Inginer diplomat Rodica FLUTUR

nmulirea in vitro prin micropropagare a nucului comun (Juglans regia L.) i importana acesteia n ameliorarea i cultura speciei
Rezumat al tezei de doctorat

Conductori tiinifici: Prof. Dr. Radu SESTRA Prof. Dr. Kourosh VAHDATI

Cluj-Napoca
2012

Cuprins
INTRODUCERE................................................................................................................................................................3 CAPITOLUL 1. STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII .....................................................................................4

1.1 IMPORTANA ECONOMIC, ALIMENTAR I CULTURAL A SPECIEI JUGLANS REGIA L. .................................4 1.1.1. Importana economic ..................................................................................................................................4 1.1.2. Importana alimentar .................................................................................................................................4 1.1.3. Importana cultural ....................................................................................................................................5 1.2 ORIGINE I ISTORIC ............................................................................................................................................5 CAPITOLUL 2. NMULIREA IN VITRO PRIN MICROPROPAGARE A NUCULUI COMUN J. REGIA L. I IMPORTANA ACESTEIA N CULTURA I AMELIORAREA SPECIEI.........................................................7 2.1 STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII NMULIRII IN VITRO PRIN MICROPROPAGARE A NUCULUI COMUN (J. REGIA L.)..........................................................................................................................................................................7 2.2 AVANTAJE I DEZAVANTAJE ALE NMULIRII IN VITRO PRIN MICROPROPAGARE A NUCULUI COMUN ..................9 2.3 IMPORTANA MICROPROPAGRII NUCULUI COMUN J. REGIA L. PENTRU AMELIORARE ...................................11 CAPITOLUL 3. 3.1 3.2 CADRUL I OBIECTIVELE CERCETRILOR ......................................................................12

PARTICULARITI I ASPECTE ALE ZONEI UNDE S-A DESFURAT CERCETAREA ..............................................12 OBIECTIVE PROPUSE ........................................................................................................................................14 MATERIALUL BIOLOGIC I METODA DE LUCRU ............................................................16

CAPITOLUL 4.

4.1 MATERIALUL BIOLOGIC ...................................................................................................................................16 4.2 METODA DE LUCRU..........................................................................................................................................16 4.2.1. Prepararea mediului de cultur .................................................................................................................16 4.2.2. Stabilizarea microbutailor ........................................................................................................................16 4.2.3. Multiplicarea microlstarilor.....................................................................................................................17 4.2.4. nrdcinarea microlstarilor....................................................................................................................17
4.2.4.1 4.2.4.2 Inducerea nrdcinrii ......................................................................................................................................17 nrdcinarea propriu-zis .................................................................................................................................17

4.2.5.

Aclimatizarea n ser a plantelor ...............................................................................................................18 REZULTATE I DISCUII ..........................................................................................................19

CAPITOLUL 5.

5.1.1. Rezultate privind influena genotipului i a agentului de gelifiere asupra lungimii microlstarilor .........19 5.1.2. Rezultate privind influena genotipului i a agentului de gelifiere alternativ asupra lungimii microlstarilor..........................................................................................................................................................21 5.2 ETAPA DE MULTIPLICARE IN VITRO A MICROLSTARILOR .................................................................................23 5.2.1. Rezultate privind influena genotipului i a concentraiei de citochinin asupra numrului de microlstari 23 5.2.2. Rezultate privind influena genotipului i a concentraiei de citochinin asupra nlimii microlstarilor 25 5.2.3. Rezultate privind influena genotipului i a concentraiei de citochinin asupra numrului de frunze/microlstar ....................................................................................................................................................26 5.2.4. Rezultate privind influena genotipului i a concentraiei de citochinin asupra lungimii frunzelor/microlstari...............................................................................................................................................28 5.3 ETAPA DE NRDCINARE IN VITRO A PLANTELOR DE NUC ...............................................................................30 5.3.1. Importana temperaturii, carbohidrailor, auxinei i a perioadei de inducie pentru inducerea nrdcinrii plantelor de nuc..................................................................................................................................30 5.3.2. Rezultate privind influena genotipului asupra nrdcinrii propriu-zise a plantelor de nuc..................30 5.4 ETAPA DE ACLIMATIZARE N SER A PLANTELOR DE NUC ................................................................................33 5.5 TRANSFERUL PLANTELOR DE NUC N CMP DESCHIS ........................................................................................37 CAPITOLUL 6. CONCLUZII I RECOMANDRI ..............................................................................................39

BIBLIOGRAFIE ..............................................................................................................................................................41

INTRODUCTION............................................................................................................................................................47 PROPOSED OBJECTIVES............................................................................................................................................48 CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS .........................................................................................................48

INTRODUCERE Teza de doctorat cu titlul nmulirea in vitro prin micropropagare a nucului comun (J. regia L.) i importana acesteia n ameliorarea i cultura speciei are ca i obiectiv principal mbogirea cunotinelor legate de nmulirea in vitro prin micropropagare a nucului comun care exist la ora actual n Romnia i evidenierea importanei pentru ameliorare a nucului obinut prin aceast metod. Motivaia alegerii acestei teme se datoreaz dorinei mele de a cunoate mai bine aceast specie valoroas din punct de vedere economic i cultural. nmulirea in vitro prin micropropagare a nucului comun este o metod complex prin ansamblul de etape ce trebuie parcurse n laborator, respectiv: iniierea culturilor, stabilizarea culturilor, multiplicarea i nrdcinarea plantelor. Complexitatea acestei metode nu const doar n gradul de dificultate a executrii acestor operaii, ci n special n sensibilitatea care o prezint explantele de nuc introduse n mediul in vitro. n cadrul acestui studiu, pentru nmulirea in vitro prin micropropagare a nucului comun, am folosit microbutai provenii de la trei soiuri (Chandler, Franquette i Jupneti). Mediul de cultur DKW (Driver, 1986) a fost folosit n etapa de stabilizare i multiplicare a culturilor, iar n etapa de inducere a nrdcinrii am folosit mediu MS (Murashige i Skoog). n etapa de stabilizare a microbutailor s-au folosit trei ageni de gelifiere diferii (2,1 g/l Phytagel, 2,2 g/l Gelrite i 10 g/l agar), auxin (0,1 mg/l AIB), citochinin (1 mg/l BAP) i 3 % zahr. Pentru multiplicarea culturilor am folosit trei concentraii diferite de BAP (0,5 mg/l, 1 mg/l, 1,2 mg/l). Pentru inducerea nrdcinrii am folosit AIB n concentraie de 3 mg/l iar plantele au fost inute la ntuneric timp de 8 zile. La nrdcinarea propriu-zis a plantelor de nuc am folosit vermiculita oferit de societatatea Comptoir de Minraux et Matires Premires din Frana, iar produsul Steckmedium l-am folosit la aclimatizarea plantelor de nuc n ser i mi-a fost oferit de ctre compania Klasmann Deilmann din Germania. n cadrul acestei teze de doctorat am efectuat i un studiu preliminar legat de influena unor ageni de gelifiere alternativi (fina de cassava i tapioca) asupra stabilizrii culturilor de nuc. Acest tip de ageni de gelifiere sunt utilizai n prezent cu succes n micropropagarea altor specii. Materialele pentru acest studiu le-am obinut de la Dr. Vandana Kumar, profesor n cadrul Colegiului de Silvicultur i Agricultur din India i a Prof. Sylvestre K. Bakoh, din Yaounde, Camerun.

CAPITOLUL 1. STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII

1.1 IMPORTANA ECONOMIC, ALIMENTAR I CULTURAL A SPECIEI JUGLANS REGIA L. Nucul, considerat una din cele mai vechi specii pomicole, este important att din punct de vedere economic i alimentar, datorit calitii fructelor sale, a calitii superioare a lemnului i a celorlalte organe ale sale, ct i din punct de vedere cultural. 1.1.1. Importana economic Nucul comun (J.regia L.) este o plant care nu necesit lucrri agrotehnice ce implic costuri operaionale mari de-alungul unui an calendaristic. Pentru a avea o cultur rentabil de nuc este necesar obinerea unei producii de cel puin 2000 de kg/ha de nuci, iar pentru a putea fi realizate investiii din profitul obinut este recomandat s se poat obin o producie cuprins ntre 3500- 4500kg/ha de nuci. Dimensiunea economic a plantaiei de nuc, a fost studiat i de ali autori, precum (Kurtz and Garrett, 1990) n lucrarea Economic aspects of eastern black walnut management. Prin acest studiu Kurtz dezvolt teoria creterii productivitii pe unitatea de suprafa prin realizarea unei asocieri ntre cultura de nuci i alte culturi agricole intercalate (soia). Cicek (Cicek, Akcay, 2001) a subliniat importana intercalrii plantaiei de soia pentru minimizarea efectelor negative determinate de nefructificarea anual a nucului. La nivel internaional (Siebert, 1993) industria productoare de fructe este controlat prin normele elaborate de Comunitatea European i Statele Unite. La nivel european, industria productoare de fructe, funcioneaz conform prevederilor Tratatului de la Roma, semnat la 25 martie 1957 de ctre BENELUX, Frana, Germania i Italia, de creare a unei piee comune care limiteaz graniele comerului, adresndu-se statelor membre. 1.1.2. Importana alimentar Din punct de vedere alimentar nucile reprezint un aliment complet i concentrat prin coninutul de substane grase, substane proteice, hidrai de carbon, substane minerale, vitamine. n stare proaspt (Cociu, Achim, 2003) fructul conine: 17,57% ap, 11,05% materii azotoase, 41,58% materii grase, 26,5% materii extractive, 1,3% celuloz, 1,6% cenui. Valoarea energetic a unui kilogram de miez de nuc este echivalent cu: un kilogram de pine + 0,5 kg de carne + 0,5 kg de pete + 0,5 kg de prune uscate + 1 kg de pere, asigurnd 6364 calorii.

innd cont de compoziia sa, nuca este un produs alimentar care are efecte benefice asupra sntii consumatorilor datorit coninutului bogat n acizi grai polinesaturai. Acidul linoleic (60%) i acidul linolenic (12%) au efecte de prevenire a apariiei cancerului i a bolilor cardiovasculare (Germain, Prunet, 1999). Acidul linoleic i acidul linolenic n combinaie cu vitamina B6 (prezent de asemenea n miezul de nuc) formeaz acidul arahidonic. Acidul arahidonic i acidul linoleic au proprietatea de a spori elasticitatea i de a micora permeabilitatea vaselor sanguine, de a forma cu colesterolul compui uor solubili, grbind transformarea n ficat a colesterolului n acizi biliari, contribuind astfel la eliminarea colesterolului din organism.
Miezul de nuc conine, de asemenea, proteine (16%), glucide (12%), fibre, elemente minerale (potasiu, fosfor, fier i calciu) i de asemenea, vitaminele A, B, C i tocoferoli (vitamina E) cu efect pozitiv n protejarea sntii omului (intervine n metabolismul grsimilor, al calciului i al fosforului, ca i n sinteza proteinelor, limiteaz producerea de colesterol; controleaz eliminarea apei din organism, previne mbtrnirea celulelor, previne apariia aterosclerozei; fortific musculatura, capacitatea mintal; acioneaz pozitiv asupra circulaiei sanguine i asupra regenerrii pielii

1.1.3. Importana cultural n Roma antic, n cadrul ceremoniilor de nunt, nucile erau aruncate de ctre mire, avnd simbolul maturitii i al fertilitii miresei. n evulul mediu, nucile erau folosite n scopul scderii greutii, mpotriva febrei, a farmecelor i a strilor de epilepsie. Conform Doctrinei semnturilor (suntem ceea ce mncm), o filosofie elaborat de mai muli botaniti din perioada lui Pedanius Dioscorides, farmacist, fizician i botanist grec, tincturile din coaj de nuci erau utilizate ca i tratament pentru scalp, iar miezul de nuc pentru dezvoltarea inteligenei. 1.2 ORIGINE I ISTORIC O relatare istoric din Persia, din anul 2000 . Cr., (actuala Republic Islamic Iran) arat c fructul era consumat doar de ctre regalitate, de unde i denumirea de nuc regal pstrat pn astzi. Din Iran, nucul s-a rspndit n Mesopotamia (actualul stat Irak, parial Siria i parial Turcia) n timpul dominaiei Imperiului Babilonian. Hammurabi, al 6-lea rege al Babilonului n perioada 1728 .H.- 1686 . H., a scris un cod de legi, cunoscute sub denumirea de Codul lui Hammurabi n care menioneaz nucile ca aliment n lista produselor alimentare. Tbliele caldeene menioneaz prezena plantaiilor de nuci n grdinile suspendate ale Babilonului, Dinastia Caldeean fiind a 11-a dinastie a Babilonului n perioada 604 .H.562 .H..

Nucul este amintit i n Vechiul Testament, n cartea Cntarea cntrilor scris de Solomon, mpratul statului Israel n perioada 971 .Hr.- 931 .Hr. care spune: M-am pogort n grdina cu nuci.... Dup persani, grecii au fost cei care i-au adus o contribuie foarte important la rspndirea i mbuntirea nucului comun n lume. n mitologia greac, Carya (karya = arbore de nuc) fiica lui Dion regele Laconiei a fost prefcut n arbore de nuc de ctre Dionysos fiul lui Zeus. Din Grecia, nucul comun s-a rspndit apoi n Roma antic, locul de unde a plecat i denumirea de Jovis glans (lb. lat. Jovis = Jupiter, considerat zeitatea suprem a statului roman, avnd ca i responsabiliti legile i ordinea social i glans = ghind). Din Italia, nucul comun s-a rspndit n Frana, Spania, Portugalia i sudul Germaniei. Aceast specie a aprut n Anglia dup anul 1562, iar n Statele Unite ale Americii a fost adus de primii coloniti. Colonitii americani i-au dat denumirea de English walnut (nucul englez) pentru a-l distinge de nucul negru american Black walnut. n Romnia, nucul este cunoscut i sub denumirea de nuc carpatic. Cu peste 2000 de ani n urm, poetul roman Ovidiu, exilat la Tomis scria despre nuc c este puin pretenios, el crete chiar pe marginea drumurilor i nu se teme de nimic, nici de vnturi, nici de tunet, nici de ploaie, nici de ari (Cociu, Botu, 2007). Domnitorul rii Romneti, Dan I, ntr-un document din anul 1385, amintete de nucii de la Dbceti, pe rul Jaleului, druii Tismanei, iar actul lui Mircea cel Btrn de la 1837 amintete de livezile cu nuci (Cociu, Botu, 2007). Nicoleanu i Brezeanu (1900) arat c, ntre anii 1883- 1885, dou societi strine au cumprat mii de rdcini i trunchiuri de nuc din judeul Gorj. n anul 1905 nuci cultivai se regseau numai n judeele din Muntenia i Moldova (peste 1.009.046 de nuci) (Cociu, Botu, 2007). ncepnd din anii 1976- 1980, nucul a nceput s se extind treptat n Romnia, mai nti n gospodriile individuale, unde se obinea din smn, urmnd ca, mai apoi prin anii 1981 s se nfiineze primele plantaii de nuc altoit. Primele plantaii astfel nfiinate au fost cele din judeele: Bihor, Gorj, Iai, Dolj, Constana. n anul 1958 la S.C.P.P. Geoagiu, N. Meza i V.Cociu au efectuat primele cercetri n scopul obinerii unor soiuri autohtone de nuc, ajungndu-se la un numr de 18 soiuri de nuc omologate. n perioada 1967-2007 s-au creat 27 de soiuri de nuc (Botu, 2008) din care: 10 soiuri de nuc au fost obinute la S.C.D.P. Geoagiu, 6 soiuri de nuc la I.C.D.P. Piteti, 4 soiuri de nuc la S.C.D.P. Tg. Jiu, 4 soiuri de nuc la S.C.D.P. Iai i 3 soiuri de nuc la S.C.D.P. Rmnicu Vlcea.

CAPITOLUL 2. NMULIREA IN VITRO PRIN MICROPROPAGARE A NUCULUI COMUN J. REGIA L. I IMPORTANA ACESTEIA N CULTURA I AMELIORAREA SPECIEI
nmulirea in vitro prin micropropagare a nucului comun (J. regia L.) are o importan considerabil pentru agricultur, horticultur i silvicultur deoarce furnizeaz material uniform, productiv i realizeaz nmulirea plantelor elit folosite n scopuri alimentare i ornamentale, a legumelor i a arborilor forestieri. Ca o alternativ la metodele tradiionale ale macropropagrii bazate pe o munc intensiv i pe o productivitate limitat, s-a dezvoltat micropropagarea. Metodele utilizate n micropropagare se bazeaz pe producerea de esut steril, stimularea regenerrii, creterea rapid a plantelor tinere i adaptarea la condiiile de sol (Collin and Edwards, 1998 ). 2.1 STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII NMULIRII IN VITRO PRIN MICROPROPAGARE A NUCULUI COMUN (J. REGIA L.) Micropropagarea este un instrument de lucru important n multiplicarea genotipurilor de nuc. n anul 1962, T. Murashige i F. Skoog au creat un mediu de cultur, denumit ulterior MS, cu scopul favorizrii creterii rapide a culturilor de esut de tutun (Murashige and Skoog, 1962). Acest mediu de cultur se folosete cu succes la nmulirea in vitro prin micropropagare a nucului. Primele rapoarte privind micropropagarea nucului au aprut n literatura de specialitate n perioada 1980 - 1984. n anul 1984, Driver i Kuniyuki (Driver, Kuniyuki, 1981) au studiat nmulirea in vitro a portaltoiului Paradox (J. hindsii x J. regia L.). Prin acest studiu s-a urmrit dezvoltarea unor tehnici de culturi de esuturi pentru regenerarea plantelor de Paradox cu scopul nmulirii clonelor superioare. n urma cercetrilor efectuate, acetia au demonstrat fezabilitatea realizrii de culturi de esuturi pe mediu de cultur, denumit ulterior mediu DKW, pentru nmulirea n mas a portaltoiului Paradox. n anul 1987, R. Gruselle (Gruselle, Badia, 1987) a cercetat posibilitatea nmulirii in vitro a nucului prin intermediul microbutailor recoltai de pe puieii de 6- 12 luni. n urma realizrii experimentelor, s-a observat o rat de nrdcinare destul de mic a explantelor. n anul 1989, D. Cornu (Cornu and Jay Allemand, 1989) au realizat un studiu asupra nmulirii in vitro a hibrizilor (J. nigra x J. regia L.) prin cultura i multiplicarea embrionilor. Pe acelai tip de mediu de cultur folosit, au observat o variabilitate mare n dezvoltarea mugurilor i alungirea lstarilor. Cauzele variabilitii, n opinia celor doi cercettori, s-au datorat: compoziiei mediului de cultur, ratei difuziei moleculare sau metabolismului compuilor fenolici. n anul 1990, R. Gruselle i P. Boxus (Gruselle and Boxus, 1990) au reluat cercetrile n vederea nmulirii in vitro a unor specii diferite de Juglans: J. regia L., J. nigra, J. cinerea
7

i portaltoiul Paradox. La fel ca i n primele cercetri (1987) s-a observat o variabilitate destul de mare ntre repetiii. n anul 1992, J. Allemand (Jayallemand, Capelli, 1992) au obinut o rat de nrdcinare bun a hibrizilor (J. nigra x J. regia L.), prin introducerea vermiculitei n compoziia mediului de cultur DKW mbuntit. n anul 1993, R Tarrazo (Rguez. Tarrazo, Ignacio de Sebastian, 1993) a efectuat o serie de cercetri n scopul determinrii modalitii de influen a fazelor fenologice ale mugurilor de nuc asupra procesului de iniiere in vitro. n acelai an, 1993, s-au efectuat o serie de cercetri asupra factorilor care influeneaz gradul de nrdcinare a culturilor de nuc. Astfel, Jay Allemand (JayAllemand, Peng, 1993) a analizat influena ndeprtrii mugurilor de pe lstarii in vitro, influena polifenolilor i a vermiculitei asupra creterii i nrdcinrii unor culturi de hibrizi. Berros (Berros, Astorga, 1993), respectiv Rodrigues (Rodriguez, Lopez, 1993) au efectuat mai multe tipuri de tratamente, n funcie de vrsta explantului, pentru stimularea nrdcinrii culturii iniiate in vitro. D. Sanjuan (DolcetSanjuan, Claveria, 1996) au ncercat s mbunteasc gradul de aclimatizare a plantelor n ser, prin inocularea unor micorize (Glomus mosseae i Glomus intraradices). Silva et all. (Marques Silva and Dias, 1997) au determinat importana carbohidrailor asupra creterii numrului i mrimii lstarilor obinui in vitro. Tot n acelai an, Rios (Rios, Sanchez-Olate, 1997) au efectuat cercetri cu privire la parametrii care afecteaz creterea i nrdcinarea culturilor in vitro de J. regia L.. O serie de cercettori de la coala Superioar Agricol din Santarem au urmrit s evidenieze mbuntirea calitii plantelor de nuc printr-o nmulire eficient in vitro, afirmnd c, nivelul de calitate a plantelor nmulite in vitro, depinde de modalitatea de ntreinere a plantelor mam n condiii controlate de mediu, de hormonii utilizai precum i de fazele fiziologice ale materialului colectat. Rezultatele cercetrilor efectuate de ctre Rai (Rai, 2001) au indicat faptul c, micorizele au un impact pozitiv asupra transplantrii plantelor obinute prin nmulire in vitro. Navatel i Bourrain (Navatel and Bourrain, 2001) au efectuat cercetri asupra produciei de plante de J. regia L. obinute prin nmulire in vitro, menionnd faptul c, un proces de micropropagare bine efectuat conduce la obinerea unor plante numeroase i foarte omogene. Materialul biologic folosit n procesul de nrdcinare i aclimatizare a fost format din trei portaltoi viguroi de J. regia L. i trei cultivare de J. regia L. (Lara, Chandler i Franquette). Saadat i Hennerty (Saadat and Hennerty, 2001) au efectuat mai multe experimente pentru a determina efectul tratamentelor cu auxine (acid naftalenacetic i acid indolil butiric) asupra nrdcinrii microbutailor de J. regia L.. Zamani (Zamani and Vahdati, 2001) a cercetat influena carbohidrailor i a tratamentelor cu azot asupra creterii lstarilor de J. regia L. i asupra aspectului lor.

Tetsumura (Tetsumura, Tsukuda, 2002) a efectuat cercetri asupra procesului de nrdcinare in vitro, a unor varieti de locale de J. regia L., prin folosirea de hormoni de cretere i vermiculit. Rezultatele obinute le-au confirmat pe cele obinute de JayAllemand (Jayallemand, Capelli, 1992). Lopez (Lopez, 2004) a efectuat o serie de cercetri i aplicaii practice referitoare la culturile de esut ale plantelor de J. regia L., menionnd cteva aspecte legate de importana cultivrii plantelor obinute prin micropropagare. Vahdati (Vahdati, Leslie, 2004) a examinat modul de nrdcinare in vitro a trei cultivare comerciale de nuc (Sundland, Chandler, Vina). nrdcinarea a fost optim dup ce microlstarii au fost inui ntre 6 i 8 zile pe mediul de inducere a nrdcinrii. Problema principal a micropropagrii nucului comun, sesizat de Leal (Leal, Snchez-Olate, 2007), este cea a contaminrii explantelor iniiale. De asemenea, oxidarea esuturilor pe parcursul sterilizrii superficiale a explantelor conduce la o scdere a numrului de microbutai obinui. Caboni (Caboni and Damiano, 2006) a identificat civa factori critici ai nmulirii in vitro a nucului i anume: compoziia mediului de cultur (mediu DKW cu coninut redus de sruri), pstrarea culturilor la ntuneric timp de 10- 12 zile concomitent cu adugarea unui hormon de cretere, transferul microbutailor, dup faza de iniiere, pe un mediu fr hormoni, n absena bacteriei Agrobacterium rhyzogenes. Folosirea bacteriei A. Rhyzogenes a condus la creterea procentului de nrdcinare, chiar i n absena tratamentului cu auxine. Hacketta (Hacketta, Leslieb, 2009) a efectuat o serie de cercetri referitoare la aclimatizarea plantelor de nuc nmulite in vitro. Bourrain (Bourrain, 2009) a efectuat o serie de cercetri referitoare la fazele micropropagrii nucului comun i la impactul folosirii micorizelor. Rezultatele nmulirii prin micropropagare a unor genotipuri pitice de nuc au demonstrat consecvena unei vigori sczute, precocitatea i nrdcinarea uoar a acestora (Sharifian, Vahdati, 2009). 2.2 AVANTAJE I DEZAVANTAJE ALE NMULIRII MICROPROPAGARE A NUCULUI COMUN IN VITRO PRIN

n urma derulrii activitilor de nmulire in vitro prin micropopagare a nucului comun se pot desprinde o serie de avantaje i dezavantaje legate de aspectele tiinifice, economice i ecobiologice ale speciei. Avantajele nmulirii in vitro prin micropropagare a nucului comun sunt: randamentul obinut la plantele nrdcinate pe rdcini proprii este mult mai mare dect la plantele altoite. Hasey (Hasey, Westerdahl, 2001) a observat c soiul Chandler nrdcinat pe rdcini proprii a fost mult mai viguros (randamentul cumulat pe 5 ani a fost de trei ori mai mare) dect soiul Chandler altoit pe portaltoi Paradox, randamentul cumulat pe o perioad de cinci ani ); plantele nrdcinate pe rdcini proprii sunt mult mai rezistente la atacul nematodelor dect plantele altoite afectate de leziuni la nivelul rdcinilor; (Hasey J., Westerdahl,
9

1999) a observat o vigoare foarte ridicat a soiului Chandler nrdcinat pe rdcini proprii la atacul unei populaii puternice de nematode; de asemenea, portaltoii Paradox au prezentat o toleran mult mai mare, la atacul nematodelor, dect portaltoii de J. hindsii i o lips total a cancerului bacterian produs de Agrobacterium tumefaciens; vigoare foarte bun a soiurilor nrdcinate pe rdcini proprii la condiiile dificile de cretere (nlimea de cretere n anul al doilea de la plantare a unor soiuri viguroase de J. regia L.: Sunland, Serr a depit 3.5 m; fructificare foarte precoce; primele flori femele au aprut n anul al doilea de la plantare, iar primele flori mascule s-au evideniat abia n anul al aselea de la plantare (Lopez, 2001) i (Frutos Tomas, 2003). nivel ridicat de omogenitate a plantaiei prin clonarea portaltoilor aparinnd aceluiai soi (mai mult de 20 de clone nrdcinate pe rdcini proprii i aparinnd aceluiai soi au fost mai performante dect soiul iniial i mai uor adaptabile la condiiile de sol (Lopez, 2001). Portaltoii viguroi au rol n creterea productivitii. Aceast caracteristic este important pentru amelioratori care urmresc utilizarea de altoi foarte viguroi altoii ulterior pe portaltoi cu capaciti de cretere heterogene i necunoscute; spre deosebire de arborii altoii care au o rdcin pivotant, arhitectura rdcinilor la arborii nrdcinai pe rdcini proprii este fibroas ceea ce favorizeaz o absorbie foarte bun a apei i a nutrienilor, o bun ancorare a arborilor n sol; au fost identificate 20 de rdcini primare toate provenind direct din colet (Lopez, 2001). lipsa punctului de altoire mbuntete procesul de cretere al arborilor, Prunet i Ginibre (Prunet and Ginibre, 2000) nregistrnd o vigoare mult mai mare a soiului Lara obinut pe rdcini proprii dect a soiului Lara altoit pe portaltoi foarte viguros de J. regia L. obinut prin nmulire in vitro; nmulirea in vitro prin micropropagare este o metod fiabil n realizarea unei selecii bune a portaltoiului prin posibilitatea realizrii de repetiii suficiente care s fie testate n cmp, n condiii diferite; obinerea unui material lemnos de calitate prin lipsa punctului de altoire; ntreaga activitate de laborator aproape 100% controlate. Dezavantaje care apar la nmulirea in vitro prin micropropagare a nucului comun: comparativ cu alte metode de nmulire vegetativ, comportamentul culturilor de esut nmulite prin micropropagare difer foarte mult de la o specie la alta; pentru obinerea aceluiai numr de plante este necesar uneori desfurarea unor etape mai lungi i mai multe ale nmulirii prin micropropagare ceea ce implic: creterea numrului personalului i implicit a costurilor de producie; necesitatea amenajrii unui spaiu de lucru care s asigure desfurarea procesului de micropropagare n condiii aseptice, precum i asigurarea permanent cu materiale consumabile; nivel de specializare i de cercetare ridicat al personalului participant la activitile de obinere a plantelor prin micropropagare.

10

2.3 IMPORTANA MICROPROPAGRII NUCULUI COMUN J. REGIA L. PENTRU AMELIORARE ntre micropropagare i ameliorarea plantelor exist o relaie de interdependen care are urmtoarele obiective: - obinerea de clone superioare prin stabilizarea unor factori de stres: obinerea de portaltoi rezisteni la stresul hidric i la atacul unor boli i duntori frecvent ntlnii n cultur: boala liniei negre provocat de virusul Cherry leafroll (CRLV), putrezirea coletului i a rdcinilor n urma atacului de Phytophthora cinnamomi i Armillaria mellea, cancerul bacterian provocat de ctre Agrobacterium tumefaciens i nematode care distrug sistemul radicular; - tehnica in vitro de manipulare a materialului biologic poate fi folosit ca i modalitate de conservare a germoplasmei n bncile de gene; - prin intermediul ingineriei genetice se pot obine plante valoroase, rezistente la condiiile de stres (de exemplu adaptabilitatea plantelor pe solurile srturate); - clonele homozigote obinute prin nmulirea in vitro vor putea fi folosite n cadrul proceselor de ameliorare la obirea de hibrizi F1; - obinerea de soiuri cu caractere fenologice valoroase: perioada de nfrunzire, nflorirea i recoltarea (data recoltrii), precocitatea, tipul de fructificare, randamentul estimat, mbuntirea caracteristicilor fizice (forma, textura, fineea, duritate, greutatea miezului, procentul de miez, culoarea, gradul de umplere, uurina ndeprtrii miezului din coaj). - obinerea de avantaje economice prin mbuntirea unor caractere valoroase i anume: precocitatea, fructificarea lateral, perioada timpurie de recoltare; - introducerea n cultur de polenizatori valoroi care s mbunteasc fondul genetic disponibil pentru ameliorare; - evaluarea descendenilor obinui din ncrucirile realizate anterior n funcie de: data nfrunzitului, receptivitatea florilor femele, dehiscena anterelor, randamentul, gradul de fructificare lateral, caracteristicile fructelor; - obinerea de plante care s conduc la reducerea costurilor pe care le implic industria nucului.

11

CAPITOLUL 3. CADRUL I OBIECTIVELE CERCETRILOR

3.1 PARTICULARITI I ASPECTE ALE ZONEI UNDE S-A DESFURAT CERCETAREA Cercetrile privind micropropagarea nucului comun (J. regia L.) s-au desfurat la Colegiul Abouraihan, din oraul Pakdasht, n laboratorul de biotehnologii al Facultii de Horticultur. Iranul (semnific teren de aur), ar recunoscut oficial ca Republica Islamic Iran, este situat n partea de sud-vest a Asiei (Orientul Mijlociu), ntre coasta nord-estic a Golfului Persic i coasta sudic a Mrii Caspice. Din punctul de vedere al temperaturilor medii lunare din Romnia i din Iran, conform informaiilor furnizate de Climate Change Knowledge Portal (sdwebx.worldbank.org), datele nregistrate n perioada 1990 2009 sunt prezentate sistematic n tabelul de mai jos. Tabelul 1/Table 1 Temperaturi medii lunare n Romnia i Iran n perioada 1990 2009 Average montly temperatures in period 1990 - 2009
Luna /Month Temperaturile medii lunare(Iran)/ Temperaturi medii lunare (Romnia)/ I II III 17 IV 23.4 V 27.4 VI VII VIII 24.8 IX X XI 7.4 XII 5.7

6.4 11.2

29.1 28.4

18.3 13.4

7.6

9.9

14.6

17.9

19.9 19.9

13.9

10.5

6.4

0.1

-1.8

Din datele prezentate n tabelul 17 se poate observa c, n perioda 1990 2009, la nivelul Iranului, cele mai mici temperaturi medii lunare s-au nregistrat n luna decembrie, respectiv 5,7oC, iar cele mai mari temperaturi medii lunare s-au nregistrat n luna iunie, respectiv 29,1oC. La nivelul Romniei, n perioada 1990 2009, cele mai mici temperaturi medii lunare s-au nregistrat n luna decembrie, respectiv -1,8oC, iar cele mai mari temperaturi medii lunare s-au nregistrat n lunile iunie i iulie, respectiv 19,9oC. n perioada 1990 2009, ntre temperaturile medii lunare din Romnia i temperaturile medii lunare din Iran s-au nregistrat diferene cuprinse ntre 8 10oC.

12

Fig. 1. Temperaturi medii lunare n Romnia i Iran n perioada 1990 - 2009 Fig. 1. Average montly temperatures in period 1990 - 2009 Din graficul prezentat mai sus, se observ c, att n Romnia ct i n Iran, temperaturile medii lunare maxime s-au nregistrat n luna iunie, iar temperaturile medii lunare minime s-au nregistrat n luna decembrie. Din punctul de vedere al precipitaiilor medii lunare din Romnia i din Iran, conform informaiilor furnizate de Climate Change Knowledge Portal (sdwebx.worldbank.org), datele nregistrate n perioada 1990 2009 sunt prezentate sistematic n tabelul 18. Tabelul 2/Table 2 Temperaturi medii lunare n Romnia i Iran n perioada 1990 2009 Average montly temperatures in period 1990 - 2009
Luna /Month Precipitaiile medii lunare(Iran) Precipitaiile medii lunare(Romnia) I 38.7 II 21 III 27..5 IV 8.9 V 3.2 VI 3.8 VII 2.9 VIII 2.3 IX 8.8 X 8 XI XII

Iu lie Se pte mb r No ie iem br ie

Ian ua rie

M art i

M ai

35 30 25 20 15 10 5 0 -5

Temperatura(C))())

Temperaturile medii lunare (Iran) Temperaturile medii lunare (Romnia)

17.8 42.8

28

17.4

53

55.1

67.9

49.9 27.9

35.6

35.4 23.1 57.7 12.2

Din datele prezentate n tabelul 18 se poate observa c, n perioda 1990 2009, la nivelul Iranului, cele mai sczute precipitaii medii lunare s-au nregistrat n lunile iulie i august, respectiv 2,9 mm i 2,3 mm, iar cele mai multe precipitaii medii lunare s-au nregistrat n luna decembrie, respectiv 42,8 mm. La nivelul Romniei, n perioada 1990 2009, cele mai sczute precipitaii medii lunare s-au nregistrat n luna decembrie, respectiv 12,2 mm, iar cele mai multe precipitaii medii lunare s-au nregistrat n luna mai, respectiv 67,9 mm.

13

Precipitaiile lunare(mm) (mm)

80 60 40 20 Septembrie Octombrie Noiembrie Aprilie Iulie Decembrie 0 Martie Ianuarie Februarie Iunie Mai August Precipitaiile m edii lunare n Iran Precipitaiile m edii lunare n Rom nia

Fig. 2. Precipitaiile medii lunare n Iran i n Romnia n perioada 1990 - 2009 Fig. 2. Average mountly precipitations in Iran and Romania in period 1990 2009 Din graficul prezentat mai sus se observ c, din punctul de vedere al precipitaiilor medii lunare, ntre Romnia i Iran se nregistreaz diferene majore. Dac, n luna mai cantitatea de precipitaii medii lunare din Romnia a atins nivelul maxim, n Iran cantitatea de precipitaii medii lunare a nregistrat cel mai sczut nivel. n perioada 1990 2009, respectiv n lunile ianuarie februrie cantitatea de precipitaii medii lunare a nregistrat valori apropiate la nivelul Romniei i Iranului. Colegiul Abouraihan este localizat n partea de nord a oraului Pakdasht, avnd o suprafa de 30 ha, inclusive 8 ha cu ferme de cercetare. n anul 1952 (anul iranian 1331), Colegiul Abouraihan i-a nceput activitatea, iar din anul 1966, respectiv anul iranian 1345 se desfoar nvmntul n grad universitar de licen. 3.2 OBIECTIVE PROPUSE Obiectivul general al cercetrii l reprezint perfecionarea tehnicilor cunoscute, de nmulire prin micropropagare i adaptarea protocoalelor existente la genotipurile din sortimentul internaional i naional. Aceste metode sunt destul de puin folosite de ctre instituiile de cercetare din ar, sau sunt folosite dar fr rezultate eficiente comparativ cu progresele realizate n acest domeniu de ctre instituii de cercetare internaionale. Obiectivele specifice ale cercetrii sunt: selecia, pentru nmulirea prin micropropagare, a unor soiuri de nuc productive sau selecii locale, uor adaptabile la condiiile de sol, clim i rezisente la atacul bolilor i duntorilor; stabilizarea compuilor fenolici eliminai ca urmare a interveniilor efectuate asupra materialului vegetal folosit pentru nmulire; realizarea unei rate de nmulire a plantelor ct mai bun;
14

producerea de plante noi, libere de boli; aclimatizarea bun a plantelor pentru a putea obine culturi de viitor; obinerea unor plante de calitate ce vor constitui baz de plecare n procesul de ameliorare. obinerea unor rezultate viabile care s reprezinte un punct de referin pentru cercetrile viitoare i pentru specialitii din domeniul pepinieristic.

15

CAPITOLUL 4. MATERIALUL BIOLOGIC I METODA DE LUCRU

4.1 MATERIALUL BIOLOGIC Un rol important n reuita iniierii culturilor in vitro l are sezonul, iar legat de aceasta, fenofaza n care se afl organele donatoare de explante. Factorii endogeni joac un rol predominant n conservarea viabilitii i a totipotenialitii celulelor esuturilor explantate. Astfel, cu toate c iniierea unei culturi in vitro poate fi realizat pe parcursul ntregului an, intensitatea diferenierii este variabil n funcie de sezon, de concentraia sezonier n hormoni endogeni sau substane inhibitoare (SARPE, 2002). n cazul cercetrii de fa, ramurile au fost recoltate n perioada aprilie mai, respectiv n perioada de vegetaie, de la arbori tineri, cu vrsta cuprins ntre 2 -3 ani, n cazul soiurilor Chandler i Franquette i respectiv 5 7 ani n cazul soiurilor Jupneti, Mihaela i Muscelean. 4.2 METODA DE LUCRU 4.2.1. Prepararea mediului de cultur Pentru etapele iniiale ale nmulirii in vitro prin micropropagare a nucului comun (J. regia L.), respectiv etapa de stabilizare a culturilor i etapa de multiplicare a culturilor am folosit mediu DKW ca i mediu de baz 4.2.2. Stabilizarea microbutailor

Pentru etapa de stabilizare a microbutailor am folosit mediu de baz DKW , n care am adugat: auxin (AIB) n concentraie de 0,1 mg/l, citochinin (BAP) n concentraie de 1 mg/l i 3% zahr. Dup stabilirea valorii de 5,5 a pH-ului mediului de cultur s-a adugat agentul de gelfiere, iar mediul de cultur a fost sterilizat n autoclav timp de 15 minute la 121 grade Celsius. Dup autoclavare vasele cu mediul de cultur se las la rcit pn n ziua urmtoare pentru o bun solidificare i pentru a observa dac exist infecii accidentale ale mediului de cultur sau ale vaselor n care s-a turnat mediul de cultur. Pentru analiza ratei de stabilizare a microbutailor de nuc, 9 tratamente (trei cultivare cu trei tipuri de ageni de gelifiere) au fost comparate n cadrul unui model factorial complet randomizat. Factorul A a fost reprezentat de trei soiuri diferite (Franquette, Chandler i Jupneti), iar factorul B a fost reprezentat de trei ageni de gelifiere (2,1 g/l Phytagel, 2,2 g/l Gelrite i 10 g/l agar). Fiecare tratament a constat n patru repetiii, iar fiecare repetiie a inclus patru microbutai uninodali.
16

Culturile au fost meninute patru sptmni pe acelai mediu de cultur, dup care datele au fost colectate, nregistrate i analizate prin analiza varianei i a testului Duncan (Sestras, 2004). Acelai model experimental a fost aplicat i pentru studierea comportamentului culturilor e mediu cu tapioca i fin de casava. 4.2.3. Multiplicarea microlstarilor Pentru analiza ratei de multiplicare a microlstarilor am folosit acelai model experimental ca i la etapa de stabilizare. Astfel, factorul A a fost reprezentat de aceleai soiuri (Chandler, Jupneti i Franquette), iar factorul B a fost reprezentat de trei concentraii diferite de benzil-aminopurin (0,5 mg/l, 1 mg/l i 1,2 mg/l). n mediu s-au mai adugat 0,1 mg/l AIB i zahr 3%. Microlstarii au fost inui n camera de cretere la temperatura de 25 2oC cu fotoperioada cu 16 h lumin/8 h ntuneric. Intensitatea luminoas a fost de 40-60 mol m1 sec-1 asigurat de lmpi Phylips fluorescente cu lumin alb (Vahdati et al. 2004). Culturile au fost meninute patru sptmni pe acelai mediu de cultur, dup care datele au fost colectate, nregistrate i analizate prin analiza varianei i a testului Duncan. 4.2.4. nrdcinarea microlstarilor nrdcinarea in vitro a microlstarilor presupune parcurgerea a dou etape: de inducere a nrdcinrii i de nrdcinare propriu-zis.
4.2.4.1 Inducerea nrdcinrii

n urma ncadrrii pe clase de lungime s-au selecionat pentru aceast etap microlstarii cei mai bine dezvoltai, cu lungimea cuprins ntre 2,5- 3 cm. Pentru etapa de inducere a nrdcinrii, am folosit mediu de baz 1 x MS la care am adugat auxin (AIB) n concentraie de 3 mg/l i zaharoz 3%.
4.2.4.2 nrdcinarea propriu-zis

La sfritul perioadei de inducie, am transferat plantele pe mediul de nrdcinare propriu-zis. Pentru nrdcinarea propriu-zis a plantelor aparinnd celor trei soiuri de nuc (Chandler, Franquette i Jupneti) am folosit mediul de baz x DKW la care am adugat vermiculit Granutec E. La amestec am mai adugat zaharoz (3%) i Phytagel (2.4 g/l), iar pH-ul a fost stabilit la 5.5. La sfritul etapei de nrdcinare am determinat urmtoarele caracteristici: procentul de explante nrdcinate, numrul total de rdcini principale, numrul total de rdcini secundare, lungimea medie a rdcinilor primare, numrul mediu de rdcini
17

primare pentru fiecare explant nrdcinat, numrul mediu de frunze pe plant i lungimea medie a tulpinii. Culturile au fost meninute n camera de cretere timp de 30 de zile, la temperatura o de 28 C, cu 16 h fotoperioada i intensitatea luminii ntre 40-60 M/s/m2. 4.2.5. Aclimatizarea n ser a plantelor Pentru aclimatizare s-au folosit: 8 plante din soiul Chandler, 10 plante din soiul Jupneti i 7 plante din soiul Franquette. Numrul de plante tratate cu Promalin a fost urmtorul: 4 plante din soiul Chandler, 5 plante din soiul Jupneti i 4 plante din soiul Franquette. Numrul total de plante tratate cu Dormex a fost urmtorul: 4 plante din soiul Chandler, 5 plante din soiul Jupneti i 3 plante din soiul Franquette. La sfritul perioadei de aclimatizare am analizat urmtoarele caracteristici: numrul final de plante aclimatizate dup tratarea cu Promalin i Dormex, nlimea medie a plantelor tratate cu Promalin i Dormex, numrul mediu de frunze pe plant n urma tratamentului cu Promalin i Dormex.

18

CAPITOLUL 5. REZULTATE I DISCUII

La nmulirea in vitro a nucului comun (J. regia L.) prin micropropare am observat o foarte bun pretabilitate a soiurilor romneti pentru aceast metod. Soiul romnesc Jupneti i dou soiuri strine (Chandler i Franquette) au fost folosite pe tot parcursul procesului de micropropagare pn la transferul n cmp deschis. Pentru testarea eficacitii a doi ageni de gelifiere alternativi (tapioca i fina de cassava) asupra stabilizrii microbutailor am folosit explante provenite de la trei soiuri romneti (Jupnei, Muscelean i Mihaela). Rezultatele i discuiile sunt prezentate n continuare. 5.1 ETAPA STABILIZRII IN VITRO A MICROBUTAILOR

5.1.1. Rezultate privind influena genotipului i a agentului de gelifiere asupra lungimii microlstarilor n prima variant a etapei stabilizrii microbutailor s-au folosit trei ageni de gelifiere convenionali (Gelrite, Phytagel i agar) i trei soiuri (Jupneti, Chandler i Franquette). Aranjarea sistematic a datelor experimetale este prezentat n tabelul de mai jos. Tabelul 3 /Table 3 Aranjarea sistematica a datelor pe variante si repetitii The systematic arrangement of datas on variants and repetitions Numarul Blocul (repetitia) Suma Media Denumirea variante Block (repetition) variantei variantei variantei No. of Sum of Variant Name of variant variant variant average I II III IV 11 Franquette/Phytagel 1.3 1.4 1.4 1.35 5.45 1.4 12 Franquette/Gelrite 0.9 1 1.1 1 4 1.0 13 Franquette/agar 1.2 1.3 1.2 1.3 5 1.3 21 Chandler/Phytagel 1.56 1.5 1.55 1.45 6.06 1.5 22 Chandler/Gelrite 1.4 1.3 1.32 1.25 5.27 1.3 23 Chandler/agar 1.5 1.4 1.35 1.2 5.45 1.4 31 Jupanesti/Phytagel 1.45 1.5 1.5 1.5 5.95 1.5 32 Jupanesti/Gelrite 0.84 1.1 1.1 1 4.04 1.0 33 Jupanest/agar 1.29 1.35 1.35 1.2 5.19 1.3 Suma B 11.44 11.85 11.87 11.25 46.41

19

Tabelul 4 /Table 4 nlimea microlstarilor (cm) dup 4 sptmni de la inocularea acestora sub influena a trei cultivare i trei ageni de gelifiere The height of microshoots (cm) after 4 weeks of the microcuttings innoculation under the influence of three cultivars and three geling agents Medie soi/ Agent de gelifiere/ Soi/ Cultivar Geling agent Cultivar average Phytagel Gelrite Agar 1.36 c 1d 1.25 c 1.20 A Franquette Chandler Jupanesti 1.52 a 1.49 a 1.32 c 1.01 d 1.36 c 1.3 c 1.40 B 1.27 A

Medie agent de gelifiere/ 1.46 M 1.1 N 1.3 O Geling agent average ds5% for the comparation of two cultivars average 0.06 ds5% for the comparation of two gelling agents 0.01 ds5% for the comparation of two cultivars average x two gelling agents 0.11 - 0.12 n aceast etap de stabilizare a microbutailor de nuc i de nceput a creterii lstarilor de nuc s-au folosit trei tipuri de ageni de gelifiere (Gelrite, Phytagel i agar). Dup patru sptmni de la inoculare cea mai bun stabilizare a microbutailor a fost nregistrat de soiul Chandler, iar cea mai slab stabilizare a microbutailor a fost nregistrat de soiul Franquette. Microbutaii aparinnd soiului Jupneti s-au adaptat, n general, mai greu pe toate variantele mediului de stabilizare, ns odat stabilizai microbutaii au lstrit destul de uor. n ceea ce privete rolul agenilor de gelifiere asupra creterii microlstarilor, din datele nregistrate am observat c, microlstarii au crescut cel mai bine pe mediul de cultur gelificat cu Phytagel. Cele mai slabe creteri ale microlstarilor de nuc le-am nregistrat pe mediile de cultur gelificate cu Gelrite. n ceea ce privete combinaiile dintre soi i mediu de cultur cu cele trei tipuri de ageni de gelifiere, cea mai sczut rat a creterii microlstarilor a fost nregistrat la soiul Franquette pe mediul de cultur DKW gelificat cu Gelrite i la soiul Jupneti pe mediul de cultur DKW gelificat cu Gelrite. Cele mai bune rezultate pentru soiul Chandler le-am obinut pe mediul de cultur DKW gelificat cu Phytagel.

20

Pentru soiul Jupneti am obinut de asemenea o stabilizare i o cretere bun a microlstarilor folosind acelai mediu de cultur DKW gelificat cu Phytagel. 5.1.2. Rezultate privind influena genotipului i a agentului de gelifiere alternativ asupra lungimii microlstarilor n a doua variant a etapei stabilizrii microbutailor s-au folosit doi ageni de gelifiere alternativi (fina de casava i tapioca) i un agent de gelifiere convenional (agarul) i repectiv trei soiuri romneti (Muscelean, Mihaela i Jupneti). Aranjarea sistematic a datelor experimetale este prezentat n tabelul de mai jos. Tabelul 5 /Table 5 Aranjarea sistematic a datelor pe variante si repetiii The systematic arrangement of datas on variants and repetitions Numarul Suma Media Blocul (repetitia) Denumirea variante variantei variantei Block (repetition) variantei No. of Sum of Variant Name of variant variant variant average I II III IV 11 Jupanesti/agar 0.85 1 0.75 1.45 4.05 1.0 Jupanesti/Cassava flour 12 0.6 0.66 0.68 1 2.94 0.7 13 Jupanesti/Tapioca 1.43 1.41 1.41 1.43 5.68 1.4 21 Mihaela/agar 1 0.75 0.85 1 3.6 0.9 Mihaela/Cassava 22 flour 0.48 0.5 0.47 0.41 1.86 0.5 23 Mihaela/Tapioca 1.1 1.19 1.21 1.23 4.73 1.2 31 Muscelean/agar 1.23 1.22 1.3 1.24 4.99 1.2 Muscelean/Cassava 32 flour 0.6 0.2 0.4 0.5 1.7 0.4 33 Muselean/Tapioca 1 1.35 1.24 1.2 4.79 1.2 suma B 8.29 8.28 8.31 9.46 34.34

21

Tabelul 6 /Table 6 nlimea lstarilor de nuc (cm) dup patru sptmni de la inoculare sub influena a trei cultivare i trei ageni de gelifiere The height of walnut shoots (cm) after 4 weeks of innoculation under the influence of three cultivars and three geling agents Media soi/ Agent de gelificare/ Soi/ Cultivar Geling agent Cultivar average Agar Cassava flour Tapioca Jupanesti 1.01 cdg 0.74 e 1.42 a 1.06 A Mihaela 0.9 de 0.47 f 1.18 bc 0.85 B Muscelean 1.25 ab 0.43 f 1.2 bc 0.96 C Media agent de gelifiere/ 1.1 M 0.5 N 1.3 O Geling agent average ds5% for the comparation of two cultivars average 0.12 ds5% for the comparation of two gelling agents 0.12 ds5% for the comparation of two cultivars average x two gelling agents 0.21 - 0.24 n urma experimentelor realizate cu cei doi ageni de gelifiere alternativi am observat c mediul de cultur a intrat ntr-un proces de degradare mult mai rapid, respectiv dup 14 zile de la preparare. n etapa de stabilizare, microbutaii au fost transferai pe mediu proaspt o dat la dou sptmni. Dup 30 de zile cea mai bun stabilizare a microbutailor a fost nregistrat de soiul Jupneti, iar cea mai slab stabilizare a microbutailor a fost nregistrat de soiul Muscelean. De asemenea i microbutaii aparinnd soiului Mihaela s-au caracterizat printr-o stabilizare destul de slab. n ceea ce privete rolul agenilor de gelifiere asupra creterii lstarilor, din datele nregistrate s-a observat c, microlstarii au crescut cel mai bine pe mediul de cultur gelificat cu tapioca. Cele mai slabe creteri ale microlstarilor de nuc s-au nregistrat pe mediile de cultur gelificate cu fina de casava. n ceea ce privete combinaiile dintre soi i mediu de cultur cu un agent de gelifiere alternativ, cea mai sczut rat a creterii microlstarilor a fost nregistrat la soiul Mihaela pe mediul de cultur DKW gelificat cu fina de casava i la soiul Muscelean pe acelai mediu de cultur DKW gelificat cu fina de casava. Cele mai bune rezultate au fost obinute de soiul Jupneti pe mediu de cultur DKW geleficat cu tapioca.

22

Spre deosebire de celelalte dou soiuri, n cazul soiului Muscelean, cea mai bun rat a stabilizrii s-a obinut pe mediul gelificat cu agar.

5.2 ETAPA DE MULTIPLICARE IN VITRO A MICROLSTARILOR La sfitul etapei de stabilizare microlstarii au fost separai i transferai apoi pe mediu de multiplicare. Pentru multiplicarea culturilor am folosit mediu de baz DKW i trei concentraii diferite de citochinin (BAP), respectiv 0,5 mg/l, 1 mg/l i 1,2 mg/l. 5.2.1. Rezultate privind influena genotipului i a concentraiei de citochinin asupra numrului de microlstari Datele referitoarea la influena genotipului i a concentraiei de citochinin asupra numrului de microlstari sunt prezentate sistematic n tabelul de mai jos.

Tabelul 7/Table 7 Aezarea sistematic pe variante i repetiii Sistematic arangement on variants and repetitions
Numarul variante No. of variant 11 12 13 21 22 23 31 32 33 Denumirea variantei Name of variant Chandler/BA0.5 Chandler/BA1 Chandler/BA1.2 Jupanesti/BA0.5 Jupanesti/BA1 Jupanest/BA1.2 Franquette/BA0.5 Franquette/BA1 Franquette/BA1.2 suma B Blocul (repetitia) Block (repetition) I 1 1.25 1.25 1.5 2 1.25 1 1.25 1.5 12 II 1 1.5 1.25 1.25 2 1.5 1 1.5 1.5 12.5 III 1 1.5 1.5 2 2.25 1 1 1.5 1.25 13 IV 1 1.25 1.25 1.25 2 1 1 1.5 1.5 11.75 Suma variantei Sum of variant 4 5.5 5.25 6 8.25 4.75 4 5.75 5.75 49.25 Media variantei Variant average 1.0 1.4 1.3 1.5 2.1 1.2 1.0 1.4 1.4

23

Tabelul 8/Table 8 Numrul microlstarilor dup 4 sptmni de la inoculare sub influena a trei cultivare i trei ageni de gelifiere The number of microshoots (cm) after 4 weeks of innoculation under the influence of three cultivars and three gelling agents Citochinin Citochinin Soi Cultivar BAP (0.5mg/l) 1 de 1.5 b 1e 1.17 O BAP (1 mg/l) 1.38 bc 2.06 a 1.44 bc 1.63M BAP (1.2mg/l) 1.31 bc 1.19 cde 1.44 bc 1.31N Media soi/ Cultivar average 1.23 C 1.58 A 1.29 B

Chandler Jupanesti Franquette Media agent de gelifiere/Geling agent average

Dup patru sptmni de la transferul plantelor pe mediul de multiplicare, cea mai bun rat de multiplicare a microlstarilor a fost nregistrat la soiul Jupneti, iar cea mai slab rat de multiplicare a microlstarilor a fost nregistrat la soiul Franquette. Microlstarii aparinnd soiului Chandler s-au caracterizat printr-o rat de multiplicare medie. n ceea ce privete influena citochininei asupra multiplicrii microlstarilor, din datele nregistrate am observat c, numrul cel mai mare de microlstari s-a nregistrat pe mediul de cultur cu BAP n concentraie de 1 mg/l. Cea mai slab rat de multiplicare a microlstarilor de nuc s-a nregistrat pe mediile de cultur i BAP n concentraie de 0.5 mg/l. n ceea ce privete combinaiile dintre soi i mediu de cultur cu BAP, cea mai sczut rat de multiplicare a microlstarilor a fost nregistrat la soiul Chandler i mediul de cultur DKW cu BAP n concentraie de 0,5 mg/l i la soiul Franquette pe acelai mediu de cultur DKW cu BAP n concentraie de 0,5 mg/l. Cele mai bune rezultate au fost obinute la soiul Jupneti pe mediul de cultur DKW cu BAP n concentraie de 1 mg/l. Pe mediul de cultur DKW cu 1 mg/l BAP cea mai mare rat a proliferrii a fost obinut la soiul Jupneti (n medie 2-3 microlstari).

24

5.2.2. Rezultate privind influena genotipului i a concentraiei de citochinin asupra nlimii microlstarilor Influena concentraiei de citochinin asupra creterii n nlime a microlstarilor de nuc a fost analizat dup patru sptmni de la tranferul microlstarilor pe mediul de multiplicare. Rezultatele obinute sunt prezentate n tabelele de mai jos. Tabelul 9/Table 9 Aranjarea sistematic pe variante i repetiii Sistematic arangement on variants and repetitions
Numarul variante No. of variant 11 12 13 21 22 23 31 32 33 Denumirea variantei Name of variant Chandler/BA0.5 Chandler/BA1 Chandler/BA1.2 Jupanesti/BA0.5 Jupanesti/BA1 Jupanest/BA1.2 Franquette/BA0.5 Franquette/BA1 Franquette/BA1.2 suma B Blocul (repetitia) Block (repetition) I 2.35 3.78 3.31 3 3.78 3.46 1.58 2.65 2.19 26.1 II 2.2 3.8 3.34 2.62 3 3.41 1.85 2.64 2.35 25.21 III 2.55 3.82 3.38 2.75 3.44 3.45 1.48 2.78 2.35 26 IV 2.52 3.8 3.45 2.72 3.4 3.5 1.65 3.75 2.38 27.17 Suma variantei Sum of variant 9.62 15.2 13.48 11.09 13.62 13.82 6.56 11.82 9.27 104.48 Media variantei Variant average 2.4 3.8 3.4 2.8 3.4 3.5 1.6 3.0 2.3

Tabelul 10 /Table 10 nlimea microlstarilor de nuc (cm) la 4 sptmni de la inoculare sub influena a trei cultivare i trei concentraii de BAP The height of walnut microshoots (cm) after 4 weeks of innoculation under the influence of three cultivars and three BAP concentrations Soi/ Cultivar Chandler Jupanesti Franquette Media agent Citochinin Cytokinin BAP (0.5mg/l) 2.41 d 2.77 c 1.64 e 2.27 M BAP (1 mg/l) 3.8 a 3.41 b 2.96 c 3.39 N BAP (1.2mg/l) 3.37 b 3.46 b 2.32 d 3.05 O Media soi/ Cultivar average 3.19 A 3.21 A 2.30 B

25

de gelificare/ Geling agent average

ds5% for the comparation of two cultivars average 0.19 ds5% for the comparation of two BAP concentrations 0.19 ds5% for the comparation of two cultivars average x BAP concentrations 0.33 - 0.4

Din datele obinute rezult c, cea mai mare cretere n nlime a microlstarilor a fost nregistrat la soiul Jupneti, iar cea mai mic cretere n nlime a microlstarilor a fost nregistrat la soiul Franquette. De asemenea, creterea n nlime a microlstarilor aparinnd soiului Chandler a fost destul de bun. n ceea ce privete influena citochininei asupra creterii n nlime a microlstarilor, din datele nregistrate am observat c, microlstarii au crescut cel mai bine pe mediul de cultur cu BAP n concentraie de 1 mg/l. Cel mai mic numr de microlstari s-a nregistrat pe mediile de cultur cu BAP n concentraie de 0.5 mg/l. n ceea ce privete combinaiile dintre soi i mediu de cultur cu BAP, cel mai sczut nivel de cretere n nlime a microlstarilor a fost nregistrat la soiul Franquette pe mediul de cultur DKW cu BAP n concentraie de 0,5 mg/l . Cea mai mare cretere n nlime a microlstarilor s-a nregistrat la combinaia Chandler pe mediul de cultur DKW cu BAP n concentraie de 1 mg/l. 5.2.3. Rezultate privind influena genotipului i a concentraiei de citochinin asupra numrului de frunze/microlstar Un alt aspect important analizat n etapa de multiplicare a fost studiul influenei concentraiei de citochinin asupra numrului de frunze pe microlstari. Datele obinute sunt prezentate sistematic n tabelele de mai jos. Tabelul 11/Table 11 Aranjarea sistematic a datelor pe variante i repetiii Sistematic arangement of datas on variants and repetitions
Numarul variante No. of variant 11 12 13 21 22 Denumirea variantei Name of variant Chandler/BA0.5 Chandler/BA1 Chandler/BA1.2 Jupanesti/BA0.5 Jupanesti/BA1 Blocul (repetitia) Block (repetition) I 4.5 7.25 6.25 4.25 7.75 II 4.25 7.25 6.25 4.5 7.5 26 III 4.5 7.5 6.5 4.5 7.5 IV 4.5 7.25 6.5 4.25 7.5 Suma variantei Sum of variant 17.75 29.25 25.5 17.5 30.25 Media variantei Variant average 4.4 7.3 6.4 4.4 7.6

23 31 32 33

Jupanest/BA1.2 Franquette/BA0.5 Franquette/BA1 Franquette/BA1.2 suma B

6.75 3.75 5.5 4 50

6.5 3 6 4.75 50

6.5 3.25 5.5 4.75 50.5

6.75 3.25 5.75 4.5 50.25

26.5 13.25 22.75 18 200.75

6.6 3.3 5.7 4.5

Tabelul 12 /Table 12 Numrul de frunze pe un microlstar la 4 sptmni de la inoculare sub influenta a trei cultivaruri si trei concentratii de BAP The number of leaves on a microshoot after 4 weeks of innoculation under the influence of three cultivars and three BAP concentrations Soi/ Cultivar Citochinin Cytokinin BAP (0.5mg/l) 4.44 c 4.38 c 3.31 e 4.04 M BAP (1 mg/l) 7.31 a 7.56 a 5.69 d 6.85 N BAP (1.2mg/l) 6.38 b 6.63 b 4.5 c 5.83 O Media soi/ Cultivar average 6.04 B 6.19 B 4.50 A

Chandler Jupanesti Franquette Media agent de gelificare/ Geling agent average

ds5% for the comparation of two cultivars average 0.18 ds5% for the comparation of two BAP concentrations 0.18 ds5% for the comparation of two cultivars average x BAP concentrations 0.32 - 0.4

Din datele obinute rezult c, cel mai mare numr de frunze/microlstari a fost nregistrat la soiul Jupneti (Fig. 29), iar cel mai mic numr de microlstari a fost nregistrat la soiul Franquette. De asemenea i la soiul Chandler numrul de frunze/microlstari a fost destul de mare. n ceea ce privete influena citochininei asupra numrului de frunze/microlstari, cele mai bune rezultate au fost obinute pe mediul de cultur cu BAP n concentraie de 1 mg/l. Cel mai mic numr de frunze/microlstari s-a nregistrat pe mediile de cultur cu BAP n concentraie de 0.5 mg/l. n ceea ce privete combinaiile dintre soi i mediu de cultur cu BAP, cel mai mic numr de frunze/microlstari a fost nregistrat la soiul Franquette pe mediul de cultur DKW cu BAP n concentraie de 0,5 mg/l.
27

Cel mai mare numr de frunze/microlstari s-a nregistrat la soiul Chandler pe mediul de cultur DKW cu BAP n concentraie de 1 mg/l. n cazul variantei soi i mediu de cultur cu BAP n concentraie de 1,2 mg/l cel mai mare numr de frunze/microlstari a fost nregistrat la soiul Jupneti. 5.2.4. Rezultate privind influena genotipului i a concentraiei de citochinin asupra lungimii frunzelor/microlstari Datorit faptului c aparatul foliar reprezint principala cale de absorbie a energiei i a substanelor nutritive necesare dezvoltrii plantelor dup depirea etapelor de nmulire in vitro, o alt caracteristic important care am analizat-o n etapa de multiplicare a fost studiul influene soiului i a concentraiei de citochinin asupra lungimii frunzelor/microlstari. Datele obinute sunt prezentate sistematic n tabelele urmtoare. Tabelul 13 /Table 13 Aranjarea sistematic a datelor pe variante i repetiii Sistematic arangement of datas on variants and repetitions
Numarul variante No. of variant 11 12 13 21 22 23 31 32 33 Denumirea variantei Name of variant Chandler/BA0.5 Chandler/BA1 Chandler/BA1.2 Jupanesti/BA0.5 Jupanesti/BA1 Jupanest/BA1.2 Franquette/BA0.5 Franquette/BA1 Franquette/BA1.2 suma B Blocul (repetitia) Block (repetition) I 1.9 2.8 2.5 1.8 2.79 2.25 1.25 2.67 2.25 20.21 II 1.85 2.71 2.7 1.67 2.72 2.24 1.27 2.72 2.29 20.17 III 1.8 2.77 2.3 1.79 2.77 2.28 1.39 2.89 2.3 20.29 IV 1.7 2.75 2.38 1.73 2.89 2.35 1.38 2.76 2.26 20.2 Suma variantei Sum of variant 7.25 11.03 9.88 6.99 11.17 9.12 5.29 11.04 9.1 80.87 Media variantei Average of variant 1.8 2.8 2.5 1.7 2.8 2.3 1.3 2.8 2.3

28

Tabelul 14 /Table 14 The leaves lenght after 4 weeks of innoculation under the influence of three cultivars and three BAP concentrations Lungimea frunzelor dup 4 sptmni de la inoculare sub influenta a trei cultivare si trei concentratii de BAP Citochinin Cytokinin BAP (0.5mg/l) 1.81 d 1.75 d 1.32 e BAP (1 mg/l) 2.76 a 2.79 a 2.76 a BAP (1.2mg/l) 2.47 b 2.28 c 2.28 c Media soi/ Cultivar average 2.35 A 2.27 A 2.12 B

Soi/ Cultivar

Chandler Jupanesti Franquette Media agent de gelificare/ Geling agent average

1.63 M

2.77 N

2.34 O

ds5% for the comparation of two cultivars average 0.08 ds5% for the comparation of two BAP concentrations 0.08 ds5% for the comparation of two cultivars average x BAP concentrations 0.13 - 0.15

Din datele obinute rezult c, cea mai mare cretere n lungime a frunzelor/microlstari a fost nregistrat la soiul Jupneti, iar cea mai mic cretere n lungime a frunzelor/microlstari a fost nregistrat la soiul Franquette. n ceea ce privete influena citochininei asupra creterii n lungime a frunzelor, din datele nregistrate am observat c, frunzele s-au dezvoltat mai bine pe mediul de cultur cu BAP n concentraie de 1 mg/l. Pe mediile de cultur cu BAP n concentraie de 0.5 mg/l frunzele s-au dezvoltat cel mai puin. n ceea ce privete combinaiile dintre soi i mediu de cultur cu BAP, cea mai slab cretere n lungime a frunzelor a fost nregistrat la soiul Franquette pe mediul de cultur DKW cu BAP n concentraie de 0,5 mg/l. n cazul variantei soi i mediu de cultur cu BAP cea mai mare cretere n lungime a frunzelor a fost nregistrat la soiul Jupneti pe mediul de cultur DKW cu BAP n concentraie de 1mg/l, dar i la celelalte dou soiuri, respectiv soiul Chandler pe mediul de cultur DKW cu BAP n concentraie de 1 mg/l i soiul Franquette pe mediul de cultur DKW cu BAP n concentraie de 1mg/l s-au nregistrat creteri n lungime a frunzelor apropiate de valoarea maxim.
29

Dup analiza final a etapei de multiplicare se poate spune c, soiul romnesc Jupneti se caracterizeaz printr-o bun capacitate de multiplicare dar i printr-o bun capacitate de dezvoltare a aparatului foliar. Pe toat durata etapei de multiplicare in vitro a microlstarilor a fost meninut temperatura n jurul valorii de 25oC. La acest nivel al temperaturii microlstarii s-au dezvoltat destul de bine, nefiind prezent fenomenul de necrozare a frunzelor. 5.3 ETAPA DE NRDCINARE IN VITRO A PLANTELOR DE NUC 5.3.1. Importana temperaturii, carbohidrailor, auxinei i a perioadei de inducie pentru inducerea nrdcinrii plantelor de nuc Temperatura Pentru etapa de inducere a nrdcinrii am stabilit un nivel al temperaturii la 220C. Carbohidraii reprezint principala surs de energie pentru culturile in vitro, caz n care fotosinteza este redus considerabil. Pentru asigurarea unei bune dezvoltri a culturilor in vitro trebuie respectate cu atenie urmtoarele caraceteristici ale luminii: intensitatea, perioada de iluminare i tipul de iluminare. Timpul de inducie pentru cultura in vitro a nucului a fost de 8 zile. Pentru inducerea nrdcinrii microlstarilor de nuc, am folosit ca mediu de baz: 1 x MS suplimentat cu 3 mg/l AIB, 4 % zaharoz i 9g/l agar Kobe. pH-ul mediului a fost de 5.5, timpul de inducie a fost de 8 zile la ntuneric. n urma ncadrrii pe clase de lungime s-au selecionat pentru etapa de inducere a nrdcinrii microlstarii cel mai bine dezvoltai cu lungimea cuprins ntre 2,5-3cm. Dup selecia pe clase de lungime, am ndeprtat calusul de la fiecare microlstar prin secionare.

5.3.2. Rezultate privind influena genotipului asupra nrdcinrii propriu-zise a plantelor de nuc

Mediul de cultur a fost suplimentat cu 3% zaharoz, Phytagel (2.4 g/l), iar pH-ul a fost stabilizat la 5.5. Dup stabilirea structurii amestecului, acesta s-a sterilizat n autoclav timp de 15 minute la 1210C. Plantulele au fost meninute pe substratul de nrdcinare in vitro o perioad de 30 de zile, dup care datele au fost observate, nregistrate i analizate.

30

40 30 Numr total de rdcini 20 principale 10 0 DKW:Vermiculit (1:1.25) Chandler Jupneti Franquette

Fig. 3. Numarul total de rdcini principale n funcie de soi Fig. 3. Total number of principal roots depending on variety Din datele prezentate mai sus se poate spune c amestecul: 1x4 DVW/vermiculit (1:1.25) a favorizat dezvoltarea plantelor provenite de la cele trei soiuri de nuc. Soiul Jupneti a nregistrat cel mai mare numr total de rdcini principale, respectiv 36 de rdcini/numr total de plante nrdcinate, iar cela mai mic numr total de rdcini a fost nregistrat de soiul Franquette, respectiv 19 rdcini/numr total de plante nrdcinate. Soiul Chandler a avut o evoluie destul de bun, nregistrnd un numr de 26 de rdcini principale/numr total de plante nrdcinate.

1.3 1.25 Lungimea medie 1.2 a rdcinilor 1.15 principale (cm) 1.1 1.05 1 1 DKW:Vermiculit (1:1.25) Chandler Jupneti Franquette

Fig. 4. Lungimea medie a rdcinilor principale n funcie de soi Fig. 4. Average lenght of principal roots depending on variety

31

n ceea ce privete lugimea medie a rdcinilor principale, la soiul Jupneti s-a nregistrat cea mai bun cretere, respectiv 1.30.09 cm, iar soiul Franquette a nregistrat cea mai slab cretere, respectiv 1.100.06 cm.

70 60 50 Procent de 40 nrdcinare 30 20 10 0 DKW:Vermiculit (1:1.25) Chandler Jupneti Franquette

Fig. 5. Procentul de nrdcinarea plantelor de nuc n funcie de soi Fig. 5. Rooting percentage of walnut plants depending on variety

6.00 5.00 4.00 Numr mediu de 3.00 frunze/plant 2.00 1.00 0.00 1 DKW:Vermiculit (1:1.25) Chandler Jupneti Franquette

Fig. 6. Numrul mediu de frunze/plant n funcie de soi Fig. 6. Average number of leaves/ plant depending on variety Cea mai mare valoare a numrului mediu de frunze/plant a fost nregistrat la soiul Jupneti, respectiv 5.60.20, iar cea mai mic valoare a numrului mediu de frunze/plant a fost nregistrat la soiul Franquette, respectiv 4.140.14.

32

14 12 10 Lungimea medie a tulpinii (cm) 8 6 4 2 0 1 DKW:Vermiculit (1:1.25) Chandler Jupneti Franquette

Fig. 7. Lungimea medie a tulpini n funcie de soi Fig. 7. Average stem lenght depending on variety n ceea ce privete lungimea medie a tuplinii, cea mai bun cretere a fost nregistrat la soiul Jupneti, respectiv 13.010.41 cm, iar creterea cea mai mic a fost nregistrat la soiul Franquette, respectiv 10.680.34 cm. n ceea ce privete numrul mediu de rdcini primare/numr de explante nrdcinate cea mai mare valoare a fost nregistrat la soiul Jupneti, respectiv 3.60.22, iar cel mai mic numr mediu de rdcini primare/numr de explante nrdcinate a fost nregistrat la soiul Franquette, respectiv 2.710.29.

5.4 ETAPA DE ACLIMATIZARE N SER A PLANTELOR DE NUC La sfritul etapei de nrdcinare, plantele tinere de nuc au fost transferate n ser, dup ce n prealabil, s-a pregtit substratul de cultur i condiiile de cretere. Pentru stimularea creterii plantelor s-au aplicat doi regulatori de cretere: Promalin (19g/l benziadenin i 19g/l giberelin) i Dormex (520g/l hidrogen cianamid). Factorii principali care condiioneaz reuita procesului de aclimatizare sunt urmtorii: calitatea plantelor destinate aclimatizrii (dormana mugurilor terminali, sistemul radicular); calitatea substratului utilizat pentru aclimatizarea plantelor; condiiile de mediu din interiorul spaiului de aclimatizare (temperatura, umiditatea, lumina). Numrul de rdcini/plant a fost n medie de 3 (ntre 2 i 3 rdcini principale la soiul Franquette i 2 -4 rdcini principale la soiul Jupneti).

33

Ca i substrat de aclimatizare s-a folosit Steckmedium (substrat special creat pentru cultura in vitro a nucului n scopul mbuntirii dezvoltrii sistemului foliar i a eliminrii necrozrii plantelor) furnizat de firma Klasmann-Deilman (Germania). Dup plantarea n ghivece, pe parcursul perioadei de aclimatizare datele au fost urmrite, nregistrate i analizate. Tabelul 15 /Table 15 Sistematizarea datelor n funcie de regulatori de cretere utilizai (1) Datas sistematisation depending on growth regulators used (1)
Caracteristici Characteristics Soiul Cultivar Numr total de plante folosite la aclimatizare/ Total no. of plants for aclimatization Numr Numr final plante tratate de plante cu Promalin/ aclimatizate/ No. of plants Final no. of treated with acclimataded Promalin plants Numr plante tratate cu Dormex/ No. of plants treated with Numr final de plante aclimatizate/ Final no. of acclimataded plants

Chandler Jupneti Franquette

8 10 7

4 5 4

3 5 2

4 5 3

4 4 1

Pe parcursul aclimatizrii plantelor a fost meninut o temperatur cu valori cuprinse ntre 22 i 240C, la un nivel maxim al umiditii (100%). Tabelul 16/Table 16 Sistematizarea datelor n funcie de regulatori de cretere utilizai (2) Datas sistematization depending on growth regulators used (2)
Caracteristici Characteristics

Soiul/ Cultivar

% de plante aclimatizate/ % of aclimatized plants

Plante tratate cu Promalin/

Plante tratate cu

Numr mediu de nlimea medie a frunze/plant la plantelor la sfritul sfritul perioadei de perioadei de aclimatizare/ aclimatizare (cm)/ Average number of Average height of plants leaves/plant at the end (cm) at the end of of the aclimatization aclimatization period period Plante Plante Plante Plante tratate cu tratate cu tratate cu tratate cu Promalin/ Dormex/ Promalin/ Dormex/

34

Plants treated with promalin Chandler Jupneti Franquette 75 100 50

Dormex/ Plants Plants Plants Plants Plants treated treated treated treated treated with with with with with promalin Dormex promalin Dormex Dormex 100 210.39 190.53 5.670.33 5.250.25 75 230.39 21.230.51 6.40.4 6.250.25 25 20.350.15 17.5 4.100.5 4

23.50 23.00 22.50 22.00 nlimea medie a 21.50 21.00 plantelor (cm) 20.50 20.00 19.50 19.00 18.50 1 Soiul

Chandler Jupneti Franquette

Fig. 8. nlimea medie a plantelor tratate cu Promalin Fig. 8. Average plants height treated with Promalin Din cauza complexitii procesului de aclimatizare, n aceast etap s-a realizat un experiment pilot pentru a se urmri evoluia plantelor de nuc sub influena a dou tipuri de regulatori de cretere. n urma tratrii plantelor cu cele dou tipuri de regulatori de cretere s-a observat c, plantele tratate cu Promalin s-au dezvoltat mult mai bine dect plantele tratate cu Dormex. Dup tratarea plantelor cu Promalin, cea mai mare nlime medie a fost nregistrat de soiul Jupneti, respectiv 230.39 cm, iar cea mai mic nlime medie a fost nregistrat de soiul Franquette, respectiv 20.350.15 cm.

35

25 20 nlimea medie a plantelor (cm) 15 10 5 0 1 Soiul Chandler Jupneti Franquette

Fig. 9. nlimea medie a plantelor tratate cu Dormex Fig. 9. Average plants height treated with Dormex n cazul tratrii plantelor cu Dormex, la soiul Jupneti s-a nregistrat cea mai mare nlime medie de 21.230.51 cm, iar la soiul Franquette s-a nregistrat cea mai mic nlime, respectiv 17.5 cm.

7 6 5 Numr mediu de 4 frunze/plant 3 2 1 0 1 Soiul Chandler Jupneti Franquette

Fig. 10. Numrul mediu de frunze/plant dup tratamentul cu Promalin Fig. 10. Average number / plant after Promalin treatement n ceea ce privete numrul mediu de frunze/plant, la plantele tratate cu Promalin, cel mai mare numr mediu de frunze/plant a fost nregistrat la soiul Jupneti, respectiv 6.40.4, iar cel mai mic numr mediu de frunze/plant a fost nregistrat la soiul Franquette, respectiv 4.100.5.

36

7 6 5 Numr mediu de 4 frunze/plant 3 2 1 0 1 Soiul

Chandler Jupneti Franquette

Fig. 11. Numrul mediu de frunze/plant dup tratamentul cu Dormex Fig. 11. Average number / plant after Dormex treatement n cazul plantelor tratate cu Dormex,cel mai mare numr mediu de frunze/plant a fost nregistrat la soiul Jupneti, respectiv 6.250.25, iar cel mai mic numr mediu de frunze/plant a fost nregistrat la soiul Franquette, respectiv 4. Din datele prezentate mai sus nu se poate spune cu certitudine c la scar mare se vor obine aceleai rezultate, dar cu siguran se poate spune c, prin folosirea regulatorilor de cretere se va mbunti dezvoltarea plantelor i n acelai timp se va evita blocarea creterii apex-ului. 5.5 TRANSFERUL PLANTELOR DE NUC N CMP DESCHIS

Etapa de transfer cmp a plantelor de nuc este un proces complex care a rmas la stadiul de analiz teoretic . Pentru transferul plantelor n cmp deschis este necesar cunoaterea factorilor care condiioneaz reuita culturii i anume: - existena terenului pentru plantarea puieilor cu urmtoarele caracteristici: gradul de favorabilitate a zonei unde este amplasat terenul, expunere, tipul solului; - cerinele solului: elemente nutritive, corectarea pH-ului solului dac este necesar, nivelarea terenului dac este cazul; - nivelul mediu anual de precipitaii, temperaturile medii anuale n zona unde este amplasat terenul; - riscul culturii nucicole de expunere la boli i duntori; - efectuarea lucrrilor de plantare i ntreinere; - existena/inexistena posibilitilor de desfacere pe pia n mod direct, fr intermediari, a produselor nucicole;

37

meninerea unei legturi permanente ntre latura tiinific i cea practic, pentru ca, pe de o parte, s existe progresul tiinific, iar pe de alt parte s existe spaiul (pmntul) de punere n practic a progresului tiinific. Deoarece transferul i controlul ulterior al plantelor de nuc n cmp deschis presupune o munc laborioas, aceast etap rmne subiect deschis pentru ali cercettori sau viitori cercettori interesai n cultura nucului.

38

CAPITOLUL 6. CONCLUZII I RECOMANDRI

Metoda de dezinfecie a materialului biologic s-a dovedit a fi foarte eficient. Prin manipularea corespunztoare a explantelor, s-au evitat riscurile de infecie extern. In cazul n care puieii de la care se recolteaz explantele de nuc nu sunt liberi de boli, n maxim dou sptmni de la inoculare se observ infecii pe mediul de cultur. n acest caz, puieii de la care s-a recoltat materialul biologic s-au dovedit a fi liberi de boli. Mediul de cultur DKW cu 1 mg/l BAP, 0.1 mg/l AIB i 2.1 g/l Phytagel a constituit cea mai bun variant pentru realizarea stabilizrii explantelor. Cele mai bune rezultate s-au nregistrat pentru soiul romnesc Jupneti, fiind confirmate rezultatele obinute de Catita arpe i prezentate n teza sa de doctorat n anul 2002. Mediul de cultur n care s-au folosit perlele de tapioca s-a dovedit eficient n stabilizarea explantelor de nuc. i n aceast variant de mediu, cu soiul Jupneti s-au obinut cele mai bune rezultate n etapa de stabilizare a culturilor. Tapioca, din punctul de vedere al rentabiliii economice este de 40-50 de ori mai ieftin dect agarul. Mediul de cultur poate fi foarte bine mbuntit din punct de vedere ionic prin folosirea perlelor de tapioca, prin aceasta realizndu-se o bun rat a diviziunii celulare dup cum menioneaz (Endale and Santhanarayana, 2001). Pentru inducerea nrdcinrii am folosit mediu de cultur MS cu auxin (AIB) n concentraie de 3 mg/l. Perioada de inducie a fost de 8 zile i temperatura din camera de cretere a fost de 22oC. Pentru nrdcinarea in vitro propriu-zis a plantelor de nuc s-a folosit o singur variant de mediu de cultur, perioada de timp n care culturile au fost inute la nrdcinat fiind de 30 de zile. Mediul de cultur pentru nrdcinarea in vitro propriu-zis a plantelor de nuc a constat dintr-un amestec format din: mediu de baz DKW fr regulatori de cretere i vermiculit Granutec E. Soiul Jupneti s-a pretat cel mai bine pentru mediul de cultur specificat mai sus, obinndu-se cea mai bun rat a nrdcinrii. nrdcinarea bun a plantelor este condiionat de: alegerea unei variante optime a mediului de inducie, realizarea unui amestec corespunztor de mediu de cultur i vermiculit i de calitatea i proveniena materialului biologic folosit. Vermiculita n amestec cu mediul DKW, n proporii corespunztoare, asigur un echilibru bun ntre oxigen i ap, iar capacitatea de penetrare a substratului este mult mbuntit. Oxigenul are rolul de a mbunti capacitatea de aerare a mediului de nrdcinare, iar coninutul de ap asigur o umiditate corespunztoare, fapt confirmat i de (Jayallemand, Capelli, 1992).

39

De asemenea, de echilibrul dintre componentele substratului de cultur (vermiculit i mediu DKW) depinde i gradul de disponibilitate al carbohidrailor pentru dezvoltarea sistemului radicular (Haissig, 1982; Jay Allemand and Cornu, 1986; Jayallemand, Capelli, 1992). n etapa de aclimatizare, folosirea substratului Steckmedium, s-a dovedit a fi foarte eficient. n cadrul acestei etape plantele s-au dezvoltat n condiii de lumin natural, iar nivelul temperaturii i al umiditii au fost controlate. Intervalul de temperatur asigurat pentru plantele puse la aclimatizat n ser a fost de o 22-24 C, iar nivelul umiditii a fost de 100%. Pentru transferul n cmp este necesar ca plantele de nuc s aib un sistem radicular bine dezvoltat i o bun capacitate autotrof. Din lis de spaiu i timp, etapa de transfer a plantelor n cmp rmne un subiect deschis care necesit a fi mbuntit.

40

BIBLIOGRAFIE

1. 2. 3. 4.

5.

6. 7. 8. 9.

10.

11. 12. 13.

14. 15. 16. 17. 18.

Berros, B., et al., Rooting studies on "in vitro" walnut tissues: aging effect. International Walnut Meeting, 1993(311): p. 105-116. Botu, I., Lista soiurilor de nuc din Romania. 2008. Bourrain, L. In vitro walnut micropropagation "Juglans regia L. application". in COST 873. 2009. Murcia, Spain. Caboni, E. and C. Damiano, In vitro propagation of walnut (Juglans regia L.): Critical factors for the induction of the rooting response. Proceedings of the Fifth International Walnut Symposium, 2006(705): p. 329-333. Cicek, A., et al., A comparative economic analysis between walnut and its alternative crops in the region (a case study of Niksar-Tokat-Turkey). Proceedings of the Fourth International Walnut Symposium, 2001(544): p. 605-616. Cociu, V., et al., Culturile nucifere, ed. V. Cociu. 2003: Editura CERES, Bucuresti. 351. Cociu, V., et al., Nucul, alunul, castanul i alte culturi nucifere. 2007: Editura CONPHYS. 133. Collin, H.A. and S. Edwards, Plant Cell Culture ed. D.o.B.a.C. David Rickwood, et al. 1998 BIOS Scientific Publishers Ltd. 158. Cornu, D. and C. Jay Allemand, Micropropagation of Hybrid Walnut Trees (JuglansNigra X Juglans-Regia) through Culture and Multiplication of Embryos. Annales Des Sciences Forestieres, 1989. 46: p. S113-S116. DolcetSanjuan, R., et al., Micropropagation of walnut trees (Juglans regia L) and response to arbuscular mycorrhizal inoculation. Agronomie, 1996. 16(10): p. 639645. Driver, J., Method for acclimatizing and propagating plant tissue culture shoots. 1986, Plant Research Lab. Driver, J.A., A.M. Kuniyuki, and R. Rodrigues, In Vitro Propagation of Paradox Walnut Rootstock (Juglans Hindsii. J. Regia). ?, 1981. ? Endale, G. and B.N. Santhanarayana, Tapioca -A New and Cheaper Alternative to Agar for Direct in Vitro Shoot Regeneration and Microtuber Production from Nodal Cultures of Potato. African Crop Science Journal, 2001. 9(1): p. 1-8. Frutos Tomas, D., Diferenciacion floral en vergel de los cultivares de nogal (Juglans regia, L.) enraizados in vitro. Actas de Horticultura 2003(39): p. 271-273. Germain, E., J.P. Prunet, and A. Garcin, Le noyer. 1999: CTIFL FRANCE. 277. Gruselle, R., N. Badia, and P. Boxus, Walnut micropropagation: first results. Acta Horticulturae 212, 1987: p. 511-515. Gruselle, R. and P. Boxus, Walnut Micropropagation. First International Symposium on Walnut Production, 1990. 284: p. 45-52. Hacketta, W.P., C. Leslieb, and G. McGranahanc, Acclimatization of In Vitro Derived Plantlets of Walnut Rootstock Clones. III International Symposium on

41

Acclimatization and Establishment of Micropropagated Plants, 2009(812): p. 427430. 19. Haissig, B.E., Carbohydrate and amino acid concentrations during adventitious root primordium development in Pinus bankasiana Lamb. cuttings. For. Sci.,, 1982. 28: p. 833-841. 20. Hasey J., B.B. Westerdahl, and B.D. Lampinen, Long-term performance of own rooted chandler vs chandler on paradox rootstock: the walnut research reports annual proceedings. Sacramento, CA: The Walnut Marketing Board of California, 1999: p. 87-92. 21. Hasey, J.K., et al., Yield performance of own-rooted 'Chandler' walnut versus 'Chandler' walnut on Paradox rootstock. Proceedings of the Fourth International Walnut Symposium, 2001(544): p. 489-493. 22. Jay Allemand, C. and D. Cornu, Culture in vitro d'embryons isol6s de noyer commun (Juglans regia L. ). Ann. Sci. For., 1986. 43: p. 189-198. 23. Jayallemand, C., P. Capelli, and D. Cornu, Root Development of Invitro Hybrid Walnut Microcuttings in a Vermiculite-Containing Gelrite Medium. Scientia Horticulturae, 1992. 51(3-4): p. 335-342. 24. JayAllemand, C., et al., Micropropagation of hybrid walnut trees: some factors involved in rooting. International Walnut Meeting, 1993(311 ): p. 117-124. 25. Kurtz, W.B. and H.E. Garrett, Economic-Aspects of Eastern Black-Walnut Management. First International Symposium on Walnut Production, 1990. 284: p. 319-325. 26. Leal, D., et al., Micropropagation of Juglans regia L, in Protocols for Micropropagation of Woody Trees and Fruits. 2007. p. 381-390. 27. Lopez, J.M., Field behaviour of self-rooted walnut trees of different cultivars produced by tissue culture and planted in Murcia (Spain). Proceedings of the Fourth International Walnut Symposium, 2001(544): p. 543-546. 28. Lopez, J.M., Walnut tissue culture: Research and field applications. Black Walnut in a New Century, 2004. 243: p. 146-152. 29. Marques Silva, D.J. and J.S.D. Dias, In vitro shoot culture on Juglans regia L.: repeated subculturing on juvenile and adult material. Proceedings of the 3rd Intern. Walnut Congress, 1997: p. 251-256. 30. Murashige, T. and F. Skoog, A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum, 1962. 15(3): p. 473-497. 31. Navatel, J.C. and L. Bourrain, Plant production of walnut Juglans regia L. by in vitro multiplication. Proceedings of the Fourth International Walnut Symposium, 2001(544): p. 465-471. 32. Prunet, J.P. and T. Ginibre, Comportement agronomique des nouveaux portegreffes CTIFL Juglans regia. Travaux de Recherche et dexprimentation.Station Exprimentale de Creysse. 2000. 33. Rai, M.K., Current advances in mycorrhization in micropropagation. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 2001. 37(2): p. 158-167.

42

34.

35.

36.

37.

38. 39. 40.

41. 42.

43. 44.

Rguez. Tarrazo, A., J. Ignacio de Sebastian, and M. Angeles Revilla, Influence of the phenological state of field grown walnut buds on their in vitro establishment. International Walnut Meeting, 1993(311): p. 153-159. Rios, D.G., et al., Rooting responses in relation with PO, PPO and IAA-o activities on walnut (Juglans regia L) explants. Third International Walnut Congress, 1997(442): p. 241-249. Rodriguez, R., et al., Simultaneous shoot-bud development on walnut tissues of different ages. macromorphological and histological analyses. International Walnut Meeting, 1993(311): p. 141-152. Saadat, Y.A. and M.J. Hennerty, The effects of different in vitro and ex vitro treatments on the rooting performance of Persian walnut (Juglans regia L.) microshoots. Proceedings of the Fourth International Walnut Symposium, 2001(544): p. 473-480. SARPE, C., PhD Thesis, Researches regarding in vitro multiplication of walnut and chesnut. 2002. Sestras, R., Ameliorarea speciilor horticole. 2004: AcademicPres, Cluj-Napoca. 334. Sharifian, S., et al., Assessment of phloroglucinol effect on rooting of tissue cultured Persian walnut. Acta Horticulturae, 2009. III IS Acclim. and Establt. of Micropropagated Plants(812). Siebert, J.B., Economic and policy considerations in marketing walnuts. Acta Horticulturae 311, 1993: p. 249-255. Tetsumura, T., K. Tsukuda, and K. Kawase, Micropropagation of Shinano walnut (Juglans regia L.). Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, 2002. 71(5): p. 661-663. Vahdati, K., et al., Rooting and acclimatization of in vitro- grown shoots from mature trees of three Persian walnut cultivars. 2004. Zamani, Z. and K. Vahdati, Influence of carbohydrate form and nitrogen source on growth of Persian walnut shoots in vitro. Proceedings of the Fourth International Walnut Symposium, 2001(544): p. 537-541.

43

Diplomat engineer Rodica FLUTUR

In vitro micropropagation of the common walnut (Juglans regia L.) and her importance for the breeding and the culture of the specie
Summary of the PhD Thesis

Supervisors: Prof. Dr. Radu SESTRA Prof. Dr. Kourosh VAHDATI

Cluj-Napoca
2012

TABLE OF CONTENTS
INTRODUCTION..............................................................................................................................................................3 CHAPTER 1. CURENT STAGE OF THE RESEARCHES .................................................................................4

1.1 ECONOMIC, ALIMENTARY AND CULTURAL IMPORTANCE OF THE SPECIES JUGLANS REGIA L.. .................... 4 1.1.1. Economic importance .................................................................................................................................. 4 1.1.2. Alimentary importance ................................................................................................................................ 4 1.1.3. Cultural importance .................................................................................................................................... 5 1.2 HISTORIC AND ORIGIN ....................................................................................................................................... 5 CHAPTER 2. IN VITRO MICROPROPAGATION OF COMMON WALNUT J. REGIA L. AND THEIR IMPORTANCE IN CULTURE AND BREEDING OF THE SPECIES.......................................................................7 2.1 L.) 2.2 2.3 THE CURRENT STAGE OF THE RESEARCH OF THE IN VITRO MICROPROPAGATION OF COMMON WALNUT (J. REGIA .......................................................................................................................................................................... 7 ADVANTAGES AND DISADVANTAGES OF THE IN VITRO MICROPROPAGATION OF COMMON WALNUT ................. 9 THE IMPORTANCE FOR BREEDING OF THE IN VITRO MICROPROPAGATION OF COMMON WALNUT ..................... 11 FRAMEWORK AND RESEARCH OBJECTIVES....................................................................12

CHAPTER 3. 3.1 2.2

PARTICULARIETIES AND ASPECTS FROM THE EXPERIMENTAL AREA ................................................................ 12 PROPOSED OBJECTIVES.................................................................................................................................... 14

CHAPTER 4. BIOLOGICAL MATHERIAL AND WORKING METHOD..........16 4.1 BIOLOGICAL MATERIAL................................................................................................................................... 16 4.2 THE WORKING METHOD ................................................................................................................................... 16 4.2.1. Culture media preparation ........................................................................................................................ 16 4.2.2. Microcuttings establishment ...................................................................................................................... 16 4.2.3. Microshoots multiplication ........................................................................................................................ 17 4.2.4. In vitro rooting of microshoots .................................................................................................................. 17
4.2.4.1 4.2.4.2 The rooting induction........................................................................................................................................ 17 The rooting stage............................................................................................................................................... 17

4.2.5. CHAPTER 5.

The stage of greenhouse acclimatization of plantlets ................................................................................ 18 RESULTS AND DISCUSIONS .....................................................................................................19

5.1 THE STAGE OF IN VITRO STABILIZATION OF MICROCUTTINGS .......................................................................... 19 5.1.1. Results regarding the influence of genotype and gelling agent on the length of microshoots ................... 21 5.1.2. Results regarding the influence of genotype and gelling agent on the length of microshoots ................... 23 5.2 THE STAGE OF IN VITRO MULTIPLICATION OF MICROSHOOTS ........................................................................... 23 5.2.1. Results regarding the influence of the genotype and cytokinin concentration on the microshoots number24 5.2.2. Results regarding the influence of the genotype and citochynin concentration on the microshoots height26 5.2.3. Results regarding the influence of the genotype and cytokinin concentration on the leaves number /microshoot .............................................................................................................................................................. 28 5.2.4. Results regarding the influence of the genotype and cytokinine concentration on the leaves length /microshoot .............................................................................................................................................................. 30 5.3 THE STAGE OF THE IN VITRO ROOTING OF WALNUT PLANTLETS ....................................................................... 30 5.3.1. The importance of temperature, carbohydrates, auxine and the period of induction for the rooting of plants30 5.3.2. Results regarding the influence of the genotype on the rooting of walnut plantlets .................................. 30 5.4 THE STAGE OF GREENHOUSE ACCLIMATIZATION OF WALNUT PLANTLETS ....................................................... 33 5.5 THE TRANSFER OF WALNUT PLANTLETS IN OPEN FIELD ................................................................................... 37 CHAPTER 6. CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS........................................................................39

BIBLIOGRAPHY... ...41

INTRODUCTION ...........................................................................................................................................................47 PROPOSED OBJECTIVES ...........................................................................................................................................48 CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS . .......................................................................................................48

INTRODUCTION
The Ph.D thesis entitled In vitro micropropagation of the common walnut (Juglans regia L.) and its importance for the breeding and culture of the specie has as a principal objective the enrichment of the knowledges about in vitro multiplication of common walnut, presently known in Romania, and the highlighting of the importance of walnuts obtained trough this method for the breeding of the species.

The motivation for choosing this topic is due to my desire to learn more about this valuable species of economically and culturally interest. As a species originating in Persia (actualy the Islamic Republic of Iran), choosing this theme was a great opportunity to make some research even in the country of origin of the common walnut (J. regia L.). Thus, some of the results presented in this thesis were obtained in the laboratory of the Faculty of Horticulture in the College Abouraihan, University of Tehran in Iran under the guidance of Prof. Dr. Kourosh Vahdati, scientific leadership in cotutela. The in vitro multiplication of common walnut is a complex method through all the steps that must be taken in the laboratory, respectively: initiation of the culture, culture establishing, multiplication and plants rooting. The complexity of this method is not only due to the difficulty of execution of these operations, but especially in the sensitivity that the introduced walnut explants present into the in vitro environment. In this study, for the in vitro multiplication of common walnut we used microcuttings from three cultivars (Chandler, Franquette and Jupneti). DKW culture medium (Driver, 1986) was used in the establishment stage and for the multiplication of the crops, and for the rooting induction stage I have used MS medium (Murashige i Skoog). In the esthablishment stage I have used three diferent gelling agents (2,1 g/l Phytagel, 2,2 g/l Gelrite and 10 g/l agar), auxin (0,1 mg/l IBA), citokinine (1 mg/l BAP) and 3 % sucrose. For the multiplication of cultures I have used three diferent BAP concentrations: 0,5 mg/l, 1 mg/l and 1,2 mg/l. For the rooting induction I have used IBA in concentration of 3 mg/l and the plants were kept in the dark for 8 days. At the rooting stage I have used the vermiculite offred by the society Comptoir de Minraux et Matires Premires from France, and the product Steckmedium was used for the aclimatisation of plants in the greenhouse, and it was offered by the company Klasmann Deilmann from Germany. In this thesis we performed a preliminary study about the influence of alternative gelling agents (cassava and tapioca flour) to stabilize walnut crop. This type of gelling agents are currently used successfully in the micropropagation of other species. Materials for this study was obtained from Dr. Vandana Kumar, professor in the College of Forestry and Agriculture of India and Prof. K. Sylvestre Bakoh from Yaounde, Cameroon. In 2012, the College of Abouraihan was declared Center of Excelence for the walnut research in Iran.
47

PROPOSED OBJECTIVES
The objective of this research is to improve the known techniques of micropropagation and multiplication by adapting existing protocols tot he genotypes from the national and international assortment. These methods are very little used by research institutions in the country, or used without effective results compared to the progress made in this field by international research institutions. The specific objectives of the research are: selection, for the in vitro multiplication of walnut cultivars and local productives clones, easily adaptable to soil conditions, climate and resistent to disease and pest attack; the stabilisation of the fenolic compounds as a result of interventions performed on plant material used for multiplication; achieving a multiplication rate as good as possible; the production of new plants free of disease; achieving a good acclimatization protocl for the new plants; obtaining quality plants that will be a starting point for the breeding process. obtain viable results to represent a reference point for further researches and for profesionals in nursery domain.

CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS

Desinfection method of the biological materials has proven to be very effective. Also, by the proper handling of explants were avoided external infection risks. If the seedlings from which walnut explants are harvested are not free of disease within two weeks after inoculation the infection is observed in the culture medium. In our case, the seedlings from which was collected the samples has proven to be free of diseases. DKW culture medium with 1 mg/l BAP, 0.1 mg/l IBA and 2.1 g/l Phytagel was the best option for achieving the esthablishment of the explants. The best results was obtained for the romanian cultivar Jupneti, being confirmed by those obtained by Catita arpe and presented in his Ph.D thesis in 2002. The culture medium wiht tapioca pearls has proven to be efficient in the walnut explant stabilisation. For this version of culture medium, with Jupneti cultivar I have obtained the better results for cultures establishment.

48

Tapioca, in terms of economic return is 40-50 times cheaper than agar. The culture medium may well be improved in terms of ionic compounds, by using tapioca pearls, thereby achieving a good rate of cell division as mentioned by (Endale and Santhanarayana, 2001). For the rooting inducition I have used MS culture medium with auxin (IBA) in concentration of 3 mg/l. Induction period was 8 days and the temperature from growing chamber was 22oC. With the Jupneti cultivar I have obtained the best results on the medium specified above, with the highest rate of rooting. A good rooting of plants is conditioned by: the choice of optimal variants induction environment, achieving an appropriate mixture of culture medium and vermiculite and the quality and origin of biological material used. DKW medium mixed with vermiculite in the proper proportions, strikes a good balance between oxygen and water, and substrate penetration ability is greatly improved. Oxygen is used to improve aeration capacity of the rooting environment and water content ensures adequate moisture, as confirmed by(Jayallemand, Capelli, 1992). Also, the equilibrium betwen culture sustrate components (vermiculite and DKW medium) depends on the disponibility degree of carbohidrates for the development of the rooting system (Haissig, 1982; Jay Allemand and Cornu, 1986; Jayallemand, Capelli, 1992). In the aclimatization stage, the use of the Steckmedium, has been proven to be very efficient. At this stage the plants have grown under natural light and temperature and humidity levels were controlled. Temperature range assured for the acclimated plants in the greenhouse was 22-24oC and the humidity was 100%. For the field transfer is required that the walnut plants have a well developed root system and a good autotrophic capacity.

49