare puternică, dar de scurtă durată a celulelor în
suspensie (45 de minute, într-o soluţie 1 % zaharoza), a indus o creştere de peste 3 ori a frecvenţei
embrionilor somatici, în mediul lipsit de auxină. Se apreciază că plasmoliza determină întreruperea
comunicărilor intercelulare la nivelul agragatelor. In acest mod, plasmodesmele intercelulare se
întrerup şi celulele devin izolate, situaţie care favorizează declanşarea dezvoltării independente, adică
generarea de embrioni somatici.
In cazul concret, al speciei Daucus carota, potenţialul embriogen optim este atins după
aproximativ 15 săptămâni de la iniţierea culturii. Potenţialul embriogen descreşte, în condiţiile
prelungirii duratei de cultivare. Sunt 3 ipoteze care explică pierderea acestui potenţial şi anume:
- cauze de ordin citogenetic - poliploidia, aneuploidie;
- cauze fiziologice - alterări ale echilibrului hormonal, sensibilizări celulare la acţiunea unor
factori exogeni (habituaţie). Este situaţia în care se poate produce o blocare a diferenţierii, fără a se
pierde potenţialitatea;

13
 - cauze combinate, decurgând din sensibilizarea culturii în prezenţa auxinei, cât şi din creşterea
ratei diviziunii celulelor neembriogene concomitent cu prelungirea duratei de cultură. In mod practic se
produce o "competiţie" între celulele neembriogene şi cele embriogene, care devin din ce in ce mai
rare.
In ceea ce priveşte embriogeneza somatică la Daucus carota, s-au evidenţiat 4 etape ale
diferenţierii şi anume:
- faza de creştere izodiametrică, caracterizată printr-o diviziune neorientată a celulelor (când se
ajunge la stadiul globular);
- imprimarea treptată a caracterului de polaritate, faza de distribuire polarizată a esterazelor
(reacţie pusă în evidenţă prin metode histochimice);
- polaritate progresivă, caracterizată prin diviziuni celulare orientate, când se formează
cotiledoanele şi apexul rădăcinii, apoi se demarchează meristemul apical al tulpinii (stadiul cordiform şi
torpedo);
- creşterea bipolară, în care meristemele apicale (radicular şi caulinar) se constituie şi sunt apte
de a intra în diviziune.
Studiile histo-anatomice au reliefat faptul că atât în calus cât şi în suspensii celulare se pot
distinge două categorii de celule:
- celule mari, cu vacuolă mare, lipsite de potenţial embriogenic;
- celule mici, cu citoplasmă densă, aglomerate într-un fel de noduli (noduli embriogeni) care, la
rândul lor, conţin două categorii de celule:
a. celule centrale,cu o singură vacuolă mare şi nuclei mici, compacţi, număr redus de
amiloplaste şi activitate dehidrogenazică scăzută;
b. celule meristematice,grupate la periferia nodulilor embriogeni, cu vacuole puţine, cu
nuclei mari, citoplasma densă şi ribozomi numeroşi, intensă activitate dehidrogenazică, conţinut bogat
de ARN şi proteine.
Pe măsură ce calusul se acumulează se poate observa dezorganizarea nodulilor embriogenici.
Celulele meristematice disociate sunt reagregate în grupuri, ce pot genera noi centri embriogenici, deci
noi noduli. Dacă grupurile de celule meristematice, apărute în subcultură, vor fi separate şi transferate
pe medii de cultură fără auxină, în zonele lor periferice se vor forma mulţi embrioni.

LUCRAREA 4
INDUCEREA ORGANOGENEZEI IN CULTURI DE CALUS DE
PAPAVER SOMNIFERUM
În inducerea procesului de regenerare prin organogeneză, un factor esenţial îl constituie tipul şi
concentraţia regulatorilor de creştere (fitohormonii) din compoziţia substratului nutritiv.
Schematic, etapele procesului de dediferenţiere şi rediferenţiere celulară pot fi reprezentate
astfel:
Explant
dediferenţiere.
Calus
rediferenţiere
rizogeneză caulogeneză
Rădăcini Lăstari
Caulogeneză rizogeneză
Plante regenerate Plante regenerate

În experimentul de fată, urmărim efectul a doua variante de mediu, respectiv mediul B 5 cu 0,5
mg/l NAA şi acelaşi mediu B5 cu 0,1 mg/l AIA şi 1 mg/l BAP,2 mg/l kinetina asupra procesului
regenerării, în culturi de calus de Papaver somniferum (calus primar, adică provenit din
dediferenţierea plantulelor de 5-7 zile de Papaver somniferum, în decurs de 3-6 săptămâni.
Material vegetal

14
 Calus de Papaver somniferum obţinut în decurs de 3-6 săptămâni de la iniţierea culturii
(plasarea plantulelor de 5-7 zile pe mediu de calusare).
Mod de lucru
Calusul obţinut într-un interval de 3-6 săptămâni, poate fi menţinut pe perioade nelimitate,cu
condiţia să fie transferat periodic pe medii proaspete. Subcultivarea se face pe mediul de intreţinere a
calusului, care de regulă are aceeaşi compoziţie cu cel de iniţiere a culturii (în cazul nostru am folosit
mediul Gamborg cu 2,4 D). Inducerea morfogenezei poate fi obţinută folosind tot mediul de bază
Gamborg, dar variind cele două tipuri de fitohormoni sub aspectul concentraţiei. Auxinele sunt implicate
în rizogeneză, iar citochininele în caulogeneză.
Mediul de calusare - B5 cu 1 mg/l 2,4 D
Mediul de intreţinere -idem
Mediul de regenerare - rizogeneză - B5 cu 0,5 mg/l NAA
- caulogeneză - B5 cu 0.1 mg/l IAA,1 mg/l BAP, 2 mg/l kinetina

LUCRAREA 5
5. IZOLAREA ŞI CULTIVAREA PROTOPLASTILOR LA
PAPAVER SOMNIFERUM

Manipularea genetică a plantelor a devenit posibilă graţie perfecţionării unor tehnici care permit
izolarea şi cultivarea protoplaştilor. Protoplaştii sunt celule nude, obţinute prin îndepărtarea pereţilor
celulaeri rigizi. Utilitatea culturilor de protoplaşti pentru ameliorarea plantelor, nu se rezumă numai la
calitatea lor de sisteme apte pentru ingineria geneticaă, ci s-au dovedit a avea un enorm potenţial în
creşterea variabilităţii genetice a plantelor. Studiile de regenerare a plantelor din culturi de protoplaşti
au condus la decelarea de mutaţii spontane şi în special a variaţiilor somaclonale, care cuprind
totalitatea schimbărilor genomice, cromozomiale sau genice, induse în timpul dezvoltării "in vitro" a
celulelor.
Tehnica obţinerii protoplaştilor a devenit de mare interes, mai ales prin aceea că oferă
posibilitatea hibridării somatice si, pe calea regenerării, obţinerea unor genotipuri valoroase Tehnicile
destinate transferului de nuclei, organite, fragmente mici de ADN în protoplaşti sporesc şansele de
transformare mai rapidă a plantelor în sensul obţinerii unor genotipuri valoroase.
Material si metoda
Plantule de 5-7 zile, obţinute prin germinarea seminţelor de Papaver somniferum, în condiţii
aseptice.Tehnica izolării protoplaştilor cuprinde 3 etape:
- Plasmoliza materialului vegetal;
- Tratamentul enzimatic;
- Purificarea protoplaştilor.
Compoziţia chimică a soluţiilor utilizate pentru izolarea protoplaştilor:

Soluţia de plasmoliză Soluţia enzimatică Soluţia de spălare

KH2PO4 27,2 mg/l Celulază 0,75g/100ml CaCl2 1,3g/l

KNO3 101 mg/l Macerozim 0,2g/100 ml NaCl 0,905g/l

CaCL2.H2O 1480 mg/l KCl 0,037g/l

MgSO4,7H2O 246 mg/l Glucoză 0,099g/l

KI 0,16 mg/l

CuSO4.5H2O 0,025 mg/l

Manitol 130 g/l pH-5,8 pH-5,8 pH-5,6

15
 Plasmoliza materialului vegetal este prima etapă în izolarea protoplaştilor. Plasmoliza cu soluţia
13% manitol este efectuată în scopul ruperii plasmodesmelor şi pregătirii pereţilor celulari pentru
tratamentul enzimatic. Durata plasmolizei este de 30 minute. După îndepărtarea soluţiei de plasmoliză,
materialul vegetal este tratat cu soluţia enzimatică. Durata incubării în soluţia enzimatică variază în
funcţie de tipul explantului şi concentraţia amestecului enzimatic. In cazul de faţă am utilizat o soluţie
enzimatică conţinând 0,75 % celulază şi 0,2 % macerozim. Celulaza este un amestec de hidrolaze,
care desfac celuloza până la glucoză, iar macerozimul, al cărui component principal este pectinaza,
hidrolizează legăturile 1,4 galacturonice ale pectinei, eliberând acizii galacturonici. Pectinliaza este o
altă componentă a macerozimului, care catalizează eliminarea acizilor nesaturaţi 4,5 galacturonici din
pectină. Incubarea materialului vegetal în soluţia enzimatică s-a realizat în condiţii de agitare, timp de
16 ore, la întuneric. Purificarea protoplaştilor reprezintă următoarea etapă în izolarea lor.Se pot utiliza
două metode:

1. Filtrarea prin sita de nylon cu diametrul porilor de 80 m:

Protoplaştii eliberaţi în urma tratamentului enzimatic sunt separaţi de resturile tisulare

nedigerate, la inceput printr-o sită metalică, apoi prin sita de nylon. Filtratul este centrifugat timp de 5-7
minute (1000 rot/min). Supernatantul este îndepartat, iar sedimentul format din protoplaşti este
resuspendat în soluţia de spălare. Operaţia de spălare a protoplaştilor se repetă de două ori, în scopul
eliminării totale a soluţiei enzimatice.

2. Flotarea protoplaştilor, ca mijloc de purificare:

Purificarea protoplaştilor prin metoda filtrării şi centrifugării prezintă dezavantajul distrugerii

protoplaştilor într-o proporţie destul de mare. De aceea putem recurge la o altă metodă, care să
inlăture acest neajuns.
Sedimentul de protoplaşti obţinut după prima spălare, este resuspendat într-o soluţie
concentrată de sucroză (40 %). Se centrifughează timp de 5 minute, protoplaştii se adună la suprafaţa
într-o bandă verde, care va fi colectată
şi resuspendată în mediul de cultivare al protoplaştilor.

Mediul de cultivare al protoplastilor

Mediul Gamborg (săruri minerale + vitamine)
manitol 54,6 g/l
glucoză 20,0 g/l
hidrolizat de cazeină 1,0 g/l
2,4 D 1 mg/l
kinetina 2 mg/l
pH 5,8

Protoplaştii purificaţi prin cele două metode mai sus amintite, sunt resuspendaţi în mediul
nutritiv pentru protoplaşti. Cultivarea lor se face la întuneric şi la temperatură constantă (23-24o C).
Protoplaştii proaspăt izolaţi îşi refac peretele celular în decursul a 48 ore, iar după trei zile se pot
observa primele diviziuni.
Pentru cultivarea protoplaştilor pot fi utilizate atât medii lichide cât şi medii agarizate. Cultivarea
protoplaştilor pe mediul solid prezintă avantajul unei mai bune vizualizări a diviziunilor celulare şi a
agragatelor celulare, care premerg formării calusului.
Imediat după izolare, trebuie să determinăm viabilitatea protoplaştilor la microscopul optic în
contrast de fază. Pe o lamă se pune o picatură din suspensia de protoplaşti şi se acoperă cu o lamelă.
Forma sferică şi existenţa unui perete continuu la periferia protoplastului format pe seama
cloroplaştilor, indică faptul că protoplaştii sunt viabili. Protoplaştii neviabili au o formă neregulată şi
cloroplaştii sunt aglomeraţi în grămezi dezordonate.

16
 La 7 zile de la izolarea protoplaştilor putem determina "capacitatea de regenerare" a celulelor
prin numărarea stadiilor de diviziune. Capacitatea regenerativă a fost stabilită ca raport între numărul
celulelor divizate (după 7 zile) şi numărul total al protoplaştilor (după izolare). Pentru numărarea
protoplaştilor se poate utiliza o cameră de numărare a celulelor de tip Fuchs-Rosenthal 0,2 mm.
Densitatea optimă a protoplaştilor pentru diviziune şi implicit pentru regenerare este de 5.10 4-1.105
protoplaşti/ml.

5.1. METODA HIBRIDĂRII CELULARE LA PLANTE PRIN FUZIUNI DE PROTOPLAŞTI

Hibridarea somatică este o tehnică de mare actualitate pentru aplicaţiile sale în genetică,
biologia celulară. Prin intermediul înmulţirii parasexuate se pot realiza genotipuri noi, care sunt
imposibil de realizat prin metodele convenţionale de ameliorare.
Inducerea fuziunii protoplaştilor se poate realiza utilizând o gamă foarte largă de agenţi de
fuziune cum ar fi : nitratul de sodiu, proteine de agregare dar cel mai eficient este polietilenglicolul
(PEG). Introdus relativ recent în tehnicile de hibridare somatică la plante (Kao şi Michayluk, 1974),
polietilenglicolul este un polimer solubil în apă şi eficienţa sa în aglutinare şi fuzionare este datorată
capacităţii de a forma legături ionice între constituienţii de suprafaţă ai celulei.

Inducerea fuziunii protoplaştilor la Papaver somniferum şi Papaver pseudo-oientale cu

ajutorul polietilenglicolului

Izolarea protoplaştilor a fost realizată prin metoda enzimatică descrisă în capitolul anterior,
utilizând două surse de protoplaşti: cotiledoanele plantulelor de Papaver somniferum şi suspensii
celulare de Papaver pseudo-orientale.
Pentru inducerea fuziunii celor două tipuri de protoplaşti s-a utilizat tehnica culturii "în picătură".
Protoplaştii izolaţi de la cele două surse sunt amestecaţi în raport de 1:1 (aproximativ 100µl fiecare)
într-un vas Petri şi se lasă 10 minute la temperatura camerei. Se adaugă apoi 2-3 picături din soluţia de
PEG la periferia suspensiei mixte de protoplaşti, după care amestecul se incubă 30 minute, timp în
care are loc aderarea şi aglutinarea reciprocă a protoplaştilor. După tratamentul cu soluţia PEG ,
aceasta este înlocuită treptat cu mediul de cultivare al protoplaştilor. Atât procesul adeziv, cât şi cel de
fuziune necesită o anumită compoziţie a soluţiei de fuziune.

Compoziţia soluţiei PEG

- polietilenglicol 50 g
- CaCl2 2H2O 120 mg
- KH2PO4 10 mg
- glucoza 1g
- pH 5,8

In timpul fuziunii, marginile externe ale protoplaştilor se unesc, iar porţiunile intermediare
formează vezicule, care se degradează treptat. Organitele celulare migrează către periferia celulelor
fuzionate. In general, amestecul complet al citoplasmelor are loc după aproximativ 12 ore. Natura
hibridă a produşilor de fuziune este evidentă numai după fuziunea nucleilor mitotici şi parcurgerea mai
multor cicluri celulare. Selecţia hibrizilor somatici vegetali poate avea loc în diferite faze:
- imediat după fuziune, înaintea apariţiei diviziunii;
- după apariţia calusului;
- după regenerarea de hibrizi somatici.

17
 LUCRAREA 6
6. DETERMINAREA CALITATIVĂ A ALCALOIZILOR
IN SUSPENSII CELULARE DE PAPAVER SOMNIFERUM
PRIN METODA CROMATOGRAFIEI IN STRAT SUBŢIRE

Cromatografia reprezintă o metodă de separare a diverşilor componenţi ai unui amestec, pe

baza migrării lor diferenţiate, în funcţie de greutatea moleculară, pe un substrat specific. Metoda
implică repartizarea componentelor amestecului supus analizei, între două faze - lichidă şi solidă
(mobilă şi staţionară).
In timpul deplasării prin faza staţionară solidă (silicagel), faza mobilă antrenează componenţii
amestecului supus analizei, în proporţii dependente de interacţiunile dintre aceştia şi cele două faze,cu
care se află în contact permanent. Tehnica concretă de lucru constă în următoarele:
Pe o placă de sticlă, având dimensiunile de 20 x 20 cm, se întinde un strat subţire şi omogen de
silicagel. Pe respectiva placă de sticlă, la distanţa de 1,5-2 cm de la margine, se pipetează amestecul
ce trebuie analizat, sub forma unui spot cu diametrul cât mai mic posibil. Cantitatea pipetată este de 50
microlitri. Distanţa dintre centrii spoturilor este de 2 cm (spre a se evita suprapunerea lor), fapt pentru
care pe o placă normală se pot pipeta 8 spoturi. După ce s-a picurat întreaga cantitate de substanţă ce
trebuie analizată, în numărul respectiv de spoturi, placa de sticlă se introduce în camera de migrare. In
prealabil, cuva cu amestecul pentru migrare a fost bine inchisă pentru a se asigura obţinerea unei
atmosfere saturate în vapori. Migrarea se produce diferenţiat, în sensul că moleculele cu greutate mare
ramân la baza plăcii, cele cu masa mai mică migrează către partea superioară a plăcii.

Metoda CSS (TLC-Thin Leyer Chromatography)

Metoda cromatografiei în strat subţire este larg utilizată pentru analiza calitativă şi cantitativă a
alcaloizilor.

Pregătirea si analiza probelor

Suspensiile celulare de Papaver somniferum obţinute din cultivarea calusului pe mediul nutritiv
lichid reprezintă materialul supus analizei. Aproximativ 1 g de calus obţinut prin filtrarea suspensiilor
celulare printr-o sită metalică, este supus extracţiei. Acesta este tratat cu 5 ml apă distilată şi 1 ml HCl
1N. Se omogenizeaza amestecul, apoi se adaugă 10 ml alcool etilic absolut. Rolul HCl este de a
separa morfina sub forma de clorhidrat de morfină. Amestecul astfel pregătit se lasă, pentru macerare,
timp de 24 de ore. Apoi maceratul se filtrează, cu ajutorul pompei de vid. Extractul se concentrează,
prin evaporare pe baia de apă. Reziduul este preluat cu 2 picături de HCl 1 N şi 1 ml alcool etilic 70%

Pregătirea plăcilor de silicagel

Pentru asigurarea stratului de silicagel, pe o placă normală (20x20 cm) se utilizează, în medie,
2,5 g silicagel. Anterior pipetării probelor de analizat, plăcile sunt activate prin incubarea lor în etuvă,
timp de 30 minute, la 100oC. Pentru migrare, în baia cromatografică, se utilizează o soluţie alcătuită
din: 5O ml acetonă + 4O ml xilen + 6 ml metanol + 5 ml amoniac.
Pipetarea probelor de analizat pe plăci se efectuează cu ajutorul tuburilor capilare. Migrarea
componentelor amestecului supus analizei este urmărită permanent, timpul de menţinere a plăcii în
baia de migrare este cuprins între 30-60 minute.
Apoi plăcile sunt scoase din cuva de migrare şi supuse uscării după care sunt examinate sub o lampă
de ultraviolete la lungimile de undă de 254 şi 366 nm.
Viteza de migrare a probei, notată cu Rf, poate lua valori cuprinse între zero (când picătura din
probă rămâne în poziţia de start) şi egalul distanţei de migrare.
Separarea componentelor din proba de analizat se realizează în ordinea descrescătoare a
dimensiunilor moleculare. Evaluarea cantitativă se face direct pe placa cromatografică, pe criteriul
morfologiei spotului migrat sau prin raclarea şi extragerea spoturilor şi citirea la un spectrofotometru.
18
 6.1. OBŢINEREA METABOLIŢILOR SECUNDARI
IN SUSPENSII CELULARE TRATATE CU ELICITORI

O nouă metodă de creştere a producţiei şi acumulării de metaboliţi secundari, în suspensii

celulare, o constituie inducerea reacţiilor chimice de aparare. Multe plante reacţionează la invazia
microbiană, cât şi la toţi ceilalţi factori din mediu, care provoacă un stres celular (radiaţii UV, ioni de
metale grele, substanţe toxice) prin producerea unor compuşi, cunoscuţi sub numele de fitoalexine.
Alături de aceste substanţe chimice de apărare, a căror biosinteză este limitată cantitativ şi temporal,
stresul celular poate fi premiza unor variaţii cantitative şi calitative considerabile în biosinteza unor
metaboliţi secundari.
Această metodă asigură utilizarea biotehnologică a culturilor vegetale, realizând premizele
sporirii producerii şi acumulării de metaboliţi secundari de importanţă în industria chimică, alimentară,
farmaceutică. In culturile celulare acţionează, în principiu, aceeaşi agenţi de elicitare, ca şi în plantele
intacte. Compuşii care declanşează reacţii chimice de apărare în organismele asupra cărora
acţionează, sunt cunoscuţi sub numele de elicitori şi pot fi de două categorii: biotici şi abiotici.
In categoria elicitorilor biotici se încadrează atât organismele intacte ca: bacterii, ciuperci
patogene sau nepatogene, cât şi molecule organice, izolate din aceste organisme ca: oligozaharide,
glicoproteine.
Printre elicitorii abiotici se numără sărurile unor metale grele ca HgCl 2, CuSO4, detergenţi,
actinomicina D.
Elicitorii, în general, induc în culturile celulare oactivitate enzimatică, care catalizează
producerea unor substanţe antimicrobiene, de tipul fitoalexinelor (acumulate în ţesuturile necrotice).
Intregul proces poate fi reprezentat ca un complex: stimul - răspuns - produs. Efectul acestui
stimul îl constituie creşterea producerii de metaboliţi secundari în culturile vegetale. In ultimii ani,
majoritatea eforturilor se concentrează spre această metodă, culturile celulare reprezentând un sistem
model pentru studiul mecanismelor de control al acumularii fitoalexinelor şi a altor metaboliţi de stres.

SISTEMUL MODEL AL INTERACŢIUNII ELICITOR - SUSPENSIE CELULARĂ

ELICITOR

RECUNOAŞTEREA ELICITORULUI LA NIVELUL CULTURII IN SUSPENSIE

ACTIVAREA GENICĂ ŞI SINTEZA ENZIMELOR IMPLICATE IN LANŢURILE METABOLICE

FORMAREA FITOALEXINELOR ŞI A ALTOR METABOLIŢI DE STRES

ACUMULAREA DE METABOLIŢI SECREŢIA DE METABOLIŢI

DE STRES IN SUSPENSII CELULARE DE STRES DIN CELULE IN MEDIUL
NUTRITIV
Acumularea metaboliţilor secundari în suspensii celulare tratate cu elicitori

Nr. Suspensii Metaboliţi

Elicitori biotici Autorii
Crt celulare secundari
Bacterii Nicotiana Fituberol
1. Tanaka,1985
Pseudomonas syringae tabacum fituberina
Alge brune Lithospermum
2. shikonina Fukui, 1983
Laminaria, Fucus erythrorhizon

19
 Alge roşii
Glycyrrhiza
3. Gelidium amansii echinatina Ayabe,1986
echinata
(alginat de Ca)
Nicotiana
capsidiol Chapell,1985
Oomycetae tabacum
4.
Phytophtora megasperma Petroselinum
cumarine Kombrink,1985
crispum
Zigomycetae Discorea
5. diosgenina Rokem,1984
Rhyzopus errhisus deltoidea
Thalictrum
Ascomycetae berberine Funk,1987
rugosum
6. Saccharomyces cerevisiae
Papaver
Sclerotina sclerotiorum sanguinarina Eilert,1985
somniferum
Cinchona
antrachinone Wijusma,1985
Deuteromycetae ledgeriana
Nicotiana
Aspergillus niger tabacum capsidiol Threlfall,1988
7. Trichoderma viridae
Papaver
somniferum morfina Heinstein,1985
Verticillium dahliae

Fusarium moniliforme Papaver

codeina Heinstein,1985
somniferum
Spermatophyta
Phaseolus
8. Phaseolus vulgaris faseolina Hargreaves,1978
vulgaris
(extract)
Elicitori abiotici Lithospermum
echinofuran Fukui,1984
erythrorhizon
cărbune activ Apium
9. bergapten
graveolens
CuSO4
Medicago
medicarpina Gustine,1982
HgCl2 sativa

In reuşita acestei metode se impune crearea condiţiilor pentru o interacţiune optimă între
elicitor şi suspensia celulară. Este foarte importantă alegerea unui elicitor adecvat, căci aceeaşi
moleculă de elicitor nu activează, la diferite specii aceeaşi cale metabolică. Pe lângă tipul de elicitor, se
are în vedere şi doza în care este el administrat. Pe de altă parte, suspensia celulară trebuie să fie
aptă¬de a reacţiona adecvat la tratamentul cu elicitor. Se are în vedere originea explantului, care a
generat cultura, vârsta culturii, starea ei fiziologică. Elicitorul este recunoscut de celulele cultivate, prin
intermediul receptorilor de la nivelul membranei plasmatice, urmând apoi un întreg lanţ de procese
fiziologice şi biochimice, la finele căruia se acumulează o cantitate însemnată de metaboliţi secundari.
Pe lângă metaboliţi secundari de tipul fitoalexinelor, se pot acumula şi substanţe fără efect
antimicrobian. Vom exemplifica câteva reuşite ale acestei metode. Suspensii celulare de Glycine max
tratate cu preparate fungice, sintetizeaza cantităţi însemnate de izoflavone, iar suspensii celulare de
Daucus carota, tratate cu spori de Chaetomium globosum sintetizează cantităţi însemnate de
izocumarina. Compuşi de tipul terpenelor au fost obţinuţi în suspensii celulare de Gosypium arboreum
tratate cu conidii de Verticillium dahliae.
In ciuda rezultatelor satisfăcătoare şi de perspectivă, metoda tratării suspensiilor celulare cu
elicitori, ridică o serie de probleme cum ar fi distrugerea unei cantităţi mari de celule după aplicarea
tratamentului.
Actualmente "strategiile" de producere a metaboliţilor secundari "in vitro" se axează pe
studierea tuturor factorilor care duc la moartea celulelor şi se încearcă limitarea acestui proces, făcând
posibilă o elicitare de lungă durată a culturii. Utilizarea sistemului experimental elicitor-suspensii
celulare, ramâne o alternativă de perspectivă în obţinerea metabiliţilor secundari "in vitro".

20
 LUCRAREA 7
7. METODE DE OBTINERE A PLANTELOR HAPLOIDE

Obţinerea "in vitro" a plantelor haploide (organisme care posedă numărul gametic de
cromozomi n) este posibilă prin tehnica cultivării "in vitro" a anterelor si polenului izolat. Androgeneza a
fost indusă pentru prima dată prin cultura "in vitro" a anterelor la specia Datura inoxia, de catre Guha şi
Maheshwari, 1964. O primă cerinţă pentru succesul culturii "in vitro" de antere o constituie stadiul de
dezvoltare a grăunciorilor de polen în momentul recoltării şi compoziţia mediului de cultură.
Tehnica de lucru cuprinde următoarele etape:
- recoltarea mugurilor florali;
- dezinfectarea mugurilor florali cu soluţie de hipoclorit de calciu 1%, timp de 10 minute, urmată
de spălarea lor cu apă distilată sterilă;
- după tratament, anterele nerănite, cu o porţiune mică din filamentul staminal se trec pe
mediul nutritiv solid, în vase Petri sau eprubete;
- culturile se păstrează la temperatura de 26-27O C şi se expun la lumină timp de 12-14 ore pe
zi;
- aproximativ, după 3-8 săptămâni, microsporii din antere generează embrioni din care se
dezvoltă plantule.

Mediul de cultură şi rolul lui în inducerea androgenezei

Mediul de cultură este un factor esenţial pentru succesul cultivării "in vitro" a anterelor şi este
specific pentru diferite specii de plante. Acesta trebuie să conţină în principal macroelemente,
microelemente, aminoacizi esenţiali, vitamine, fitohormoni, zaharoză şi uneori suplimente organice.
Pentru cultura anterelor "in vitro" se utilizează fie mediul White (1943), fie Murashige-Skoog
(1962).

Medii nutritive folosite pentru cultura anterelor "in vitro”

COMPOZIŢIA CHIMICĂ MEDII DE CULTURĂ

White Nitsch
Macroelemente mg/l mg/l
Ca(NO3)2 ,4H2O 288 950
KNO3 80 950
NH4NO3 _ 720
KCl 65 _
KH2PO4 _ 68
NaH2PO4, 4H2O 19 _
CaCl2 . 2 H2O _ 166
MgSO4 7 H2O 737 185
Na2SO4 200

Microelemente
Fe2(SO4)3 2,5 -
FeSO4 7 H2O - 27,8
Na2EDTA - 37,3
MgSO4 4 H2O 6,7 25
H3BO3 1,5 6,2
ZnSO4 4 H2O 2,2 10
KI 0,75 -
Na2MoO4 2 H2O - 0,25
CuSO4 5 H2O - 0,025
21
Substanţe organice
Biotina - 0,05
Glicina 3 2
Inozitol - 100
Acid nicotinic 0,5 5
Piridoxina 0,1 0,5
Tiamina 0,1 0,5
Acid folic - 5
Zaharoza 20 000 20 000
Obţinerea de plante haploide prin culturi de antere

Mugure floral
Antere
Microspori
Embriogeneză Calus haploid
Plante haploide Mutageneză
Dublarea cromozomială Selecţie
( tratament cu colchicină)
Regenerare
Plante homozigote 2n
(linii izogene) Mutante haploide

7.1. CULTURA IN VITRO DE MICROSPORI IZOLATI

In cazul culturii de microspori izolaţi posibilitatea de obţinere a populaţiilor omogene de plante

haploide sunt mai mari în raport cu utilizarea culturilor de antere. Acest fapt s-ar explica prin influenţa
negativă a ţesutului anterei asupra dezvoltării microsporilor (în cultura de antere). Astfel, pe de o parte,
ţesutul degenerativ al anterei, prin substanţe inhibitoare de creştere, limitează dezvoltarea
microsporului, iar pe de altă parte, ţesutul diploid al anterei creşte foarte activ formând calus care
inundă microsporii. Plantele haploide obţinute prin cultura de microspori prezintă o mai mare stabilitate
genetică faţă de cele obţinute prin cultura de antere.
Metoda include două etape importante:
- prima, influenţarea microsporilor în vederea schimbării evoluţiei normale sexuale cu o evoluţie
pe cale vegetativă. Inducerea dezvoltării microsporului pe cale vegetativă are la bază inhibarea formării
nucleului generativ, astfel ca nucleul vegetativ să se poată dezvolta similar unei celule somatice
- a doua, direcţionarea dezvoltării microsporilor către embriogeneză. Dezvoltarea polenului
poate fi indusă prin tratarea anterelor cu diferiţi agenţi fizici sau chimici, care au rolul de a produce
modificări în mitoza polinică. Dintre aceştia amintim:
- şocurile de temperatură, care aplicate la polen au ca rezultat formarea a doi nuclei identici
nediferenţiaţi;
- centrifugarea polenului la temperaturi scăzute;
- utilizarea colchicinei pentru alterarea mitozelor polinice.

Tehnica izolării microsporilor

Pentru izolarea microsporilor au fost elaborate mai multe metode:

1. Tehnica lui Sunderland N. şi Roberts M. (1977) de izolare a microsporilor.
Mugurii florali (recoltaţi după prima diviziune mitotică, la tutun, când corola are 21-23 mm) se
păstrează 12 zile la 7-8 0C apoi anterele se extrag din muguri şi se trec în mediu lichid (câte 15 antere
în 5 ml mediu) cu următoarea compoziţie:

22
 mg/l
KNO3 950
NH4NO3 825
MgSO4 7H2O 185
CaCl2 220
KH2PO4 85
FeSO4.7H2O 27,8
Na2EDTA 37,3
Sucroza 20 000
pH 5,5

Vasele Petri se izolează cu Parafilm şi se incubează la 28 0C , la întuneric primele 14 zile. Apoi

se trec la 25 0C şi lumină, timp de 12 ore pe zi. Polenul eliberat în mediu după 6,10, 14 zile continuă să
crească şi să germineze, generând embrioni haploizi.
2. Tehnica lui Nitsch (1974), de izolare a microsporilor
Metoda se bazează pe extracţia polenului în mediul de cultură prin presarea anterelor, cu ajutorul unui
piston de seringă. Urmează operaţia de filtrare, printr-o sită de nylon în scopul îndepărtării ţesuturilor
anterei. Suspensia de polen se centrifughează la 100 turaţii, timp de 5 minute. Polenul este spălat de
două ori, după care suspensia finală este pipetată în vase Petri mici, cu diametrul de 5 cm. Vasele
Petri sunt izolate cu parafilm şi sunt incubate la 27-30oC

7.2. CULTURA IN VITRO DE OVARE

Cultura « in vitro » de ovare a fost realizată pentru prima dată de La Rue C.D, în anul
1942, care a utilizat în experimentări 92 de specii de mono şi dicotiledonate. Succesul culturii de ovare
este limitat la speciile care posedă o morfologie simplă şi fructele ajung rapid la maturitate. Vom
prezenta metoda folosită de Rao P.S., Rangaswamy N.S. (1965) pentru cultura ovarelor de Nicotiana
rustica. Mediul de cultură are următoarea compoziţie:

mg/l
Ca(NO3)2 4H2O 500
KNO3 125
MgSO4 H2O 125
KH2PO4 125
MnSO4 4H2O 3
ZnSO4 7H2O 5
H2BO3 5
CuSO4 5H2O 0,25
Na2MoO4 0,25
CaCl2 0,25
citrat de Fe 10
glicina 7,5
acid nicotinic 11,25
tiamina 25
pantotenat de Ca 0,25
piridoxina 0,25
hidrolizat de caseină 500
zaharoză 40,0
agar 8,0
pH 5,8

Mediul de cultură se sterilizează prin autoclavare la 121 o C, timp de 15 minute. Apoi se

repartizează în eprubete, câte 25 ml/eprubetă.

23
 Prepararea explantului şi plasarea sa pe mediul de cultură

1. Se recoltează florile sau mugurii florali, iar pedunculul, staminele şi petalele se indepărtează ;
2. Ovarele se dezinfectează cu etanol 70%, apoi, se imersează în 0,5 % hipoclorit de sodiu timp
de 10 minute şi se spală cu apă distilată sterilă ;
3. Se transferă pistilele pe mediul nutritiv cu agar. Culturile se ţin la 27o C şi la lumină
fluorescentă 10 000 lucsi, timp de 16 ore/zi.

LUCRAREA 8
CULTURA IN VITRO DE ENDOSPERM

Endospermul este un ţesut unic din punct de vedere genetic, fiind triploid la cele mai multe
angiosperme, rezultând din fuziunea a trei nuclei haploizi. Endospermul este ţesutul nutritiv al
embrionului şi în acelaşi timp centrul dinamic al influenţei de dezvoltare a acestuia. Cercetările din
ultimii ani au bsolute potenţialul organogenetic al endospermului cultivat “in vitro”. Dat fiind faptul ca
ţesutul endospermic este triploid, plantele formate prin cultura acestuia “in vitro” sunt triploide.
Primele cercetări privind cultura de ţesut endospermic au fost efectuate încă din 1933 de Mills
R, Lamp C. Aceştia au plasat endosperm de la boabele tinere de Zea mays pe mediu nutritiv,
conţinând extract de cartof şi au obţinut o uşoară proliferare a celulelor învecinate embrionului. Mai
târziu, în 1949, La Rue, extinde cercetările privind creşterea şi diferenţierea endospermului “in vitro”,
reuşind să obţină o creştere continuă de ţesut endospermic, imatur provenit de la porumb.

Tehnica culturii “in vitro” de endosperm

O importanţă deosebită pentru tehnica culturii endospermului o constituie momentul optim de

excizare a endospermului. Astfel, la Zea mays, timpul optim este la 8-11 zile după polenizare iar la
Cucumis sativus la 7-10 zile după polenizare.
In scopul realizării unei bune proliferări a endospermului, mediul de cultură se suplimentează cu
diferiţi factori de creştere : suc de tomate, extract de drojdie. Cele mai adecvate medii nutritive pentru
cultivarea endospermului sunt mediul White (1943) şi mediul MS (Murashige-Skoog,1962). Indiferent
de compoziţia mediului de bază, prezenţa auxinei (2,4D sau IAA), a citokininei (BAP sau kinetina) şi a
extractului de drojdii sau hidrolizatului de cazeină (sursa de azot organic) este esenţială pentru iniţierea
unei culturi de endosperm.
Organogeneza indusă în calusul bsolute din culturile de endosperm
Specia Autorii
Euphorbiaceae
Srivastava, 1973
Jatropha panduraefolia
Srivastava, 1973
Putranjiva roxburghii
Gramineae
Bajaj et al., 1980
Oryza sativa
Loranthaceae
Bhojwani, 1970
Scurrula pulverulenta
Nag si Johri, 1971
Taxillus vestitus
Santalaceae
Lakshmi Sita et al,1980
Santalum album
Rutaceae
Wang si Chang, 1978
Citrus grandis
Rosaceae
Shu-quiong si Jia qu, 1980
Prunus persica
Mu et al, 1977
Pyrus malus

24
 Endospermul cultivat pe medii nutritive adecvate poate genera plantule direct prin
embriogeneză sau indirect prin formarea mai întâi a calusului şi apoi, prin diferenţierea acestuia.
Pentru formarea mugurilor direct din tesut endospermic este absolut necesară prezenţa în mediu a
unei citokinine.
CULTURA IN VITRO DE EMBRIONI
Embriocultura constituie o metodă eficientă de obţinere de plante fertile de la hibrizi neviabili
sau de la seminţe care şi-au pierdut capacitatea de a germina. Metoda culturii de embrioni constă, din
izolarea aseptică a embrionului şi transferul lui pe mediu nutritiv.
Ovulele intacte, seminţele sau capsulele care conţin ovule se sterilizează iar embrionii sunt
extraşi în condiţii aseptice. Sterilizarea seminţelor se poate face cu etanol, timp de 3 minute, sau cu
clorura mercurică 0,1%, timp de 15 minute. In condiţiile în care se lucrează cu seminţe de dimensiuni
reduse, toate operaţiile de excizare a embrionilor din seminţe se efectuează sub microscop.
Mediile de cultură folosite pentru cultivarea embrionilor variază funcţie de specia de la care
provin embrionii si de vârsta acestora. Embrionii maturi pot creşte pe un mediu cu săruri minerale şi
zaharoză, iar proembrionii necesită suplimentarea mediului de cultură cu vitamine, aminoacizi,
fitohormoni.

Prepararea mediului de cultură

Mediul nutritiv complet prezintă următoarea compoziţie :

mg/l
KH2PO4 910
KCl 750
MgSO4 7H2O 740
MnSO4 H2O 3
H2BO3 5
ZnSO4 7H2O 5
CoCl2 0,25
CuSO4 5H2O 0,25
citrat de Fe 10
inozitol 50
tiamină 25
pantotenat de Ca 25
piridoxină 25
glutamină 400
alanină 50
cisteină 20
arginină 10
leucină 10
fenilalanină 10
tirozină 10
acid malic 1
zaharoză 30000

Tehnica culturii « in vitro » de embrioni la grâu (Triticum aestivum)

Boabele de grâu sunt spălate în alcool etilic 70 %. Apoi, sunt sterilizate cu hipoclorit de calciu 5
%, timp de 5-10 minute, după care urmează excizia embrionului cu ajutorul unui bisturiu. Embrionii
excizaţi sunt plasaţi în vase Petri mici, fiecare conţinând 5 ml din mediul de cultură. Probele sunt
menţinute la o temperatură de 25oC, în condiţiile unei fotoperioade de 16 ore.

25
 Compoziţia mediului nutritiv utilizat pentru cultivarea embrionilor de grâu (Triticum
aestivum)

Macroelemente mg/l
KNO3 1900
CaCl2.2H2O 880
NH4NO3 825
MgSO4.7H2O 370
KCl 350
KH2PO4 170

Microelemente mg/l
H3BO3 12,4
MnSO4.H2O 33,6
ZnSO4.7H2O 21
KI 1,66
Na2MoO4 0,5
CuSO4.5H2O 0,5
CaCl2.6H2O 0,5

LUCRAREA 9
METODA CULTURII IN VITRO DE MERISTEME

Cultivarea "in vitro" a meristemelor urmăreşte în principal două aspecte: obţinerea plantelor
sănătoase şi multiplicarea clonală rapidă. Cerinţele pentru cultura "in vitro" de meristeme variază în
funcţie de dimensiunea explantului, scopul culturii şi genotipul din care provine explantul. Astfel,
explantul de meristem apical necesită un mediu nutritiv suplimentat cu hormoni, în timp ce acela format
din mici porţiuni de primordii foliare nu necesită un astfel de mediu. Explantul de tip meristem, utilizat
pentru obţinerea plantelor libere de viroze poate fi mic de 0,1-0,3 mm, iar cel folosit pentru multiplicarea
clonală poate avea câţiva mm.
In cazul explantului meristematic de dimensiuni reduse, se recomandă cultivarea lui pe unul din
mediile nutritive: Murashige-Skoog (1962), White (1954), Morel şi Martin (1955).

Tehnica cultivării meristemelor

Zonele meristematice situate în varful de creştere al tulpinii, în zona axilară a mugurilor foliari
sau în varful rădăcinii reprezintă sursa de iniţiere a culturii.
Prelevarea zonelor meristematice este realizată în condiţii aseptice, în boxa cu flux laminar,
după ce în prealabil explantele au fost dezinfectate prin imersarea lor într-o soluţie de hipoclorit de
sodiu 6-7 %, timp de 10 minute urmată de spălarea repetată cu apă distilată sterilă.
Explantele meristematice sunt plasate pe medii nutritive adecvate, în scopul regenerării
plantelor întregi. Pe langă natura substratului nutritiv, un rol important îl prezintă şi factorii fizici în
declanşarea proceselor regenerative. Culturile de meristeme sunt păstrate la o temperatură de 22-26o
C, intensitatea luminii este cuprinsă între 3000-4000 lucşi, fotoperioada 16/8 ore.
Fitohormonii constituie factorii decisivi în regenerarea plantelor întregi. Combinaţiile de
citokinine şi auxine se folosesc pentru inducerea lăstarilor.

26
 Medii nutritive pentru cultivarea meristemelor
Compoziţia chimică White Martin şi Morel
Macroelemente mg/l mg/l
Ca(NO3 )2 4H2O 288 500
KNO3 125 125
KCl 65 -
KH2PO4 - 125
NaH2PO4 4H2O 19 -
MgSO4 7H2O 737 125
Na2SO4 200 -
Microelemente mg/l mg/l
Fe2(SO4)3 2,5 2,5
MnSO4 4H2O 7,7 0,8
H2BO3 1,5 0,025
ZnSO4 4H2O 2,2 0,04
KI 0,75 0,25
CuSO4 5H2O _ 0,025
NiCl2 6H2O _ 0,025
CoCl2 6H2O _ _
Substanţe organice mg/l mg/l
biotina _ 0,001
pantotenat de calciu _ 0,001
cisteina _ 0,01
glicina 3 _
inozitol _ 0,001
acid naftalenacetic _ 0,01
acid nicotinic 0,5 _
piridoxina 0,1 _
tiamina 0,1 0,001
glucoza _ 40000
zaharoza 20000 _

LUCRAREA 10
10. METODE CITOLOGICE SI HISTOLOGICE DE STUDIERE A
MATERIALULUI VEGETAL IN VITRO

10.1. METODA DE COLORARE A CROMOSOMILOR DIN CELULELE IN SUSPENSIE

Perpetuarea unui genotip valoros depinde, în esenţă, de succesiunea ordonată a proceselor de
replicare cromosomială şi diviziune. Imperfecţiunile ocazionale, apărute în derularea acestor procese,
constituie baza materială a variabilităţii, şi implicit, a evoluţiei. Celulele şi ţesuturile vegetale, în
condiţiile cultivării "in vitro" sunt expuse mai mult decât în ipostaza integrată, manifestării unor procese
deviante . Modificările nucleare pot fi apreciate prin semnalarea mutaţiilor cromosomiale sau genice.
Evidenţierea mutaţiilor cromosomiale este realizată prin intermediul preparatelor microscopice.
Mutaţiile cromosomiale sunt markerii principali ai schimbărilor genetice.
Culturile celulare conţin, adesea, celule cu grad diferit de diferenţiere. Legat de acest aspect,
grosimea şi consistenţa pereţilor celulari variază, ceea ce creează dificultăţi în observaţiile
microscopice. De aceea, operaţia preliminară efectuării preparatelor microscopice este tratarea
celulelor cu pectinază sau celulază, în scopul distrugerii pereţilor celulari. Metoda care va fi prezentată

27
în cele ce urmează, a fost aplicată în cazul multor specii : Triticum aestivum, Daucus carota, Phaseolus
vulgaris, Vicia hajastana, Haplopappus gracilis.

Materialul vegetal
Suspensii celulare
Reactivi
1. Soluţia acid acetic/alcool etilic 1:3
2. Soluţia de carbol fuxină modificată
3. Soluţia tampon de acetat de sodiu 0,1 M, pH 4,5
4. Soluţia enzimatică:celulază Onozuka 0,5% şi pectinază Sigma 0,5%, in 0,1 M soluţie
de acetat de sodiu, pH 4,5
Metoda de lucru
I. Pretratarea
0,5 ml suspensie celulară se păstrează la temperatura de 1-2oC, timp de 12-24 de ore
II.Fixarea
Suspensia celulară (0,5 ml) este tratată cu soluţia de fixare (acid acetic/alcool etilic). Se
pastrează la 4oC timp de 12-14 ore. Durata mazimă de păstrare în soluţia fixatoare este de
două săptămâni.
III. Tratamentul enzimatic
Celulele sau agragatele celulare menţinute în soluţia fixatoare, sunt transferate într-
untub de centrifugă şi centrifugate timp de 6 minute la 1000 rot/min.
Se îndepărtează supernatantul şi celulele sunt spălate de două ori cu soluţia tanpon 0,1 M.
Urmează tratamentul cu soluţia enzimatică, durata acestui tratament fiind de 1-2 ore. Celulele
sunt spălate şi suspensionate în acid acetic 45%.
IV. Pregătirea preparatelor microscopice
Pe o lamă microscopică se pipetează 20 l din suspensia de celule în acid acetic, peste
care se adaugă 50 l carbol fuxină modificată 5%. Timpul de colorare al lamei este cuprins între
10 şi 30 minute. Lama este aşezată între două straturi absorbante de hârtie de filtru, iar lamela
este presată cu un băţ de chibrit, pentru obţinerea preparatului tip squash. Preparatul astfel
pregătit este observat la microscop pentru evidenţierea cromosomilor.

10.2. METODE HISTOLOGICE DE STUDIERE A MATERIALULUI VEGETAL IN VITRO

Celulele cultivate "in vitro" pot evolua spontan sau indus pe calea formării : traheidelor,
primordiilor de organe sau a embrionilor. Investigarea acestor procese ale dezvoltării "in vitro",
presupun studii comparative, pe baza preparatelor histologice. Există diverse metode, prin care
ţesuturile vegetale pot fi pregătite pentru examinarea microscopică. Procedeul care va fi prezentat
constă într-o succesiune de operaţiuni : includerea, secţiunea, colorarea calusului.

A. Reactivii
I. Fixatorii
1. Glutaraldehida 4%,în soluţie fosfatică tampon 0,025 M, pH- 6,8.păstrată la
temperatura de 0-4o C.
2. FAA
formalină 5 ml
acid acetic glacial 5 ml
alcool etilic 70% 90 ml
II.Agenţi de deshidratare
1. alcool etilic absolut
2. 2-metoxietanol
III.Material de includere
1. xilen
28
 2. parafină
IV. Coloranţi
1. Hematoxilină Delafield
2. Albastru de metilen 1%
3. Roşu ruteniu- soluţie apoasă 0,1%
B. Metoda de lucru
I. Fixarea
1. Fragmente mici de calus (5 mm) sunt introduse într-un recipient de sticlă, care
conţine soluţia fixatoare (glutaraldehida). Se păstrează la temperatura de 4 oC, cel puţin 36 de
ore. Glutaraldehida este folosită ca fixator pentru conservarea citoplasmei, iar FAA este utilizat
ca fixator, în cazul efectuării preparatelor histologice. In acest ultim caz, fixarea se realizează la
temperatura camerei şi durează 24 de ore.
2. Spălarea materialului vegetal este realizată prin înlocuirea soluţiei fixatoare cu apă.
Au loc două spălări, fiecare durează o oră.
II. Deshidratarea
1. Materialul vegetal este trecut succesiv în etanol 30%, 50% şi 70% şi menţinut la rece
(0-4oC). Timpul de incubare în fiecare baie de etanol este de 30 de minute.
2. Se continuă deshidratarea materialului vegetal, prin treceri succesive ale acestuia
prin băi de etanol 89%, 90% şi 95%, la temperatura camerei.
3. Urmează tratarea materialului vegetal cu alcool etilic absolut, operaţie care se repetă
de 3 ori, fiecare baie durează o oră.
4. Materialul vegetal este tratat apoi cu o soluţie etanol-xilen 1:1 şi apoi cu xilen, fiecare
tratament durează 30-60 minute.
5. Se topeşte parafina la 60-70oC.
6. Materialul vegetal este introdus în xilen -parafină 1:1 şi se păstrează peste noapte la
temperatura de 60-70oC.
7. Se înlocuieşte amestecul xilen:parafină cu parafină pură, această schimbare este
făcută de două ori, în decursul unei zile. 2-Metoxietanolul este un alt agent de deshidratare.
Materialul vegetal fixat cu FAA, poate fi deshidratat la temperatura camerei.
III. Includerea în parafină
1. Materialul vegetal este transferat în blocul de parafină lichid.
2. Parafina se va solidifica în decurs de câteva ore.
IV. Secţionarea
1. Se efectuează secţiuni rectangulare de 10-15 m grosime, cu ajutorul microtomului.
2. Se aleg câte 4-5 secţiuni şi se transferă pe o lamă, într-o picătură de apă.
3. Lamele se încălzesc şi se usucă la 30-40oC.
V. Colorarea
1. Preparatele perfect uscate, sunt trecute prin xilen (de 3 ori), alcool etilic absolut (de 3
ori) şi alcool etilic 95, 90, 80, 70, 50 şi 30%. Preparatele sunt lăsate în fiecare soluţie câte 2-3
minute.
2. Lamele sunt plasate într-un vas, care conţine hematoxilină, timpul de colorare este de 15-30
minute. Dacă se utilizează albastru de metilen, timpul de colorare este de 10 minute.
3. Preparatele sunt spălate cu apă.
4. Se revine la etapele băilor cu etanol şi xilen, durata fiecărei băi este de 1-2 minute. Prin
utilizarea hematoxilinei, pereţii celulari şi nucleul, se colorează albastru, iar în cazul albastrului de
metilen şi a roşului de ruteniu, lamela mediană şi pereţii primari se colorează roşu, iar pereţii celulari
lignificaţi se colorează albastru.

BIBLIOGRAFIE

1. Alberts, B.; Bray, D.; Lewis, J.; Raff, J.; Roberts, K.Watson, J. (1983)-Special Features of Plant Cells In:
Molecular Biology of the Cell, Garlland Publishing, 1100-1110

29
2. Ammirato, P. V. (1985) - Patterns of development in culture In: Tissue Culture in Forestry and Agriculture,
Plenum Press, 9-29
3. Ayers, A.; Ebel, J.; Valent, B.; Albersheim, P.(1976) -Host- Pathogen interactions. Fractionation and
biological activity of an elicitor isolated from the mycelial walls of Phythophthora var. sojae, Plant Phisiol. 57:760-
785
4. Băra, I. (1989) -Reproducerea, factor al evoluţiei plantelor, Ed.Academiei Române
5. Beiderbeck, R.; Reichling, J. (1989) -Pflanzenzellkulturen in Forschung und Praxis, 188-193
6. Bhojwani, S.; Razdan, M. K. (1983)-Plant Tissue Culture: Theory and Practice In: Developments in Crop
Science, vol. 5, Elsevier, Amsterdam, Oxford, NewYork
7. Bigot, C. (1987)-Cell Culture Techniques Applied to Plant Production and Plant Breeding, Bocconcibod, J. et
al. (Eds), ENITHP, Angers, 5-10
8.Bengochea,T.;Dodds,J.N.(1986)-Plant Protoplasts- A Biotechnological Tool for Plant Improvement,
Chapmann, Hold (Eds), 3-24
9. Botnariuc, N. (1976)-Concepţia şi metoda sistemică în biologia generală, Ed.Acad.
10. Cachiţă Cosma, D. (1984)-Tehnica cultivării "in vitro"a celulelor şi ţesuturilor vegetale In: Culturi de celule şi
ţesuturi vegetale Aplicaţii în agricultură, Edit. Ceres, Bucureşti
11. Cantrel, C.; Guallot-Salomon, T.; Brown, S.; Dubocq, M, Dubocq,J.B. (1991)-Isolation and biochemical
characteristics of Protoplasts of Jojoba (Simmondsia chinensis), Plant Cell Phisiol.,12 (7),959-967
12. Constabel, F. (1975)- Histological Methods In: Plant Tissue Culture Methods, Gamborg, O.L.; Wetter,
L.R.(Eds.), 50-54
13. Coocking, C. E. (1984) -Plant Cell Fusion:Transformation Using Plant and Bacterial Protoplasts In: Cell
Fusion: Gene Transfer and Transformation Roland F.M., Beers J., Bassett P.D. (Eds), Raven Press, 140-150
14. Coocking, C. E. (1987) -Plant Cell Biology in the 21.Century: The Neede of Plant Cell and Tissue Culture In:
Plant Tissue and Cell Culture,3-15
15. Dale, P. J.; Cheyne, V. A.; Dalton, J. (1980)-Pathogen elimination and in vitro plant storage in forage
grasses and legumes In:Tissue Culture methods for plant pathologists, Ingram D.S., Helgeson Y.P.(Eds), 119-
124
16. D'Amato, D. (1978) -Chromosome number variation in cultured cells and regenerated plants In: Frontiers of
plant tissue culture, Thorpe T.A. (Ed), Calgary Canada, 287-295
17. Debergh, P.; Maene, L. (1981)-A schema for comercial propagation of ornamental plants by tissue culture,
Scientia Horticulturae 14, 335-345
18. Dixon, R. A.; Lamb, C. L. (1990) -Molecular communication in interactions between plants and microbial
pathogens, Ann. Rev. Plant Physiol. 41, 339-367
19. Dodds, J. H.; Roberts, L. W. (1982)-Experiments in Plant Tissue Culture, University Press Cambridge, 133-
144
20. Dougall, D. K.; Johnson, J. M.; Whitten, G. H. (1980)-Clonal analysis of anthocianin accumulation by cell
cultures of wild carrot, Planta 49,292-297
21. Demarly, Y.(1977)-Genetique et amelioration des plantes, Edit. Masson
22. Eriksson, T. (1965) - Studies on the growth requirements and growth measurements of cell cultures of
Haplopappus gracilis, Physiologia Pl., 18, 976-993
23. Evans, D. A.; Flick, C. E.; Jensen, R. H. (1981)-Disease rezistance incorporation into sexually incompatible
somatic hybrids of the genus Nicotiana, Science 213, 907-909
24. Evans, D. A.; Sharp, W. R.; Flick, C. E. (1981)-Growth and behaviour of cell cultures. Embriogenesis and
organogenesis In: Plant tissue culture Methods and applications in agriculture,Thorpe T.A. (Ed), Academic
Press,45-115
25. Fitzsimons, P. J.; Weyers, J. D. H. (1985)- Properties of some enzymes used for protoplasts isolation In:
The Physiological Properties of Plant Protoplasts, Pilet P. E. (Ed.)
26. Fujimura, T.; Komamine, A. (1984)-Fractionation of cultured cells In : Cell Culture and somatic cell genetics
of plants, Vasil I. K. (Ed.), Academic Press,159-166
27. Furuja, T.; Nakano, M.; Yoshikawa, T (1978)-Biotransformation of RS-reticuline and morphinan alkaloids by
cell cultures in Papaver somniferum, Phytochemistry 17, 891-893
28. Galun, E.; Aviv, D. (1986)-Cell Culture and Tansformation In: Plant Molecular Biology,Weissbach A.,
Weissbach H. (Eds.), Academic Press, 595-611
29. Gamborg, O. L.; Wetter, I. D. (1975)-Plant Tissue Culture Methods, Ed. N. R. C. Canada Saskatoon
30. Gautheret, R. (1959)-Le culture des tissus vegetaux. Techniques realisations, Ed.Masson Paris
31. George E. F, Hall , M.A. De Klerk Geert-Ja- 2008- Plant Propagation by Tissue Culture, Springer
32. Gleba, Y.; Sytnik, K. M. (1984)-Protoplast Fusion -Genetic Engineering in Higher Plant, Shoenan, R. (Ed.),
Springer Verlag, 7-20

30
33. Glimelius, K. (1984)-High growth rate and regeneration capacity of hypokotyl protoplasts in some
Brassicaceae, Plant Physiol. 61, 38-44
34. Green, C. E.; Phillips, R. E. (1975)-Plant regeneration from tissue cultures of maize, Crop Sci. 15, 417-420
35. Gyerese, A.; Racs, G. (1973)-Neuen Fliessmittel zur Trennung der Hauptalkaloiden des Opiums, Pharmazie
28, 271-275
36. Heinstein, P. F. (1985)-Future approaches to the formation of secondary natural products in plant cell
suspension cultures, J. Nat . Prod. 48, 1-9
37. Hodges, C. C.; Rapoport, H. (1982)-Morphinan alkaloids in callus cultures of Papaver somniferum, J. Nat.
Prod. 45, 481-485
38. He, G. Y.; Korbuly, E.; Barnabas, R. (1993)-High frequency of callus formation and regeneration of fertile
plants from haploid cell suspensions derived from anther culture in wheat (Triticum aestivum L.), Plant Science
90, 81-87
39. Ikuta,A.(1974)-Alkaloids of callus, tissues and redifferentiated plantlets in the Papaveraceae , Phytochemistry
13, 2157-2179
40.Jain, S.M. ; Häggman, H, (2007) - Protocols for Micropropagation of Woody Trees and Fruits
41.Jain, M.S.; Saxena, P.K. (2009) -Methods in Molecular Biology, Protocols for In Vitro Cultures and Secondary
Metabolite Analysis of Aromatic and Medicinal Plants, vol. 547, Springer Science
42.Kao, K.N.(1975)- A chromosomal staining method for cultured cells In: Plant Tissue Culture Methods,
Gamborg, O.L.;Wetter, L.R.(Eds), 63-64
43.Kao, K.N. (1975)- A nuclear staining method for plant protoplasts In; Plant Tissue Culture Methods, Gamborg,
O.L.; Wetter, L.R (Eds), 60-61
44. Krens, F. A.; Schilperoort, R. A. (1984)-Ti-Plasmid, DNA Uptake and Expression by Protoplasts of Nicotiana
tabacum In : Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vasil I.K (Ed.), 523-533
45. Larquin, P. J.; Scowcroft, W. R. (1981)-Somaclonal variation -a novel source of variability from cell culture,
Theor. Appl. Genet. 60, 197-214
46. Lazzeri ,P. A.; Lorz, H. (1988) -In vitro genetic manipulation of cereals and grasses In : Advances in Cell
Culture, Maramorosch K, Sato Gordon (Eds), vol.6, 291-309
47. Lorz, H. (1980)-Isolierte Protoplasten hoherer Pflanzen -ihre Bedeutung in Grund-lagenforschung und
Pflanzenzuchtung, Mikrokosmos 69, 241-250
48. Lowe, K.C., Davey, M.R.; Power, J.B. (1996)- Plant tissue culture ; past, present and future In; Plant Tissue
Culture and Biotechnology, vol.2, no.4, 175, no.4, 175-186
49. Maheshwari, S. C.; Gill, R.; Maheshwari, N.; Gharyal,P.K. (1986) Isolation and Regeneration of Protoplasts
from Higher Plants In: Results and Problems in Cell Differentiation, Hennig W., Reinert, J.(Eds.), 3-35
50. Melchers, S.; Labib, G. (1974) -Somatic hybridization of plants by fusion of protoplasts. Selection of light-
rezistant hybrids of light sensitive varieties of tabacco, Mol. Gen. Genet.,135, 277-291.
51. Melchers, G.; Sacristan, M. O.; Holder, A.(1978)-Somatic hybrid plants of potato and tomato regenerated
from fused protoplasts, Pflanzenphysiol. 43, 203-218
52. Misawa, M.; Takayana, S. (1985)-Accumulation of antineoplasic agents by plant cell cultures In: Primary and
Secondary metabolism of plant cell cultures Neumann, K., Reinhard, E. (Eds), Springer Verlag, 235-246
53. Murashige, T. (1974)-Plant propagation tissue culture, Ann. Rev. Plant Physiol. 25, 126-166
54. Power, J; Chapman, J. V. (1985)-Isolation, Culture and Genetic Manipulation of Plant Protoplasts In: Plant
Cell Culture- A Practical Approach, Dixon, R. A.(Ed.), IRL Press
55. Power, J.; Davey, M.R.; McLellan , M.; Wilson, D. (1995) - Laboratory Manual, Plant Tissue Culture. Plant
Genetic Manipulation Group, Department of Botant, univ. of Nottingham,
56. Robins, J. R.; Nicholas, J. W.; Hamil, J. D; Parr, A; Rhodes, J.C. (1991)-Strategies for the Genetic
Manipulation of Alkaloid Producing Pathways in Plants, Planta Medica 57, 27-29
57. Ruffoni, B, Massabo, F. (1996)- Plant production by somatic embryogenesis in cell suspension cultures of
Lisianthus russellianus Hook In: Plant Tissue Culture and Biotechnology,vol.2, nr.4, 104-198
58. Schuchmann, R.; Wellmann, E. (1985)-Somatic embryogenesis of tissue cultures of Papaver somniferum
and Papaver orientale and its relationship to alkaloid and lipid metabolism, Plant Cell Report 2, 88-91
59. Schell, J. (1995)- Progress in plant sciences is our best hope to achieve an economically rewarding,
sustainable and environmentally stable agriculture. In Plant Tissue Culture and Biotechnology, vol.1, nr.1, 10-12
60. Seitz, H. V.; Seitz, V.; Alfermann, W. (1985)-Pflanzliche Gewebekultur, ein Praktikum, Gustav Fischer
Verlag, 50-55
61. Shepard, J. F.; Bidney, D.; Barsby, T.; Kemble, R. (1983)-Genetic transfer in plants through interspecific
protoplast fusion, Science,219, 683-688
62. Spangenberg, G,; Neuhaus, G.; Potrykus, J.(1990) Micromanipulation of Higher Plant Cells In: Plant Cell
Line Selection- Procedures and Applications, Dix, P.Y (Ed.) 88-100

31
63. Sunderland, N. (1978)-Strategies in the improvement of yields in anther culture In: Proceedings of
Symposium on plant tissue culture, Science Press, 65-86
64. Sul,J.W.; Korban, S.S. (1996) - A highly efficient method for isolating genomic DNA from plant tissues. In :
Plant Culture and Biotechnology, vol 2. no. 2, 113-116
65. Sweykowska, A. (1977) -Regulation of organogenesis in cell and tissue cultures by phytohormones In:
Regulation of developmental processes in plants, 123-134
66. Tam, W. H. J.; Constabel, F.; Kurz, W. G. (1980)-Codeine from cell suspensions cultures of Papaver
somniferum, Phytochemistry 19, 486-487
67. Tabata, M.; Yoshikawa, N. (1978)-Frontiers of Plant Tissue Culture, Thorpe, T.(Ed.), Calgary Press
68. Tesule, E. (1993)-Biotechnologie et Amelioration des plantes In:Biotechnologie, Scriban R. (Ed.), 566-588
69. Thorpe, T. A.(1981)-Plant Tissue Culture-Methods and Application in Agriculture, Academic Press
70. Torrey, Y. C. (1973)-Plant embryos In: Tissue Culture Methods and Application, Academic Press, 166-170
71. Urban, L. A.; Sherman, J. M.; Daub, M.(1994)-High frequency shoot regeneration and Agrobacterium
mediated transformation of Chrysanthemum, Plant Science 98, 69-74
72. Vasil, I. K. (1986)-Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, vol.3, Academic Press,121-150
73. Vântu, S. ; Băra, I. ; Toma, O. (1998)- Culturi in vitro- Tehnici de laborator, Edit. Corson
74. Vântu, S. (2005)- Culturi de celule şi ţesuturi vegetale în biotehnologie, Edit. Univ. „Al.I.Cuza”, Iaşi
75. Wenzel, G.; Schieder, G.; Melchers, S. G. (1979)-Comparison of single cell culture-derived Solanum
tuberosum plants and a model for their application in breeding programms,Theor. Appl. Genet. 55, 49-55
76. Wilson, D.(1988)- Laboratory Manual. Plant Tissue Culture. Plant Genetic Manipulation Group, Department
of Botany University of Nottingham,
77. Witte, L.; Berlin, J.; Wray, V.; Kohl, W.; Hammer, H.(1983)-Mono- and diterpene from cell cultures of Thuja
occidentalis, Planta Medica 49, 216-221
78. Zimmermann, R. H. (1986)-Methodes modernes de multiplicatio vegetative, C. R.Acad., 619-719
79. Zhang, L.Y.; Harris, P.J.C.; Yao, D.Y.(1997)- In vitro regeneration of fertile plants from Amaranthus species.
In: Plant Tissue Culture and Biotechnology, vol.2, no.1, 32-36

32