Curs:

VARIABILITATEA SOMACLONALǍ

Regenerarea plantelor din celule cultivate in vitro este un proces asexuat. Proces care implică,
desigur, numai diviziuni celulare mitotice. Dat fiind faptul că toate celulele somatice ale unei plante
donor de explante provin dintr-o celulă-ou (celulă-mamă) şi ar trebui să fie identice din punct de vedere
genetic, procesul de regenerare ar trebui să fie sinonim cu o clonare. Altfel spus, plantele obţinute ar
trebui să fie copii fidele ale originalului. Însă, pe măsură ce au fost elaborate sisteme de cultură in vitro
şi regenerare, la tot mai multe specii economic importante, iar plantele astfel obţinute au fost studiate din
punct de vedere morfologic, fiziologic, biochimic, citogenetic, molecular, s-a constatat existenţa unei
ample variabilităţi. O variabilitate ce pare să nu fie specifică speciei sau unui anumit organ.
Cultura de celule şi ţesuturi in vitro este deci un protocol mutagen, iar variabilitatea pe care o
generează poate constitui o nouă sursă de caractere valoroase pentru ameliorare atât timp cât este stabilă
şi se transmite la descendenţi.

DEFINIŢIE. NOMENCLATURǍ. TIPURI.

Variabilitatea manifestată de plantele regenerate din culturi in vitro a fost numită “variabilitate
somaclonală” (Larkin şi Scowcroft, 1981).
Variabilitatea generată in vitro este de două tipuri: genetică (mutaţională) şi epigenetică (de
expresie).
Atunci când nu se cunoaşte natura variabilităţii (variaţiei) – cu alte cuvinte, dacă este genetică
sau epigenetică – se foloseşte termenul “variantă”.
Termenii de “variaţie genetică” şi “mutantă” se utilizează pentru a desemna variaţia care se
transmite sexuat conform legilor eredităţii sau se menţine la mai multe generaţii obţinute prin
multiplicare vegetativă.
Variaţia epigenetică – rezultat al modificării expresiei genelor – este de obicei, instabilă.

METODE DE OBŢINERE ŞI EVALUARE A VARIABILITǍŢII SOMACLONALE

Pentru a obţine plante mutante sau variante somaclonale, se recomandă parcurgerea următoarelor
etape:
- inducerea şi apoi, menţinerea calusului sau a suspensiei celulare, prin subcultivări repetate;

1
 - regenerarea unui mare număr de plante din celulele cultivate, timp îndelungat, sub formă de
calusuri sau suspensii;
- studierea plantelor regenerate şi a descendenţei lor pentru identificarea caracterelor calitative
şi cantitative variabile;
- evaluarea stabilităţii caracterului selecţionat, în decursul mai multor generaţii;
- multiplicarea şi/sau utilizarea în programele de ameliorare a mutantelor/variantelor stabile.
În funcţie de scopul urmărit, există două opţiuni: stabilitate sau variabilitate.
Stabilitatea este dorită în micropropagare şi inginerie genetică, în timp ce variabilitatea este
utilă în selecţie şi ameliorare. În ambele cazuri, trebuie evaluată populaţia plantelor regenerate la nivel
fenotipic, biochimic, citogenetic şi molecular. De asemenea, ori de câte ori este posibilă, este oportună
o analiză genetică a descendenţei pentru a se stabilii natura şi modul de transmitere ereditară a
modificărilor apărute. De exemplu, la speciile ornamentale, plantele regenerate in vitro prezintă
numeroase variaţii somaclonale ale unor caractere calitative, identificabile prin studiul morfologiei
frunzelor, florilor etc.
La crizanteme, Begonia şi Saintpaulia a fost raportată şi variabilitatea unor caractere cantitative:
înălţimea plantei, numărul de flori etc.
Evaluarea calitativă şi cantitativă a unor enzime, proteine sau metaboliţi secundari permite
identificarea variantelor somaclonale apărute ca urmare a unor mutaţii genetice sau a modificărilor
induse de cultura in vitro în modul de reglare a expresiei familiilor de multigene. De exemplu, rezultatele
studiului comparativ al cantităţilor de alcaloizi tropanici şi al spectrelor alcaloidice la 19 gametoclone şi
la planta de origine, aparţinănd speciei Datura innoxia, au evidenţiat o amplă variabilitate, mai ales din
punct de vedere calitativ.
Studiul numărului şi structurii cromozomilor permite corelarea modificărilor fenotipice cu
schimbările induse in vitro la nivelul genomului.
La lucernă, analiza cariotipului unei protoclone ce prezenta modificări fenotipice a evidenţiat
existenţa unui număr aneuploid de cromozomi şi a două translocaţii. De exemplu, prin utilizarea
sondelor specifice, a fost evidenţiat la somaclonele de cartof un polimorfism la nivelul ADN
corespunzător genelor care codifică ARN ribozomal. Pe de altă parte, prin utilizarea markerilor
moleculari a fost evidenţiat la somaclone de grâu, orez, tutun şi usturoi polimorfismul ADN nuclear şi
citoplasmatic.

2
 Atunci când variaţiile fenotipice ale somaclonelor nu pot fi asociate unor modificări ale structurii
şi/sau numărului cromozomilor evidenţiate prin analize citogenetice, trebuie studiată descendenţa
obţinută prin autofecundare. Într-un asemenea caz, pot fi întâlnite mai multe situaţii:
- identitatea descendenţei cu planta de origine;
- uniformitatea descendenţei în privinţa unui caracter fenotipic nou;
- segregarea descendenţei conform rapoartelor mendeliene.

În primul caz, este vorba de variante. În al doilea – de o mutaţie homozigotă, de o expresie

genică nouă sau de amplificarea ori deleţia regiunii de pe cromozom implicate în determinarea
caracterului respectiv. În al treilea caz, este vorba de o mutaţie la nivelul unui locus implicat în
determinarea unui caracter calitativ. Mutaţie care poate fi dominantă, codominantă sau recesivă.

FACTORII CARE INFLUENŢEAZǍ SPECTRUL ŞI AMPLITUDINEA VARIABILITǍŢII

SOMACLONALE

Apariţia variabilităţii în populaţiile regeneranţilor este o regulă. Frecvenţa şi natura variaţiilor

depind de o serie de factori, a căror implicare va fi ilustrată, în majoritatea cazurilor, prin rezultatele
unor cercetări proprii.
Modul de regenerare. La Datura innoxia, toate plantele regenerate prin embriogeneză
somatică directă au fost diploide, în timp ce 70% dintre regeneranţii obţinuţi prin organogeneză indirectă
au fost poliploizi. Stabilitatea regeneranţilor obţinuţi prin embriogeneză somatică a mai fost raportată şi
la speciile Panicum, Pennisetum, Hordeum etc.

3
 Natura explantului. În general, regeneranţii din explante organizate, cu meristeme
preformate pe plantă, sunt stabili din punct de vedere genetic. Explantele lipsite de meristeme
preformate, care dediferenţiază, generează însă o mare variabilitate, pentru că sunt formate din tipuri
celulare diferenţiate structural şi funcţional.
În consecinţă, atunci când sunt folosite ca explante pentru obţinerea calusului segmente de
frunză sau rădăcină, celulele diferenţiate dediferenţiază, adică încep să se dividă. Condiţia nucleară in
vivo se va reflecta astfel in vitro prin formarea unei populaţii de celule cu modificări la nivelul
genomului. Modificări ce se vor regăsi şi la regeneranţi.
Genotipul. Influenţează atât capacitatea de regenerare in vitro, cât şi amplitudinea variaţiei
somaclonale. De exemplu, la somaclone de grâu provenite din două soiuri şi două linii dublu haploide au
fost evidenţiate, prin studiul meiozei, diferenţe genotipice majore. Frecvenţa aberaţiilor meiotice a fost
de 27,77% la plantele provenite din cele două soiuri şi de 72,72% la regeneranţii derivaţi din haploizii
dublaţi. Aceste rezultate sugerează faptul că plantele care au mai parcurs un ciclu de cultură in vitro –
ciclu destinat obţinerii haploizilor – sunt mai puţin stabile decât soiurile, prezentând cu o frecvenţă mare
(42,65%) restructurări cromozomale, sugerate de anomaliile din meioză.
Nivelul de ploidie. În general, frecvenţa variaţiei somaclonală este mai mare la speciile
poliploide şi la cele propagate vegetativ (trestia de zahăr, cartoful, unele specii de plante ornamentale
etc). Amplitudini remarcabile ale variaţiei somaclonale au fost înregistrate însă şi la unele specii care se
reproduc sexuat, fie ele poliploide (lucerna) sau diploide (orezul).
Durata culturii. Calusurile şi suspensiile celulare menţinute in vitro timp îndelungat sunt o
excelentă sursă de variabilitate. Există însă riscul ca ele să-şi piardă complet potenţialul regenerativ.
Dacă se urmăreşte stabilitatea clonală, se reduce deci la minim timpul menţinerii culturilor in vitro (în
cazul micropropagării) sau se recurge la crioconservare (în cazul băncilor de germoplasmă).
Întreprinderile care practică micropropagarea în scop comercial, culturile unor specii ornamentale
(Begonia, Pelargonium) sunt reiniţiate periodic, deoarece creşterea numărului de cicluri de propagare
este asociată cu frecvenţa mare a apariţiei variantelor fenotipice.
Substanţele reglatoare ale creşterii. Efectele unui anumit tip de hormoni asupra frecvenţei
variaţiei somaclonale nu sunt deplin elucidate. Creşterea amplitudinii variaţiei manifestate de
regeneranţi odată cu sporirea concentraţiei hormonilor în mediile de cultură in vitro a fost demonstrată
însă la căpşun, Begonia, Saintpaulia. Se presupune că hormonii nu au un efect mutagen direct, ci

4
acţionează indirect, stimulând creşterea neorganizată sau selecţionănd celulele cu un anumit nivel de
ploidie.

TIPURI DE MODIFICǍRI GENETICE ASOCIATE VARIABILITǍŢII SOMACLONALE

În celula vegetală cultivată in vitro apar frecvent o serie de modificări la nivelul materialului
genetic: poliploidii, aneuploidii, restructurări cromozomale, schimbări ale structurii şi expresiei genelor
etc.
La Nicotiana tabacum, din calus indus din măduvă de tulpină prelevată de la plante haploide
şi diploide au fost obţinuţi dihaploizi şi, respectiv, tetraploizi cu o frecevenţă variabilă în funcţie de soi
(tabelul următor ).

Rata plantelor (%)

Nr. de cromozomi ai plantei Nr. plantelor
Soiul
donor analizate
n 2n 4n
Virginia n 42 41 52 7
Havana n 33 42 50 8
Havana 2n 26 - 60 40

Cercetările noastre citogenetice efectuate în cursul procesului de calusare a explantelor constând

din embrioni imaturi au evidenţiat apariţia celulelor poliploide in vitro la grâu. În momentul inoculării,
toate mitozele din celulele explantelor au fost normale şi diploide. Variabilitatea cromozomală a apărut
foarte repede în cultură (într-un interval de 1-2 zile), cu o rată diferită în funcţie de genotip, dar a scăzut
treptat în perioada de calusare, fapt ce sugerează existenţa unui proces de eliminare a tipurilor celulare
care suferă pierderi mari de informaţie.
Analiza cariotipului în celulele mitotice ale plantelor regenerate şi studiul meiozei sunt
modalităţi de evaluare a variaţiilor numerice şi structurale ale cromozomilor induse prin cultivarea in
vitro.
De exemplu, cu ocazia studiului meiozei la somaclone de Avena, s-a constatat că anomaliile cele
mai frecvente au constat în rupturi şi pierderi de fragmente cromozomiale (McCoy et al., 1982). Peste
20% dintre plantele regenerate prezentau una sau mai multe translocaţii şi/sau deleţii. La grâu, analiza
meiozei la somaclone a evidenţiat o frecvenţă neobişnuit de mare a translocaţiilor (Karp şi Maddock,
1984).
5
 La plantele regenerate din culturi in vitro au fost observate şi rearanjamente de ADN cloroplastic
(cp) şi ADN mitocondrial (mt). De asemenea, a fost semnalată apariţia unor plantule albinotice în cursul
regenerării.

Mutaţii specifice culturilor in vitro

Din această categorie fac parte: mutantele homozigote recesive; modificarea expresiei genice în
familiile de multigene; amplificarea sau reducerea numărului de copii ale unor secvenţe repetate ş.a.
Regenerarea unor mutante homozigote recesive din explante heterozigote pentru un anumit
caracter are la bază crossing-over-ul mitotic.
La grâu a fost studiată variabilitatea indusă de cultivarea in vitro la nivelul locilor implicaţi în
sinteza unor enzime şi proteine de rezervă. Au fost detectate subunităţi proteice noi, au apărut noi fracţii
enzimatice sau a fost modificată mobilitatea electroforetică a acestora. A fost emisă ipoteza conform
căreia rearanjamentele induse in vitro ar putea modifica expresia unei familii de multigene, determinând
fie represia unor gene anterior exprimate, fie derepresia unor gene anterior represate.

MECANISMELE VARIABILITǍŢII SOMACLONALE

UTILIZAREA VARIAŢIEI SOMACLONALE ÎN AMELIORARE

Unul dintre cele mai importante avantaje constă în faptul că variabilitatea somaclonală este o
potenţială sursă suplimentară de caractere utile, preţioasă mai ales în cazul speciilor care, înmulţindu-se
asexuat sau fiind apomictice, au o bază genetică limitată.
La unele specii, frecvenţa mare a modificării unor caractere face din variabilitatea somaclonală o
sursă de mutante utile. De exemplu, la grâu au fost regenerate somaclone cu proteine de rezervă
modificate.
Rata mare a dublării numărului de cromozomi permite, la unele specii, diploidizarea haploizilor
sau obţinerea poliploizilor prin regenerarea plantelor in vitro (tabelul de mai jos).

Variaţia cromozomială Exemple de utilizare

Dublarea numărului de cromozomi pentru Tutun

6
 producerea dihaploizilor
Multiplicarea numărului de cromozomi pentru
producerea poliploizilor
Modificarea structurii cromozomilor pentru
realizarea unor introgresii la hibrizi
interspecifici
Variaţia numărului şi structurii cromozomilor
pentru producerea amfiploizilor şi realizarea
unor introgresii la hibrizii intergenerici
Saccharum officinarum x Sclerotachya fuchsa
Cartof
Tutun
Brassica spp.
Datura innoxia
Lolium multiflorum x Lolium perenne
Hordeum vulgare x Hordeum jubatum
Hordeum vulgare x Hordeum bulbosum
Oryza sativa x Oryza latifolia
Triticum crassum x Hordeum vulgare
Triticum aestivum x Secale cereale
Elymus canadensis x Secale cereale
Triticum tauschii x Secale cereale
Hordeum vulgare x Triticum aestivum
Lolium multiflorum x Festuca pratensis
Triticum aestivum x Agropyron sp.

Multe schimbări se reflectă favorabil asupra unor caractere importante din punct de vedere
agronomic, cum sunt: rezistenţa la boli sau la dăunători, productivitatea, conţinutul de proteine,
toleranţa la stres.
În sfârşit, pot să apară caractere noi sau combinaţii de caractere interesante la un singur
regenerant, sau la scara întregii populaţii de plante regenerate in vitro.