PROCESE MORFOFIZIOLOGICE LA

NIVELUL EXPLANTELOR CULTIVATE

IN VITRO
Curs 8
 Introducere
• Explantele inoculate pe medii aseptice:
- îşi vor relua activitatea metabolică
- se vor integra noilor condiţii de viaţă
- îşi vor reamorsa procesele fiziologice vitale
- şi vor începe un nou ciclu de viaţă

 dependenţă de mediul de cultură,

 de natura inoculilor,
 de seria de operaţiuni prin care au trecut
 de condiţiile de cultură
 de scopul urmărit
după dediferenţierea celulelor şi
regenerarea de noi celule
evoluţia acestora poate fi dirijată
 1. Diferenţierea

• Celulele meristematice, divizându-se continuu – diferenţiere

- se pierd caracterele citologice şi fiziologice de tip embrionar
evoluându-se spre - diferitele tipuri de ţesuturi sau organe în alcătuirea cărora
celulele mature vor intra

În primele faze de diferenţiere – citodiferenţiere

- volumul celulei creşte
- scade raportul nucleoplasmatic
- se extinde vacuomul care împinge citoplasma şi nucleul la periferia celulei

• Peretele celular - suferă modificări: depunerilor de celuloză îngreunare a

lignină, mineralizare, comunicării
intercelulare
gelificare sau chiar lichefiere
 1. Diferenţierea
• Substanţele elaborate de celule pot difuza – inducţie organogeneză
• După diferenţiere şi generarea de noi celule - celulele neoformate - reorganizează
structural şi funcţional
- citodifereţiere,
- histodiferenţiere (histogeneză),
- de organe (organogeneză)

- regenerarea unei noi plante

Diferenţierea celulară in vitro nu - foarte variată
- unele funcţii - reduse/simplificate
- în timp ce altele sunt amplificate
 2. Dediferenţierea celulară
transformarea progresivă a celulelor din starea de celulă specializată în celulă
meristematică

Observată:
- în organele care se ramifică
- în cazul traumatizării organelor generarea la locul rănirii de calus
- ţesut - nu toate celulele dediferenţiază

În caz de traumatism - organele din ţesuturile lezate:

- beneficiază de acumularea unor substanţe cu rol esenţial în inducerea şi
stimularea proceselor de dediferenţiere

Factori ce intervin în procesele de regenerare:

 fitohormonii,
 condiţiile de cultură,
 natura ţesuturilor implicate,
 starea lor fiziologică şi
 vârsta plantelor donatoare
 2. Dediferenţierea celulară
• Celulele explantelor - inoculate pe medii aseptice
proces de conversie
din celule definitivate structural şi funcţional

în celule meristematice - apte de multiplicare

Fazele de dediferenţiere celulară:

1. prima faza de dediferenţiere:
• amorsarea proceselor de dediferenţiere;
• producerea dediferenţierii celulelor - dobândirea caracteristicilor citologice
-celule aplatizate aspect şi structură cu cambiul
 Fazele de dediferenţiere celulară
2. A doua fază de dediferenţiere:
 dediferenţierea în continuare – stadiul - meristem primar;
 generarea, din meristemele:
- centre organogene/de embrioni somatici,
iar din acestea regenerarea de plante;
 generarea, prin proliferarea celulelor dediferenţiate a unui calus

meristemoizi sau centrii embriogeni

 3. Regenerarea
• capacitatea organismelor vii de a-şi reface oricare parte le-a fost distrusă

 Intermediul tehnicilor de cultivare in vitro:

- pune în valoare manifestarea integrală a totipotenţialităţii celulare

 Teoretic - celulele vii - totipotente

- din celule somatice - obţinut plante diploide
- din celule generative: androgeneză şi ginogeneză regenerat plante haploide

Variabilitate - priveşte reactivitatea celulară: capacitatea regenerativă - funcţie de

numeroşi factori:

 Factori endogeni:
- vârsta celulelor, gradul de diferenţiere, conţ. în hormoni, echipam.enzimatic
 Factori exogeni:
- traumele şi natura acestora: stresul datorat introd. in vitro
- condiţiile de mediu
 3. Regenerarea
• Numărul celulelor dintr-o populaţie cultivată in vitro care-şi exprimă potenţialul
organogen sau embriogen se află sub controlul mai multor factori
•
• Specia: prin organogeneză / prin embriogeneză
- specii care pot regenera atât lăstari cât şi embrioni in vitro
• Genotipul:
- genotipuri „pretabile”
- genotipuri recalcitrante
• Natura explantului:
- la unele specii (lucerna) toate tipurile de explante generează calus regenerativ
- la altele – condiţionată
De exemplu: la graminee numai embrionii imaturi, inflorescenţele foarte tinere şi
microsporii - generează calusuri regenerative
• Vârsta explantelor.:
- Calusurile - ţesuturi tinere - regenerează vs. explante mature
- embriogeneza directă: celulele embrionare, celulele epidermei hipocotilului, celulele
nucelei şi sinergidele
 4. Morfogeneza in vitro
• reprezintă originea şi schimbările unei forme specifice (formă, structură,
organizare) în timpul dezvoltării unui organism
- ca rezultat al organogenzei / embriogenezei o plantă structurată şi
organizată fiziologică

Factori:
- conţinutul endogen în fitohormoni
- sărurile minerale
- natura şi concentraţia glucidului
- prezenţa în substrat a unor compuşi organici
- prezenţa, natura şi concentraţia gazelor (O2, CO2)
- prezenţa în substrat a unor extracte complexe
- factorii fizici (lumina, temperatura).
Influență
- potenţialul osmotic al mediului negativă
- tipul vaselor de cultură
 5. Organogeneza in vitro
reprezintă toate procesele morfologice prin care sunt induse să se formeze pe
explantele de tip:
-protoplaşti, celule, calus, fragmente de ţesut, fragmente de plantă
structuri în formă identic naturală şi organe neautonome

• Până în momentul explantării ţesuturilor - celulele viitorului explant au parcurs -

trepte în care diferitele cerinţe fiziologice - satisfăcute, mai mult sau mai puţin
• Cerințe:
- raportul endogen în fitohormoni
- conţinutul endocelular în nutrienţi,
ambele fiind dependente de iluminarea plantelor,
de temperatura mediului ambiant,
de aprovizionarea cu săruri minerale
vor depinde
- reacţia explantelor,
- capacitatea regenerativă / de organogeneza la nivelul inoculilor
 5. Organogeneza in vitro
• De exemplu:
• pentru inducerea înrădăcinării tulpinilor de Sequoia sempervirens sau a altor plante
lemnoase, se impune un pretratament, de scurtă durată, a lor cu soluţie nutritivă,
conţinând 100 mg/l AIB*

- Cu toate acestea, nici o tulpină nu a înrădăcinat dacă au fost păstrate, pe o durată lungă de
timp, în acest mediu;
- rădăciniţe s-au diferenţiat şi au crescut numai după ce explantele caulinare au fost scoase şi
reinoculate pe un alt mediu, lipsit de auxină (Teixeira, 1981).
 6. Rizogeneza in vitro
- Un anumit fragment explantat se comportă, în linii mari, ca un minibutaş

- din cauza dimensiunilor sale reduse - dependent de mediul de cultură

Factori: concură la evoluţia ulterioară a inoculului.

- factorul genetic,
- mărimea explantului
- vârsta plantei mamă,
- starea fiziologică a celulelor pe care le deţine

in vitro - pierdere a capacităţii rizogene –

urmare a practicării unor repicări (subculturi) succesive

- Lumina poate exercita - efect pozitiv asupra rizogenezei

- Temperatura optimă pentru rizogeneză - de 26 oC.
- Aportul de auxină !!
 7. Caulogeneza in vitro
• Formarea de muguraşi in vitro
• Inducerea caulogenezei, a formării de muguraşi şi tulpiniţe, la nivelul inoculilor
cultivaţi in vitro, este stimulată de prezenţa - citochininelor, adeseori, în
condiţiile asocierii acestora cu auxinele

• Reuşita formării muguraşilor - nu - important doar raportul fitohormonal,

- ci şi natura
- concentraţia compuşilor utilizaţi ca regulatori de creştere.
reducând concentraţia de auxină
concentraţii relativ ridicate de citochinină

De exp:
La calus, în inducerea caulogenezei - rezultate pozitive:
- cultivarea succesivă
- concentraţie foarte ridicată de 2,4D / în prezenţa unei auxine mai slabe ca
eficienţă
 7. Caulogeneza in vitro
• Folosirea alternativă a mediilor lichide - solide: efect benefic asupra producerii
proceselor de morfogeneză.
• De exp:
- la orhidee, se cunoaşte că menţinerea protocormilor în stare submersă favorizează
multiplicarea acestora, dar este inhibată organogeneza.

Trecerea protocormilor din mediu lichid mediu agarizat declanşează organogeneza

Dacă - perioadă de menţinere a protocormilor pe mediu agarizat (câteva săptămâni)
- se submersează protocormii (acoperirea lor cu soluţie nutritivă diluată, sau cu
apă distilată sterilă)
, stimulare a proceselor de organogeneză (Cachiţă, 1983).

Protocorm - A tuberous mass
of cells that is the embryonic form
of orchids 
 Embriogeneza
• procesul iniţierii şi dezvoltării unui organism

• Se distinge faţă de organogeneză prin faptul că

o structură autonomă care nu mai are legatură prin intermediul sistemului
vascular cu nici o altă structură iniţială.
- în practică - termenul include toate procesele (mai mult sau mai puţin sincrone)
de dezvoltare a celor doi poli: apical şi radicular.
 Embriogeneza somatică – definiție
• proces – pornind de la celule somatice, fără legătură vasculare cu ţesutul de
origine
se formează o structură bipolară asemenea embrionului zigotic

Embrionii somatici se pot diferenţia dintr-un explant vegetal:

direct din celule somatice organizate
indirect prin trecerea printr-o fază de calus
 Embriogeneza somatică
• Procesul de formare a embrionului
- respectiv succesiunea fazelor de multiplicare celulară şi de histogeneză finalizate cu
formarea unui embrion se numeşte embriogeneză
Embriogeneza somatică - fenomenul prin care din celule somatice iau naştere
embrioni.

• Embrionii somatici sunt - un rezultat al multiplicării repetate a unei celule

somatice şi
NU a unei celule a gametofitului sau a celulelor generative

Un gametofit - una dintre cele două faze multicelulare

alternante din ciclurile de viață ale plantelor și algelor.
• organism multicelular haploid
- se dezvoltă dintr-un spor haploid - un set de cromozomi.
• este faza sexuală în ciclul de viață al plantelor și al algelor
• gametofitul feminin se dezvoltă din macrospori,
• gametofitul masculin se dezvoltă din microspori
 Embriogeneza somatică
• Embriogeneza somatică in vitro - semnalată la morcov
Steward şi colab. (1958) şi de către Reinert (1958, 1959).
- în inducerea embriogenezei somatice - rol important - adăugarea în mediul
de cultură a laptelui din nucă de cocos
- datorită citochininelor naturale - din abundenţă

• În funcţie de modul de obţinere (sexuată, somatică sau vegetativă),

embrionii pot fi de mai multe tipuri:
- somatici sau adventivi, obţinuţi prin regenerarea „in vitro” a celulelor
sporofitului diploid
- partenogenetici, rezultaţi din ovule nefecundate
- androgenetici (n), rezultaţi din grăunciori de polen
- ginogenetici (n), rezultaţi din gametofitul femel
 Embriogeneza somatică
• Prin dezvoltarea tehnicilor de embriogeneză somatică - s-a putut stabili:
- capacitatea embriogenă - conţinută în fiecare celulă
- embrionul în formare are un anumit grad de autonomie

• Embriogeneza somatică parcurge mitoze succesive: faze (stadii) ca şi

embriogeneza zigotică, în cazul dicotiledonatelor , sunt:
- stadiul „globular”
- stadiul de „inimă”
- stadiul de „torpilă”
- stadiul „cotiledonar” - cotiledoane complet formate
- apar meristemele primare la extremităţile hipocotilului : apical-caulinar
între cotiledoane şi apical-radicular în partea opusă cotiledoanelor)
 Embriogeneza somatică

Avantajele embriogenezei somatice:

• Obţinerea unui număr foarte mare de copii ale unui organism
• Embrionii somatici obţinuţi pot fi transformaţi în “seminţe artificiale”
• Plantele rezultate din embrionii somatici sunt identice
• Plantele obț. - libere de agenţi fitopatogeni, uniforme, viguroase
• pot reprezenta - tip de biomasă – obț. de produşi secundari valoroşi
• în mutageneză, pentru îmbunătăţirea calităţii produselor agricole
• obţinerea formelor haploide (n)

Dezavantajele embriogenezei somatice:

- latenţa embrionilor somatici -necontrolată suficient
- procentul embrionilor somatici - „in vitro” dintr-un explant (inocul): redus
(< 50%)
 Exemple:
In vitro Direct Regeneration from Node and Leaf Explants of Phalaenopsis cv. 'Surabaya’
December 2015, Plant Tissue Culture and Biotechnology 25(2):193-205
Khosro Balilashaki, Maryam Vahedi and Roghayeh Karimi

Fig. 2. Plant regeneration through direct

somatic embryogenesis from leaf explants of
Phalaenopsis cv. 'Surabaya'. (a) Somatic
embryos formed from the adaxial surface near
the cut end of leaf explant. (b) embryos further
enlarged and formed PLBs, (c) proliferated
PLBs clump showing leafy shoots and newly
formed PLBs, (d) regenerated plants ready for
acclimatization.

Fig. 3. Acclimatization of
Phalaenopsis cv. 'Surabaya'.
(a) A regenerated plantlet
acclimatized in greenhouse,
(b) flowering plant after one
year of acclimatization.
 Somatic Embryogenesis in Centaurium erythraea Rafn—Current Status and Perspectives: A Review
by Ana D. Simonović, ,Milana M. Trifunović-Momčilov, Biljana K. Filipović, Marija P. Marković, Milica D. Bogdanović
 andAngelina R. Subotić
Plants 2021, 10(1), 70; 

Țintaura 

Direct somatic embryogenesis (SE) in Centaurium erythraea solid root culture. (a) The first response of root
explant is enlargement and clear morphological changes observed five days after the culture setup on half-strength
Murashige and Skoog (½MS) medium, (b) Detail of root explant with somatic embryos, (c) Cotyledonary somatic
embryos developed directly from the root explant with no intervening callus phase, (d) Cross-section of root explant
at the beginning of the culture. Scale bar indicates 200 μm, (e) Histological appearance of a proembryogenic
structure. Scale bar indicates 100 μm, (f) Somatic embryo originated directly from the epidermal and subepidermal
cells of the root tissue. Scale bar indicates 100 μm.
Mulțumesc!
Întrebări, dacă sunt?