UASM

Fondul Global Programul Naţiunilor Ministerul Ecologiei Universitatea Agrară

de Mediu Unite pentru Mediu şi Resurselor Naturale de Stat din Moldova

Andrei Palii, Galina Comarov, Angela Lozan, Vasile Scorpan

BIOTEHNOLOGII MODERNE ÎN
FITOTEHNIE ŞI
BIOSECURITATE

Chi[in=u 2004
CZU 631.52/.53+575.085

Această lucrare a fost editată cu suportul financiar al Proiectului UNEP-GEF nr. GF/2716-
02-4520 “Dezvoltarea Cadrului Naţional de Biosecuritate în Republica Moldova”,
implementat de Ministerul Ecologiei şi Resurselor Naturale.

Materialele publicate în actuala lucrare reflectă punctul de vedere exclusiv al autorilor.

Reproducerea materialelor este permisă doar cu indicarea obligatorie a sursei.

Descrierea CIP a Camerei Naţionale a Cărţii

Biotehnologii moderne în fitotehnie şi biosecuritate / Andrei PALII, Galina COMAROV,
Angela LOZAN ..... – Ch.: Ministerul Ecologiei şi Resurselor Naturale; UNEP, 2004 (F.E.-P.
“Tipografia Centrală”), 232 p.
ISBN 9975-78-351-1
500 ex.
CZU 631.52/.53+575.085

Această lucrare a fost avizată pentru publicare de către Senatul Universităţii Agrare de Stat
din Moldova.

© UNEP
© Ministerul Ecologiei şi Resurselor Naturale
© Universitatea Agrară de Stat din Moldova
ISBN 9975-78-351-1
 CUPRINS

Prefaţă.......................................................................................................................................7

I. BIOTEHNOLOGIA CELULEI LA PLANTE....................................................................9

1.1. Elemente de biologie a celulei în condiţii de cultivare
in vitro...........................................................................................................................10
1.1.1 Fenomenul de totipotenţă şi avantajele organismelor
vegetale pentru biotehnologia celulară........................................................10
1.1.2. Cultura de calus................................................................................................. 11
1.1.3. Cultura suspensiilor celulare..........................................................................14
1.1.4. Cultura celulelor izolate şi protoplaştilor..................................................... 16
1.1.5. Particularităţile populaţiilor celulare in vitro...............................................19
1.1.6. Particularităţile morfogenezei celulelor de calus........................................21
1.1.7. Regenerarea plantelor din celule cultivate in vitro ....................................24
1.2. Cultura in vitro pentru obţinerea substanţelor
biologic active............................................................................................................25
1.2.1. Specificul sintezei şi acumulării metaboliţilor secundari
in vitro şi factorii, care influenţează asupra acestor
procese.................................................................................................................26
1.2.2. Căile de intensificare şi păstrare a potenţialului biosintetic
a culturilor celulare...........................................................................................29
1.3. Tehnologiile celulare pentru însănătoşirea şi clonarea
plantelor.......................................................................................................................33
1.3.1. Obţinerea plantelor libere de viroze prin cultura meristemelor
apicale...................................................................................................................33
1.3.2. Avantajele micropropagării in vitro.................................................................36
1.3.3. Etapele şi metodele micropropagării plantelor............................................38
1.3.4. Tehnica cultivării ţesuturilor vegetale la diferite etape
ale micropropagării clonale..............................................................................42
1.3.5. Folosirea practică a micropropagării plantelor............................................44
1.4. Tehnologii celulare auxiliare, care accelerează procesul
de selecţie a plantelor agricole...........................................................................47
1.4.1 Crioconservarea, păstrarea şi multiplicarea in vitro
a genofondului vegetal......................................................................................47
1.4.2 Obţinerea haploizilor in vitro şi folosirea lor în ameliorarea
plantelor...............................................................................................................49
1.4.3 Tehnologiile in vitro pentru învingerea incompatibilităţii
progame................................................................................................................51
1.4.4. Tehnologiile celulare elaborate pe baza endospermogenezei
şi embriogenezei plantelor superioare..........................................................52
1.5. Tehnologii celulare utilizate pentru extinderea diversităţii
genetice la plantele agricole..................................................................................55
1.5.1. Hibridarea somatică la plante.........................................................................55
1.5.2. Variabilitatea somaclonală...............................................................................58
1.5.3. Ameliorarea plantelor la nivel celular............................................................61
2. INGINERIA GENETICĂ LA PLANTE...................................................................... 66

2.1. Elemente de genetică şi biologie moleculară – instrumente

principale ale ingineriei genetice........................................................................67
2.1.1. Structura, însuşirile şi funcţiile acizilor nucleici .........................................67
2.1.1.1. Identificarea naturii chimice şi organizarea materialului
genetic.........................................................................................................67
2.1.1.2. Compoziţia chimică, structura şi însuşirile acidului
dezoxiribonucleic (ADN). 69
2.1.1.3. Structura şi replicarea acidului ribonucleic (ARN)...........................72
2.1.2. Enzimologia sintezei ADN şi ARN...................................................................74
2.1.2.1. Mecanismul biochimic al biosintezei replicative
a ADN-ului.................................................................................................74
2.1.2.2. Sinteza artificială a ADN-ului.................................................................76
2.1.2.3. Biosinteza ARN-ului (transcripţia genetică)........................................77
2.1.2.4. Sinteza artificială a ARN-ului.................................................................81
2.1.3. Codul genetic şi biosinteza proteinelor......................................................... 81
2.1.3.1. Codul genetic.............................................................................................81
2.1.3.2. Etapele biosintezei proteinelor...............................................................83
2.1.3.3. Dogma centrală a geneticii..................................................................... 87
2.1.3.4. Replicarea genetică a sintezei proteinelor...........................................88
2.2. Metode şi tehnici utilizate în ingineria genetică............................................91
2.2.1. Izolarea ADN........................................................................................................91
2.2.2. Secvenţierea nucleotidelor acizilor nucleici..................................................92
2.2.3. Enzime de restricţie folosite pentru fragmentarea ADN............................93
2.2.4. Hibridarea moleculară a acizilor nucleici.....................................................95
2.2.5. Analiza ADN şi ARN prin metoda “Petelor”...................................................96
2.2.6. Metoda PCR de amplificare a genelor ............................................................97
2.2.7. Clonarea ADN şi molecule de vectori.............................................................98
2.2.8. Construirea ADN-recombinat........................................................................101
2.2.9. Transferul de gene (transgenoza).................................................................103
2.2.10. Biblioteci genomice.........................................................................................104
2.3. Particularităţile ingineriei genetice la plante................................................106
2.3.1. Avantajele ingineriei genetice în fitotehnie................................................106
2.3.2. Alegerea, izolarea şi clonarea genei din celula vegetală .........................108
2.3.3. Tehnologiile transferării genelor la plante şi expresia lor
în genomul plantei- recipiente..................................................................... 112
2.3.3.1. Transferul indirect al genelor la plante cu ajutorul
vectorilor biologici..................................................................................113
2.3.3.2. Transferul direct al genelor la plante...............................................118
2.3.3.3. Tehnologia antisens..............................................................................120
2.3.4. Regenerarea celulelor transformate............................................................121
2.4. Plante transgenice...................................................................................................121
2.4.1. Plante transgenice rezistente la maladii.....................................................122
2.4.2. Plante transgenice rezistente la insecte......................................................127
2.4.3. Plante transgenice tolerante la erbicide......................................................131
 2.4.4. Plante transgenice tolerante la factori abiotici nereglatori.................... 135
2.4.5. Plante transgenice cu dezvoltarea modificată...........................................140
2.4.5.1. Clonarea androsterilităţii/fertilităţii....................................................140
2.4.5.2. Modificarea procesului de coacere şi perioadei
de păstrare................................................................................................141
2.4.6 Plante transgenice cu conţinutul biochimic sau valoarea
nutritivă ameliorată 143
2.4.7 Plante transgenice cu calităţi tehnologice modificate.............................148
2.4.8 Plante transgenice producătoare de molecule terapeutice.................... 151
2.4.9 Etapele obţinerii unui soi transgenic..........................................................153

3. MARCAREA MOLECULARĂ A GENOMULUI VEGETAL – O ETAPĂ

IMPORTANTĂ A INGINERIEI GENETICE ÎN FITOTEHNIE.............................159
3.1. Metodele de analiză bazate pe folosirea markerilor
moleculari..................................................................................................................161
3.1.1. Tehnici bazate pe hibridarea moleculară ADN-ADN................................164
3.1.2. Tehnici bazate pe PCR....................................................................................164
3.1.2.1. Reacţia în lanţ catalizată de ADN polimerază.....................................164
3.1.2.2. Metodele de amplificare a ADN-ului, bazate pe tehnologiile
PCR 170
3.2. Folosirea tehnicii bazate pe PCR pentru identificarea genomului
plantelor agricole.................................................................................................... 172
3.2.1 Folosirea markerilor pentru construirea hărţilor genetice
ale plantelor 174
3.2.2 Folosirea microsateliţilor în marcarea genomului vegetal......................177
3.2.3 Metodele marcării genelor ce determină caracterele valoroase,
în ameliorarea şi selecţia soiurilor noi 178
3.2.4 Folosirea metodei RAPD pentru paşaportizarea noilor soiuri
şi linii 178
3.2.5 Folosirea metodei SSR pentru analiza polimorfismului
la plante 182

4. BIOTEHNOLOGII ŞI BIOSECURITATEA................................................................186
4.1. Cadrul legislativ internaţional în domeniul securităţii biologice...........188
4.1.1. Convenţia cu privire la Diversitatea Biologică
(Rio de Janeiro, 1992) 188
4.2. Politici şi strategii naţionale şi sectoriale de mediu a
Republicii Moldova..................................................................................................188
4.2.1. Politici şi strategii naţionale............................................................................188
4.2.2. Politici şi strategii sectoriale...........................................................................189
4.2.3. Acorduri bilaterale şi multilaterale...............................................................190
4.3. Legislaţia cadru a Republicii Moldova în domeniul
securităţii biologice.................................................................................................192
4.3.1. Legea privind Securitatea Biologică..............................................................192
4.3.2. Regulamentul privind autorizarea activităţilor legate de obţinerea,
testarea, utilizarea şi comercializarea organismelor modificate
genetic 193
4.4. Legislaţia sectorală..................................................................................................194
4.4.1. Aspecte privind protecţia consumatorilor................................................... 194
4.4.2. Sectorul fitotehnic.............................................................................................195
4.4.3. Sectorul zootehnic.............................................................................................196
4.4.4. Sectorul farmaceutic.........................................................................................196
4.4.5. Sectorul sanitaro-epidemiologic.....................................................................197
4.4.6. Securitatea produselor alimentare................................................................197
4.4.7. Procedurile de import-export..........................................................................198
4.5. Cadrul instituţional privind securitatea biologică....................................... 199
4.5.1. Autorităţile publice centrale...........................................................................199
4.5.2. Organele centrale de resort.............................................................................200
4.5.3. Organele administraţiei publice locale.........................................................202
4.5.4. Organele de autorizare, control şi monitorizare.........................................202

4.6. Potenţialul de cercetare-dezvoltare în domeniul biotehnologiilor.........203

4.6.1. Capacităţile instituţionale în domeniul cercetare-dezvoltare.................203
4.6.2. Educaţia şi pregătirea cadrelor......................................................................204
4.7. Protecţia drepturilor consumatorilor................................................................205
4.7.1. Protecţia drepturilor consumatorilor în domeniul produselor
alimentare 206
4.8. Sistemul de reglementare şi monitorizare a activităţilor ce ţin
de utilizarea OMG........................................................................................................206
4.8.1. Genuri de activitate...........................................................................................206
4.8.2. Procedurile de autorizare.................................................................................207
4.8.3. Monitoringul activităţilor cu OMG................................................................ 208
4.9. Informarea şi participarea publicului la luarea deciziilor..........................208
Glosar.....................................................................................................................................211
Bibliografie selectivă........................................................................................................225
 Prefaţă

Biotehnologia este disciplina biologică ce se ocupă cu obţinerea de produse

utile omenirii, folosind culturile celulare de bacterii, microalge, drojdii, animale
sau de plante. Cu ajutorul metodelor biotehnologice se obţin substanţe active cu un
grad înalt de puritate, ţesuturi ale plantelor sau animalelor, sau chiar indivizi
integri de animale şi plante. Datorită posibilităţilor destul de vaste ale metodelor
biotehnologice, ele se utilizează pe larg în medicină, zootehnie, fitotehnie,
industria alimentară etc. La momentul actual, metodele biotehnologice stau la baza
procesului de terapie genică, cu ajutorul lor în farmacologie se produc noi vaccine
şi medicamente, în medicină se îmbunătăţesc şi se perfecţionează tehnicile de
testare şi diagnostică, în procesul de ameliorare se concep noi genotipuri de plante
şi animale, care ulterior servesc în calitate de surse potenţiale de organe şi ţesuturi
pentru transplant sau ca resurse genetice cu caractere valoroase. Astfel, prin
intermediul procedurilor biotehnologice are loc procesul de modificare a
capacităţilor materiei vii, aşa încât noile genotipuri modificare genetic la
maximum să asigure necesităţile umane în produse alimentare, medicamente sau
modalităţi de protecţie a mediului ambiant.
Iniţial, biotehnologia clasică cuprindea numai procesele de fermentare şi de
conservare, cum ar fi producerea berii, vinului, caşcavalului, pâinii, oţetului etc.
Biotehnologia modernă are un areal de răspândire cu mult mai larg şi este axată,
preponderent, pe utilizarea masivă a ingineriei genetice. În fitotehnie, procesele
biotehnologice se utilizează sub două aspecte principale. Prima direcţie de utilizare
a biotehnologiei în fitotehnie ţine de următoarele aspecte:
– obţinerea materialului săditor, lipsit de germenii ce provoacă bolile virotice
sau bacteriale la plantele de cultură;
– multiplicarea mai rapidă, în comparaţie cu metodele tradiţionale, a
materialului săditor;
– selectarea populaţiilor sau genotipurilor rezistente la anumiţi factori
biotici şi abiotici.
Aceste metode se consideră inofensive şi se utilizează pe larg în practicile
agricole şi în procesul de ameliorare a plantelor de cultură, contribuind în mod
esenţial asupra productivităţii culturilor respective.
A doua direcţie se referă la utilizarea metodelor biotehnologice în ansamblu
cu metodele ingineriei genice pentru modificarea genetică a unor genotipuri.
În rezultatul acestor manipulări se obţin organisme cu astfel de modificări ale
genomului, care în mod tradiţional în natură nu pot fi obţinute. În practica agricolă,
astfel de organisme poartă denumirea de organisme genetic modificate. La ora
actuală, există rezultate ştiinţifice în baza cărora se fac unele concluzii directe sau,
în cele mai dese cazuri, unele aprecieri extrapolare referitor la riscurile potenţiale
ale organismelor genetic modificate sau a produselor obţinute din ele asupra
ecosistemelor naturale şi stării sănătăţii populaţiei. La nivel global, aceste aspecte
sunt strict reglamentate de prevederile Protocolului de la Cartagena al Convenţiei
privind Diversitatea Biologică.
În lucrarea de faţă, într-o formă generală şi accesibilă, sunt expuse metodele
biotehnologice principale, utilizate pe larg în fitotehnie, în scopul îmbunătăţirii
calităţii şi sporirii productivităţii plantelor de cultură. De asemenea, sunt expuse
principiile necesare pentru asigurarea securităţii biologice în procesul utilizării
biotehnologiilor în fitotehnie. Modul de reflectare a materialului este conceput în
forma unui manual pentru studenţii instituţiilor superioare de învăţământ şi
colegiilor cu specializare în agronomie, ecologie şi protecţia mediului ambiant.
Totodată, sperăm că studiul nostru va fi benefic şi pentru un cerc mai amplu de
specialişti practicieni din agricultură şi din domeniul protecţiei mediului ambiant.

Autorii
 1. BIOTEHNOLOGIA CELULEI LA PLANTE

Biotehnologia celulară se bazează pe capacitatea celulelor de a exista şi a se

reproduce in vitro. Biotehnologia celulară reprezintă un sistem de procese
tehnologice, la baza cărora se află metoda cultivării celulelor sau ţesuturilor izolate
pe medii nutritive, în condiţii aseptice, în afara organismului. Această metodă,
numită cultură in vitro, actualmente se foloseşte pe larg în biotehnologie.
Rolul culturii ţesuturilor şi celulelor izolate a plantelor în biotehnologie poate
fi apreciat în conformitate cu următoarele aspecte:
Capacitatea celulelor vegetale izolate de a produce in vitro substanţe de
sinteză ale metaboliţilor secundari (alcaloizi, steroizi, glucide, hormoni, uleiuri
eterice, insecticide şi al.), valoroase din punct de vedere aplicativ.
Avantajul obţinerii metaboliţilor secundari prin metode biotehnologice constă
în posibilitatea utilizării unor specii de plante, care în condiţii locale nu pot fi
cultivate, pentru obţinerea, în condiţii de laborator, prin cultura acestor plante in
vitro, a producţiei în decursul anului întreg. Productivitatea sporită a celulelor
cultivate în consecinţa selecţiei celulare poate să majoreze esenţial capacitatea de
producţie a plantelor întregi.
Următorul aspect al tehnologiilor celulare reprezintă folosirea culturii
ţesuturilor izolate pentru microclonarea plantelor şi însănătoşirea materialului
săditor de infecţia virotică şi de alţi patogeni.
Metoda microclonării oferă posibilitatea să fie obţinute până la 1 milion de
plante de la o singură meristemă. De asemenea, ea nu depinde de condiţiile
climaterice şi oferă posibilitatea de a obţine producţie în decursul întregului an.
Alt aspect al biotehnologiei celulare se bazează pe folosirea celulelor izolate
în genetica şi ameliorarea plantelor. Cultivate pe mediile nutritive artificiale,
celulele posedă o heterogenitate genetică considerabilă, care apare în procesul de
cultivare.
Heterogenitatea genetică a celulelor în cultura in vitro (fenomen de variabilitate
somaclonală) dă posibilitatea ca ele să fie folosite în ameliorarea celulară. Pentru
aceasta se selectează celulele rezistente la diferiţi factori nefavorbili ai mediului
ambiant: secetă, salinitatea solului, temperaturi joase, patogeni etc; de asemenea, se
selectează şi celulele care posedă o productivitate înaltă.
 1.1. Elemente de biologie a celulei în condiţii de
cultivare in vitro
1.1.1. Fenomenul de totipotenţă şi avantajele organismelor
vegetale pentru biotehnologia celulară.
La baza metodei culturii de celule se află fenomenul de totipotenţă.
Totipotenţa este însuşirea celulelor de a realiza informaţia genetică a nucleului
care asigură înmulţirea, diferenţierea şi dezvoltarea lor până la regenerarea în
cultură a unui organ sau a întregului organism. Această capacitate este specifică
pentru gametul femel fecundat la plante şi la animale. În anumite condiţii,
totipotenţa poate să se manifeste şi la celulele somatice. Exemple de manifestare a
totipotenţei celulelor somatice în condiţii naturale pot fi următoarele:
– dezvoltarea mugurilor şi a plantelor întregi din celulele frunzei de begonie
sau din celulele epidermale ale hipocotilului la in;
– înmulţirea vegetativă;
– cicatrizarea rănilor.
Or, în condiţii naturale, totipotenţa nu se manifestă la toate grupele sistematice
ale plantelor. Astfel, multe specii de plante din clasa monocotiledonatelor au
pierdut capabilitatea de a regenera. Însă, în procesul cultivării ţesuturilor sau
organelor (explantelor) pe mediile nutritive artificiale in vitro, şi la aceste plante
este posibilă realizarea totipotenţei, care în condiţii naturale este supresată. Anume
celulele vegetale şi celulele somatice de animale pot regenera in vitro din ţesuturile
somatice nediferenţiate într-un organism matur fertil.
În fitotehnie toate tehnologiile celulare utilizate sunt elaborate cu folosirea
obiectelor ce au diverse niveluri de complexitate, începând cu protoplaştilor izolaţi
şi terminând cu ovarele sau embrionii.
Se disting următoarele obiecte vegetale de izolare in vitro în funcţie de:
1) tipul de organe (cultura embrionilor, cultura rădăcinilor, cultura meri-
stemelor, lăstarilor şi al.);
2) tipul de ţesuturi (cultura ţesuturilor de calus, cultura ţesuturilor tumorale);
3) tipul de celule (cultura de suspensie, cultura celulelor separate, cultura
protoplaştilor izolaţi).
Celulele ce se cultivă in vitro , joacă un rol primordial, deoarece ele apar sau
ca un obiect direct al manipulărilor genetice, sau ca o etapă specială a
tehnologiilor, care se realizează.
Din fiziologia plantelor se ştie, că în condiţii naturale fiecare celulă vegetală
trece trei faze de dezvoltare: diviziunea, extinderea şi diferenţierea.
Celulele diferenţiate (specializate) în componenţa plantei nu sunt capabile să
se divizeze. Deci, este clar, că totipotenţa lor este joasă. Din această cauză, multe
specii de plante, mai ales din monocotiledonate, au pierdut capacitatea de

10
regenerare directă din celule sau fragmente ale ţesuturilor, chiar în condiţii in vitro.
Pentru ca celulele diferenţiate să capete din nou capacitatea de a se diviza, e
necesar să se producă dediferenţierea, adică celulele să se reîntoarcă din nou în
stare meristematică. În acest scop, savanţii au folosit fenomenul care se întâlneşte
în natură – formarea ţesutului de calus.
1.1.2. Cultura de calus.
Calusul reprezintă o masă neorganizată de celule parenhimatice proliferate,
care prin cultivare formează focare de celule meristematice, elemente de sisteme
conducătoare, celule pigmentate (fig.1.1. Anexa).
Celula de calus, în urma diviziunii căreia apare, prezintă un tip de dediferenţiere
celulară, proprie plantelor superioare. Pentru plantă, calusul este un ţesut care apare în
condiţii excepţionale, de obicei prin traumă, şi care funcţionează timp neîndelungat. În
natură calusul înlesneşte lecuirea rănilor şi concrescenţa altoiului cu portaltoiul.
Calusul iniţial constă din celule nediferenţiate, care sunt capabile de a se dediferenţia
(cambiu, floemă, părţile tinere ale xilemei).
Inducţia şi activizarea totipotenţei se înfăptuieşte, mai repede, în condiţiile
transferării celulei din starea diferenţiată în starea dediferenţierii. De aceea, ulterior, în
calus poate să se producă diferenţierea secundară cu formarea ţesuturilor şi organelor
specializate. Acest ţesut apără locul vătămat, acumulează substanţe nutritive pentru
regenerarea structurilor anatomice sau a organului pierdut.
Culturile de ţesuturi şi celulele izolate, de obicei, se prezintă nu numai în
formă de calus, dar şi în formă de tumori, adică drept celule dediferenţiate, care şi-
au pierdut specializarea.
Tipul principal de cultivare a celulei vegetale este cultura de calus. Mai rar se
cultivă celulele tumorilor vegetale de diferite etiologii. Diferenţa între aceste două
tipuri de culturi celulare constă în următoarele: independenţa hormonală a
celulelor tumorale, care le dă posibilitate să se divizeze şi să crească pe medii
nutritive, fără adăugirea stimulatorilor de creştere; celulele tumorale sunt lipsite de
capacitatea de a da început structurilor organizate – rădăcinilor şi lăstarilor, în
procesul de organogeneză, şi la embrioizi, în procesul de embriogeneză somatică.
În consecinţă, dacă în mediul nutritiv, care conţine hormoni de creştere
(auxine şi citochinine), se plasează celula izolată diferenţiată sau o bucată de ţesut
specializat, celula începe să se divizeze, iar în continuare se formează ţesutul de
calus. Aşadar, transformarea celulei specializate diferenţiate în calus este legată de
inducţia diviziunii celulare, capacitate, pe care celula a pierdut-o în procesul de
diferenţiere.
Trecerea celulei in vitro din starea de diferenţiere în starea de dediferenţiere şi
la o diviziune celulară, este condiţionată de schimbările activităţii genelor
(variabilitatea epigenetică). Activarea genelor, care până la un moment n-au lucrat
şi inhibarea unora din cele care lucrează, duce la schimbarea componenţei
11
proteice a celulelor. Se micşorează cantitatea sau scade activitatea, iar câteodată
dispar şi proteinele, caracteristice pentru celulele frunzelor ce posedă capacitatea
de fotosinteză şi apar proteinele, specifice pentru celulele de calus.
De menţionat, că la plantele dicotiledonate procesul de represie şi depresie a
genelor, care stă la baza dediferenţierii, se realizează mai uşor, decât la
monocotiledonate.
Celula de calus îşi are ontogeneza proprie. Ea repetă ontogeneza oricărei
celule şi include diviziunea, extinderea şi diferenţierea celulei de calus, după care
urmează îmbătrânirea şi moartea ei.
Curba creşterii ţesuturilor de calus are forma caracteristică literei S.
Se deosebesc următoarele faze ale ciclului de creştere:
1) faza latentă sau lag-faza;
2) faza expotenţială sau faza logaritmică a creşterii culturii;
3) faza lineară;
4) faza diminuării creşterii;
5) faza staţionară;
6) faza de distrugere a celulelor.
Caracteristica fazelor ciclului de creştere.
1) Faza latentă. În această perioadă celulele nu se înmulţesc, lipseşte, de
asemenea, creşterea vizibilă, dar se desfăşoară un proces activ de
absorbţie a apei, a substanţelor nutritive. În genere, au loc procesele,
care determină pregătirea celulei pentru diviziune.
2) Faza expotenţială sau faza logaritmică a creşterii culturii. Este o
perioadă limitată în ciclul de creştere a culturii acumulate, în mersul
căreia se produce o majorare a numărului celulelor graţie diviziunii lor
intense şi, ca urmare, majorarea substanţei uscate. Se deosebesc două
subfaze expotenţiale: timpurie şi târzie.
În decursul fazei expotenţiale timpurii se observă un şir de schimbări
citologice; în celulă dispare vacuola cea mare, se majorează volumul citoplasmei,
se măreşte numărul poliribosomilor şi al mitocondriilor. Paralel cu schimbările
citoplasmatice are loc şi activarea metabolismului celular: se majorează conţinutul
de ARN, proteină, ADN, intensitatea absorbţiei de oxigen. Se realizează o
diviziune activă a celulelor cu formarea de agregate celulare.
În decursul fazei expotenţiale târzii a creşterii culturilor în suspensie se
observă încetinirea diviziunii celulare, însă se constată majorarea dimensiunilor
medii ale celulelor. Astfel, majorarea biomasei în această perioadă se
realizează, în fond, din contul extensibilităţii celulelor.
3) Faza lineară e foarte scurtă. Viteza creşterii culturii în această fază e
permanentă.
12
 4) Faza diminuării creşterii. În această perioadă se remarcă cea mai mare
heterogenitate a populaţiei celulare şi începutul sintezei substanţelor
secundare: de exemplu, a saponinelor steroide, componenţilor fenolici,
etc.
5) Faza staţionară. În această perioadă cultura de calus în suspensie atinge
punctul maximum al masei uscate. În mediul de cultură se acumulează
produsele activităţii vitale a celulelor, care inhibă creşterea culturii.
Mediul cultural sărăceşte în unele componente. Ca să nu se înceapă faza 6
a distrugerii celulelor, este necesar să se facă subcultivarea culturii în
suspensie, pe un mediu nutritiv nou. În genere, de la începutul cultivării şi până
la faza staţionară a creşterii trec 21-28 de zile.
Pentru ca să nu se înfăptuiască îmbătrânirea – adică pierderea capacităţii de
diviziune şi moartea celulelor de calus, calusul primar, care apare pe explante,
peste 4-6 săptămâni se transferă pe mediul nutritiv proaspăt. Această operaţie se
numeşte pasaj, iar procesul de creştere a calusurilor celulare transferate pe mediul
nutritiv proaspăt se numeşte subcultivare. Prin pasaje reglate, capacitatea celulelor
de a se diviza poate să fie susţinută în decurs de câteva zeci de ani.
Diferenţierea ţesuturilor de calus nu se poate confunda cu diferenţierea
secundară a celulelor de calus, care stă la baza morfogenezei. Particularităţile de
dediferenţiere a celulelor explantului şi calusogeneza depind de caracteristicile
epigenetice ale ţesuturilor care o alcătuiesc. Sub “caracteristicile epigenetice” sau
“variaţiile epigenetice” se înţelege exprimarea fenotipică a activităţii diferenţiale a
genelor. De mutaţii şi variaţii somaclonale, ele se deosebesc prin faptul că nu se
păstrează în ciclul celulă – plantă – celulă.
Ţesutul de calus creşte după metoda de creştere la suprafaţa mediului nutritiv
ca o masă amorfă de celule parenchimatice cu pereţii subţiri, care nu au o anumită
structură anatomică. Culoarea masei ţesutului de calus poate fi albă, gălbuie,
verde, roşie, cenuşie, pigmentată complect sau cu prezenţa zonală a clorofilei şi
antocianului.
În dependenţă de origine şi condiţiile de cultură, ţesuturile de calus pot fi:
– afânate, pline cu apă, uşor se desfac în celule independente;
– de consistenţă medie, cu focare meristematice bine evidenţiate;
– compacte, cu zone de cambiu redus şi vase conducătoare.
De obicei, în cultura de repicare de lungă durată, pe mediile care includ auxină
– 2.4 diclorfenoxiacidacetic (2.4D), ţesuturile de calus îşi pierd pigmentarea şi
devin mai poroase.
Culturile de calus sunt folosite la un şir de plante în scopul de a obţine din ele
bioproducente, ceea ce se efectuează în condiţii industriale, pentru multiplicarea
materialului iniţial al plantei (prin inducţia în ţesutul de calus a mlădiţelor), sau
pentru obţinerea somaclonilor.
13
 De regulă, pentru regenerarea plantelor sunt de preferat ţesuturile de calus,
crescute pe suprafaţa mediului. Aceste ţesuturi se folosesc frecvent pentru
păstrarea în stare de cultură a colecţiilor de diferite forme, linii, mutaţii etc; din ele
se obţin suspensii de celule, crescute în mediul nutritiv lichid.
1.1.3. Cultura suspensiilor celulare.
Suspensia celulară prezintă nişte celule izolate, una câte una, sau agregate de
celule care cresc într-un mediu nutritiv lichid, de o anumită componenţă, în
condiţii aseptice.
Cultura celulelor în suspensie presupune cultivarea de mici agregate celulare
sau celule izolate, în mediu lichid, într-un regim de aeraţie şi amestec cu ajutorul
unei aparaturi speciale.
Pentru obţinerea culturii suspensiilor se folosesc ţesuturile de calus afânate, care
se fragmentează uşor în mici agregate celulare sau celule aparte. Acestea sunt plasate
într-un mediu de cultură lichid. În acest scop, în perioada cultivării calusului se exclud
din mediul nutritiv citochininele sau se micşorează concentraţia lor, dar se majorează
concentraţia auxinelor. Pentru culturile suspensiilor este caracteristică heterogenitatea
morfologică şi biochimică a celulelor. Populaţia celulară constă din celule, care
variază după formă şi dimensiuni.
Majorarea dispersiei suspensiei celulare se poate realiza prin adăugirea în
mediul cultural a concentraţiilor joase de fermenţi – pectinază şi celulază. S-a
constatat, că celulele activ reproducătoare nu numai că absorb substanţele nutritive
ale mediului de cultură, dar şi elimină produsele activităţii vitale proprii, de
exemplu unele enzime.
Pentru cultura suspensiilor se folosesc două sisteme: periodică şi continuă.
Din aceste două sisteme cea mai simplă şi mai răspândită este cultura
suspensiei periodice sau de acumulare, la care ne vom opri mai detaliat În acest
caz, înmulţirea populaţiei celulelor se face într-un sistem închis, într-un volum
constant al mediului nutritiv. De obicei, densitatea iniţială a populaţiei celulare
alcătueşte 0.5×105 – 2.5×105 de celule la ml.
Există diferite procedee pentru cultivarea suspensiilor celulare: în retorte pe
agitatoare, în fermentatoare.
Vasele cu suspensie se fixează pe platforma agitatorului sau se instalează pe
un rotativ. În aceste condiţii se asigură aeraţia. În consecinţă, masa agregatelor
celulare se măreşte, se dezintegrează în fragmente separate.
În condiţii de laborator, de obicei, se folosesc vase cu o capacitate de 100-
250 ml., cu un volum mic de mediu nutritiv – 20 şi, corespunzător, 70 ml.
Cultivarea suspensiilor pe o scară mai mare se efectuează cu o capacitate de
câteva zeci de litri prin aeraţia activă a mediului lichid.
Ciclul de creştere sau ciclul de cultură – cuprinde perioada de la introducerea
inoculumului pe mediul proaspăt, până la subcultivarea următoare.
14
 Cultura celulelor în suspensii se prezintă ca o populaţie de celule separate şi
mici agregate celulare. Dacă nu ţinem seama de heterogenitatea în interiorul
populaţiei, apoi creşterea culturilor celulare a diferitelor populaţii se descrie, de
asemenea, în formă de curbă de tipul literei S (aceleaşi faze de creştere ca şi la
celulele ţesutului de calus).
Ciclul de creştere a culturii de suspensie se măsoară cu durata timpului până
când cultura în suspensie ajunge la faza staţionară. Durata fazelor depinde de
specia de plante şi de organele, din care a fost obţinută cultura de calus. De obicei,
durata pasajului (timpul până la transplantare) e de 14-16 zile. Totodată, se
măreşte densitatea de la 5×10 4-105 celule/ml până la 105×106 celule/ml (cam de 20
de ori). Pentru subcultivare (transplantare), suspensia celulară se ia la sfârşitul
fazei logaritmice (exponenţiale). Pentru fiecare cultură trebuie de ales condiţiile, în
prezenţa cărora creşterea suspensiei este optimală: se realizează curba, în forma
literei S, la o viabilitate destul de sporită (70-80%). Celulele unice şi grupele lor
(agregatele), care alcătuiesc cultura suspensială, se numesc unităţi de cultivare.
În procesul de lucru, cultura suspensiilor se caracterizează prin următorii
parametri:
– Densitatea populaţiei celulare – reprezintă concentraţia celulelor într-un ml
de suspensie;
– Perioada minimală pentru dublarea populaţiei celulare în cultura de
suspensii acumulate. De exemplu, timpul dublării celulare la sfecla de
zahăr este de 86 de ore, la tutun – 48 de ore, la trandafir – 36 de ore, la
fasole – 22 de ore;
– Greutatea substanţei brute a suspensiei se determină după instalarea ei pe
un filtru, în prealabil cântărit, din ţesut de nailon şi spălat cu apă după
înlăturarea resturilor mediului nutritiv;
– Greutatea substanţei uscate se determină după uscarea unei anumite
cantităţi de masă brută a celulelor la temperatura de 60-70 oC în decurs de
24 de ore;
– Numărul de celule. Pentru a stabili numărul de celule într-un volum anumit
a suspensiei este necesar să se facă prelucrarea suspensiei cu soluţie de 5-
10% a acidului de crom, pentru a obţine suspensia monocelulară. După
aceea, se calculează numărul de celule într-un mililitru al suspensiei
monocelulare, care se suprapune peste camera de calcul;
– Dimensiunile celulelor se determină prin măsurarea lungimii şi lăţimii lor la
microscop, cu ajutorul diviziunilor ocular-micrometrului;
– Viabilitatea culturii se determină după raportul dintre numărul de celule
viabile faţă de numărul de celule dintr-un mililitru de cultură.
O mare importanţă revine şi procesului de sincronizare a diviziunilor celulare
în cultura de suspensie. În genere, populaţia celulară a culturilor în suspensie este
15
nu numai heterogenă, dar şi asincronă, după timpul includerii celulelor în mitoză,
ceea ce generează dificultăţi pentru obţinerea unui număr necesar de celule, care se
află la unul şi acelaşi stadiu de dezvoltare.
Pentru sincronizarea culturilor celulare se folosesc metodele de inducţie, când
decursul ciclului celulei se blochează într-o perioadă determinată, sub influenţa
factorilor fizici sau a componenţilor chimici.
Din domeniul citologiei se ştie, că ciclul celular reprezintă totalitatea fenomenelor din
viaţa celulei de la o diviziune şi până la următoarea şi constă din 4 perioade:
G
1 – perioada presintetică – începe după mitoză;
S – perioada sintetică, în decursul căreia se produce sinteza ADN-ului;
G2 – perioada postsintetică;
M – perioada diviziunii mitotice.
Inductorii sinhronizaţiei în sistema celulelor cultivate pot fi inhibitorii sistemei
ADN-timidin sau oxiurea.
Atunci, când celulele se tratează cu aceste substanţe, ciclul celular continuă
numai până la perioada G1 şi celulele se acumulează înaintea perioadei sintetice.
Înlăturarea din mediu a inhibitorului duce la trecerea sincronică a celulelor la
sinteza ADN-ului şi apoi la diviziunea lor.
Altă metodă de sincronizare a culturii este “înfometarea”. În acest caz, din
mediul cultural se exclude unul din componenţi. Celulele se acumulează în
perioadele G1 şi G2 ale ciclului celular. Apoi urmează pasajul culturii pe un alt
mediu cu lipsa componentului în cauză, ceea ce aduce la sincronizarea diviziunii
celulare. Dintre astfel de componenţi ai mediului, faţă de care celulele vegetale
sunt sensibile la cultivare, în primul rând, trebuie să fie numiţi: fitohormonii
(auxinele, citochininele), glucidele şi azotul.
Cultura suspensionară se foloseşte ca o sistemă-model pentru studierea căilor
metabolismului secundar a sintezei enzimelor, a expresiei genelor etc.
Suspensia celulară este o sursă de valoare a substanţelor biologic active (de
exemplu, a medicamentelor), serveşte ca material pentru selecţia celulară, pentru
obţinerea celulelor izolate sau a protoplaştilor.

1.1.4. Cultura celulelor izolate şi cultura protoplaştilor.

Suspensiile celulare constituie materialul iniţial pentru evidenţierea celulelor
izolate.
Pentru argumentarea totipotenţei unei celule izolat separate, este necesar de
înfăptuit pe cale experimentală următoarele procedee:
– izolarea celulelor separate;
– multiplicarea celulei izolate;
– cultivarea plantei întregi dintr-o celulă aparte izolată.

16
 Primele lucrări privitor la izolarea celulelor şi obţinerea clonilor monocelulari
au fost efectuate în 1954 de un grup de savanţi de la Universitatea Wisconsin
(SUA). Celulele separate de tutun au fost izolate din bucăţi de ţesut de calus,
plasate în substratul nutritiv lichid. Recipientele cu mediu şi calus au fost instalate
pe un rotativ cu viteză permanentă, pentru o agitare cât mai bună. Apoi s-au
separat celule individuale. Pentru a obţine cloni monocelulari a fost elaborată şi
folosită metoda ţesutului “dădacă“. Separată individual, celula plasată pe mediul
nutritiv nu se divizează. Atunci au transferat-o pe hârtie de filtru, înmuiată în
substratul nutritiv. Hârtia de filtru cu celula a fost aranjată pe suprafaţa unui ţesut
de calus în bună creştere. În această situaţie, celula de calus a dat un impuls de
inducţie şi a susţinut mereu diviziunea celulei. Ca urmare, numai dintr-o singură
celulă izolată s-a obţinut un ţesut de calus.
Experienţele ulterioare (anii 1959-1965), au constituit o mărturie a totipotenţei
unei singure celule izolate aparte. Celule individuale au fost izolate nu numai din
suspensii celulare, din ţesuturile de calus, dar şi din plante întregi. Unul dintre cele
mai potrivite obiecte s-au dovedit a fi celulele mezofilului frunzelor mature.
Aceste celule au fost izolate pe cale mecanică cu ajutorul bisturiurilor speciale.
Izolate, în acest fel, celulele au fost cultivate într-un mediu nutritiv lichid, în care
s-a observat diviziunea lor.
O direcţie foarte interesantă şi de perspectivă a cercetărilor din biotehnologia
vegetală reprezintă izolarea şi utilizarea protoplaştilor.
Protoplastul izolat este acea parte a celulei, care rămâne după îndepărtarea
peretelui celular. Protoplastul are formă caracteristică, de regulă sferică, iar
suprafaţa lui este protejată numai de plasmolemă.
Protoplaştii se separă din diferite părţi ale plantelor, de asemenea, din calus şi
din cultura de suspensii. Adeseori, în calitate de material iniţial se foloseşte
mezofilul, care eliberează o mulţime de protoplaşti de acelaşi fel.
Izolarea protoplaştilor, pentru prima dată, a fost efectuată de către Klerker în
anul 1892, pe cale mecanică. Celulele supervacuolizate ale ţesuturilor de rezervă
au fost supuse plasmolizei, apoi au fost tăiate şi, în rezultat, se eliberau protoplaşti.
În 1960 Cocking a demonstrat posibilitatea izolării enzimatice a unui număr
mare de protoplaste. El a separat protoplastele din vârfurile rădăcinilor şi
mlădiţelor de tomate, solubilizând pereţii celulari cu enzima celulaza, obţinută din
ciuperca de mucegai Myrothecum verrucaria.
Preparate comerciale de enzime pentru izolarea protoplaştilor au fost oferite
de către cercetătorii japonezi în anul 1968. Actualmente, se folosesc preparate de
celulaze şi pectinaze, obţinute din culturile de ciuperci şi din sucul gastric al
melcului Helix pomatia. Tipul enzimelor, combinarea lor şi concentraţia se aleg
pentru fiecare tip de ţesut şi plantă.

17
 În cadrul unor experienţe a fost demonstrat că, imediat după spălarea
enzimelor, protoplaştii încep să regenereze peretele celular. În această perioadă se
observă majorarea reticulului endoplasmatic, legat cu plasmalema. Toate
substanţele sintetizate din protoplast migrează spre locurile de formare ale
învelişului nou. Iniţial se observă apariţia microfibrilelor celulozice, care treptat se
organizează în peretele celular tipic. În multe cazuri, deja peste vre-o 2-4 zile,
protoplastul îşi pierde forma sferică, se regenerează peretele celular. La unele
culturi, de exemplu la Vicia, se remarcă apariţia învelişului vădit peste 8-24 de ore
de la începutul cultivării. În alte cazuri, s-a remarcat lipsa sintezei învelişului
celular în decurs de câteva săptămâni sau chiar luni. Unul din factorii mediului
cultural, care condiţionează sinteza peretelui celular, este zaharoza. În lipsa ei,
sinteza peretelui celular nu se efectuează.
Protoplaştii care nu regenerează peretele celular, îşi pierd capacitatea de diviziune
mitotică normală şi de formare a coloniilor celulare. Astfel de protoplaşti sau nu se
divizează, sau, dacă diviziunea are loc, atunci în urma diviziunii se formează celulele
polinucleare, deoarece cariochineza nu însoţeşte citochineza. Dar nici formarea
peretelui celular nu este o condiţie, îndeajuns, pentru ca celula să treacă la diviziune.
În dependenţă de specificul şi condiţiile de cultivare, diviziunea ulterioară pot s-o
înceapă de la 0.1 până la 80% de protoplaşti, care au regenerat peretele celular.
Primele diviziuni devin observabile peste 2-7 zile de la începutul cultivării
protoplaştilor. În rezultatul diviziunilor şi a dezvoltării celulelor se formează colonii,
care pot servi drept sursă pentru plantele-regenerante.
Prima comunicare despre regenerarea plantelor în cultura protoplastelor
mezofilului frunzelor de tutun a fost publicată în 1971. Mai târziu, totipotenţa
protoplaştilor a fost demonstrată pentru mulţi reprezentanţi din fam. Solonaceae.
Există şi unele limite genotipice, care determină posibilitatea protoplaştilor de
a regenera peretele celular şi a trece la diviziune. S-a constatat, de exemplu, că
gramineele constituie unul din cele mai grele obiecte pentru obţinerea
protoplaştilor totipotenţi, în comparaţie cu solonaceele.
De regulă, la regenerare este capabilă cultura protoplaştilor separată din celule
cu potenţial morfogen. După cum s-a mai subliniat, calusul morfogen şi embriogen
la graminee, de obicei, se obţine din ţesuturile meristematice ale embrionilor tineri
şi infloriscenţelor tinere. Ţesuturile meristematice posedă celule foarte mărunte,
ceea ce îngreuiază obţinerea din ele a protoplaştilor. În acest caz, se obţine iniţial
cultura de calus, care posedă capacitatea de a regenera, iar apoi o astfel de cultură
se introduce în suspensie. Suspensia poate să păstreze potenţialul morfogen, dar
poate să şi-l piardă. Celulele morfogene ale suspensiei, prin transferarea lor în
mediu agarizat, devin surse de plante-regenerante. La graminee, suspensii
morfogene s-au obţinut la grâu. După regenerarea peretelui celular şi dezvoltarea
coloniilor celulare, osmoticii sunt excluşi din mediu.
18
 Un alt factor al cultivării reuşite a protoplaştilor este şi densitatea semănatului
lor. În majoritatea cazurilor, această mărime alcătuieşte 10 4-105 de protoplaşti la 1
ml de mediu.
Lipsa peretelui celular la protoplaşti condiţionează însuşirile lor, deosebite de
celulele întregi, precum şi posibilitatea de a le folosi în diferite experienţe. În
calitate de model, protoplaştii sunt aplicaţi în experienţele de fiziologie şi
biochimie: pentru studierea sintezei peretelui celular, a funcţiei plasmalemei, a
analizei schimbărilor metabolismului protoplaştilor cu celula întreagă. Modalitatea
de a introduce predecesorii marcaţi în protoplaşti, dă posibilitatea de a efectua
cercetări cu privire la reglarea proceselor de transcripţie la plante. Protoplaştii
izolaţi servesc în calitate de sursă pentru separarea structurilor şi organitelor
subcelulare şi citoplasmatice funcţional active şi nevătămate (cloroplastele,
vacuolele, nucleii, cromozomii). Protoplaştii sunt capabili să absorbe
macromoleculele şi organitele. Aceasta condiţionează folosirea lor în experienţe în
ce priveşte transformarea plantelor.
În paralel cu celulele izolate, protoplaştii sunt folosiţi în experienţele ce se
referă la selecţia celulară şi în mutageneză. Capacitatea protoplaştilor de a fuziona
între ei se foloseşte pentru crearea hibrizilor somatici.

1.1.5. Particularităţile populaţiilor celulare in vitro. Prima etapă

de dediferenţiere a celulei este intrarea în ciclul mitotic (celular). Inductorii acestui
proces sunt fitohormonii – auxinele şi citochininele, sub influenţa cărora se
intensifică sinteza ADN-ului, ARN-ului, proteinei. În urma diviziunii active
celulare se formează ţesutul de calus.
Deşi are loc o oarecare standardizare a tipurilor de celule cultivate, totuşi,
cultura de calus a ţesuturilor vegetale nu prezintă o populaţie omogenă de celule
divizibile. Ţesutul de calus poate fi prezentat de către următoarele tipuri de celule:
– parenchim;
– celulele separate sau zone de elemente ale sistemei conducătoare;
– focare de celule meristematice;
– necrotic (necroze).
O astfel de heterogenitate a celulelor poate fi legată de heterogenitatea
celulelor explantelor iniţiale sau de procesele de diferenţiere secundară, care se
petrec în cultura ţesutului.
Cultura ţesuturilor este caracteristică nu numai prin heterogenitatea după gradul
de diferenţiere a celulelor, dar şi prin neomogenitatea citogenetică. S-a stabilit, că
celulele ţesuturilor vegetale mature şi diferenţiate, ca, de exemplu, scoarţa, măduva, se
caractereizează prin variabilitatea lor după numărul de cromozomi.
Anume celulele meristematice se analizează pentru a constata numărul de
cromozomi, caracteristic pentru citotipul plantei analizate. În meristemele apicale
(vârfurile rădăcinilor, lăstarilor) are loc ciclul normal celular; după sinteza ADN-
19
ului urmează diviziunea nucleului şi a celulei întregi cu formarea a două celule-
fiice. În aşa fel, poliploidia celulelor meristematice se menţine la acelaşi nivel.
Totuşi, în procesul de diferenţiere a celulelor pot avea loc abateri în ciclul celular,
care duc la schimbarea numărului de cromozomi în celulă. Astfel, în cultura
ţesuturilor la floarea-soarelui, în decurs de 16 luni de cultură, celulele au rămas în
majoritatea lor diploide. După acest timp de cultură, a început să crească frecvenţa
celulelor poliploide, iar după 28 de luni două din patru linii au devenit complect
tetraploide.
În condiţii de cultură, mai frecvent decât în planta întreagă, la rând cu
poliploidizarea are loc şi aneuploidizarea celulelor. Se pot întâlni, de asemenea,
aberaţii structurale ale cromozomilor: translocaţii, deleţii, inversii, duplicaţii.
Hetereogenitatea citogenetică a culturii in vitro poate fi condiţionată de două
motive de bază:
– celulele explantului iniţial au ploidia şi constituţia genetică diferită;
– celulele explantului iniţial au aceeaşi ploidie, care este specifică pentru
celulele meristematice ale plantei, dar în condiţii de cultură se produce
variabilitatea lor.
Ca inductori ai variabilităţii citogenetice a celulelor în cultură pot fi diferiţi
componenţi ai mediului nutritiv, inclusiv fitohormonii, rolul cărora a fost studiat
mai detaliat. Este necesar de remarcat, că acţiunea unuia şi aceluiaşi hormon în
diferite sisteme celulare poate să determine diverse reacţii ale celulelor în cultură.
Astfel, prin cultivarea segmentelor rădăcinii de mazăre pe mediul nutritiv, care
conţinea 2.4D, s-a observat numai diviziunea celulelor diploide. Prin adăugirea, în
mediul nutritiv, a chinetinei şi a extractului de drojdii a fost indusă diviziunea
celulelor tetraploide. În alte experienţe a fost demonstrat rolul auxinei 2.4D, ca
factor de poliploidizare. Aşa, în cultura de suspensie Haplopappus, în mediul ce
conţinea 2.4D, în decurs de 6 luni de cultivare se desfăşura o prefacere a culturii
diploide în tetraploidă.
În multe cazuri, pe măsura măririi timpului de cultivare se remarcă o majorare
a nestabilităţii citogenetice. Totodată, se mai pot forma linii cu însuşiri specifice.
Astfel, a fost obţinută cultura de calus din parenchimul mădular al tutunului, din
care iniţial a fost evidenţiată linia, marcată KX-1, care necesită pentru creştere şi
auxine şi citochinină. În procesul de analiză citologică a celulelor acestei linii s-a
evidenţiat o variaţie a numărului de cromozomi în diferite plăci metafazice – de la
150 cromozomi şi mai mult. Din această linie au fost separate alte două: X-I şi O-
I. Pentru creşterea liniei X-I era nevoie de adăugat în mediu numai auxină, iar
variabilitatea după numărul de cromozomi era de la 123 până la 275. Linia O-I era
auxin-independentă şi citochinin-independentă, adică pentru creşterea ei aceşti
fitohormoni nu erau necesari. Variabilitatea numărului de cromozomi în celulele
acestei linii era de la 70 până la 100 (numărul diploid de cromozomi la planta-
donor de tutun fiind 2n – 24).
20
 Aşadar, pentru culturile de ţesut şi celulare in vitro este caracteristică
heterogenitatea, care poate fi exprimată prin gradul diferit de diferenţiere, cât şi
prin heterogenitatea citogenetică a celulelor.
La o anumită etapă de cultivare, celula de calus poate întrerupe procesul de
diviziune şi să treacă la creştere şi diferenţiere.
Există câteva căi pe care poate să se dezvolte celula de calus după
diferenţierea ei:
– ontogeneza normală a celulelor de calus, care se termină cu îmbătrânirea şi
apoi degradarea celulelor;
– pierderea capacităţii celulelor de calus pentru diferenţierea secundară şi
regenerarea plantelor, manifestarea capacităţii de a creşte pe mediile de
cultură fără hormoni, adică transformarea celulei de calus în celulă –
tumoră. Astfel de însuşiri caracterizează celulele culturilor vechi de
repicare, iar procesul de transformare a celulelor de calus, aşa-numitele
tumori chimice, se numeşte fenomenul de deprindere;
– diferenţierea secundară a celulelor de calus. Anume pe această cale pot fi
obţinute plante-regenerante în condiţii de cultură in vitro.
Pe parcursul ultimei căi, în cultura ţesuturilor pot fi observate următoarele
tipuri de manifestare a diferenţierii secundare a celulelor de calus:
– histodiferenţierea (histogeneza) – în procesul căreia celulele de calus se
transformă în elementele de floemă sau xilemă;
– diferenţierea celulei de calus, care iese din ciclul de diviziune şi care se
specializează asupra sintezei unor produse (fitohormoni, vitamine şi al.);
– morfogeneza, cu regeneraţia ulterioară a plantei întregi.

1.1.6. Particularităţile morfogenezei celulelor de calus.

Morfogeneza reprezintă formarea individuală a plantelor ce include procesele
de creştere şi dezvoltare a celulelor (citogeneza), ţesuturilor (histogeneza),
organelor (organogeneza), care sunt genetic programate şi coordonate între ele.
Morfogeneza în cultura ţesuturilor poate să se manifeste în formă de
organogeneză şi în formă de embriogeneză somatică (fig. 1.2).
Organogeneza constitue procesul de formare a germenilor, rădăcinilor sau
mugurilor vegetativi sau florali. Organogeneza se subdivizează în: organogeneza
radiculară, de lăstari şi florală, cu formarea mugurilor florali.
Formarea plantelor pe cale de organogeneză constă în apariţia şi creşterea
lăstarilor din caluşi, sau din iniţierea şi creşterea lăstarilor din muguri axilari, care
formează ulterior rădăcini adventive. Lăstarul este structura monopolară, fizic
legată cu ţesutul, de la care îşi ia originea.
Procesele de organogeneză la nivelul celular sunt de durată destul de lungă şi
asincrone. În genere, se produc următoarele fenomene:
21
 10

9 1

8
l=stari omogenizator
2

embrioizi
r=d=cini
7
celule de
mezofil

6 3

5 4

Fig. 1.2. Ciclul de regenerare a plantelor de Macleya cordata × microcarpa

prin culturi de celule (după Lang and Kohlenbach, 1978).
1 – triturare în omogenizator; 2 – separarea celulelor; 3,4, – formarea calusului;
5 – segmentarea calusului; 6,7 – formarea rădăcinilor sau a embrioizilor;
8,9,10 – plantule regenerate şi transplantate în sol.

– în cultura de calus se remarcă formarea de zone meristematice, în special în

partea ei bazală, care contactează cu mediul nutritiv;
– celulele acestor zone se caracterizează prin sinteza intensivă a ARN-ului şi
proteinei;
– treptat se produce formarea rudimentelor de organe.
Acest proces se controlează nu numai de fitohormoni, care se conţin în mediul
nutritiv, dar şi de fitohormonii endogeni, care se sintetizează de celulele proprii.
Probabil, anume acest nivel de fitohormoni endogeni determină reacţia diferită a
explantelor.
Embriogeneza somatică – formarea celulei zigoto-similare (a embrionului
somatic) din celulele de calus pe cale asexuată. Embrionii somatici, numiţi embrioizi,
se formează prin diferenţierea celulelor somatice. Embrioizii se deosebesc de
embrionii zigotici (sexuali), care se dezvoltă, după cum se ştie, din zigot – celulă, ce s-
a format prin fuziunea a două celule sexuale – maternă şi paternă.
Morfologic, embrioizii şi embrionii zigotici sunt identici şi au o structură
caracteristică bipolară, la care se dezvoltă concomitent apexurile de lăstar şi de
22
rădăcină. Prin aceasta, ei se deosebesc de mugurii de lăstari, care au o structură
monopolară, legată de ţesuturile vacuolare cu organul plantei sau cu ţesutul de
calus.
Predispoziţia celulelor ţesutului cultivat pentru anumite căi de dezvoltare în
condiţii in vitro poate să depindă de mai mulţi factori, printre care:
– factori interni:
– genotipul plantei iniţiale;
– vârsta fiziologică (starea de ontogeneză);
– aparţinerea explantului la un anumit organ sau ţesut.
– factori externi:
– acţiunea factorilor fizici în procesul de cultivare;
– durata de cultivare;
– componenţa mediului nutritiv.
Cel mai puternic inductor al morfogenezei este schimbarea corelaţiei între
citochinine şi auxine, care intră în componenţa mediului nutritiv. În această privinţă,
în anul 1957 a fost efectuată lucrarea clasică a lui Skoog şi Miller. Aceşti autori au
studiat cultura ţesuturilor de tutun, obţinută din parenhima medulară a lăstarilor plantei
în floare. Celulele unor astfel de culturi nu se divizează şi nu cresc pe medii fără
auxine şi citochinine. Prin adăugirea în mediul cultural a acestor fitohormoni, în
dependenţă de balansul lor, au fost observate următoarele particularităţi:
– o majorare a conţinutului de citochinină în raport cu auxina, contribuie la
formarea de muguri şi lăstari într-o cultură care creşte sporadic;
– majorarea concentraţiei de auxină în raport cu citochinina contribuie la
formarea rădăcinilor;
– concentraţia mijlocie, aproape egală în raport după conţinutul auxinei şi
citochininei, menţine creşterea neorganizată a ţesutului de calus.
Fenomenele menţionate reprezintă doar unele dintre cele câteva principii
generale, de care se călăuzesc experimentatorii, atunci când aleg componentele
mediului de cultură pentru reglarea proceselor de organogeneză in vitro.
Totuşi, trebuie de avut în vedere, că numărul de celule în care se schimbă
programul de diferenţiere sub influenţa condiţiilor ce duc spre morfogeneză, este
prea mic în comparaţie cu numărul total de celule în populaţie. Aşadar, pentru a
trece la morfogeneză, nu este suficientă influenţa inductorului, dar este necesar ca
celula să fie gata să răspundă la acţiunea lui.
În unele cazuri, spre exemplu la unele graminee şi leguminoase, nici unul din
inductorii hormonali cunoscuţi n-a provocat morfogeneza şi n-a adus la obţinerea
plantelor din celule şi protoplaşti.
Morfogeneza începe de la faptul că, sub influenţa condiţiilor corespunzătoare,
celula care îndeplineşte rolul zigotei (în embriogeneza somatică) sau formează

23
un focar meristematic (în organogeneză), se izolează de celulele de calus, formând
un perete celular îngroşat. Celula iniţială se deosebeşte de celelalte celule de calus
prin dimensiunile mai mici ale vacuolei şi are un nucleu mai măşcat. Se măreşte
raportul nucleo-plasmă. Nucleul ocupă o poziţie centrală. Vacuola întretaie o
mulţime de fibre. De multe ori, celulele iniţiale conţin mult amidon, dar, câteodată,
în calitate de substanţă de rezervă, şi lipide.
Caracteristica celulelor iniţiale, apărute în masa celulelor de calus, indică asupra
faptului, că ele nu sunt celule activ proliferatoare. Ele, mai curând, se află în stare de
lagfază specifică, necesară pentru reconstrucţia şi pregătirea lor pentru diviziunile
accelerate ulterioare. Apoi, celula separată se divizează de câteva ori la rând.
Celula iniţială se divizează după tipul fracţionării, formând în rezultatul
câtorva diviziuni accelerate o masă de celule sferice, mărunte, izodiametrice, cu
caracter embrionar sau meristematic. Această masă de celule, apărute din celulele
determinate, se numeşte sau factor meristematic, în care se diferenţiază rudimente
de lăstari sau rădăcini, sau factor proembrio globular, dacă în masa acestor celule
se dezvoltă structura embrioidă bipolară. Aceste celule se caracterizează cu un
nucleu mai mare şi cu o majorare a raportului nucleo-plasmal.
Focarele meristematice sau proembrio pot să apară la periferia ţesutului de
calus sau pot fi adâncite în ea. Dealtfel, nu s-a semnalat nici o regulă în localizarea
lor. Ca excepţie, poate fi organogeneza de lăstari – caulogeneză la cultura de calus,
obţinută din parenchim mădular la tutun a soiului Wisconsin-38, la care focarele
meristematice şi structurile de lăstari au fost localizate numai în partea inferioară a
masei tisulare.
În procesul de trecere de la celulele de calus spre morfogeneză se schimbă
metabolismul. S-a dovedit, că formele de focare meristematice şi proembrio
globulare sunt însoţite de intensitatea majorată a respiraţiei şi a consumului rapid a
amidonului de rezervă. Se măreşte, de asemenea, şi consumul de glucide. Se
intensifică activitatea fermentului glicoliză şi a căii de respiraţie pentozofosfate; se
activează sinteza proteinei şi a ARN-ului. Activitatea sintetică intensificată a
celulelor focarului meristematic şi proembrio, le transformă într-un centru de
atracţie, unde se transportă toate substanţele nutritive. Celulele de calus, care le
înconjoară, de multe ori se distrug şi embrioizii, care se formează uşor, cad din
masa celulelor de calus. Celulele de calus sunt legate între ele cu plasmodesme şi
sunt foarte reduse. Celulele focarelor meristematice sau a embrioizilor dezvoltaţi
sunt legate între ele cu o mulţime de plasmodesme.

1.1.7. Regenerarea plantelor din celule cultivate in vitro.

Capacitatea unei celule izolate de a da început unui organism vegetal întreg
este legată de fenomenul de totipotenţă a celulei vegetale. Totipotenţa celulelor
somatice de multă vreme e folosită pentru înmulţirea vegetativă a plantelor.
24
Segmentele de lăstari, frunze, rădăcini ale plantelor de diferite grupe taxonomice
sunt capabile să regenereze lăstari şi rădăcini. În condiţii de cultură in vitro, aceste
posibilităţi sunt cu mult mai mari, ele sunt de asemenea realizate şi la plante, care
n-au manifestat capacitatea de regenerare în condiţii naturale. De exemplu, dacă la
mlădiţele tinere de in, care încă n-au atins vârsta de 15 zile, se înlătură vârful
mlădiţei, peste un anumit interval de timp din celulele epidermale ale hipocotilului
încep să se formeze o mulţime de muguri, de lăstari. Ceva mai târziu, unul din ei
începe să se dezvolte mai deplin şi dă naştere unui lăstar real. Dacă în mediul de
cultură al componenţei corespunzătoare se plasează un segment de hipocotil de 15
mm, se dezvoltă până la 160-170 de plăntuţe care se formează atât din celulele
epidermale, cât şi din celulele subepidermale (Link, Eggers, 1946 Murray şi al.,
1977).
Or, obţinerea plantelor prin organogeneză sau prin embriogeneză somatică se
poate înfăptui pe două căi: directă şi indirectă (fig.1.3 şi fig.1.4. Anexa). Calea
formării mugurilor de lăstari sau a mugurilor florali din celulele explantului fără
formarea ulterioară a calusului, se numeşte organogeneză directă; de exemplu,
obţinerea plantelor de Begonia prin organogeneza din mugurii florali. Calea de
formare a structurilor morfologice, care duc spre formarea mugurilor de lăstari şi a
celor florali, a rădăcinilor şi a plantelor întregi în cultura de calus, se numeşte
organogeneză indirectă.
Prin analogie cu organogeneza, se deosebesc două tipuri de embriogeneză
somatică: directă şi indirectă. În cazul embriogenezei directe, formarea
embrionilor somatici se înfăptuieşte din celulele explantului fără faza
premergătoare a calusogenezei. Embriogenezei indirecte îi premerge
calusogeneza.
Drept exemplu de embriogeneză somatică în condiţii naturale (in vivo), poate
servi poliembrionia adventivă la citruşi. Într-o sămânţă pot fi până la 40 de embrioni.
De obicei, numai un singur embrion se formează din celulele sexuate şi cuprinde în
sine atât caracterele materne, cât şi cele paterne ale plantei. Ceilalţi embrioni sunt
asexuali şi se dezvoltă din celulele nucelusului, care înconjoară sacul embrionar şi
conţin în sine numai caracterele plantei materne. Prin cultivarea celulelor nucelusului
în condiţii in vitro, se înfăptuieşte formarea embrionilor somatici.
Aşadar, inducţia morfogenezei şi regeneraţia plantelor reprezintă un proces
complex, deseori format din mai multe etape.

1.2. Cultura in vitro pentru obţinerea substanţelor

biologic active
Metabolismul primar, asemănător pentru toate organismele vii, include: formarea
şi descompunerea acizilor nucleici, proteinelor şi precursorilor săi, de asemenea
majoritatea glucidelor, a unor acizi carbonici etc. În afară de metabolismul
25
primar, mai există un mare număr de căi metabolice, care duc la formarea de
compuşi specifici numai pentru unele specii. Aceste reacţii sunt unite sub o
singură definiţie – metabolismul secundar, iar produsele lor se numesc produse ale
metabolismuluii secundar sau substanţe secundare.
Metaboliţii secundari pot fi obţinuţi pe mai multe căi. Prima presupune
extracţia din plantele cultivate sau din flora spontană. O altă cale este semisinteza
chimică, care necesită identificarea în plante a moleculelor, de la care se poate
continua sinteza in reactor; cei mai mulţi compuşi din această categorie sunt, însă
greu de sintetizat. Cea mai eficientă cale este cultivarea in vitro a celulelor care
sintetizează metaboliţi secundari. Pe această cale pot fi obţinuţi compuşii doriţi, la
niveluri calitative şi cantitative constante.

1.2.1. Specificul sintezei şi acumulării metaboliţilor secundari

in vitro şi factorii, care influenţează asupra acestor procese.
Una din particularităţile culturii ţesuturilor constă în posibilitatea celulelor de a
păstra capacitatea de sinteză a substanţelor secundare, care caracterizează specia
respectivă de plante.
Pentru prima dată cultura ţesuturilor la plantele medicinale a fost obţinută în
1945 de către White. Aceasta a fost ţesutul galelor coronate de la Vinca rosea.
Ulterior, în 1947, Tell şi Gautheret au stabilit, că cultura ţesuturilor măsălăriţei
negre (Hyoscyamus niger) este producentul alcaloizilor. Din acest moment s-au
intensificat cercetările în ce priveşte studiul cultivării celulelor în suspensii şi
capacităţii lor de a acumula produsele secundare ale biosintezei. Spre anul 1982, în
urma folosirii culturii celulelor, au fost obţinute mai mult de 30 de produse ale
metabolismului secundar în cantitate egală sau cu depăşirea obţinerii lor, în mod
tradiţional, din plantele corespunzătoare (producenţi ai acestor substanţe).
De exemplu, despre substanţe utilizate în farmaceutică:
– conţinutul de serpentin în masa celulară din Catharanthus roseus este mărit
de 1000 de ori în comparaţie cu conţinutul din plantă;
– conţinutul de biotină în cultura celulelor lavandei este mărit de 15 ori în
comparaţie cu conţinutul din plantă;
– conţinutul de şiconină în cultura de mărgeluş – de 12 ori;
– conţinutul de aimalină în masa celulară Rauvolfia – de 10 ori;
În producţia industrială şi-au găsit aplicare culturile celulare ale producenţilor
naturali: tutun – sursa pentru ubihinon – 10, folosit în calitate de vitamină, dracilă
– producentul iatrorezinei (mijloc medical spazmolitic); mărgeluş, care produce
şiconină (se aplică pentru tratamentul rănilor, arsurilor).
Pentru multe culturi este necesar de perfecţionat cultura in vitro cu condiţia, că
folosirea lor în calitate de materie primă medicinală, din punct de vedere economic
să fie avantajoasă.
26
 În planta intactă, biosinteza produselor metabolismului secundar este limitată de
celulele şi ţesuturile specializate, unde în urma expresiei genelor se sintetizează şi se
acumulează fermenţii, răspunzători de un anumit proces de sinteză. Produsele
metabolismului secundar sintezate pot să se acumuleze în aceleaşi celule, unde au şi
fost sintetizate. De exemplu, la sfeclă, alcaloizii şi se sintetizează, şi se acumulează în
rădăcină şi tulpină. În alte cazuri, locurile de biosinteză ale produsului nu coincid cu
locurile de acumulare. La belladona, la tutun sinteza se produce în rădăcini, apoi prin
xilemă se transportă în partea superioară a plantei şi se acumulează în epiderma
frunzelor şi a lăstarilor. Alcaloizii dracilei se sintezează în rădăcini, iar acumularea se
realizeasză în rădăcini şi tulpini. Locul de sinteză a cofeinei la cafea sunt părţile verzi
ale plantei, iar acumularea se realizează în frunze şi fructe.
Atât sinteza, cât şi acumularea produselor metabolismului secundar se
realizează în celule specializate sau în straturile unor astfel de celule. De exemplu,
la lupin, alcaloizii se sintezează în cloroplastele celulelor stratului mezofil al
frunzelor, apoi, prin floemă, se transportă în epidermă. Epiderma este locul de
acumulare a alcaloizilor la multe plante (colhicină la brânduşă, alcaloizii
stereotipici în Solonaceae, morfine – la Papaveraceae, cocaină – la Erytroxylon).
La multe specii de plante terpenele, uleiurile, flavanoizii, ceara se acumulează în
cuticula lăstarilor. În perii secretori a multor specii se acumulează uleiuri. Locul de
bază a metabolitelor secundare sunt vacuolele centrale ale celulelor diferenţiate
specializate. Sinteza şi acumularea produselor metabolismului secundar depind de
anotimp şi de starea ontogenetică a plantei.
Produsele metabolismului secundar îndeplinesc o funcţie anumită în plantele
intacte. De exemplu, alcaloizii sunt componenţii ce conţin azot. Anume ei, într-o
anumită perioadă a ontogenezei, se acumulează şi apoi sunt folosiţi de plantă.
Foarte des, la sfârşitul vegetaţiei, alcaloizii nu se pot evidenţia în ţesuturile
plantelor. Astfel, la lupin, alcaloizii se află în seminţe. În procesul de germinare a
seminţelor se produce degradarea alcaloizilor până la substanţe azotoase simple,
care sunt asimilate de către mlădiţele în creştere.
După cum se ştie, la plante nu există sistema imună, de aceea, protecţia
biochimică a plantelor faţă de microorganisme (viruşi, bacterii, ciuperci), faţă de
animale şi alte plante (în ultimul caz ne referim la fenomenul de alelopatie) se
efectuează de către metabolitele secundare.
Aşadar, plantele sunt bioproducente a multor substanţe, sinteza şi acumularea
cărora reprezintă un proces complex, genetic controlat, care decurge în spaţiu şi
timp.
În decursul izolării fragmentelor ţesuturilor şi a celulelor separate, se produce
încălcarea legăturilor corelative între procesele care pot să nu fie realizate in vitro.
De aceea, pentru susţinerea biosintezelor folositoare în condiţii de cultură este
necesară:
27
 – alegerea corectă a ţesutului iniţial;
– optimizarea condiţiilor de cultivare;
– controlul asupra produselor biosintezei.
S-a demonstrat, că cea mai eficientă cale este utilizarea culturii masei celulare
cu bioproducenţi, din ţesuturi care sunt şi producenţi, şi acumulatori ai produsului
dat.
În cazul, dacă la plantă este programat transportul distanţional al produsului
sintezei, atunci în condiţii de cultură in vitro poate să fie relevată elaborarea
produsului dat din celule în mediul nutritiv. De regulă, produsul format sub
acţiunea fermenţilor eliberaţi de către celule în mediu, se distruge. De aceea,
succesele în obţinerea alcaloizilor din biomasa celulelor (în multe cazuri) sunt
legate de faptul, că celulele cultivate îndeplinesc două funcţii: de biosinteză şi de
acumulare. Îndeosebi, acest proces este caracteristic pentru culturile de origine
radiculară, care produc alcaloizii: şiconină la mărgeluş, iatrorrizină la dracilă,
nicotină la tutun, diosgenină la dioscoreia şi al.
Locurile de biosinteză a multor produse au fost stabilite graţie folosirii culturii
organelor şi ţesuturilor izolate. S-a arătat că, în cultura ţesuturilor belladonei,
alcaloizii se produc numai în cultura de origine radiculară. Ţesuturile explantate
din părţile aeriene ale belladonei, în aceleaşi condiţii de cultură, nu conţin
alcaloizi. În consecinţă, s-a ajuns la concluzia, că locul de sinteză a alcaloizilor la
această specie se găseşte în rădăcini.
Locul de sinteză a nicotinei la tutun se află în vârfurile rădăcinilor, mai ales în
perioada de alungire a celulelor. Capacitatea de a sintetiza nicotină se păstrează în
cultura de calus – de origine radiculară – şi se menţine până când calusul devine
capabil la rizogeneză. Calusul de tutun – de origine foliară şi semenogenă –
manifestă capabilitatea de a forma rădăcinile şi sintetizează, de asemenea, o
oarecare cantitate de nicotină. Conţinutul de nicotină în culturile de calus – de
originea lăstarilor – se poate majora prin reglarea concentraţiei şi raportului între
fitohormoni şi mediul cultural. Astfel, de cele mai dese ori 2.4 D deprimă sinteza
alcaloizilor, în rândul cărora se află şi nicotina. Acidul indolil acetic (AIA), din
contra, activează această sinteză.
În afară de fitohormoni, un rol important în reglarea productivităţii culturilor
celulare revine şi altor componenţi ai mediului şi condiţiilor de creştere (pH
mediului, temperatura, iluminarea). Aşadar, în condiţii de cultură se pot modela
procesele de biosinteză, schimbând condiţiile de cultivare in vitro.
Unele plante sunt producătoare ale mai multor substanţe valoroase pentru
industria farmaceutică. De exemplu, Vinca rosea conţine mai mult de 60 de
alcaloizi, 4 din care (leirozină, leirozidină, vincaleicoblastină, leirocristină) posedă
diferite nivele de activitate antitumorale (Kalinin şi al.,1980). Locurile de sinteză
ale anumitor alcoloizi în plante intacte de vinca sunt diferite organe: lăstarul,
rădăcina, sămânţa, frunzele.
28
 Folosind în calitate de obiect de studiu cultură celulară la genul Vinca, s-au
demonstrat procesele de diferenţiere a celulelor în cultura in vitro, care pot să
aducă la schimbarea calitativă a componentelor produselor secundare ale
biosintezei. Astfel, în procesul de analiză a culturilor de calus la Vinca a fost
evidenţiată apariţia a 10 alcaloizi neidentici cu alcaloizii plantei mature (Patterson,
Carew,1969).
În consecinţa dediferenţierii poate să se piardă capacitatea de sinteză a
anumitor metaboliţi. Într-un şir de cercetări a fost evidenţiată pierderea capacităţii
culturii ţesuturilor de mintă rece, referitor la sinteza uleiurilor eterice. Aceasta se
explică prin faptul, că biosinteza uleiurilor eterice este legată de anumite structuri,
cum ar fi perii secretori, canalicule, care nu s-au diferenţiat în condiţii de cultură.
În ce priveşte o altă specie de plantă, producentă de uleiuri eterice – Ruta
graveolens – acumularea acestor produse la întuneric, în condiţii in vitro, s-a
realizat în toate celulele, iar la lumină s-au format nişte recipiente, unde cantitatea
de uleiuri eterice s-a majorat cu mult (Reinhardt şi al.,1968).

1.2.2. Căile de intensificare şi păstrare a potenţialului

biosintetic al culturilor celulare.
Pentru a obţine forme celulare cu facultatea genetică determinată spre
supersinteza unor anumite substanţe, se folosesc două căi principale:
– alegerea plantelor, ţesuturilor şi organelor corespunzătoare, care posedă cea
mai mare înclinaţie spre sinteza şi acumularea produsului necesar;
– folosirea variabilităţii genetice a culturilor celulare.
În unele cazuri, variabilitatea productivităţii se intensifică prin prelucrarea
celulelor cu mutageni, spre exemplu, în urma prelucrării cu etilenă a masei
celulelor de calus a rauvolfiei (Rauwolfia serpantina) – producentă de alcoloizi de
indol, s-a obţinut o linie celulară, care se deosebeşte prin conţinutul înalt al unuia
din alcoloizi (Volosovici şi al., 1976).
Prin radiaţia cu razele-γ a celulelor de lavanda s-a putut obţine o linie
mutantă, care conţine de 5 ori mai multă biotină liberă, decât liniile spontan
eliberate (Watanabe, Jamada, 1982).
Prin menţinerea culturilor celulare prin pasage pe mediile proaspete, se poate
păstra potenţialul lor biosintetic în decurs de o lungă perioadă. Astfel, cultura
celulelor de rauvolfia rămâne ca producent al aimalinei în decurs de 11 ani, iar
cultura celulelor de Panax gingseng produce panaxozidele în decurs de 25 de ani
(Butenko, 1986).
Cultura de rădăcini se aplică pentru producerea metaboliţilor secundari a
căror sinteză/acumulare este strâns legată de existenţa unor structuri organizate.
De exemplu, alcaloidul scopolamină este produs de Datura în rădăcini şi
transportat, prin floem, în frunze. O cultură de rădăcini firoase, induse prin infecţie
cu Agrobacterium rhizogenes, reprezintă un excelent material pentru producerea
29
unor metaboliţi secundari (alcaloizi, flavonoizi sau steroizi). Există, de asemenea,
posibilitatea selecţionării unor cloni cu potenţial biosintetizator înalt, deoarece
rădăcinile provin din celule care, fiecare în parte, constituie “un eveniment de
transformare” şi, în consecinţă, prezintă o amplă variabilitate. Clonii pot fi
menţinuţi timp îndelungat cu modificări minime. Un avantaj major al culturii de
rădăcini, comparativ cu suspensiile celulare, constă în faptul că, deseori,
metaboliţii secundari sunt secretaţi în mediu şi pot fi purificaţi relativ uşor.
Se pot păstra formele valoroase şi în condiţii de crioconservare. Există metode
de crioconservare a celulelor vii în azotul lichid cu folosirea substanţelor
crioprotectoare, care apără celulele de vătămare prin congelare. Dintre acestea se
foloseşte dimetilsulfoxida, glucoza, polietilenglicolul, glicerina şi al. Sunt
elaborate şi metode de imobilizare a celulelor vegetale în cultură – producente de
substanţe bioactive.
Pentru diferite culturi e necesar de luat în seamă fazele ciclului de dezvoltare,
în decursul cărora se realizează sinteza şi acumularea produsului, fără a se admite
degradarea lui. De exemplu, la speciile din Solonaceae, majorarea nivelului de
alcaloizi se realizează în faza staţionară şi este legată de începutul proceselor de
diferenţiere şi formare ale rudimentelor radiculare. În suspensia celulară a plantei
Digitalis purpurea, sinteza diditoxinei este optimală în prezenţa focarelor
meristematici (Tewes şi al., 1981). La celulele imobilizate, aceste procese sunt mai
pronunţate decât la celulele libere cultivabile.
O cale efectivă de aplicare a culturii celulelor în calitate de bioproducenţi –
este biotransformarea. Această metodă se bazează pe capacitatea celulelor
vegetale de a transforma substanţele induse în mediul cultural, în anumite produse.
De exemplu, L-fenilalanina sau L-tirozina, induse în mediu la cultivarea celulelor
Coleus blumei, se transformă în acid rozmarinic. Fenilalanina, adăugată în mediul
cultural, se preface de către celulele de tutun în polifenoli. În cultura celulelor de
Datura brusc a fost stimulată majorarea alcaloizilor prin introducerea în mediu a
anumitor aminoacizi, care sunt precursorii biosintezei alcaloizilor. Multe plante
medicinale se înmulţesc cu folosirea metodelor in vitro. Acest proces este de o
mare importanţă mai ales pentru speciile de valoare, care sunt pe cale de dispariţie.
În ultimii ani au fost propuse principiile generale ale programului de producere a
metaboliţilor secundari prin cultura in vitro (Badea, Săndulescu, 2001).
Elaborarea unei tehnologii de producţie a metaboliţilor secundari în culturi in
vitro presupune parcurgerea mai multor etape:
1. Alegerea speciei şi chemotipului.
Se porneşte de la raţionamentul, că genurile/speciile care sintetizează un metabolit
secundar în cantităţi mari vor genera culturi in vitro foarte productive. De exemplu,
genurile Scopolia, Duboisia şi Atropa sintetizează alcaloidul atropină. Speciile genului
Duboisia sunt cele mai bune surse de atropină, însă nu sintetizează
30
acest compus in vitro. În schimb, în aceleaşi condiţii, în culturile derivate din
speciile genului Atropa este detectată atropina.
În continuare, în cadrul speciei respective, se selecţionează plante foarte
productive, exploatându-se variabilitatea genetică naturală.
2. Obţinerea unei colecţii de calusuri.
Se iniţiază culturi de calus. Scopul: extinderea variabilităţii genetice prin
efectul mutagen al culturii per se. Sunt luaţi în consideraţie toţi factorii implicaţi în
controlul fenomenului:
– tipul de explant (se folosesc explante foarte variate, provenite din frunze,
tulpini, rădăcini, inflorescenţe etc.);
– tipul mediului de cultură (se folosesc diferite doze de săruri minerale şi
surse de energie, diverşi hormoni);
– condiţiile de cultură (se aplică diferite temperaturi, fotoperioade etc).
Colecţia de calusuri este menţinută prin subcultivări, repetate la intervale
regulate de timp. În cursul acestor repicări, sunt selecţionate variaţiile de interes
(culoare, aspect, consistenţă, viteză de creştere etc.). Liniile celulare identificate
sunt izolate şi multiplicate în condiţii de cultură bine stabilite.
3. Selecţia liniilor celulare înalt productive.
La această etapă sunt necesare o serie de tehnici foarte eficace de extracţie şi
de dozare a metabolitului. Tehnicile utilizate în cazul plantelor întregi nu sunt
întotdeauna aplicabile culturilor in vitro. În absenţa unor organe specializate
pentru acumulare, pot fi selecţionate tipurile celulare care “rezolvă” această
problemă. De exemplu, celulele de busuioc şi de mac acumulează terpenoizi sub
formă de glucozide şi, respectiv, alcaloizi conjugaţi cu molecule cu greutate mare.
Tot în absenţa organelor specializate, este posibil ca metabolitul secundar să fie
eliberat în mediu (prin liza celulelor, difuzie sau excreţie).
Metaboliţii coloraţi (şikonine, antociani) sau cei care sunt fluorescenţi în
ultraviolet (serpentina, acidul rozmarinic), se selecţionează cel mai uşor (vizual).
Pentru toţi ceilalţi se poate utiliza întreaga gamă de metode biochimice cunoscute:
colorimetrice, cromatografice, imunologice (ELISA = enzyme- linked
immunosorbent assay; RIA = radio-immunoassay). Metodele de detectare trebuie
să fie rapide, sensibile, fiabile, reproductibile şi aplicabile atât celulelor, cât şi
mediului.
4. Obţinerea unei suspensii celulare stabile şi înalt productive.
Pentru utilizarea tehnologiilor industriale aplicate în mod obişnuit la
microorganisme, este necesară trecerea culturilor în mediul lichid. Trecerea se face
treptat, începându-se cu vase de 250 ml. Noile condiţii de cultură pot determina
însă modificări ale capacităţii de biosinteză, impunând o nouă selecţie pentru
izolarea unor cloni cu randament stabil.
31
 Odată obţinută, o linie stabilă în mediul lichid, se poate trece la optimizarea
producţiei. Altfel spus, la stabilirea factorilor chimici şi fizici care determină cele
mai înalte niveluri ale producţiei compusului vizat. Se studiază efectele
modificării:
– surselor de elemente minerale (azot, fosfor) şi/sau de energie din mediu;
– valorii pH şi
– condiţiilor de mediu (temperatura, calitatea luminii, oxigenul), asupra
producţiei metabolitului secundar.
Dacă sinteza se realizează la nivelul cloroplastelor (de exemplu, producerea
alcaloizilor in vitro, la lupin), trebuie stabilit un protocol de cultură fotoautotrofă la
lumină, în absenţa zaharozei şi în atmosferă bogată în C0 2.
Trebuie determinat, de asemenea, momentul sintezei metabolitului: la sfârşitul
culturii, în faza staţionară sau în faza de încetinire a creşterii. Frecvent, se stabilesc
condiţiile optime de creştere a culturilor şi de sinteză a metaboliţilor, care pot să
nu coincidă. De exemplu, producerea comercială a şikoninelor (compuşi coloraţi,
antimicrobieni, evaluaţi la aproximativ 4000 USD/kg) se realizează în două etape
(Japonia, 1985):
– o etapă, cu durata de 9 zile, în care se produce biomasa;
– o etapă de producţie a metaboliţilor, cu durata de 5 zile, ce se desfăşoară
într-un mediu îmbogăţit în azot şi calciu (creşterea conţinutului de calciu de
30 de ori determină creşterea producţiei de metaboliţi de 3 ori), dar lipsit de
vitamine şi citokinine.
Optimizarea producţiei se mai poate realiza şi prin:
– adiţionarea în mediul de cultură a unui precursor al metabolitului;
– aplicarea unor stresuri de natură biotică (provocate de filtrate ale culturilor
unor patogeni etc.) sau abiotică (generate de metale grele).
Suspensiile celulare stabile şi foarte productive trebuie conservate la
temperaturi scăzute, eventual în azot lichid.
5. Producţia la scară industrială.
Se realizează pasaje succesive, în volume din ce în ce mai mari, pentru a se
ajunge la condiţiile industriale (75 m 3). La această etapă, trebuie să se ţină cont de
o serie de caracteristici ale celulelor vegetale:
– au timpul de dublare de 16-24 h., deci cu mult mai lung decât timpul de
dublare al microorganismelor, care este de numai l h- şi, din această cauză,
cantitatea de biomasă produsă va fi relativ mică;
– formează agregate in vitro, fapt ce impune agitarea puternică a culturilor (se
recomandă utilizarea fermentatoarelor Airlift, cu bule de aer care
antrenează celulele, fragmentând agregatele);
– au o rată a diviziunii (mică) şi o durată a unei “şarje” (relativ mare, de
câteva zile sau săptămâni), care sporesc pericolul apariţiei şi răspândirii
infecţiilor bacteriene, făcând din asepsie o condiţie sine qua non a reuşitei;
– comparativ cu microorganismele, au nevoie de mai puţin oxigen.
32
 6. Extracţia şi purificarea.
Se efectuează prin metode clasice, chimice şi biochimice. Există două situaţii:
– metabolitul secundar este secretat în mediul de cultură, de unde poate fi
extras;
– metabolitul secundar este acumulat în celule, urmând să fie extras din
biomasa recoltată.
În acelaşi timp, după cum menţionează cercetătorii din România (Badea,
Săndulescu, 2001), deşi au fost realizate progrese considerabile în producţia
industrială a metaboliţilor secundari în culturi in vitro, foarte puţini dintre aceşti
compuşi sunt prezenţi pe piaţă (tab. 1.1.).
Tabelul 1.1.
Produse obţinute prin culturi in vitro şi comercializate
(după Chrispeels şi Sadava, 1994)

Produsul Specia Compania Ţara

Lithospermum
Jîikonină erythrorhizon Mitsui Japonia
Berberină Coptis japonica Mitsui Japonia
Biomasă Panax ginseng Nitto Denki Japonia
Peroxidază Raphanus Toyobo Japonia
Geraniol Geranium spp. Kanebo Japonia
Acid rozmarinic Coleus blumei Natterman Germania
Digoxină Digitalis lannata Boeringer Germania

S-a estimat că cercetarea şi dezvoltarea pentru producerea comercială a unui

nou compus necesită 10 ani de investiţii. Costurile pot fi recuperate numai dacă:
produsul are o piaţă anuală de 50 de milioane USD; preţul – cel puţin 400-500
USD/kg. Practicarea culturilor de celule vegetale in vitro se justifică pentru crearea
produselor noi, în special a medicamentelor, sau dacă specificarea de “natural”
permite cucerirea unei părţi a pieţei ocupate de produse de sinteză din categoriile
arome, aditivi alimentari etc.

1.3. Tehnologiile celulare pentru însănătoşirea

şi clonarea plantelor
1.3.1. Obţinerea de plante libere de viroze prin cultura
meristemelor apicale.
Majoritatea plantelor cultivate, mai ales acelea, care se înmulţesc vegetativ, tot
timpul sunt supuse infecţiilor, provocate de viruşi şi de microorganisme patogene.
33
Bolile plantelor aduc la micşorarea productivităţii şi la scăderea calităţii lor. S-a
stabilit, că la plantele libere de patogeni, productivitatea poate fi mărită cu 30%.
Una din metodele de însănătoşire a plantelor, aplicată pe larg la multe culturi,
constă în multiplicarea clonală cu folosirea culturii meristemei apicale.
În 1949 Limasset şi Cornuet au constatat că, în multe cazuri, ţesuturile
meristematice ale plantelor nu conţin viruşi. S-a arătat, că în plantele infectate
conţinutul de viruşi se micşorează în direcţia spre vârf, iar meristema, ca atare,
poate fi în întregime liberă de infecţia virală. Aceasta se explică, pe de o parte, prin
faptul că viruşii în plante se răspândesc prin sistema vasculară, care în meristeme
nu este dezvoltată, iar pe de altă parte, prin faptul că replicarea viruşilor este
deprimată de substanţe endogene, active metabolic, de natură auxină, care se
sintetizează în zonele celulelor ce se divizează.
Morel şi Martin, în 1952, au propus să se efectueze însănătoşirea plantelor,
crescându-le din meristeme cultivate in vitro. În acest scop, au fost tăiate câte 100
mkm din vârfurile meristemelor de dalii şi cultivate pe mediile nutritive. Au fost
crescute mlădiţe libere de viruşi, care singure nu se înrădăcinau, de aceea au fost
altoite pe plante înrădăcinate sănătoase. În continuare, metoda de cultură a
meristemelor apicale a căpătat o dezvoltare largă în scopul de a crea plante libere
nu numai de viruşi, dar şi de bacterii şi de ciuperci.
Meristema apicală – este conul de celule activ divizibile cu o lungime de 0.1
mm şi lăţime de 0.25 mm. Practic, este greu de excizat explantele cu o astfel de
dimensiune fără vătămări. Altă dificultate constă în inducţia slabă a micilor
explanţi la regeneraţia plantelor. De aceea, pentru cultivare, uneori se folosesc
explantele de mărime de 1 mm, cu câteva primordii foliare, care servesc ca surse
de sinteză a fitohormonilor, ce induc dezvoltarea plantelor.
În fiecare caz concret, mărimea explantului trebuie să fie optimă pentru ca
planta să poată regenera, dar, în acelaşi timp, să nu conţină viruşi. De aceea,
meristema apicală in vitro, de obicei, se îmbină cu termo- şi (sau) chemoterapia.
După termoterapia plantelor se poate de dezmembrat explante relativ mai
mărişoare, deoarece viruşii în meristeme sunt inactivaţi. În multe cazuri,
termoterapia ameliorează dezvoltarea plantelor, care regenerează din meristeme.
Pentru anumiţi viruşi s-a stabilit, că inactivarea lor se asigură numai prin
îmbinarea metodei de cultură in vitro şi a termoterapiei. De exemplu, la zmeura de
grădină, virusul care provoacă xantoza poate fi înlăturat numai dacă se folosesc
ambele metode. La cartof, în consecinţa infectării plantelor de către viruşi, se
manifestă mozaica obişnuită, încreţită, dungată, încreţirea frunzelor şi a.m.d. La
plantele atacate de viruşi, scade brusc productivitatea, se înrăutăţesc calităţile
gustative.

34
 Doi din cei şapte viruşi, care atacă cartoful, S şi X, pot fi înlăturaţi numai prin
aplicarea complexă a metodei in vitro şi a termoterapiei. Virusul S se elimină din
plantă cu mult mai greu decât virusul X.
Metodele de obţinere a plantelor libere de viruşi sunt elaborate şi se aplică la
mai multe culturi (leguminoase, cartofi, asparagus, conopidă, hrean, usturoi şi al.),
la flori (gladiole, dahlia, garoafe, crizanteme, narcişi, iris şi al.), la plante
hortipomicole (măr, zmeură, agriş, fragi şi al.).
Este necesar de subliniat, că plantele deseori sunt infectate nu numai de un
singur virus, dar şi de un complex de viruşi. De aceea, în practică, a vorbi despre
însănătoşirea plantelor de un anumit virus se poate numai după testarea
materialului. În acest scop, se folosesc următoarele analize: serologice, electro-
microscopice. În ultimile decenii, cea mai răspândită este metoda ELISA-tehnique.
Această metodă permite diagnosticarea în decursul unei zile de muncă a cca
100 de mostre, în următoarea succesiune:
– sensibilizarea plăcilor cu alveole;
– extragerea sucului din obiectul diagnosticat;
– legarea virusului;
– determinarea culorii în scopul identificării mostrelor infectate.
Apariţia culorii galbene în amestecul reagentului la etapa finală de testare
indică infectarea plantelor cu virusuri.
Principiul de bază al inactivaţiei viruşilor prin încălzirea plantelor se bazează
pe alegerea condiţiilor în aşa fel, ca virusul să fie inactivat, iar ţesuturile plantei-
gazdă să nu fie atacate. Prelucrarea plantelor se face cu apă fierbinte (dacă mugurii
sunt încă dorminzi) sau cu aer fierbinte (dacă mugurii sunt în creştere activă).
Temperatura de prelucrare, prin ridicarea ei treptată, în primele zile este de 35 o-
40oC; durata de prelucrare – de la câteva minute până la câteva săptămâni, la o
umiditate relativă de 85-95%. De exemplu, pentru a extrage virusul din garoafe
este nevoie de o termoreglare la temperatura de 38 oC, în decurs de două luni.
Altă tehnologie folosită pentru eliberarea plantelor de viruşi reprezintă
chemoterapia. În calitate de preparate chimice pentru inactivarea viruşilor la plante
se întrebuinţează substanţele, care inhibă replicarea viruşilor, de exemplu,
ribonuclează, actinomicin D, ciclohexamid şi al. Astfel, una din metodele de
chemoterapie constă în adăugarea în mediul nutritiv, pe care se cultivă
meristemele apicale, a analogului guanozinului – 1β-Dribofuranozil-1,2,4-triazol-
3-karboximid (denumirea comercială – virozol) în concentraţie 20-50 mg/l. Acesta
este un preparat cu spectrul de acţiune larg. La folosirea virozolului în mediul
cultural, procentul plantelor meristematice fără viruşi pentru un şir de viruşi
caracteristici speciei respective se măreşte până la 80-100%, fiind 0-41% în
control. Rezultate pozitive ale chemoterapiei au fost obţinute la prun, cireş,
zmeură, la unele plante decorative şi al.

35
 Luând în consideraţie faptul, că mulţi viruşi sunt termostabili, pentru
însănătoşirea plantelor de multe ori se foloseşte cultura meristemelor izolate atât
fără termoterapie, cât şi prin îmbinare cu prelucrarea termică sau chimică. În
ultimul caz se efectuează prelucrarea specială a plantelor până la explantarea
meristemelor sau a meristemelor în timpul cultivării.
În multe cazuri, libere de viruşi sunt plantele-regenerante din cultura de calus.
Se presupune, că în astfel de condiţii eliminarea viruşilor se efectuează în urma
acţiunii de deprimare asupra replicării viruşilor de către fitohormonii mediului
nutritiv; în afară de aceasta, replicarea viruşilor nu corespunde tempurilor de
proliferare celulară; unele celule capătă rezistenţă la infecţia de viruşi prin
mutageneză.
După înmulţirea materialului eliberat de viruşi, în scopuri comerciale se
folosesc numai plantele care au trecut testuri speciale la absenţa viruşilor în decurs
de 18 luni (perioadă, în decursul căreia virusul poate reveni la activitate). În
calitate de test se folosesc simptomele vizibile, caracteristice pentru acţiunea unor
anumiţi viruşi. Paralel, se efectuează şi înlocuirea plantelor test-control (planta-
indicatoare). Se folosesc, de asemenea, analizele serologice, electrono-
microscopice, tehnologia ELISA-tehnique.
Plantele libere de viruşi peste un timp oarecare din nou sunt expuse la
infectare, de aceea, în procesul de implementare pe scara largă a soiurilor de plante
libere de viruşi, este necesară izolarea lor şi includerea totală de soiuri cu
materialul lipsit de viruşi.
Plantele libere de virusuri, obţinute prin cultura meristemelor apicale (fig. 1.5.
Anexa), mai departe sunt înmulţite în condiţii in vitro cu ajutorul metodei de
microînmulţire clonală (micropropagarea in vitro).

1.3.2. Avantajele micropropagării in vitro.

Pentru multe specii de plante seminciere sunt caracteristice 2 metode de
înmulţire: prin seminţe şi vegetativă. Ambele metode au atât avantaje, cât şi unele
neajunsuri. La neajunsurile metodei de înmulţire prin seminţe se referă, în primul
rând, diversitatea genetică a materialului săditor obţinut şi prelungirea perioadei
juvenile. La înmulţirea vegetativă se păstrează genotipul plantei materne şi se
reduce durata perioadei juvenile. Însă, pentru majoritatea speciilor (în primul rând
pentru culturile forestiere), problema înmulţirii vegetative nu este rezolvată până la
urmă. Aceasta situaţie este determinată de următoarele cauze:
– nu toate speciile, chiar şi în perioada juvenilă, pot să se înmulţească prin
metoda vegetativă cu eficacitatea dorită;
– practic, este imposibil de înmulţit cu ajutorul butăşirii multe specii forestiere
în vârsta de 10-15 ani şi mai mult;
– nu întotdeauna este posibil de obţinut material săditor standard;

36
 – volumul mare de muncă şi complicitatea operaţiilor la înmulţirea plantelor
mature cu ajutorul altoirii;
– eficacitatea mică a tehnologiilor elaborate pentru obţinerea cantităţilor
necesare de material genetic omogen în timpul anului.
Majoritatea pomilor fructiferi, a plantelor decorative şi al. sunt heterozigote,
de aceea prin înmulţirea lor cu seminţe genotipul plantei iniţiale se pierde. Genetic,
plante identice pot fi obţinute doar prin înmulţirea clonală.
Clonul – este toată generaţia unui individ, obţinut în rezultatul înmulţirii
asexuate.
În natură, înmulţirea clonală se înfăptuieşte prin procesul de apomixis
(dezvoltarea seminţelor fără fecundare) sau prin înmulţirea vegetativă (prin stoloni,
tuberculi, bulbi, lăstari modificaţi etc).
Înmulţirea vegetativă se foloseşte:
– pentru plantele care produc puţină sămânţă sau sunt aperene (de exemplu,
bananul, viţa de vie şi al.);
– pentru plantele care au o lungă perioadă juvenilă (perioada de până la
înflorire).
Cu mult mai efectivă şi economic mai rentabilă este multiplicarea clonală pe
baza metodei de cultură in vitro (micropropagarea in vitro).
Realizările în sfera culturii celulelor şi ţesuturilor au adus la elaborarea noilor
metode principale de înmulţire vegetativă – microînmulţirea clonală (obţinerea în
condiţii in vitro pe cale asexuată a plantelor genetic identice cu materialul iniţial).
La baza metodei se află posibilitatea unicală a celulei vegetale de a realiza
totipotenţa caracteristică pentru ea, adică de a iniţia sub influenţa efectelor
exogene dezvoltarea unui organism vegetal întreg.
Prin termenii micropropagare in vitro sau micromultiplicare clonală este
numită înmulţirea asexuată în masă a plantelor în cultura ţesuturilor şi celulelor, în
procesul cărora formele de plante apărute genetic sunt identice cu exemplarul
iniţial.
E necesar de enumerat următoarele avantaje, pe care le asigură metodele de
cultură a ţesuturilor şi a organelor izolate prin multiplicarea clonală:
– obţinerea materialului săditor genetic omogen;
– eliberarea plantelor de viruşi pe baza folosirii culturii meristemelor;
– coeficientul înalt de înmulţire (10 5-106 pentru plantele ierboase şi plantele
pomicole, 104 – pentru conifere);
– reducerea duratei perioadei de selecţie;
– accelerarea trecerii plantelor de la faza juvelină la cea productivă de
dezvoltare;
– înmulţirea plantelor care se reproduc cu greu prin metodele tradiţionale;
– posibilitatea efectuării lucrărilor anul întreg şi a economisirii suprafeţelor de
teren, necesare pentru creşterea materialului săditor;
37
 – posibilitatea mecanizării procesului de cultivare;
– înmulţirea rapidă a genotipurilor unicale (hibrizi, mutaţii şi a.m.d.);
– înmulţirea mlădiţelor, fără a le scoate din faza juvenilă;
– posibilitatea de a crea banca formelor valoroase de plante, în decursul
păstrării îndelungate a plantelor de eprubetă, la temperaturi scăzute.
Calculul economic al rentabilităţii înmulţirii clonale a plantelor decorative
de herbera, comparativ cu înmulţirea obişnuită prin butaşi, a arătat, că preţul de
cost la o mie de bucăţi – producţie se micşorează prin microînmulţire clonală de
2.5 ori, realizarea lor se majorează de 3 ori, iar rentabilitatea producţiei se măreşte
de 15-20 de ori.
1.3.3. Etapele şi metodele micropropagării plantelor.
Procesul micropropagării poate fi împărţit în 4 etape (fig.1.6):
1 – alegerea plantei-donor, izolarea explantelor şi obţinerea culturii sterile
bine crescute;
2 – micropropagarea propriu-zisă, când se atinge obţinerea cantităţii maximale
de microclone;
3 – înrădăcinarea lăstarilor înmulţiţi cu adaptarea lor ulterioară la condiţiile de
câmp, iar în caz de necesitate – deponarea plantelor regenerante la temperaturi
mici (+2° +10° C);
4 – creşterea plantelor în condiţii de seră şi pregătirea lor de realizare sau
sădire în câmp, iar în caz de necesitate – deponarea plantelor la temperaturi mici
(+2°+10°C).
1 2 3 4 5 6 7 8

Mugure floral

Meristem

R=d=cin=

Fig. 1.6. Etapele tehnologiei de micropropagare

(după E. Badea şi D. Săndulescu, 2001).
1 – stoc de plante, care vor fi clonate; 2-4 – iniţierea unei culturi aseptice şi
alegerea mediului; 5-6 – multiplicarea şi alungirea lăstarilor; 7 – înrădăcinarea
lăstarilor; 8 – aclimatizarea plantelor în sol.

38
 Există mai multe metode de micropropagare. Diferiţi autori, efectuând
cercetări individuale cu privire la influenţa condiţiilor cultivării explantelor asupra
proceselor morfogenezei, au urmărit diferite reacţii morfogenetice de răspuns la
schimbarea condiţiilor de cultivare, ceea ce, la rândul lor, a dus la noi clasificări a
metodelor micropropagării. Reieşind din metodele propuse în literatură de
specialitate, acest proces poate fi realizat pe următoarele căi:
– activarea dezvoltării meristemelor deja existente în plante (apexul tulpinii,
mugurii adventivi ai tulpinii);
– inducerea apariţiei mugurilor adventivi prin intermediul ţesuturilor
explantelor;
– inducerea embriogenezei somatice;
– diferenţierea mugurilor adventivi în ţesutul de calus primar şi transplantat.
Metoda de bază, folosită la micropropagarea plantelor, este activarea
dezvoltării meristemelor deja existente în plante, bazată pe înlăturarea dominării
apicale. Aceasta poate fi atinsă pe două căi:
a) prin înlăturarea meristemei apicale a tulpinii şi cu microbutăşirea lăstarului
in vitro pe mediul fără hormoni;
b) prin adăugarea în mediul nutritiv a substanţelor de tipul citochininelor, care
induc dezvoltarea unui număr mare de lăstari laterali.
De regulă, în calitate de citochinine se foloseşte 6-benzilaminopurina (BAP)
sau 6-furfurilaminopurina (chinetin), la fel şi 2-izopenteniladenin (2ip) şi zeatina.
Lăstarii obţinuţi, în aşa fel, se înlătură de la explantul matern primar şi din nou se
cultivă independent pe mediul nutritiv proaspăt pregătit, care stimulează
proliferarea meristemelor axilare şi apariţia lăstarilor de ordin mai înalt.
În prezent, această metodă se foloseşte pe larg la producerea materialului
săditor devirozat a culturilor agricole, atât tehnice (sfeclă de zahăr, tutun,
topinambur, stahis), cât şi legumicole (tomate, cartof, castravete, ardei, bostan), de
asemenea şi pentru înmulţirea culturilor decorative (garoafe, crizanteme, trandafir,
herbera), plantelor tropicale şi subtropicale (rododendron, azalia, camelia, ceai),
culturilor pomicole şi culturilor bacifere (măr, prun, vişin, păr, viţa de vie, zmeur,
coacăz, agriş), plantelor forestiere (plop, salcie, arin, mesteacăn, scorus, tuia,
ienupăr). La unele culturi agricole, precum cartoful, tehnologia micropropagării
este pusă pe bază industrială.
Folosirea metodei activării dezvoltării meristemelor existente în plante
permite obţinerea dintr-o meristemă de cartof a mai mult de 10 5 plante pe an. În
plus, tehnologia prevede obţinerea în eprubete a microtuberculelor deci, a
materialului semincier valoros devirozat.
A doua metodă este inducerea apariţiei mugurilor adventivi prin intermediul
ţesuturilor explantelor. Ea se bazează pe capacitatea părţilor izolate ale plantelor

39
de a regenera în condiţii favorabile ale mediului nutritiv, organele insuficiente,
regenerând pe această cale plante întregi. Formarea mugurilor adventivi poate fi
efectuată aproape de orice organ şi ţesut al plantei (embrion izolat, frunză, tulpină,
cotiledon), în cazul dacă ele sunt libere de infecţii. Procesul în cauză, de regulă, se
realizează pe mediile nutritive care conţin citochinină liberă sau în combinaţie cu
auxină, în raport de 10:1 sau 100:1. În calitate de auxină, în acest caz, mai frecvent
se foloseşte acidul indolic acetic (AIA) sau alfa – acidul naftil acetic (α-ANA).
Metoda dată cunoaşte o aplicare mai largă în micropropagarea plantelor
superioare, prin ea au fost înmulţite plante decorative. Narcise, crini, gladiole,
lalele – din învelişul bulbilor, din segmentele părţii bazale ale bulbei, din
explantele frunzelor. Speciile genului Brasica (conopida, varza de bruxel, brocoli)
– din segmentele hipocotilului, cotiledoane, frunze. Ceapa, usturoiul
– din meristema superioară, ţesuturile părţii de jos ale bulbei. Tomate – din
meristemele apicale sau laterale. Petunia – din segmentele rădăcinilor. Gloxinia,
toporaşii – din segmentele discurilor foliare. Unele specii ale plantelor forestiere –
din embrionii izolaţi maturi sau imaturi.
Este studiată şi folosită pe larg tehnologia micropropagării clonale a
căpşunilor, bazată pe cultivarea meristemelor apicale. Vârfurile meristematice se
izolează din plante tinere libere de viruşi şi se cresc pe medii nutritive modificate
M-S, care conţin BAP în concentraţie de 0,1-0,5 mg/l. După 3-4 săptămâni de
cultivare, meristema se dezvoltă în plăntuţe, la baza cărora se formează muguri
adventivi, care cresc repede şi dau naştere la muguri noi. Timp de 6-8 săptămâni se
formează un conglomerat de muguri aflaţi la diferite stadii de dezvoltare şi legaţi
între ei cu un ţesut conjungtiv. Apar frunze pe butaşi scurţi în partea inferioară a
cărora se formează muguri adventivi noi. Aceşti muguri se despart şi se
transplantează pe mediul nutritiv proaspăt. Pe mediul cu citochinină continuă
proliferarea lăstarilor suplimentari, iar pe mediile fără reglatori de creştere, timp de
4-6 săptămâni, se formează plante normale, cu rădăcini şi frunze. Activitatea
morfogenetică a explantului se păstrează timp de 3-4 ani. În aşa fel, de la o plantă
maternă se pot obţine câteva milioane de plante-regenerante pe an.
Un mare interes pentru cercetători prezintă problema legată de provenienţa
mugurilor adventivi şi, în special, a straturilor celulare care participă la
proliferarea meristemelor. O părere unică în această problemă, deocamdată, nu
există. Experienţele efectuate asupra ţesuturilor de tutun au demonstrat, că anume
epiderma este ţesutul capabil să formeze, în cel mai activ mod, muguri, calus sau
rădăcini, în dependenţă de bilanţul hormonal al mediului nutritiv. Cercetările
citologice efectuate pe segmentele părţii bazale ale bulbilor de lalele şi narcis, au
demonstrat, că lăstarii adventivi se formează din straturile superioare ale celulelor
meristematice, în timp ce, la plantele de gloxinia, procesul de formare a mugurilor
adventivi, de regulă, se produce în straturile celulare subepidermale ale discurilor
foliare. O părere unică, în această problemă, de asemenea, nu există nici în sfera
cercetătorilor preocupaţi de studiul plantelor forestiere. Astfel, s-a demonstrat,
40
că formarea mugurilor pe acele izolate de conifere la bradul comun se produce în
stratul epidermal al explantului cultivat, în timp ce, la culturile cotiledoanelor de
pin, pe mediile ce conţin doar citochinină (BAP), procesul dat se desfăşoară,
concomitent, atât în stratul epidermal, cât şi în cel subepidermal. La pinul comun,
la fel, s-a constatat formarea mugurilor adventivi în straturile epidermale şi
subepidermale ale cotiledoanelor embrionilor, procesul în cauză, la specia dată,
fiind independent de citochininele folosite.
A treia metodă se bazează pe diferenţierea din celulele somatice a structurilor
embrionare care, după exteriorul lor, amintesc de embrionii zigotici. Această metodă a
obţinut denumirea de embriogeneză somatică. Deosebirea principală a formării
embrionilor in vitro de cea in vivo, constă în faptul, că embrionii somatici se dezvoltă
asexual în afara sacului embrionar şi, după exteriorul lor, amintesc de structurile
bipolare, la care se urmăreşte dezvoltarea concomitentă a meristemelor apicale ale
tulpinii şi rădăcinii. Se ştie, că embrionii somatici parcurg 3 perioade de dezvoltare:
globulară, cardioformă şi faza de torpedă, cu tendinţa finală de dezvoltare în plantule.
Această situaţie pentru prima dată a fost sesizată la cultura celulelor de morcov încă la
mijlocul anilor 50. În prezent, metodele în cauză se utilizează pentru înmulţirea
majorităţii plantelor din fam. Orchidaceae şi Rutaceae, a unor specii de cereale (grâu,
orz), lucernă, ridiche, viţa de vie, unele specii ale genurilor forestiere (plopul
tremurător, eucaliptul, stejarul, bradul comun etc).
Formarea embrioizilor în cultura ţesuturilor se desfăşoară în 2 etape.
La prima etapă, celulele explantului se diferenţiază pe baza adăugării în
mediul nutritiv a auxinelor, de regulă, a acidului 2,4-diclorofenoxiacetic (2,4-D),
cu transformarea lor în celule embrionare. În următoarea fază este necesar de
impus celulele formate să se dezvolte în embrioizi, ceea ce se obţine prin
micşorarea concentraţiei de auxine sau prin excluderea ei definitivă din
componenţa mediului nutritiv.
Embriogeneza somatică poate fi urmărită nemijlocit în ţesuturile explantului
primar, dar şi în cultura de calus, în mediul nutritiv lichid (suspensie), reprezintând
o acţiune mai anevoioasă, deoarece nu întotdeauna este posibil de realizat
totipotenţa caracteristică celulelor. Totodată, această metodă de înmulţire îşi are
avantajele sale, legate de reducerea etapei a III-a de înmulţire clonală, care nu
necesită alegerea condiţiilor speciale de înrădăcinare şi adaptare a plantelor de
eprubetă, deoarece embrionii somatici prezintă plantule complet formate. Prin
folosirea tehnicii corespunzătoare de capsulare, din embrioizi pot fi obţinute
seminţe artificiale.
A patra metodă constă în diferenţierea mugurilor adventivi în ţesut de calus
primar sau transplantat. Este folosită mai rar în scopurile obţinerii materialului
săditor in vitro, deşi are părţile ei pozitive, precum şi anumite avantaje:
– este efectivă şi economă, deoarece în procesul înmulţirii din fiecare celulă
de calus individuală, în condiţii favorabile de cultivare, pot să se formeze
muguri adventivi, care dau început unei plante noi;

41
 – într-un şir de cazuri, ea este unica metodă posibilă de înmulţire a plantelor în
cultura in vitro;
– plantele obţinute se deosebesc genetic şi morfofiziologic, ceea ce dă
posibilitate amelioratorilor să efectueze selectarea plantelor după unele
caractere valoroase şi să aprecieze comportarea lor în câmp.
Este raţional de aplicat această metodă la acele specii de plante, la care se
observă stabilitatea genetică a ţesutului de calus, fără ca variabilitatea dintre
plantele-regenerante să depăşească nivelul schimbării naturale. Prin cultura de
calus au fost înmulţite: sfecla de zahăr, unele specii ale genului Brasica, porumbul,
orzul, grâul şi alte cerealiere, floarea soarelui. Au fost prelucrate condiţii care
determină regenerarea plantelor din calus la castravete, cartof, tomate etc.
Această metodă are şi unele părţi negative. În perioada de transfer a ţesutului
de calus pe mediul nutritiv, deseori se observă aparenţe nedorite la microînmulţire:
schimbarea ploidiei celulelor cultivate, aberaţii cromozomale, acumularea
mutaţiilor genice, pierderea potenţialului morfogenetic a celulelor cultivate.
Concomitent, se observă şi schimbări morfologice: piticitatea, nervaţia incorectă a
frunzelor şi aranjarea lor incorectă pe tulpină, formarea internodurilor scurte şi
îngroşate, rezistenţa scăzută la boli şi dăunători. În plus, deoarece cultivarea
îndelungată a celulelor de calus sporeşte aceste schimbări, perioada creşterii
neorganizate la micropropagare trebuie redusă la minimum.

1.3.4. Tehnica cultivării ţesuturilor vegetale la diferite etape ale

micropropagării clonale.
Pentru cultivarea ţesuturilor în fiecare din cele 4 etape menţionate mai jos,
este necesar de folosit mediul nutritiv corespunzător.
Etapa I. La această etapă este necesar de a obţine o cultură sterilă bine
crescândă. Ea se realizează pe calea sterilizării ţesuturilor vegetale cu soluţii ce
conţin sublimat corosiv sau diacid – 0,1-0,2%, timp de 5-10 min pentru ţesuturile
fine uşor deteriorabile şi 10-20 minute pentru ţesuturile cu înveliş mai dens. În
continuare, ţesuturile vegetale trebuie spălate în apă sterilă distilată, de regulă în 3
porţii, şi trecute apoi pe mediul nutritiv steril pregătit din timp. În cazurile, când
este greu de obţinut o cultură sterilă iniţială a explantului, se recomandă de
introdus în componenţa mediului antibiotice (tetraciclină, benzilpenicilină), în
concentraţie de 100-200 mg/l. Aceasta, în primul rând, se referă la plantele
forestiere, la care se observă tendinţa de acumulare a infecţiei inferioare.
La prima etapă, de regulă, se foloseşte mediul nutritiv care conţine săruri
minerale conforme reţetei M-S, de asemenea, diferite substanţe biologic active şi
stimulatori de creştere (auxine, citochinine) în diferite combinaţii, în dependenţă
de obiect. În cazurile, când se constată inhibarea creşterii explantului primar pe
baza secreţiei de către el a substanţelor toxice în mediul nutritiv (fenoli, terpene şi
al.), eliminarea lor este posibilă datorită folosirii antioxidanţilor. Acest proces
42
se realizează pe două căi: prin spălatul explantului cu soluţia lui slabă timp de 4-24
ore, sau prin adăugarea nemijlocită în mediul nutritiv a antioxidanţilor. În calitate
de antioxidanţi se folosesc: acidul ascorbic (1mg/l,), glutation (4-5 mg/l),
ditiotreitol (1-3 mg/l), dietilditiocarbomat (2-5 mg/l), polivinilpirolidon (5000-
10000 mg/l). În unele cazuri, este raţional de adăugat în mediul nutritiv
adsorbentul – cărbune activat în concentraţie 0,5-1%. Durata primei etape poate fi
de la 1 până la 2 luni. În rezultat, se constată creşterea ţesuturilor meristematice şi
formarea lăstarilor primari.
Etapa II – micropropagarea propriu-zisă. La această etapă este necesar de a
obţine cantitatea maximală de mericloni, avînd în vedere că o dată cu mărirea
subcultivarelor se măreşte numărul de plante-regenerante cu morfologia anormală
şi posibilitatea de a urmări formarea plantelor-mutante. Ca şi la prima etapă, se
foloseşte mediul nutritiv M-S, care conţine diferite substanţe biologic active, dar,
totodată, şi reglatori de creştere. Rolul principal în alegerea condiţiilor optime de
cultivare a explantelor revine raportului şi concentraţiei citochininelor şi auxinelor
întroduse în mediul nutritiv. Din citochinine, mai des, se foloseşte BAP în
concentraţie de la 1 până la 10 mg/l, iar din auxine – AIA şi ANA în concentraţii
de până la 0,5 mg/l. La cultivarea îndelungată a ţesuturilor vegetale pe mediul
nutritiv cu concentraţia ridicată de citochinine (5-10 mg/l), are loc acumularea lor
treptată în cantităţi mai mari decât nivelul lor fiziologic necesar, ceea ce duce la
acţiunea toxică şi formarea plantelor cu morfologia modificată. Concomitent, se
poate observa suprimarea capacităţii plantelor de a se înrădăcina. Acţiunea
negativă a citochininelor poate fi depăşită, fie pe calea folosirii mediului nutritiv
cu o concentraţie minimală a citochininelor care asigură un coeficient de
microînmulţire stabil, fie pe calea alternării ciclurilor de cultivare pe mediile
nutritive cu nivel scăzut şi înalt al fitohormonilor.
Etapele III şi IV – înrădăcinarea microlăstarilor, adaptarea lor ulterioară la
condiţiile naturale şi plantarea în câmp reprezintă etapele cele mai anevoioase, de
care depinde succesul micropropagării. În etapa a 3-a, de regulă, se schimbă
conţinutul de bază al mediului nutritiv: se micşorează de 2 ori, iar uneori de 4 ori
concentraţia sărurilor minerale conform reţetei M-S, sau se înlocuieşte cu mediul
White; se micşorează cantitatea de zahăr până la 0,5- 1%, cu eliminarea totală a
citochininelor, lăsând doar auxinele. În calitate de stimulator la înrădăcinare se
folosesc β-indolil- 3-acid oleic (AIO), AIA şi ANA. Înrădăcinarea microlăstarilor
se efectuează prin 2 metode:
– menţinerea microlăstarilor timp de 2-24 ore în soluţie de auxine concentrată
sterilă (20-50 mg/l) şi cultivarea lor ulterioară pe mediul agarizat fără
hormoni sau nemijlocit în substratul de sol respectiv;
– cultivarea nemijlocită a microlăstarilor timp de 3-4 săptămâni pe mediul
nutritiv care conţine auxine în concentraţii nu prea mari (1-5 mg/l), în
dependenţă de obiectul cercetat.
43
 În ultimul timp, este propusă metoda, deocamdată puţin folosită, de
înrădăcinare a plantelor de eprubă în condiţii de hidroponică. Metoda în cauză
permite de a simplifica, în măsură considerabilă, etapa înrădăcinării şi, totodată, de
a obţine plante adaptate la condiţii normale.

1.3.5. Folosirea practică a micropropagării plantelor.

Micropropagarea este o metodă nouă de înmulţire vegetativă a plantelor, care
permite obţinerea materialului săditor omogen cu un coeficient înalt de înmulţire,
reducerea duratei procesului de ameliorare, cu efectuarea lucrărilor în decursul
întregului an, precum şi reducerea terenurilor necesare pentru cultivarea plantelor.
În multe ţări, bioindustria micropropagării clonale este implementată pe bază
industrială la zeci de întreprinderi activ funcţionale. De exemplu, în Franţa, 94%
din toată producţia culturilor decorative este obţinută prin metoda ţesuturilor
izolate. În SUA, circa 100 de întreprinderi comerciale obţin materialul săditor
însănătoşit al plantelor decorative, legumicole, culturilor de câmp, pomicole şi
culturilor forestiere prin metoda micropropagării. Producătorul principal al
materialului săditor sănătos al plantelor decorative este Olanda (tab. 1.2.), iar al
portaltoilor de măr, prun şi piersic – Italia (≅250-500 mii/an).

Tabelul 1.2.
Plantele micropropagate în 1995 în Olanda (mii bucăţi)
(După Badea, Săndulescu, 2001)

Tipul plantei Numărul de plante produse

Nephrolepis 13.002
Gerbera 6.044
Lilium 5.130
Phalaenopsis 4.422
Spatiphyllum 3.185
Alstroemeria 1.969
Limonium 1.250
Saintpaulia 1.701
Plante de acvariu 1.204
Cymbidium 1.171
Aster 1.130
Ficus 1.039
Bromeliaceae 895

44
 Continuarea tabelului 1.2.
1 2
Anthunum andreanurn 810
So/anum tuberosum 430
Hosta 492
Zantedeschia 410
Anthurium scherzerianum 402
Hydrangia 400
Synchonium 381
Plante carnivore 333
Delphinium 305
Syringa vulgaris 180
Brassica o/eracea Bofr. 172
Philodendron 155
Actinidia chinensis 110
Sinningia 100
În fosta USSR, lucrările de micropropagare au fost lansate în anii 60, în
laboratoarele de cultură a ţesuturilor şi morfogeneză ale Institutului de Fiziologie a
Plantelor “Timireazev” al AŞ din Rusia, sub conducerea prof. R. Butenko. Au fost
studiate condiţiile de microclonare ale cartofului, sfeclei de zahăr, garoafei,
herberii, freziei şi altor plante, fiind elaborate tehnologii industriale. Primele
succese ale microclonării sunt legate de cultivarea meristemelor apicale a plantelor
ierboase pe mediile nutritive corespunzătoare, care asigură, în final, obţinerea
plantelor-regenerante.
În prezent, multe Institute de cercetări şi laboratoare industriale perfecţionează
şi utilizează metodele microînmulţirii şi însănătoşirii diferitor culturi decorative,
pomicole, drupacee, legumicole, furagere şi forestiere. De exemplu, metodele de
înmulţire rapidă a viţei de vie, elaborate la Institutul Viei şi Vinului “Magaraci”,
permit de a obţine dintr-un butaş cu un ochi – pînă la 8 mii de plante timp de 4
luni.
În Republica Moldova, în laboratorul de biochimie, fiziologie şi biotehnologie
al ICŞ pentru Porumb şi Sorg (A. Rotari, I. Anţibor şi O. Ojoga) a fost elaborată şi
pusă în producţie o tehnologie modificată de multiplicare clonală şi însănătoşire a
materialului săditor de cartof (fig.1.7). Prima etapă a tehnologiei respective constă
în diagnosticarea soiurilor şi formelor în colecţia de cartof la prezenţa-absenţa
viruşilor în frunze, în faza butonizării plantelor. Depistarea viruşilor Y şi L în
frunze este efectuată prin analiza-expres a imunofermenţilor – ELIZA-tehnique. În
urma testării, sunt selectaţi tuberculi de pe tufele neinfectate, care sunt folosiţi în
cultura in vitro prin cultivarea meristemelor apicale. Plantele regenerante obţinute,
45
de asemenea, sunt testate la prezenţa viruşilor Y şi L. Cele lipsite de viroze sunt
folosite în calitate de material iniţial pentru multiplicarea microclonală a
cartofului, în corespundere cu metoda generală acceptată. Pe baza tehnologiei
menţionate, în decurs de numai 3 luni, au fost obţinute circa 20 mii de plante de
eprubetă, care ulterior au fost sădite în seră, apoi în câmp, în scopul obţinerii
microtuberculilor de superelită. Au fost recoltate 200 kg de cartofi, aproximativ 30
mii de microtuberculi liberi de viroze.

Fig.1.7. Culturi de meristeme din mugurii tuberculilor de cartof (după C.

Milică, 1999).

Sfera întrebuinţării micropropagării este diversă şi are tendenţa de a se extinde

în continuare. Aceasta, în primul rând, se referă la înmulţirea in vitro a genurilor
forestiere mature, în special a coniferelor, cu aplicarea tehnicii in vitro pentru
păstrarea speciilor rare şi pe cale de dispariţie a plantelor medicinale.
Primele lucrări în domeniul culturii ţesuturilor la speciile forestiere au fost
publicate în anii 20 ai secolului trecut şi sunt legate de numele savantului francez
Gotre. În ele se remarcă posibilităţile de calusogeneză in vitro ale ţesuturilor
cambiale la unele specii de ulm şi pin. La mijlocul anilor 60, savantul Mates a
46
reuşit să obţină primele plante-regenerante de plop, care au fost crescute până la
sădirea lor în sol.
Cultivarea ţesuturilor speciilor conifere in vitro, timp îndelungat a servit ca
obiect de cercetare, faptul fiind condiţionat de greutăţile specifice ale cultivării
ţesuturilor juvenile şi, în special, a celor mature, izolate de la plante. În prezent,
sunt cunoscute mai mult de 200 de specii forestiere, reprezentând 40 de familii,
care au fost înmulţite prin metoda in vitro (castanul, mesteacănul, stejarul, arţarul,
plopul tremurător, hibrizi ai plopului tremurător x plop, pinul, bradul etc).

1.4. Tehnologii celulare auxiliare, care accelerează procesul

de selecţie a plantelor agricole

1.4.1. Conservarea, păstrarea şi multiplicarea in vitro a

genofondului vegetal.
Un domeniu de mare importanţă în aplicarea metodei de cultură in vitro a
ţesuturilor revine multiplicării plantelor-elită de valoare, în scopul de a obţine cloni
genetic identici, pentru folosirea lor în ameliorare şi fitotehnie. Metoda asigură:
– păstrarea şi multiplicarea genotipurilor separate ca forme iniţiale pentru
rezolvarea problemelor specifice de ameliorare şi pentru experienţe în domeniul
selecţiei;
– multiplicarea rapidă şi efectivă a noilor soiuri de valoare;
– păstrarea şi multiplicarea efectivă a liniilor pentru producerea de seminţe
hibride a leguminoaselor, plantelor decorative;
– multiplicarea avantajoasă, din punct de vedere economic, a genotipurilor
înalt productive a culturilor silvicole, plantelor decorative lemnoase sau a
portaltoilor culturilor pomicole;
– multiplicarea în condiţii sterile, în scopul obţinerii materialului de sădit fără
viruşi;
– păstrarea sortimentului plantelor, cu reproducerea vegetativă şi a speciilor
alogame.
O contribuţie importantă în practica agricolă este asigurată prin implementarea
tehnologiilor de conservare şi păstrare în cultura in vitro a genofondului folosit în
ameliorarea plantelor:
– fie în formă de conservare în eprubete pe termen mediu (presupune creşterea
intervalului dintre două repicări pentru colecţia de plante valoroase);
– fie în formă de colecţii meristematice, care se păstrează după o congelare
profundă în criobănci în azot lichid (-196oC).
Scopul formării colecţiilor şi a băncilor este următorul:
– pe de o parte, cercetătorii sunt asiguraţi în mod constant cu genotipul care
controlează caracterele dorite, necesare pentru ameliorare;
47
 – pe de altă parte, este garantată păstrarea nu numai a genofondului speciilor
ce se reproduc vegetativ, dar şi a speciilor de plante ce se reproduc numai pe cale
sexuată. Ultimele sunt de mare importanţă pentru menţinerea liniilor izogene,
liniilor cu androsterilitate masculă, genotipurilor unicale, însuşirile cărora pot fi
pierdute în procesul selectiei tradiţionale.
Creşterea lentă (subcultivarea periodică). Cea mai eficientă cale de creştere
lentă a colecţiilor constă în micşorarea temperaturii de cultivare. Adesea,
concomitent cu reducerea temperaturii de cultivare, se folosesc inhibitori
hormonali sau osmotici. Subcultivarea periodică este un procedeu anevoios, care
majorează, considerabil, costul tehnologiei. Perioada fără subcultivare poate fi
prelungită până la 6-24 luni, păstrând colecţia în condiţii de temperaturi joase
pozitive (+1 +10°C), la o intensitate a luminii de 400-500 lucşi. Alegerea
temperaturii se determină după gradul de rezistenţă a soiului la frig.
Creşterea plantelor poate fi reţinută prin adăugarea în substratul nutritiv a
osmoticilor – manitului şi sorbitului, majorarea concentraţiei de zaharoză sau
introducerea în mediul nutritiv a substanţelor ce blochează creşterea. În calitate de
astfel de substanţe, au fost folosite hidrolizatele acidului malenic, 2,2-metil-
hidrazidul acidului de chilimbar, a acidului abscizic.
Un avantaj deosebit al păstrării genotipurilor în formă de colecţii in vitro
constă în posibilitatea de a plasa pe fiecare metru pătrat al camerelor de cultivare –
mai mult de o mie de eprubete cu plante.
Crioconservarea. Crioconservarea genofondului materialului vegetal în azot
lichid – reprezintă o metodă mai evoluată în comparaţie cu cele descrise anterior.
Avantajele metodei de crioconservare constau în următoareele:
– garantează păstrarea stabilă şi îndelungată a proprietăţilor genetice a
obiectelor;
– permite păstrarea genofondului cu un spectru de obiecte destul de larg, de la
protoplaştii izolaţi până la embrionii şi seminţele plantelor;
– funcţionarea criobăncii, bine organizată, e mai puţin dificilă decât susţinerea
şi deponarea colecţiilor de creştere.
În general, metoda utilizată pentru crioconservarea suspensiilor celulare,
protoplaştilor şi calusurilor presupune parcurgerea următoarelor etape:
– pretratamentul (precultura şi impregnarea);
– congelarea;
– posttratamentul (dezgheţarea şi trecerea în cultură).
Tehnologiile de crioconservare permit să fie păstrate, fără schimbări,
mutaţiile, hibrizii, celulele diferitor specii de plante, capabilitatea de morfogeneză,
meristemele şi apexurile lăstarilor, embrionii zigotici şi somatici, polenul,
seminţele – chiar şi acelea, care nu pot suferi de hidratare.

48
 1.4.2. Obţinerea haploizilor in vitro şi folosirea lor în
ameliorarea plantelor.
Este cunoscut faptul, că reproducerea sexuată, folosită pe larg în analiza
genetică şi ameliorare, admite o durată de 10-15 ani de activitate, până ce un
genotip nou, mai valoros (soi sau hibrid F1), ajunge în producţie. Durata lucrărilor
poate fi redusă considerabil la o durată de numai 4-5 ani, prin utilizarea metodei de
cultură in vitro.
Procesul selecţiei genotipurilor superioare in vitro în mare măsură este
condiţionat de obţinerea plantelor haploide prin androgeneză (fig. 1.8). Androgeneza
poate fi indusă prin cultura in vitro a anterelor sau a polenului aflat într-un anumit
stadiu de dezvoltare. Microsporii prin androgeneză duc la formarea haploizilor, fie
direct, prin embriogeneză, fie indirect, prin formarea de calus, care ulterior, prin
diferenţiere sau organogeneză, pot genera plantule, apoi plante haploide.
Plantele haploide obţinute posedă un genotip hemizigot, ceea ce permite
manifestarea în fenotip a întregii informaţii genetice, genotipul fiind identic cu
fenotipul. Celulele haploide reprezintă un material excepţional de valoros pentru
inducerea in vitro a mutaţiilor autotrofe (biochimice şi nutriţionale). Deoarece la
formele haploide în fenotip se manifestă toate genele, în consecinţă, orice mutaţie
poate fi detectată imediat. Dacă aceasta este valoroasă, prin dublarea numărului de
cromozomi se realizează o plantă homozigotă, posesoare a mutaţiei respective.

plasarea
antere ]n cultur=
polen
ovare
ovule

prelevarea explantelor embrioni

trecerea
]n teren plantul=

dublarea cu
colchicin=

Fig. 1.8. Metoda obţinerii de haploizi prin androgeneză şi

ginogeneză (după C. Milică, 1999).

49
 Astfel, selecţia clonilor haploizi valoroşi, urmată de diploidizare şi
regenerarea plantelor întregi, asigură obţinerea liniilor izogenice. Constituţia
genetică a haploizilor dubli este, teoretic, absolut homozigotă.
Reiese că, prin utilizarea culturii celulelor in vitro, în timp de numai două
generaţii (în prima se obţin plantele haploide şi sămânţa în urma restaurării
meiozei prin dublarea numărului de cromozomi, iar în a doua generaţie se obţin
dublu haploizi absolut homozigoţi) se pot crea linii homozigote, a căror
descendenţă este uniformă şi identică genetic, net superioară liniilor obţinute prin
consangvinizare în timp de 6-8 generaţii.
Liniile dublu haploide, valoroase din punct de vedere agronomic, pot fi folosite
direct în producţie, în calitate de soiuri comerciale (la speciile autogame şi cele cu
reproducere vegetativă), sau pentru producerea seminţei hibride F1 comerciale
(îndeosebi la speciile alogame). Folosirea unor astfel de părinţi în hibridare determină
manifestarea într-o măsură mai mare a fenomenului heterozis, întrucât prin
consangvinizare nu se poate ajunge niciodată la o homozigotizare absolută.
Androgeneza a fost indusă, pentru prima dată prin cultura in vitro a anterelor
de la Datura inoxia, de către S. Guha şi S. C. Maheshwari (1964). Ulterior, metoda
a fost experimentată şi aplicată cu succes şi la alte genuri de plante: Nicotiana,
Petunia, Asparagua etc. (J. P. Bourgin şi J. P. Nitsch, 1967; K. Nakata şi
M.Tanakas, 1968: G. Pelletier ş.a., 1968 etc.). Utilizarea metodei androgenezei a
permis obţinerea de haploizi prin cultura anterelor şi polenului la peste 150 de
specii de plante, printre care: Aegilops caudata, Brassica oleracea, Capsicum
etnnum, Coffea arabica, Fragaria virginiana, Hordeum vulgare, Licopersicon
esculentum, Secale cereale, Solanum tuberosum, Triticum aestivum, Triticale,
Oriza sativa ş.a.
Obţinerea haploizilor in vitro prevede şi folosirea culturii embrionilor
haploizi.
Pentru a obţine hibrizi de orz cultural, o aplicare practică şi-a găsit aşa-zisa
“metoda bulbosum”. Prin încrucişarea formelor diploide de orz cultural, Hordeum
vulgare, cu forma diploidă a orzului sălbatic, Hordeum bulbosum, în procesul de
dezvoltare al embrionilor, iniţial hibrizi în procesul de diviziune a celulelor, se
produce pierderea de cromozomi a orzului sălbatic. În consecinţă, se formează
embrioni haploizi ai orzului cultural, care trebuie dezmembraţi şi cultivaţi la timp.
După colhicinarea germenilor haploizi se obţin linii homozigote. Această metodă
actualmente este aplicată pentru accelerarea procesului de ameliorare, la crearea
noilor soiuri de orz.

50
 1.4.3. Tehnologiile in vitro pentru învingerea incompatibilităţii
progame.
În procesul hibridării îndepărtate (între specii sau genuri), fecundarea în multe
cazuri nu se efectuează din cauza incompatibilităţii progame.
Incompatibilitatea progamă se poate manifestata ca o inaptitudine a polenului
de a germina pe stigmate, o inaptitudine a polenului germinat de a străbate
stigmatul străin, o inaptitudine a tuburilor de polen de a ajunge până la ovul, sau în
formă de rupturi a tuburilor de polen în stiluri, o inaptitudine a gametului mascul
de a-l fecunda pe cel femel, pentru a forma zigotul.
Această situaţie, naturalmente anevoiasă, poate fi evitată prin intermediul
fecundării ovulelor in vitro.
Fecundarea in vitro. Prin utilizarea culturii celulelor in vitro se poate învinge
incompatibilitatea sexuală şi sterilitatea ce se manifestă în cadrul hibridărilor
interspecifice şi intergenerice. În acest scop, se aplică metoda polenizării şi
fecundării in vitro (fecundarea în eprubetă).
Prin aplicarea tehnicii de polenizare şi fecundare in vitro, s-au obţinut o serie
de hibrizi interspecifici şi intergenerici, care au ajuns la maturitate; de exemplu –
Melandrium album × M.rubrum, Nicotiana tabacum × Hyoscyamus niger,
Hordeum Sativum × H.bulbosum, Licopersicon esculentum × L.peruvianum etc.
Rezultatele obţinute până în prezent, demonstrează posibilităţile pe care le oferă
această metodă, în scopul creării unor genotipuri hibride care, în mod obişnuit, nu
pot fi realizate prin hibridare sexuată.
Folosirea metodei de polenizare in vitro s-a dovedit a fi necesară şi eficace
pentru a învinge incompatibilitatea prin crearea hibrizilor interspecii de tutun
(ciclul de lucrări a profesorului Ternovski şi colab. de la Institutul de Cercetări în
domeniul Tutunului din or. Krasnodar). Hibrizii obţinuţi prezintă interes în
procesul de ameliorare pentru crearea materialului iniţial, cu rezistenţă complexă
faţă de mai mulţi patogeni.
Cultura ovulelor după polenizare. Prima comunicare despre cultura reuşită a
ovulelor dezmembrate pentru cultivare după polenizare, a fost efectuată de către
Magoschwari cu colab. (1958). Ei au separat ovulele macului de grădină după 6
zile din momentul polenizării. Ovulele conţineau zigot sau proembrio bicelular şi
câţiva nuclei ai endospermului. Seminţele se dezvoltau normal în condiţii in vitro,
în prezenţa placentei pe mediul ce conţinea săruri minerale (după Nitsch), vitamine
(după White), 5% zahăroză şi fără adaosul de substanţe de creştere. Până la stadiul
globular, embrionii se dezvoltau mai încet decât în condiţii in vivo, dar cum
ajungeau în faza globulară, creşterea lor se intensifica brusc. Prin adaosul în
mediul nutritiv a chinetinei sau a hidrolizatului de cazeină, se accelera şi stadiul
iniţial de dezvoltare a embrionului.
51
 O cultură reuşită de ovule la orhidee pe placentă, cu obţinerea embrionilor
viabili, a fost utilizată de B. Poddubnîi-Arnoldi, cu folosirea unei soluţii de 10 %
de zaharoză.
În 1978 a fost propus mediul nutritiv, pe care, prin cultura ovulelor polenizate
şi izolate, au fost obţinuţi noi hibrizi interspecifici de bumbac (Steward J. M., Hsu
G. I., 1978). În afară de acesta, cultura ovulelor de bumbac nefecundate şi
fecundate este folosită ca metodă pentru stimularea proceselor de formare a
fibrelor (Beasley, Ting, 1974; Butenko, Azizhodjaev, 1986).
Cultura ovarelor după fecundare. Cultura ovarelor in vitro, din punct de
vedere tehnic este mai uşor de înfăptuit, decât cultura ovulelor izolate. Această
metodă se foloseşte pentru studierea influenţei diferitelor ţesuturi a florii asupra
dezvoltării ovarului în fruct, pentru a învinge incompatibilitatea în procesul de
hibridare îndepărtată. Primele cercetări în această direcţie au fost efectuate de către
Nitsch în anii 1949-1951, prin cultivarea florilor de tomate pe punţi de hârtie de
filtru, plasate pe mediul nutritiv lichid. Florile polenizate pe planta maternă, peste
câteva zile se înlăturau şi, după sterilizare, se treceau în cultură. S-a constatat o
dezvoltare treptată şi o creştere mare a ovarelor cu formarea ulterioară a fructului.
Mai târziu, au fost efectuate experienţe bazate pe cultura ovarelor la diferite
specii de plante, care conţineau zigoţi sau proembrio bi- sau tricelular. S-a
constatat, că în dezvoltarea fructului şi a embrionului o importanţă deosebită
revine învelişului floral, care joacă un rol principal. De aceea, atunci când se face
polenizarea in vitro cu folosirea ovarelor izolate, este necesar de luat în
consideraţie prezenţa învelişului floral nevătămat.
Cultura ovarelor, ca metodă de a învinge incompatibilitatea, se aplică pe larg
în procesul de hibridare interspecifică la genul Brasica.

1.4.4. Tehnologiile celulare elaborate pe baza

endospermogenezei şi embriogenezei plantelor superioare.
Cultura endospermilor izolaţi. Endospermul s-a dovedit a fi un model
interesant pentru cultura in vitro, deoarece este reprezentat de un ţesut omogen
parenhimatoz, în care lipsesc elementele sistemei conducătoare. În afară de
aceasta, plantele-regenerante în cultura ţesuturilor de endosperm pot să aibă, ca şi
celelalte iniţiale, numărul triploid de cromozomi.
O cultură reuşită a ţesutului de calus de lungă durată a endospermului imatur
de porumb a fost obţinută în 1949 (la Universitatea din Michigan – SUA, de către
La Rue). Mai târziu, diferiţi cercetători au obţinut cultura endospermilor imaturi a
grâului comun (explantarea peste 9-10 zile după polenizare), a orzului (explantarea
după 8 zile), a orezului (explantarea după 4-7 zile de la polenizare).
Pentru multe plante a fost stabilită faza critică, în timpul căreia endospermul
îşi pierde capacitatea spre proliferare în procesul de cultivare in vitro. În această
52
fază, celulele endospermului, cu excepţia stratului aleuronic, devin neviabile,
îndeplinind numai funcţia de rezervare. Totuşi, la plantele unui şir de familii
(Euphorbiaceae, Santalaceae, Louantaceae), în anumite condiţii de cultivare se
desfăşoară şi proliferarea endospermului matur, cu formarea ţesutului de calus în
culturile ulterioare.
Pentru prima dată, organogeneza în cultura endospermului a fost descrisă de
cercetătorii indieni Johri B. M. şi Bhojwani S. S. (1965). S-a remarcat, că mugurii
de lăstari pot să se formeze atât în mod direct din celulele endospermului, cât şi în
rezultatul organogenezei indirecte din calusul format în prealabil. În cultura
endospermului plantele triploide au fost obţinute la citrus, măr, copacul de sandal
etc. În prezent, cultura endospermului este apreciată ca metodă alternativă pentru
obţinerea plantelor triploide.
Cultura embrionilor izolaţi. Izolarea şi cultivarea embrionilor se efectuează la
diferite etape de dezvoltare a lor, în dependenţă de scopurile experienţei.
Cultura embrionilor maturi nu prezintă greutăţi metodice în condiţiile
respectării cerinţelor aseptice şi a folosirii mediilor nutritive, destul de simple ca
componenţă, conţinând săruri neorganice şi surse de carbon.
Posibilitatea de a cultiva embrionii a fost demonstrată, pentru prima dată, în
anul 1904, de către Hanming, prin extirparea şi cultivarea embrionilor maturi ai
cruciferelor.
În prezent, cultivarea embrionilor izolaţi se efectuează în următoarele scopuri:

– studierea fiziologiei embriogenezei;

– studierea fenomenului de repaos şi înfrângerii lui;
– creşterea embrionilor nedezvoltaţi, dezmembraţi din seminţe plăpânde, dar
care prezintă o anumită valoare;
– înfrângerea incompatibilităţii postgame;
– ameliorarea celulară.
Creşterea embrionilor pe mediul nutritiv artificial se numeşte embriocultură.
Pentru cultivarea reuşită a embrioizilor izolaţi e necesar de ţinut cont de
următorii factori:
1) Stadiul critic – etapa când este necesar de plasat embrionul în cultură. Se
deosebesc două faze de dezvoltare a embrionilor:
a) faza heterotrofă – în decursul dezvoltării timpurii a embrionului, când acesta
este dependent de endosperm şi de ţesuturile materne care-l înconjoară;
b) faza autotrofă – în decursul careia embrionul, dacă este plasat în condiţii de
cultură, devine capabil să sintetizeze substanţe necesare pentru dezvoltare,
folosind sărurile minerale şi zaharoza mediului nutritiv artificial.
Stadiul critic (perioadă, când embrionul depăşeşte faza heterotrofă şi intră în
faza autotrofă), variază de la specie la specie. De exemplu, la specia straista
ciobanului acesta este stadiul cardiform.
53
 2) Apartenenţa botanică a speciei şi genotipul plantei-donor.
3) Mediul nutritiv. Pentru cultivare se folosesc mediile nutritive specifice
pentru diferite plante, elaborate pe baza de modificare a mediilor cunoscute, cum
ar fi: Murashige-Skoog, White, Ghamborg şi al. Din substanţele glucide, cel mai
des se foloseşte zaharoza. Pentru cultivarea proembrio, concentraţia zaharozei
trebuie să fie mai mare (până la 8-12%) decât în procesul de cultură a embrionilor
mai diferenţiaţi (2-3%). Din aminoacizi, cei mai întrebuinţaţi sunt glutamina şi
hidrolizatul cazeinei. În procesul de cultivare a embrionilor imaturi, în mediu se
adaugă vitaminele grupei B, acidul ascorbic, inozitol, biotin.
4) Regimul de cultivare (lumina, temperatura). Cultivarea se efectuează la
temperatura de 25-30°C. La germinarea embrionilor gramineelor, lumina se
manifestă ca un inhibitor; la cultivarea embrionilor tineri ai Daturei lumina nu
manifestă o acţiune negativă.
Scopurile aplicării practice a culturii embrionilor izolaţi sunt următoarele:
– învingerea repaosului seminţelor. Aplicarea se produce în scopul de a accelera
procesele de selecţie a plantelor. De exemplu, perioada îndelungată a repaosului la
seminţele de stângenel este determinată de endosperm. Seminţele, în condiţii
obişnuite, nu germinează timp de 2-3 ani. În condiţii de cultură, deja peste 15-20 de
zile după dezmembrarea embrionilor, aceştea se dezvoltă în plante, care peste 3,5 luni
se repică în sol. Repaosul embrionului de frasân se determină de către influenţa
cotiledoanelor; înlăturarea cotiledoanelor contribuie la starea de repaos;
– germinarea embrionilor nedezvoltaţi. Seminţele cu embrionii rudimentari şi
nedezvoltaţi se întâlnesc la reprezentanţii a 38 de familii ale plantelor
angiosperme. În afară de aceasta, plantele introduse în condiţii noi pentru ele dau
seminţe firave cu embrionii nedezvoltaţi;
– germinarea embrionilor izolaţi. Prelucraţi cu mutageni, au o superioritate
faţă de seminţele prelucrate cu mutageni. În acest caz se remarcă o penetrabilitate
înaltă a substanţei în celulele embrionilor tineri, care contribuie la obţinerea
accelerată a plantelor-regenerante;
– cultivarea embrionilor hibrizi. În procesul de cultivare a embrionilor hibrizi
slab diferenţiaţi, a gramineelor, lotusului, trifoiului – se aplică tehnica de
transplantare prealabilă a embrionilor în endospermii tineri ai plantelor iniţiale,
mai des materne, care împreună cu embrionii respectivi intacţi sunt plasaţi pe
medii de cultură. În astfel de cazuri se asigură condiţiile mai apropiate de regimul
in vivo, deoarece endospermul intact conţine fitohormoni, care influenţează activ
la diferenţierea şi germinarea embrionilor transplantaţi pe el.
Cultura embrionilor hibrizi este mai des folosită în cazul hibridării îndepărtate.
Obţinerea hibrizilor interspecii şi intergenuri este legată de enorme dificultăţi,
îndeosebi de incompatibilitatea între plantele unor specii şi genuri, determinate de
către genele de incompatibilitate, care funcţionează nu numai în perioada de
polenizare, dar şi în decursul procesului de dezvoltare embrionară, ceea ce
condiţionează incompatibilitatea postgamă (incompatibilitatea după fecundare).
54
 În procesul de analiză a metodelor de cultivare a ovulelor şi a ovarelor izolate
s-a subliniat posibilitatea de a folosi aceste metode pentru obţinerea hibrizilor
îndepărtaţi. Totuşi, metoda de cultură a embrionilor hibrizi izolaţi în scopul de a
preîntâmpina incompatibilitatea postgamă, obţine o utilizare largă, fiind mai
accesibilă. Pentru prima dată o cultură reuşită a embrionilor izolaţi, obţinuţi prin
încrucişarea între speciile de in, a fost menţionată în 1925 de către Leibah. După
datele cercetătorilor Colins şi Gross, în 1985, metoda culturii embrionilor izolaţi a
fost aplicată la obţinerea hibrizilor interspecifici şi intergenici de la mai mult de 30
de genuri, inclusiv la speciile decorative, leguminoase, ierburile furagere,
graminee şi al.

1.5. Tehnologii celulare utilizate pentru extinderea diversităţii

genetice la plantele agricole
1.5.1. Hibridarea somatică la plante.
Hibridarea somatică la plante a devenit posibilă numai după ce au fost
elaborate metode eficiente pentru obţinerea unui tip special de celule, denumite
protoplaşti. Eliminarea peretelui celular s-a realizat la început pe cale mecanică,
iar după anul 1960 prin utilizarea unor enzime (celulază, pectinază, macerozină).
Pentru izolarea protoplaştilor se folosesc ţesuturi diploide meristematice sau
mature (de exemplu, parenhimul sau mezofilul frunzei, ţesuturi haploide,
microspori etc.). Protoplastele, fiind unităţi vii, au proprietatea ca pe anumite
medii de cultură să prolifereze organisme întregi. În anul 1971 cercetătorul francez
J. Nitsch, prin folosirea unor medii de cultură adecvate, a reuşit să inducă la
protoplaste formarea peretelui celular, diviziunea mitotică, formarea calusului,
diferenţierea ţesuturilor, regenerarea unor plantule, apoi a unor plante normale de
tutun. Ulterior, au fost izolate protoplaste şi s-au regenerat plante întregi la cartof,
tomate, morcov, petunia, soia, bob, grâu etc.
Pentru genetică şi ameliorare o importanţă deosebită au două proprietăţi ale
protoplaştilor: 1) fuzionarea protoplaştilor; 2) absorbirea şi includerea particulelor
străine (molecule de ARN sau ADN, cloroplaste etc.), care, în mod normal, nu pot
străbate peretele celular.
Fuzionarea protoplaştilor se confruntă cu următoarele probleme: mărimea
frecvenţei celulelor hibride şi selectarea acestora. Pentru a spori frecvenţa de
fuzionare a protoplaştilor, în mediul de cultură se adaugă diferiţi stimulatori:
polietilenglicolul, nitratul de sodiu, ionii de calciu (Ca ++) la un pH ridicat, ser
proaspăt de iepure, etc. În prezent, se foloseşte şi metoda de electroporare
celulară, care s-a dovedit a fi deosebit de eficientă. S-a constatat o bună asociere a
protoplaştilor într-un cîmp electric neuniform, urmând ca fuziunea protoplaştilor
să se înfăptuiască sub acţiunea unui impuls scurt de curent electric.
55
 Selectarea celulelor fuzionate se
realizează prin folosirea de medii
selective, care păstrează celulele hibride
şi elimină celulele nefuzionate. S-a
constatat, că mediile de cultură ce nu Specia B
Specia A
conţin substanţe de creştere (auxină şi
citochinină) elimină protoplaştii
formelor parentale, în timp ce celulele Tratament pentru
hibride se pot lipsi de substanţele de inducerea fuziunii Protopla[ti
izola\i
creştere respective.
În anul 1972, geneticianul P. S.
Carlson de la Laboratorul National
Brookhaven din SUA a obţinut primii Agregare
hibrizi somatici, prin fuzionarea
protoplaştilor de la două specii de
tutun Nicotiana glauca (2n=24) şi
N.langsdorffii (2n=18). Din celulele Fuziunea protopla[tilor
fuzionate au regenerat plante hibride
normale, amphidiploizi ce aveau
2n=42 cromozomi, identici cu hibrizii Mediu pentru poliferarea protopla[tilor
fuziona\i
obţinuţi prin hibridare sexuală.
Ulterior, în urma perfecţionării
tehnicii de obţinere a protoplaştilor şi Selec\ia hibrizilor dup= culoare
hibridării celulare la plante, s-au
realizat fuzionări celulare în cultură
între specii foarte îndepărtate
Transferul pe mediu diferen\iat
taxonomic, care în mod obişnuit nu se
pot încrucişa pe cale sexuală: porumb
x ovăz, porumb x soia, morcov x tutun
etc. (fig.1.9).
Prin fuzionarea protoplaştilor de
cartof (2n=24) şi de tomate (2n=24) s-a Selec\ia plantelor hibride-somatice
obţinut un nou hibrid intergeneric
Fig. 1.9. Ilustrarea schematică a
denumit Pomato (4n=48), care
fuziunii protoplaştilor proveniţi de la
formează tuberculi şi tomate pe aceeaşi două specii vegetale diferite (indicate
plantă (G.Melchers, 1979). Acest hibrid prin culoarea deschisă şi închisă a
nu se cultivă în practică, dar însuşi frunzelor), cultura mixtă şi selecţia
faptul obţinerii lui contribuie la coloniilor hibride urmată de
regenerarea “hibrizilor somatici”
extinderea variabilităţii genetice, (după Y. Bajaj, 1974).
deschide perspective importante pentru
ameliorarea cartofului şi tomatelor.

56
 În ultimii ani a devenit clar specificul genetic al hibrizilor somatici în ceea ce
priveşte îmbinarea eredităţii nucleare şi celei extracromozomale: ei se deosebesc
principial de cei sexuali. Hibrizii somatici moştenesc genele extracromozomale de
la ambii părinţi, iar cei sexuali – numai pe linie maternă. Această particularitate a
hibrizilor somatici deschide posibilităţi absolut noi pentru ameliorare.
Una din posibilităţile de aplicare a hibridării somatice o constituie transferul
direct de factori genetici citoplasmatici. De exemplu, transferul androsterilităţii
citoplasmatice de la un soi sau specie la alta. G.Belliard şi G.Pelletier (1979,
Laboratorul de ameliorare a plantelor al Universităţii Paris XI) au obţinut hibrizi
somatici citoplasmatic androsterili între Nicotiana tabacum (2n=48) şi N.debneyi
(2n=24). Autorii consideră, că cloroplastele sunt independente în ceea ce priveşte
fenomenul de androsterilitate la tutun. Datele referitoare la ADN-ul mitocondrial
relevă existenţa la fiecare cibrid (hibrid celular citoplasmatic, constituit din
nucleul şi citoplasma unei celule şi citoplasma enucleată a altui tip de celulă) a
unui ADN mitocondrial specific, diferit de cel găsit la părinţi. Astfel, aceste
cercetări au pus în evidentă, pentru prima oară, recombinarea mitocondrială la o
specie vegetală superioară cum este tutunul.
Protoplastele au o deosebită importanţă prin faptul că pot încorpora molecule
de ADN străine, existente în mediu, particule străine (virusuri) şi alte molecule.
Fenomenul a fost denumit transgeneză. Pe această cale se pot transfera gene sau
chiar organite citoplasmatice (cloroplaste, mitocondrii) de la o specie la alta.
De menţionat, că în paralel cu elaborarea metodelor de hibridare a celulelor
somatice, s-a determinat şi o altă direcţie – donarea protoplastelor în scopul
folosirii lor în ameliorare. La unele specii de plante (tutun, tomate ş.a.), prin
utilizarea unui singur protoplast, se poate obţine un clon omologic de protoplaşti
cu o structură genetică identică, după regenerarea cărora se poate căpăta o
populaţie uniformă de plante.
Deci, pentru genetică şi ameliorare, utilizarea protoplaştilor prezintă o serie de
avantaje şi perspective:
– înmulţirea vegetativă rapidă a unor genotipuri preţioase;
– obţinerea unor hibrizi celulari între două specii îndepărtate filogenetic, care
în mod normal nu se pot încrucişa pe cale sexuală;
– obţinerea unor forme cu un grad diferit de poliploidie;
– inducerea şi determinarea rapidă a mutaţiilor în culturile de protoplaşti
haploizi;
– inducerea rezistenţei la boli, pesticide prin încorporarea unui genom de la o
plantă rezistentă, într-un protoplast sensibil;
– convertirea unor linii fertile în linii analoage citoplasmatic androsterile;
– transplantarea nucleară, inserţia unui genom întreg sau a unei părţi din
acesta, sau a ADN-ului străin prin absorbţie.
57
 Pe baza realizărilor obţinute până în prezent se poate aprecia, că utilizarea
nemijlocită a protoplaştilor şi hibridarea somatică a lor constituie o metodă de
transformare genetică a plantelor agricole.

1.5.2. Variabilitate somaclonală.

Este cunoscut faptul, că în cadrul grupei mari de organisme care se reproduc
sexual, variabilitatea este generată de mutageneză şi recombinogeneză. Legile care
guvernează aceste fenomene caracteristice organismelor vii şi integritatea lor sunt
pe deplin elucidate. Dar legile variabilităţii celulelor cultivate in vitro sunt puse în
discuţie. În cercetările de genetică a fost pusă în evidenţă o formă nouă de
variabilitate genetică şi anume variabilitatea somaclonală (PJ.Larkin,
W.R.Scowcroft, 1981). Ea reprezintă variabilitatea genetică evidenţiată printre
plantele regenerate in vitro din culturi de celule şi ţesuturi somatice.
În procesul de regenerare a organismelor în cultura de celule in vitro se pot
obţine protocloni, în cazul plantelor regenerate din protoplaşti, somacloni, în cazul
plantelor regenerate din celulele somatice şi gametocloni în cel al plantelor
regenerate din ţesuturi cu origine gametică. Plantele regenerate din cultura de
celule se notează, de regulă, Ro, iar generaţiile următoare R1, R2, R3...Rn.
Apariţia acestei forme de variabilitate a constituit o surpriză, dat fiind faptul
că la baza reproducerii celulelor somatice se află mecanismul conservativ al
mitozei, mecanism care în plan teoretic asigură identitatea genetică a celulelor-
fiice nou-formate.
Cauzele variabilităţii somaclonale se presupun a fi următoarele:
– mutaţiile somatice;
– variaţiile numeric cromozomale;
– variaţiile structural-cromozomale;
– crossing-over-ul somatic, atât între cromatidele-nesurori ale cromozomilor
omologi, cât şi între cromatidele-surori ale aceluiaşi cromozom, în caz,
dacă crossing-over-ul este inegal;
– acţiunea transpozonilor;
– amplificarea genetică.
Aceste cauze ale variabilităţii somaclonale, în mare măsură, sunt influenţate
de compoziţia mediului nutritiv. S-a constatat, de exemplu, că surplusul de CaCl 2,
modificarea balanţei hormonale între auxine şi citochinine, în mediul nutritiv,
stimulează considerabil instabilitatea genetică a celulelor cultivate. În scopul
izolării anumitor variaţiuni utile, se încearcă diferite modificări ale mediului
nutritiv, care ar permite selectarea acestor variaţiuni.
Mecanismele variabilităţii somaclonale nu sunt complet elucidate. Până în
prezent, au fost avansate trei ipoteze, pe care nu le prezentăm în ordine
cronologică, ci în funcţie de numărul dovezilor acumulate ulterior în sprijinul lor.

58
 Karp (1991, 1994) consideră ca mecanismul care determină apariţia cu
frecvenţă mare a variaţiilor ereditare este legat de schimbarea nivelurilor de
metilare a ADN-ului, care induce modificări în secvenţa bazelor şi în structura
cromatinei. Intensificarea metilării determină heterocromatinizarea cromatinei şi,
în consecinţă, o replicare întârziată ce duce la apariţia punţilor în anafază, la
ruperea cromozomilor şi la rearanjamente cromozomale (translocaţii, inversii,
duplicaţii, deleţii).
Barbara McClintock (1984) a sugerat că apariţia variabilităţii genetice in vitro
este o reacţie la stres. În discursul ţinut cu prilejul decernării Premiului Nobel, ea a
afirmat următoarele: “Izolarea, cultivarea în condiţii artificiale şi obţinerea
calusului sunt tot atâtea experienţe traumatizante pentru celule, şi în aceste
condiţii, resetarea genomului poate să nu se mai desfăşoare ca în condiţii naturale.
Altfel spus, genomul poate fi anormal reprogramat sau chiar restructurat. Aceste
schimbări pot da naştere unor expresii fenotipice dintre cele mai diferite, care vor
apare la plantele regenerate şi la descendenţii lor”.
De Klerk (1990) leagă variabilitatea somaclonală de rolul meristemelor în
plantă, rol care nu se limitează la construirea organismului plantei, ci include şi
formarea unei noi generaţii sexuate. Pentru că, la un moment dat, se transformă în
meristeme florale, meristemele vegetative funcţionează într-un mod similar liniei
germinale de la animale, în consecinţă, stabilitatea genetică trebuie menţinută
numai în meristeme.
Variabilitatea somaclonală prezintă atât dezavantaje, cât şi avantaje
considerabile.
Principalele dezavantaje sunt următoarele:
– apariţia şi frecvenţa variaţiilor depind, în mare măsură, de genotip;
– multe schimbări sunt fie lipsite de importanţă, fie nedorite, altele sunt
instabile (epigenetice);
– multe variaţii nu sunt noi, ele au mai apărut, fie spontan, fie induse prin
mutageneză;
– unele caractere de interes economic nu sunt afectate de variaţii;
– nu există certitudinea că parcurgerea unui ciclu de cultură va induce
modificarea oricărei însuşiri, care prezintă un interes specific.
Avantajele sunt următoare:
– variabilitatea somaclonală reprezintă o potenţială sursă suplimentară de
variabilitate genetică ce determină caractere utile, preţioase mai ales în
cazul speciilor care, înmulţindu-se asexuat sau fiind apomictice, dispun de
o bază genetică limitată;
– la unele specii, frecvenţa mare a modificării unor caractere transformă
variabilitatea somaclonală într-o sursă de mutante utile. De exemplu, la
grâu au fost regeneraţi somacloni cu proteine de rezervă modificate;
59
 – rata mare a dublării numărului de cromozomi permite, la unele specii,
diploidizarea haploizilor sau obţinerea poliploizilor prin regenerarea
plantelor in vitro;
– incidenţa mare a rearanjamentelor structurale, mai ales a translocaţiilor care
au loc în timpul cultivării in vitro, permite realizarea unor introgresii la
hibrizii interspecifici şi intergenerici;
– multe schimbări se reflectă favorabil asupra unor caractere importante din
punct de vedere agronomic, cum sunt rezistenţa la boli sau la dăunători,
productivitatea, conţinutul de proteine, toleranţa la stres etc.;
– posibilitatea apariţiei unor noi caractere sau combinaţii de caractere interesante
la un singur regenerant, sau la nivelul întregii populaţii de plante
regenerate in vitro.
Deşi este un fenomen relativ nou, care, deocamdată, nu este controlat şi mai
generează o serie de probleme, variabilitatea somaclonală a făcut deja posibilă
obţinerea unor soiuri noi la unele specii: Eustoma grandiflorum, Hemerocallis
(soiul YellowTinkerbell), Paulownia tomentosa (Somaclonal Snowstormj,
Peargonium (Velvet Rose), Torenia (Uconn White), Rubus (Lincoln Logan),
Apium (UC- T, Somaclone), Ipomoea bătaia (Scorbet), Medicago sativa (Sigma).
Posibilitatea utilizării variabilităţii somaclonale în ameliorarea plantelor a fost
semnalată pentru prima dată la trestia de zahăr. La această specie, studiul plantelor
regenerate din culturi de celule şi ţesuturi a evidenţiat o pronunţată variabilitate a
proprietăţilor morfologice, biochimice şi citogenetice. În legătură cu aceasta, au
fost iniţiate cercetări care s-au încununat cu succes în ce priveşte ameliorarea
rezistenţei plantelor la virusul ce provoacă boala “Fidji”. Tot prin folosirea
variabilităţii somaclonale au fost obţinute forme noi de orez, rezistente la excesul
de NaCl (P. Janardhan Reddy şi W. Valdyanath, 1986), soiuri de tutun rezistente la
erbicide (C. Sellin şi colab., 1989). În cercetările efectuate de către D. Marty
(1988) a fost obţinut un soi de tomate cu un conţinut foarte bogat în substanţe
uscate. Până în prezent au fost identificate variaţii somaclonale la numeroase
specii de plante cultivate (grâu, orz, ovăz, porumb, cartof, tutun, lucernă, morcov,
usturoi, ananas ş.a.).
Actualmente, la catedra de selecţie genetică şi biotehnologie a Universităţii
Agrare de Stat din Moldova, prin cultura de explante din embrioni imaturi au fost
obţinute variaţii somaclonale de porumb, în baza căror a fost creată o colecţie de
variante somaclonale la această specie (generaţia R8), care se deosebesc printr-un
şir de caractere şi însuşiri de linia originară (recolta de boabe, masa a 1000 de
boabe, înălţimea plantelor, caracteristici distincte la nivel de marcare moleculară
ş.a., fig. 1.10). În descendenţa generaţiei R8 a somaclonilor obţinuţi, au fost
studiate variante somaclonale testate la capacitatea combinativă generală

60
 BC27D4 C 56 C4 BC27D4 C 51 C 54

Fig.1.10. Etapele obţinerii variantelor somaclonale

(după Galina Comarov şi al., 2002).

cu trei linii-testeri. La aceşti somacloni a fost, de asemenea, determinat şi nivelul

de înrudire genetică cu linia originară prin efectuarea încrucişărilor de înrudire. În
baza rezultatelor obţinute (Galina Comarov şi colab., 2002), s-a constatat că:
– după indicii productivităţii, trei variante somaclonale depăşesc semnificativ
linia originară;
– încrucişările înrudite între somaclonii studiaţi şi linia iniţială a arătat un
diapazon larg de distanţă genetică pentru somaclonii studiaţi;
– în încrucişările de test, cea mai înaltă capacitate combinativă generală s-a
manifestat la două variantele somaclonale, care au fost incluse ca material
iniţial în procesul de ameliorare a porumbului.

1.5.3. Ameliorarea plantelor la nivel celular.

S-a stabilit, că celulele ţesutului de calus posedă o heterogenitate fiziologică,
citogenetică şi genetică expresivă la plantele-regenerante.
Diversitatea genetică a celulelor de calus şi a celulelor de suspensii a servit
drept bază pentru folosirea acestei proprietăţi în ameliorarea celulară.
Ameliorarea celulară este o metodă de evidenţiere a celulelor mutante şi a
variaţiilor somaclonale. La baza ameliorării celulare se află procesul de dominare
crescendă în cultură a celulelor de un anumit tip. O astfel de dominare poate fi:
– sau ca o urmare, îndeosebi, a proliferării numai a unui anumit tip de celule
(metoda directă a ameliorării pozitive);
– sau ca o eliminare sporită (înlăturare) a celulelor tipului sălbatic (metoda
indirectă a selecţiei negative).
Pe lângă aceasta, există posibilitatea de a obţine un număr mare de plante din
volumul culturii celulelor în suspensii. De exemplu, în 100 ml de suspensie a

61
culturii celulelor de tutun, care se dezvoltă accelerat, se numără mai mult de 10 7 de
celule independente (Bhojwani, Rezdan, 1983).
Frecvenţa unor anumite fenotipuri poate fi majorată de câteva ori, dacă
celulele vor fi prelucrate cu mutageni.
În vederea obţinerei liniilor cu însuşiri valoroase pentru ameliorare, suspensia
de celule sau ţesutul de calus se instalează în condiţii selective. Din celulele
selectate regenerează, apoi, plante întregi (fig.1.11. Anexa).
Din punct de vedere tehnic nu este greu de a crea condiţii selective celulelor la
rezistenţa lor faţă de un şir de factori nefavorabili:
– la concentraţia majorată de săruri;
– la valori joase ale pHului (rezistenţa la aciditate);
– rezistenţa la erbicide;
– la temperaturi joase sau majorate;
– la stresuri osmotice;
– la antibiotici;
– la patotoxine.
Unii factori selectivi se adaugă nemijlocit în substratul mediului nutritiv,
printre care: concentraţii înalte de săruri, menţinerea în mediul nutritiv a
erbicidului studiat sau a antibioticului, osmoticului sau toxinei secretate de
patogenul corespunzător. Mai poate fi şi o altă variantă de experimentări: vasele
Petri cu celulele semănate pe suprafaţa mediului agarizat se transferă în condiţii
selective, de exemplu, în cazul studierii rezistenţei la temperaturi extremale. Acest
principiu de selectare se mai foloseşte şi în cazul necesităţii de a selecta celule,
care se caracterizează cu o capacitate sporită la sinteza unor aminoacizi esenţiali
şi, în genere, la sinteza proteinei. Pe lângă aceasta, în calitate de factori selectivi se
folosesc analogii anormali ai aminoacizilor esenţiali sau insuşi aceşti aminoacizi în
concentraţii majorate.
Mutaţiile biochimice, cum ar fi superproducenţii aminoacizilor, sunt folosiţi în
calitate de modele pentru studierea căilor metabolice a aminoacizilor, a reglării
biosintezei lor. În perspectivă, această metodă poate deveni o cale reală de obţinere
a unor astfel de mutaţii, pentru crearea noilor soiuri de plante.
Exemple de selecţie celulară la rezistenţa faţă de aminoacizi şi analogilor lor.
La porumb, pe calea selecţiei treptate faţă de 5-metiltriptofan, au fost
obţinute linii celulare rezistente şi plante-regenerante. Rezistenţa faţă de analogii
triptofanului şi superproducţia de triptofan se transmite următoarei generaţiei ca un
simptom simplu dominant (Hibberd şi al., 1986).
Un interes deosebit prezintă plantele rezistente faţă de analogii prolinei şi
capabile să acumuleze acest aminoacid. S-a dovedit, că la plantele superioare
acumularea prolinei libere condiţionează mecanismele de protecţie (osmoreglarea)
a membranelor celulare şi a fermenţilor faţă de acţiunea nefavorabilă a factorilor
62
stresanţi (concentraţii majorate de săruri, temperaturi extremale, schimbările
regimului hidric (Aspinall, Peleg, 1981; Treichel şi al.,1984).
În calitate de analogi toxici ai prolinei, care se adaugă în substratul nutritiv la
cultivarea celulelor, se foloseşte hidroxiprolina, tioprolina şi al. S-au obţinut linii
celulare şi plante-regenerante ale cartofului, rezistente la astfel de analogi care,
comparativ, au un conţinut majorat de prolină liberă şi care se caracterizează
printr-o rezistenţă deosebită faţă de temperaturile joase.
Exemplu de ameliorare celulară la rezistenţa faţă de concentraţiile majorate
de săruri. Pe mediile care conţineau 0.1 M NaCl, au fost evidenţiate linii celulare
rezistente la concentraţii majorate de săruri în sol şi, din ele, au fost obţinute
plante-regenerante de tutun (Nabors şi al., 1980). Linii rezistente la concentraţii
mari de săruri au fost obţinute, de asemenea, la orez, lucernă, cimăfaie.
Studiul unor modele a arătat, că rezistenţa la concentraţiile mari de săruri este
un simptom poligen.
Exemplu de ameliorare celulară faţă de rezistenţa la antibiotice. Plantele
rezistente la antibiotice sunt folosite în calitate de markeri în experienţele ce
urmăresc transformarea genetică şi obţinerea hibrizilor citoplasmatici. Simptomul
de rezistenţă faţă de antibiotici se controlează cu determinaţii citoplasmatico-
genetici.
Prin acţiunea antibioticilor asupra celulei vegetale se produce decolorarea
ţesuturilor fotosintetice sau reprimarea dezvoltării lor. Liniile rezistente se
selectează pe mediile de o anumită componenţă după capacitatea lor de
fotosinteză, sau după felul cum se dezvoltă ele pe mediile unde au fost adăugate
antibioticele.
Au fost evidenţiate linii celulare de tutun, petunia, rezistente faţă de streptomicină
(Maliga şi al., 1973; 1980). S-au obţinut, de asemenea, mutanţi de tutun rezistenţi şi
faţă de alţi antibiotici: canamicină, lincomicină, cloramfinicol şi al.
Exemplu de ameliorare celulară la rezistenţa faţă de patotoxine. Ciupercile şi
bacteriile care atacă organismele vii, elimină în celulele atacate toxine. Una din
metodele de selectare la rezistenţa plantelor faţă de boli prevede selecţia liniilor
celulare şi a plantelor pe un mediu selectiv indus cu toxine, eliminate de patogenul
corespunzător.
m plantelor la patogeni cu ajutorul toxinelor constă în următoarele:
– calusul obţinut din ţesuturile plantelor sensibile se selectează in vitro după
rezistenţa lui faţă de T-toxină;
– din calusul rezistent la toxină se regenerează plante, care, de asemenea, se
testează la rezistenţa faţă de toxină.
Prin folosirea unei astfel de metode au fost obţinute plante de orez, rezistente
la Helmintosporium orizae (Ding şi al., 1985), plante de porumb, rezistente la
Helminthosporium maydis (Brettel şi al., 1980). Prin această metodă se efectuează

63
cercetări şi în ce priveşte selecţia celulară a liniilor şi a plantelor de cartof,
rezistente la Phytophtora şi Fusarium.
Aşadar, selecţia celulară şi mutageneza îşi găsesc aplicarea pentru a obţine o
mulţime de mutanţi rezistenţi la patogeni.
Pentru păstrarea liniilor – celulelor mutante se efectuează cultura lor în
condiţii corespunzătoare, cu controlul periodic al însuşirilor lor mutagene în
prezenţa agentului selectiv. Totuşi, cultivarea îndelungată duce la acumularea unor
variaţii genetice şi pierderea capacităţii lor la organogeneză. Din aceste
considerente, dacă este posibil, este raţional de indus regenerarea plantelor şi de
menţinut mutaţiile prin înmulţirea lor vegetativă sau obţinerea şi păstrarea
seminţelor. Actualmente sunt elaborate metode de a păstra timp mai îndelungat
celulele în stare de congelare (crioconservare).
Plantele-mutante evidenţiate se încrucişează cu cele de control şi, după datele
analizei hibridologice, se stabileşte natura mutaţiei.
În perspectivă, se presupune folosirea unor astfel de mutaţii în lucrările pentru
crearea noilor soiuri de plante.

Verificarea cunoştinţelor

1. Numiţi şi caracterizaţi direcţiile principale ale dezvoltării tehnologiilor

celulare.
2. În ce constau avantajele organismelor vegetale pentru biotehnologia celulară?
3. Ce prezintă totipotenţa?
4. Ce este calusul şi în ce scop se utilizează ţesutul de calus?
5. Enumeraţi şi caracterizaţi tipurile de calus.
6. Ce înseamnă ciclul de creştere a celulei în condiţii in vitro? Enumeraţi şi
caracterizaţi fazele ciclului de creştere.
7. Cum se clasifică obiectele vegetale folosite pentru cercetările din domeniul
biotehnologiei celulare?
8. Din ce motive poate fi condiţionată heterogenitatea citogenetică a culturii in
vitro?
9. Prin ce fel de căi poate să se dezvolte celula de calus după diferenţierea ei?
10. Ce tipuri de manifestare a diferenţierii secundare a celulelor de calus
cunoaşteţi?
11. Ce înseamnă morfogeneza in vitro?
12. Enumeraţi factorii, cu ajutorul cărora se poate regla morfogeneza in vitro.
Daţi exemple de reglare a organogenezei in vitro.
13. Cum se începe şi cum se realizează etapa iniţială a morfogenezei celulelor de
calus din punct de vedere citologic şi biochimic?
64
14. Ce fel de căi ale organogenezei sau embriogenezei somatice pot fi folosite
pentru regenerarea plantelor în condiţii in vitro?
15. În ce constă specificul sintezei şi acumulării metaboliţilor secundari in vitro?
16. Cum se intensifică şi cum se păstrează potenţialul biosintetic al culturilor
celulare?
17. Enumeraţi etapele unui program de producere a metaboliţilor secundari în
culturi in vitro.
18. Ce prezintă meristema apicală şi din ce cauză ea se utilizează ca obiect
principal pentru obţinerea plantelor libere de viroze?
19. Ce fel de metode sunt folosite pentru eliberarea şi diagnosticarea plantelor
libere de viruşi?
20. Numiţi avantajele metodelor de propagare in vitro.
21. Caracterizaţi etapele micropropagării in vitro.
22. Ce fel de metode ale micropropagării in vitro cunoaşteţi? În ce constă
diferenţa dintre ele?
23. Cum şi unde se utilizează micropropagarea plantelor sub aspect practic?
24. Ce înseamnă crioconservarea şi ce avantaje are ea pentru conservarea
genofondului vegetal comparativ cu alte tehnologii? Enumeraţi etapele
crioconservării suspensiilor celulare.
25. În ce scop se înfăptuieşte cultivarea in vitro a polenului şi anterelor?
26. Cum se obţin haploizii de orz prin metoda de haploproducenţi (metoda
“bulbozum”)?
27. Ce fel de tehnologii in vitro sunt utilizate pentru învingerea incompatibilităţii
progame?
28. Enumeraţi şi caracterizaţi direcţiile de bază ale aplicării practice a
embrioculturii la plantele superioare.
29. Care factori determină dezvoltarea normală a embrionilor în condiţii in vitro?

30. Ce prezintă hibridarea somatică şi ce posibilităţi de aplicare a hibridării

somatice cunoaşteţi?
31. Din ce cauză variabilitatea somaclonală poate fi ca sursă nouă pentru lărgirea
diversităţii genetice a plantelor superioare? Numiţi avantajele şi dezavantajele
variabilităţii somaclonale.
32. Ce prezintă ameliorarea celulară şi în ce constă principiile de selectare a
celulelor in vitro? Daţi exemple.

65
 2. INGINERIA GENETICĂ LA PLANTE

Descoperirile răsunătoare din genetică, realizate în ultimile decenii,

cunoaşterea structurii fine a genelor şi cromozomilor, au determinat apariţia unei
noi direcţii de cercetare în biologie - ingineria genetică.
Ingineria genetică poate fi definită ca un ansamblu de metode şi tehnologii de
laborator, care permit manipularea materialului genetic la nivel celular şi
molecular, fără participarea procesului sexuat in vitro, realizându-se astfel structuri
genetice noi.
Savantul american H.H.Smith (1976) defineşte ingineria genetică strict în
limitele biologiei moleculare, aceasta reprezentând fenomenul transferului de
ADN de la un genotip la altul şi integrarea, replicarea şi expresia ADN-ului donor
în organismul – gazdă.
Ingineria genetică înlătură barierele genetice ce apar la încrucişarea dintre
specii, asigurând schimbul de gene între specii foarte îndepărtate pe scara evoluţiei
(de exemplu, mamiferă-bacterie), încorporând în genotipul unei specii factori
ereditari, care niciodată nu au aparţinut acestuia în condiţii naturale. Graţie
utilizării metodelor contemporane de bioinginerie, a devenit posibil transferul
oricărei gene cu funcţii normale sau anormale, dintr-un organism în alt organism,
inclusiv la om, sau combinarea materialului ereditar al eucariotelor cu al
procariotelor şi copierea (donarea) acestui ADN hibrid sau recombinat, prin
includerea lui într-o bacterie gazdă.
Astfel, scopul principal al ingineriei genetice este de a construi un aşa fel de
ADN-recombinat, care să atribuie organismelor vii însuşiri folositoare pentru
mediul ambiant şi umanitate: de exemplu, producerea comercială a unui volum
mare de proteine specifice, care să fie de reală utilizare pentru industrie,
agricultură şi medicină, sinteza hormonilor şi a enzimelor cu destinaţie
farmaceutică, protecţia mediului înconjurător şi lupta împotriva poluării lui etc.
Formarea şi dezvoltarea ingineriei genetice, în ultimile trei decenii, s-a
desfăşurat destul de rapid datorită folosirii intense a realizărilor biologiei
moleculare, care au dat posibilitate să fie evidenţiate bazele moleculare ale
eredităţii. Cunoaşterea aprofundată a elementelor genetice şi biologiei moleculare
este condiţia necesară pentru cuprinderea şi utilizarea cu succes a instrumentelor
principale ale ingineriei genetice.

66
 2.1. Elemente de genetică şi biologie moleculară –
instrumente principale ale ingineriei genetice

2.1.1. Structura, însuşirile şi funcţiile acizilor nucleici.

2.1.1.1. Identificarea naturii chimice şi organizarea materialului genetic.

De multă vreme se caută răspuns la întrebarea: ce reprezintă factorii ereditari
şi din ce sunt ei compuşi? Care este mecanismul transmiterii informaţiei genetice
de la părinţi la urmaşi?
Evoluţia cunoştinţelor despre compoziţia chimică a materialului ereditar
începe cu relevarea de către F. Miescher (1871) în lapţii peştelui somol (Salmo
salar) a unei substanţe pe care a numit-o nucleină. Studiul nucleinei a arătat că
este compusă dintr-un acid organic, care conţine fosfor, şi din proteine. Acidul
organic a fost identificat şi izolat pentru prima oară de R. Altmann (1899), care 1-a
denumit acid nucleic.
Cu toate că acizii nucleici au fost descoperiţi încă la sfârşitul secolului XIX,
natura genei este elucidată abia la mijlocul secolului XX, datorită unor investigaţii
remarcabile, care au demonstrat că gena este un segment de acid nucleic.
Un prim mare pas în descoperirea rolului genetic al acizilor nucleici a fost
făcut de către F.Griffith (1928), prin relevarea fenomenului de transformare
bacteriană. El a efectuat experienţe cu două suşe de bacterii din specia
Diplococcus pneumoniae (aşa-numiţii pneumococi): tipul S, ale cărui celule sunt
virulente şi au capsulă, şi tipul R, ale cărui celule sunt nevirulente şi fără capsulă.
Experimental a fost constatată schimbarea unui tip de pneumococi în alt tip,
prin trecerea unei “substanţe” sau “factor transformator” de la donorul S la
recipientul R.
Cercetările lui Griffith au constituit un preludiu care anunţa viitoarele mari
descoperiri ale geneticii moleculare. În anul 1944, cercetătorii americani O. T.
Avery, C. M. Mac Leod şi M. Mc. Carty au făcut o descoperire de importanţă
excepţională, stabilind că agentul care determină transformarea bacteriană de la
tipul nevirulent de pneumococi la tipul virulent este acidul dezoxiribonucleic
(ADN; descoperit în 1924 de R.Feulgen). Prin extragerea şi purificarea ADN-ului
de la un tip de pneumococi şi adăugarea acestuia în substraturi de cultură pură a
altui tip, s-a realizat inducerea controlată a transformării genetice.
Cercetările efectuate de A. Hershey şi M. C. Chase (1952) asupra virusurilor,
în special a bacteriofagilor din seria T 2 care parazitează bacteria E coli, au adus
argumente substanţiale în sprijinul ideii, că anume ADN-ul, şi nu proteina, conţine
informaţia genetică. Cercetarea fagului T 2 a relevat că el conţine circa 40% ADN
şi 60% proteine. Marcând separat, cu ajutorul izotopilor radioactivi, proteinele
67
şi ADN-ul, ei au demonstrat că în cursul infecţiei în celula bacteriană pătrunde
numai ADN-ul, iar proteinele rămân în afara celulei bacteriene. Acest ADN, în
scurt timp, este capabil să producă singur, fără aportul proteinelor, câteva sute de
particule virale progene (descendente), lizând celula bacteriană – gazdă. Deci, se
poate conchide, că ADN-ul cuprinde singur întreaga informaţie ereditară, necesară
pentru obţinerea generaţiilor noi.
În afară de probele directe menţionate, s-au adus şi dovezi indirecte, pe baza
cărora au fost făcute concluzii asupra naturii materiei ereditare. În această privinţă
menţionăm faptul, că la organismele eucariote ADN-ul este localizat aproape
exclusiv în cromozomi, al căror rol în ereditate a fost relevat încă de genetica
clasică. S-a constatat, de asemenea, că ADN-ul se caracterizează printr-o
remarcabilă constanţă cantitativă pentru fiecare specie de-a lungul generaţiilor.
Celulele haploide sexuale conţin numai o jumătate din cantitatea de ADN a celulei
somatice, iar celulele care posedă un număr dublu de cromozomi, triplu sau un
multiplu al numărului de bază, conţin şi o cantitate de ADN mărită corespunzător.
Corelând datele despre cantitatea de ADN în celulă cu datele citologice privind
comportarea şi rolul cromozomilor în diviziunea celulară de-a lungul generaţiilor
(prin mecanismul mitotic şi meiotic), ajungem, indirect, la concluzia că ADN-ul
reprezintă substratul biochimic purtător al informaţiei ereditare. Capacitatea ADN-
ului şi ARN-ului de a îndeplini funcţii genetice este determinată de structura lor
chimică particulară.
Organizarea materialului genetic. Sistemele biologice cuprind două tipuri
fundamentale de organizare a materialului ereditar: organizarea procariotă şi
organizarea eucariotă.
În concepţia actuală, organismele procariote sunt caracterizate prin faptul că
nu au nucleu şi membrană nucleară, ci o structură genetică simplă, o singură
macromoleculă de ADN sau ARN, ce alcătuieşte cromozomul. Procariotele se
împart, la rândul lor, în organisme de tip acelular, din care fac parte virusurile,
virozii şi plasmidele, şi organisme de tip celular, bacteriile şi algele verzi şi
albastre.
Organismele eucariote sunt constituite, în general, din numeroase celule
diferenţiate cu nucleu şi membrană celulară bine definite. Celulele eucariote se
divid prin mitoză şi meioză. Cromozomii lor au o structură mult mai complexă,
fiind alcătuiţi din ADN, ARN, proteine, lipide etc. Numărul cromozomilor la
eucariote este variabil, dar niciodată nu există unul singur. La eucariote, pe lângă
genomul nuclear, există cele plastidic, mitocondrial şi centriolar etc. Din acest tip
fac parte plantele şi animalele, inclusiv omul.

68
 2.1.1.2. Componenţa chimică, structura şi însuşirile acidului
dezoxiribonucleinic (ADN).
Structura primară a ADN-ului. ADN-ul reprezintă o substanţă chimică cu
structura macromoleculară, constituită din unităţi mai simple (monomeri),
denumite nucleotide. Un nucleotid este format din trei componente: un radical
fosforic, un monozaharid – dezoxiriboză şi o bază azotată purinică sau
pirimidinică. În structura ADN-ului intră două baze purinice, adenina (A), guanina
(G) şi două pirimidinice, citozina (C) şi timina (T). Dezoxiriboza, împreună cu o
bază azotată, formează un nucleozid. Ataşarea restului fosforic la nucleozide
condiţionează formarea nucleotidelor. Radicalul fosforic realizează legătura între
carbonul monozaharidului din poziţia 5′ (C 5) a unui nucleotid cu carbonul din
poziţia 3′ (C3) a unui alt nucleotid, astfel, încât se formează un lanţ de mai multe
nucleotide unite prin asemenea legături 5′–3′ sau 3′– 5′, care a primit denumirea de
lanţ polinucleotidic sau catenă polinucleotidică. Structura monocaterană
reprezintă structura primară a ADN-ului. Secvenţa bazelor azotate în cadrul
structurii primare a ADN-ului este specifică pentru fiecare specie şi reprezintă
modalitatea de înscriere a informaţiei ereditare în molecula de ADN sub formă de
codificare biochimică.
Structura secundară a ADN-ului. În mod normal, molecula de ADN este
alcătuită din două lanţuri polinucleotidice complementare, sau două catene,
aceasta fiind structura secundară a ADN-ului (fig. 2.1).
În anul 1953, J. D. Watson şi F. H. C. Crick au propus modelul de structură
biatenară a ADN-ului (fîg.2.2. Anexa). Acest model admite că molecula de ADN
este constituită din două catene polinucleotidice complementare, răsucite una în
jurul celeilalte, formând un helix (spiral) dublu cu diametrul de 20Å (1Å = 10-8
cm). Rotaţia completă a unei catene în jurul axului imaginar al moleculei cuprinde
10 perechi de nucleotide şi măsoară 34 A lungime. Spre exterior se află scheletul
glucido-fosforic al moleculei de ADN, iar spre interior – bazele azotate
complementare legate prin punţi de hidrogen.
Molecula de ADN are dimensiuni foarte mari, fiind cea mai mare moleculă
biologică, cu o masă moleculară care poate atinge 12–16×10 daltoni (l dalton =
1/12 din masa atomului de C).
Realizarea structurii bicatenare este consecinţa complementarităţii dintre
bazele azotate purinice şi bazele azotate pirimidinice. Prin proprietăţile sale
structurale, adenina este complementară faţă de timină, iar guanina faţă de
citozină. Se formează, astfel, perechi de baze azotale A-T sau T-A şi G-C sau C-G.
Complementaritatea purinică-pirimidinică face ca în condiţiile când pe una
dintre cele două catene ale dublului dublu – helix ADN se află secvenţa de baze
azotate A-T-T-G-A-A-G etc, pe catena complementară să fie posibilă o singură
secvenţă: T-A-A-C-T-T-C. Datorită complementarităţii în molecula de ADN,
cantitatea de adenină este egală cu cantitatea de timină (A=T), cantitatea de
69
guanină este egală cu cantitatea de citozină (C=C), iar conţinutul purinic este egal
cu conţinutul pirimidinic A+G=T+C (regula lui Chargaff). Raportul dintre (A+T):
(G+C) diferă şi este specific, fiind mult mai apropiat la organismele înrudite
filogenetic.
Cele două catene polinucleotidice sunt antiparalele: un lanţ fiind orientat 3′ –
5′, iar celălalt – 5′ – 3′ (fig. 2.1).

Fig. 2.1. Structura secundară a ADN-ului (după R. Lewis, 2001).

70
 ADN-ul este împachetat cu ajutorul proteinelor, formând fibra de cromatină.
Dacă primul nivel de împachetare în spaţiu este dublu helix, al doilea este fibra
nucleosomă, cu diametrul de 10 nm, al treilea este solenoidul, cu bucle de la 5
până la 200 de kilobaze (kb), ataşate la bază de matricea nucleară. Locul de ataşare
(de aproximativ 1 kb) se numeşte “regiunea de ataşare la matrice” (SAR = scafold
atachment region). Gradul maxim de condensare este atins în cromozomii
metafizici. Aici, buclele mari de cromatină sunt ataşate la un schelet proteic, care
are forma caracteristică unui cromozom. Se consideră că un cromozom este format
dintr-o singură moleculă de ADN.
ADN-ul se caracterizează prin următoarele însuşiri:
a) denaturare – ADN-ul bicatenic este capabil să se descompună sub acţiunea
temperaturii înalte sau reacţiei alcaline a mediului în care se găseşte;
b) renaturare – catenele complementare ale ADN-ului denaturat (descompus)
pot să se unească în spirală dublă, adică renaturarea este un proces contra
denaturării. Această reasociere a catenelor complementare este numită
hibridare moleculară;
c) replicare – însuşire principală a ADN-ului, ce se exprimă prin capacitatea
ADN-ului de a se replica (dubla) pe baza principiului de complementare.
Pornind de la principiul complementarităţii celor două catene ale dublului –
helix ADN, Watson şi Crick au propus modelul replicării semiconservative. Acest
mecanism de replicare presupune separarea treptată a lanţurilor polinucleotidice
complementare prin desfacerea punţilor de hidrogen, fiecare catenă servind drept
matriţă pentru sinteză. Procesul de replicare a ADN-ului are loc în intervalul dintre
două diviziuni celulare succesive, numit interfază.
Esenţa replicării constă într-o reacţie de copiere a secvenţei de nucleotizi a
matriţei pe baza principiului complementarităţii, datorită căruia se realizează
perechi specifice de baze A-T, T-A, G-C, C-G între nucleotizii angajaţi deja în
matriţe şi nucleotizii liberi, care se aranjează selectiv pe matriţă în virtutea
complementarităţii. Între nucleotizii liberi şi cei de pe matriţă se formează punţi de
hidrogen. În acelaşi timp, între nucleotizii liberi aliniaţi pe matriţe se realizează
succesiv legături fosfodiesterice. Astfel, dintr-o macromoleculă iniţială de ADN se
formează două macromolecule indentice de ADN, fiecare având o catenă veche şi
una nou-sintetizată.
Modelul de structură bicatenară a moleculei de ADN, propus de Watson şi
Crick, face explicabilă posibilitatea realizării celor două funcţii ale materialului
genetic:
funcţia autocatalitică – în cadrul procesului de replicare a ADN-ului prin care
se realizează copierea informaţiei ereditare, deci continuitatea genetică;
funcţia heterocatalitică – în cadrul procesului de biosinteză proteică, care se
realizează pe baza descifrării codului genetic, prin transformarea secvenţei de
nucleotizi din genă în secvenţă proteică.
71
 2.1.1.3. Structura şi tipurile de replicare ale acidului ribonucleic (ARN).
Acidul ribonucleic (ARN) are o constituţie chimică asemănătoare cu cea a
ADN-ului, însă se deosebeşte prin faptul că în loc de dezoxiriboză conţine riboză,
iar timina este înlocuită cu uracilul. Deosebirea principală dintre ADN şi ARN
constă în faptul, că molecula de ARN este formată dintr-un singur lanţ
poliribonucleotidic, deci are o structură monocatenară. Aceasta face ca bazele
azotate purinice să nu fie în cantităţi egale cu cele pirimidinice. Uneori se pot
forma şi structuri duble helicoidale, pe anumite porţiuni, în care bazele
complementare, venite în contact, se pot lega între ele prin punţi de hidrogen. A. S.
Spirin susţine că 50-60% din molecula de ARN are regiuni bicatenare. La viruşii
ARN, numiţi reoviruşi (virusul maimuţelor SV 40, bacteriofagul de tipul T 4), s-a
stabilit că molecula de ARN este formată din două catene complementare.
Ţinând seama de funcţia pe care o îndeplineşte ARN-ul, se apreciază că există
două categorii de acid ribonucleic: ARN viral şi ARN celular.
ARN viral este înzestrat cu funcţie genetică primară de depozitare a
informaţiei genetice şi transmiterea ei în generaţiile virale succesive prin replicare.
Se întâlneşte la unii riboviruşi, cum ar fi: virusul mozaicului tutunului (VMT),
virusul gripal, virusul poliomelitei, virusul stomatitei, virusul imunodeficitar
(HIV), virusul encefalitei etc.
ARN celular îndeplineşte funcţii esenţiale în procesul decodificării informaţiei
genetice şi translării ei în procesul de biosinteză proteică celulară. Se disting
câteva tipuri principale de ARN celular: ARN mesager (ARNm), ARN solubil sau
de transfer (ARNt), ARN ribozomal (ARNr) şi ARN nuclear mic (ARNnm).
ARN mesager (ARNm) a fost numit mesager sau de informaţie, pentru că poartă
cu sine informaţia genetică copiată de pe un fragment de ADN, pe care o transferă la
ribozomi, unde se realizează biosinteza proteinelor. Este singurul tip de ARN tradus în
proteine, reprezentând 2-5% din cantitatea totală de ARN din celulă.
ARNm are o structură monocatenară. Lungimea catenei de ARNm este foarte
variabilă, deci şi masa moleculară este variabilă, în funcţie de lungimea
segmentului de ADN, de pe care este copiată informaţia genetică. La eucariote,
lungimea ARNm matur este cu mult mai mică decât lungimea secvenţei genetice
transcrise.
Faptul că cele mai mici proteine au un lanţ polipeptidic, alcătuit din cel puţin
100 de aminoacizi, conduce la concluzia că lungimea minimă a catenei ARN este
de 100 x 3 nucleotizi (un codon este format din 3 nucleotizi). La E.coli mărimea
unei molecule de ARN variază între 900-2500 de nucleotizi, codificând lanţuri
polipeptidice de 300-900 de aminoacizi.
ARN de transfer sau ARN solubil (ARNt sau ARNs). Rolul ARNt este de a fixa
aminoacizii sub formă de compuşi activaţi şi de a-i transfera la ribozomi, unde are
loc biosinteza proteinelor. Acest acid ribonucleic reprezintă 10-25% din cantitatea
totală de ARN celular.
72
 Lungimea monocatenei sale este de cea 70-90 nucleotide, cu o greutate
moleculară în jur de 25000 de daltoni. Compararea structurii secundare a diferitelor
tipuri de ARNt a condus la stabilirea unor regularităţi structurale în molecula de
ARNt, care îi atribuie o configurare spaţială asemănătoare cu frunza de trifoi.
Într-o moleculă de ARNt pot fi identificate trei zone distincte:
– zona terminală monocatenară cu segmentul liber CCA, care are rol de
acceptor pentru un aminoacid activat. Fiind aceeaşi la toate moleculele de
ARNt, secvenţa CCA nu este implicată în specificitatea ataşării
aminoacidului la ARNt. Aminoacidul se fixează pe această zonă cu ajutorul
enzimei aminoacil ARN-sintetaza – enzimă activatoare specifică pentru
fiecare aminoacid;
– zona anticodonului, formată dintr-un triplet de nucleotide cu secvenţa
complementară bazelor azotate dintr-un codon de ARNm. Numărul
anticodonilor este egal cu numărul codonilor din cadrul moleculei de
ARNm.
– zona pentru recunoaşterea şi fixarea ARNt în ribozom în timpul procesului
de biosinteză a proteinelor.
ARNt este sintetizat sub forma unei monocatene de pre-ARNt pe matriţa de
ADN. Secvenţa de ribonucleotide a acestui pre-ARNt reprezintă structura primară
ARNt, care este iniţial cu 30-40 de nucleotide mai mare decît ARNt matur.
Cercetările au permis să se stabilească existenţa a 61 tipuri diferite de ARNt
(acest număr este egal cu numărul de codoni activi în sinteza proteică. Vezi codul
genetic).
Au fost izolate în stare pură aproape toate tipurile de ARNt, iar la peste 20
dintre ele a fost stabilită secvenţa de nucleotide a monocatenei (structura primară).
ARNt este specific şi universal. Specificitatea se manifestă prin aceea că un
anumit tip de ARNt poate fi sintetizat numai de o specie anumită. Universalitatea
ARNt constă în faptul că, odată sintetizat, el poate transfera un anumit aminoacid
spre locul de sinteză a proteinei la orice specie.
ARN ribozomal (ARNr) reprezintă circa 80-85% din cantitatea totală de ARN
celular, intrînd în structura ribozomilor. Alături de proteine, ARNr constituie 40-
60% din masa ribozomilor, formaţiuni ce participă direct la citirea şi traducerea
mesajului genetic.
Structura primară ARNr este monocatenară, complementară ADN-ului din
zona organizatorilor nucleari ai cromozomilor. Sinteza proteinelor ribozomale şi
asamblarea acestora cu ARNr are loc în nucleoli, de unde rezultă noile subunităţi
ribozomale. O caracteristică importantă a ARNr constă în faptul că se găseşte
întotdeauna asociat cu proteinele.
La procarioţi, ribozomii activi în sinteza proteinelor au o constanţă de
sedimentare de 70S (unităţi Svedberg). Fiecare particulă ribozomală de 70S este
73
alcătuită din două subunităţi: subunitatea mică de 30S (cu o masă moleculară de
850000) şi subunitatea mare de 50S (cu o masă moleculară de 1800000). În
fiecare subunitate ribozomală există o singură catenă de ARNr, care conţine între
1500-3900 de ribonucleotizi. În ribozomii de E.coli constanţa de sedimentare a
ARNr din subunitatea mică este de 16S, iar în subunitatea mare există o catenă de
ARNr de 23S şi una de 5S; ARNr cu constanţa de 16S are 1541 de nucleotizi,
ARNr 23S are 2904 nucleotizi, iar ARNr cu constanţa 5S are 120 de nucleotizi.
Ribozomii la eucariote au constanţa de sedimentare 80S, cu subunităţi 40S şi
60S, în care ARNr are constantele de sedimentare 18S, respectiv 25S şi 5S.
ARNr din cloroplastele şi mitocondriile celulelor eucariote prezintă greutăţi
moleculare mai mici decât moleculele corespunzătoare din citoplasmă, şi chiar mai
mici decât cele întâlnite la procariote.
Deocamdată nu se cunoaşte care este funcţia specifică a acestor tipuri de
ARNr. Se presupune că bazele azotate reîmperecheate din ARNr participă la
interacţiunea cu celelalte tipuri de ARN celular în procesul de decodificare a
informaţiei genetice purtată de ARNm. La E.coli a fost izolat ARNr din ribozomi
purificaţi şi s-a demonstrat că ARNr nu este purtător de informaţie genetică.
ARN nuclear mic (ARN nm) reprezintă un tip de ARN de dimensiuni mici,
care a fost identificat în nucleii tuturor celulelor animale. Acest ARNnm
interacţionează cu proteine specifice pentru a forma particule ribonucleo-proteice
mici (jma.ll nuclear ribonucleoprotein particles – sn RNP). Se presupune, că
sinteza ARNnm se realizează cu ajutorul ARN-polimerazei III şi că acest tip de
ARN este implicat în iniţierea sintezei proteice.

2.1.2. Enzimologia sintezei ADN şi ARN.

2.1.2.1. Mecanismul biochimic al biosintezei replicative a ADN-ului.
Separarea celor două catene, în procesul de replicare, se realizează progresiv,
astfel că, în desfăşurarea procesului, macromolecula ADN capătă forma literei
“Y”. Această configuraţie în formă de Y a fost numită bifurcaţie de replicare şi
reprezintă cele două catene-matriţă ce-şi expun bazele în vederea împerecherii cu
baze azotate ale nucleotidelor libere.
Mecanismul biochimic al procesului de replicare cuprinde următoarele etape:
– sinteza nucleotizilor ce vor intra în componenţa moleculei noi de ADN;
– dezrăsucirea moleculei de ADN şi separarea în două monocatene sub
acţiunea ADN-helicazei şi a proteinelor de destabilizare;
– dispunerea monomerilor în ordinea dictată de fiecare catenă utilizată ca
matriţă, ce se realizează pe principiul complementarităţii bazelor azotate cu
formarea legăturilor de hidrogen;
74
 – polimerizarea nucleotizilor prin formarea legăturilor 5′-3′ sub controlul
enzimei ADN-polimeraza. Polimerizarea se realizează, în principiu, sub
acţiunea polimerazei III.
S-a stabilit, că toate enzimele ADN-polimerazice au capacitatea de a alungi
numai catene polinucleotidice deja existente, nu însă şi de a putea iniţia sinteza de
novo a unei catene de ADN. O astfel de capacitate are enzima ARN-polimeraza.
De aceea, primul eveniment în replicare, după destabilizarea dublului helix, este
sinteza prin intervenţia enzimei ARN-polimeraza a unui ARN-primer. După ce
începe reacţia de polimerizare ARN-primer este excizat, iar capătul liber 3′-OH
este oferit ADN-polimerazei de către nucleotidele deja incluse în noua catenă de
ADN. Acum ADN-polimeraza catalizează reacţia de condensare a acestei grupe
3′-OH a primerului şi a grupei 5′-fosfat a primului nucleotid aliniat pe matriţă.
Replicarea ADN-ului este, astfel, iniţiată.
Studiul procesului de replicare a ADN-ului a relevat faptul, că ambele catene
servesc drept matrice pentru câte o catenă nouă de ADN. Catenele-fiice cresc
simultan în direcţia de la 5′ la 3′, prin adiţia unor segmente, care întotdeauna sunt
sintetizate în direcţia 5′ 3′ (direcţia de funcţionare a ADN-polimerazei).
În anul 1966, K. Sakabe şi R. Okazaki au propus modelul de replicare
discontinuă a ADN-ului, care ulterior a fost unanim acceptat şi s-a dovedit a fi
aplicabil la toate sistemele biologice.
Conform acestui model, replicarea începe în puncte de iniţiere şi se desfăşoară
în ambele direcţii, formându-se două elice-surori (furci de replicaţie). Cele două
catene de ADN au o dispoziţie antiparalelă (una are o polaritate de 3′5′, iar
cealaltă 5′3′). Catena 3′5′, numită şi catenă directoare (leading), constituie o
matriţă pe care replicarea se desfăşoară continuu prin mişcarea neîntreruptă
a ADN-polimerazei de-a lungul furcii de replicare. Celălalt filament 5′3′, numit şi
catenă discontinuă, segmentară sau întîrziată (lagging), este necesar a fi copiat
retro, discontinuu prin segmente mici, numite fragmente Okazaki, astfel ca
polimerizarea să se realizeze tot pe direcţia 3′5′. Sinteza fiecărui fragment este
iniţiată de un segment de ARN-primer sintetizat prin acţiunea ARN-polimerazei.
După sinteza fragmentului Okazaki, ARN-primerul este excizat. Fragmentele
Okazaki, având circa 1000-2000 de nucleotizi, sunt unite sub acţiunea enzimei
ADN – ligaza în segmente mai lungi. În ultimă instanţă, din unirea acestora din
urmă rezultă catena nou-sintetizată, replică a matriţei (fig. 2.3.).
Unitatea de replicare a materialului genetic este repliconul, care are o origine
unde începe şi un terminus, acolo unde replicaţia se termină. Cromozomul
bacterian constituie un singur replicon, în timp ce cromozomul eucariotic conţine
un număr mare de repliconi.

75
 3′ 5′

helicaz=

proteine destabiliz=toare
enzime de ini\iere (HDP)

primaz=
primer
ADN-polimeraz=-III

ADN-ligaz=
excizie primer

5′ ADN-giraz=
fragment Okazaki

5′ 3′ catena discontinu= catena continu= 5′ 3′

(lagging) (leading)
Fig. 2.3. Reprezentarea schematică a mecanismului
biochimic al replicaţiei moleulei de ADN

2.1.2.2. Sinteza artificială a ADN-ului.

În anul 1958, A. Kornberg, I. Lehmann, M. S. Bessman şi S. S. Simms au
realizat sinteza artificială a ADN-ului (sinteza artificială a genei). În acest scop, ei
au folosit un sistem enzimatic denumit ADN-polimeraza (sau enzima lui
Kornberg), extras din E.coli, un amestec de dezoxiribonucleotide, ioni de
magneziu şi o cantitate mică de ADN – matriţă.
Caracteristica esenţială a acestui proces de sinteză în vitro a ADN-ului o
constituie faptul, că pentru realizarea lui este necesar un model iniţial – matriţa.
Deci, pentru a se începe sinteza, la amestecul de reacţie se adaugă o cantitate mică
de ADN. Noile catene sintetizate s-au dovedit a avea aceeaşi frecvenţă relativă a
celor patru baze, ca şi catenele ADN-ului folosit ca sursă iniţială. În condiţii
favorabile, procesul de sinteză se desfăşoară eficient, realizându-se o cantitate de
ADN nou-sintetizat de zeci de ori mai mare, decât cantitatea de ADN natural care
a servit ca “model”.
Ulterior, la bacterii, au fost descrise încă două enzime din grupa ADN-
polimeraze: ADN-polimeraza II şi ADN-polimeraza III.
Deşi la început s-a crezut că ADN-polimeraza I este implicată în reacţia de
replicare, mai târziu s-a dovedit că doar ADN-polimeraza III este enzima
76
polimerizatoare de replicare, pe când ADN-polimeraza I joacă un rol esenţial în
repararea leziunilor produse în ADN de către diferiţi agenţi mutageni, şi un rol
secundar în replicare. Funcţia ADN-polimerazei II încă nu a fost definitiv precizată,
însă e cunoscut faptul că ea nu este implicată direct în vreo etapă a replicării.
La eucariote s-au descris mai multe tipuri de ADN-polimeraze:
– polimeraza alfa, implicată în replicarea propriu-zisă;
– polimeraza beta, implicată la reparare;
– polimeraza gamma, care pare a fi polimeraza mitocondrială.

2.1.2.3. Biosinteza ARN-ului (transcripţia genetică).

Categoriile de ARN celular implicate în procesul biosintezei proteinelor şi
anume ARNm, ARNt şi ARNr nu au proprietatea de autoreplicare. Biosinteza
ARN-ului celular se realizează în cadrul procesului de transcriere genetică sau
transcripţie genetică.
Transcrierea reprezintă un proces complex, care se desfăşoară în mai multe
etape în cadrul căruia ADN-ul funcţionează ca matriţă pentru sinteza monocatenei
de ARN, asigurându-se transferul informaţiei genetice de la ADN la ARN. Sinteza
ARN-ului este catalizată de enzima ARN-polimerază, numită şi transcriptază.
ARN-polimeraza, spre deosebire de ADN-polimeraza, are capacitatea de a iniţia
sinteza “de novo” a unei catene nucleotidice, fără a necesita primer.
În procesul de transcripţie, ARN-polimeraza recunoaşte secvenţe specifice de
pe matriţa ADN, realizând polimerizarea unor ribonucleotide trifosfat libere,
alineate pe catenă de ADN matriţă, conform principiului complementarităţii de
baze azotate, în care A din matriţă se uneşte cu uracilul (U), înlocuitorul timinei în
ARN, G se împerechează cu C, iar T din matriţa ADN-ului se împerechează cu A
din ribonucleotidele alineate pe matriţă. Matriţa şi catena poliribonucleotidică nou-
sintetizată formează un hibrid molecular ADN – ARN provizoriu, prin intermediul
punţilor de hidrogen dintre bazele complementare. Creşterea catenei ARN are loc
prin formarea punţilor diesterice succesive în direcţia 3′5′. Ulterior, hibridul
molecular ADN-ARN este disociat, desprinzându-se de pe matriţa ADN o catenă
poliribonucleotidică, care nu este altceva decât produsul de transcriere
(transcriptul), respectiv o moleculă de ARN. Fragmentul catenei de ADN, care a
servit ca matriţă în procesul de transcripţie genetică şi a suferit o denaturare
fiziologică, revine la structura normală bicatenară.
De precizat că dintre cele două catene complementare de ADN doar una
funcţionează ca matriţă pentru sinteza de ARN (catena sens), cealaltă rămânând
netranscrisă (catena antisens). Transcripţia este, însă, asimetrică pentru un
fragment dat al ADN-ului. La nivelul altor fragmente de ADN, catena sens poate fi
cealaltă catenă complementară.

77
 Sinteza ARN-ului este secvenţională în sensul, că în lungul unei molecule de
ADN există mai multe unităţi de transcripţie.
Procesul de iniţiere a transcripţiei presupune recunoaşterea de către enzima
ARN-polimeraza a unui segment specific din matriţa de ADN de circa 50 de
nucleotizi, numit promotor, care se află înaintea genei ce urmează să fie transcrisă.
Enzima ARN-polimeraza se leagă specific cu promotorul, determinând desfacerea
dublului helix ADN şi iniţierea transcripţiei de pe gena respectivă. Prima bază din
catena nouă de ARN este o adenină sau o guanină, ceea ce înseamnă că prima bază
copiată din ADN este o pirimidină (T sau C). Când ARN-polimeraza atinge şi
recunoaşte situl de terminare a secvenţei de ADN sau secvenţa terminator, catena
de ARN este eliberată de pe matriţa de ADN. Odată cu desprinderea de pe matrice,
noua catenă de ARN poate migra din nucleu în citoplasmă. În urma acestui proces
se formează un ARN a cărui succesiune de baze este riguros complementară unui
fragment dintr-o catena de ADN.
Deşi diferitele categorii de ARN celular nu sunt încadrate în depozitarea şi
transmiterea mesajului genetic, transcripţia genetică în timpul căreia are loc
sinteza acestor macromolecule se găseşte în sfera unui reglaj, deoarece greşelile de
includere, care pot fi comise pe parcursul transcrierii genetice, au valoarea unei
mutaţii. De aceea, funcţionarea fidelă a enzimei ARN-polimeraza în cadrul
transcrierii genetice joacă un rol important în desfăşurarea normală a activităţii
vitale a celulei.
Pentru ingineria genetică prezintă un mare interes cunoaşterea unor
particularităţi ale sintezei ARNm.
Sinteza acidului ribonucleic mesager (ARNm). ARNm este de mai multe
tipuri, câte unul pentru fiecare moleculă de proteină diferită. Moleculele de ARNm
au mărimi diferite, în dependenţă de cantitatea de informaţie transcrisă.
La procariote, molecula de ARNm conţine mesajul genetic al unei gene active
în sinteza proteică. Însă, deseori produsul imediat al transcrierii este un ARNm
policistronic, care cuprinde informaţia genetică a unor gene adiacente,
responsabile de sinteza proteinelor diferite. Fragmentele adiacente de ADN, care
codifică molecule unice de ARN sub controlul unui singur promotor, au fost
denumite operoni (fig. 2.4).
La eucariote, ARNm obişnuit este monocistronic. La nivelul nucleului,
secvenţa nucleotizilor din ADN (gena) este transcrisă în întregime într-o moleculă
precursoare de ARNm, numită pre-ARNm. După transcripţie, acest pre-ARN este
supus unor prelucrări posttranscripţionale (processing), cum sunt: tăierea în
segmente, modificarea chimică a unor baze azotate (metilarea, acetilarea,
adenilarea), excizia unor secvenţe din transcriptul primar sau adăugarea unor
secvenţe nucleotidice etc.
78
ARN-
polimeraza Debutul genei

Promotor succesiunea nucleotizilor din gen= Terminator

1. Ini\ierea
Nucleotide
ARN
de ARN

ARN-polimeraza

ADN-matrice
2. Elongarea ARN

Direc\ia de
transcrip\ie

3. Terminarea

Fig. 2.4. Transcripţia şi sinteza ARNm

(după R. Lewis, 2001).

În 1977, simultan în patru laboratoare de genetică din SUA, Elveţia, Franţa şi

Olanda, s-a stabilit că în celulele eucariote molecula de pre-ARNm este cu mult
mai lungă, decât molecula de ARNm matur ce se formează în urma prelucrării
posttranscripţionale. S-a pus în evidenţă faptul, că genele eucariote au o structură
mozaică ce cuprinde secvenţe care poartă informaţia genetică – regiuni
codificatoare denumite exoni, şi secvenţe lipsite de informaţie genetică – regiuni
necodificatoare denumite introni (fig. 2.5. Anexa).
Deci, o genă este constituită din mai mulţi exoni separaţi prin introni. În
medie, exonii şi intronii sunt constituiţi din 100-1000 de nucleotide. În timpul
prelucrării posttranscripţionale intronii sunt eliminaţi, pe când exonii sunt sudaţi
sub acţiunea unor enzime de tipul ligazei ARN, numite şi enzime de
sudare(splicing). Astfel, molecula de pre-ARNm, în urma prelucrării
posttranscripţionale, se transformă în ARNm matur, a cărui secvenţă de
ribonucleotizi va fi în final tradusă în secvenţa de aminoacizi din lanţul
polipeptidic. De la molecule de pre-ARNm foarte lungi (uneori 50000 de
nucleotide) se ajunge, prin eliminarea intronilor şi unirea exonilor, la molecule de
ARNm citoplasmatic cu lungimea de 500-3000 de nucleotide.

79
 Sinteza ARN-ului viral sau sinteza ARN-ului dependent de ARN . Biosinteza
ARN-ului prezintă unele particularităţi în funcţie de structura lui moleculară şi de
tipul de virus, căruia îi aparţine. Molecula de ARN viral se sintetizează prin
replicare în celula parazitată. Imediat după pătrunderea ARN-ului viral în celula-
gazdă, monocatena de ARN parentală (simbolizată “+”) se leagă de ribozomii
gazdei şi începe sinteza enzimei ARN-sintetază (ARN-replicaza), necesară pentru
replicarea ARN-ului viral. Molecula de ARN “+” serveşte ca matriţă pentru
sinteza catenei complementare “–” pe principiul împerecherii bazelor
complementare cu formarea punţilor de hidrogen, realizându-se pentru un anumit
timp un helix bicatenar de ARN, numit forma replicativă (Rf). În această structură,
ambele catene “+” şi “–” servesc drept matriţă pentru sinteza unor noi catene
complementare. Unele din catenele “+” nou-sintetizate acţionează ca ARNm,
determinând sinteza de replicază şi de proteine ale capsulei. Alte catene “+”, nu
este exclus că şi unele din acelea care au participat la sinteza proteinelor, sunt
încorporate în capsida proteinică a noilor particule fagice, constituind cromozomul
viral. În acest caz, ne întâlnim cu o dualitate în care aceeaşi moleculă de ARN
viral poate funcţiona atât ca ARNm, cât şi ca material genetic. În final se produce
liza celulei-gazdă şi eliberarea particulelor virale-fiice, în număr de 1000-10000,
dintr-o particulă parentală.
Sinteza ARN-ului la retroviruşi. Reverstranscripţia. La virusurile oncogene,
denumite retroviruşi, ce aparţin familiei R.troviridae, din care face parte şi virusul
ce produce la puii de găină boala cunoscută sub denumirea de sarcomul lui Rous –
RSV, replicarea ARN-ului viral se realizează printr-un mecanism descris în anul
1970 de către H.Temin, D.Baltimore şi H.Mizutani, numit reverstranscripţie.
Aceşti cercetători au descoperit că virionii unor asemenea viruşi conţin o enzimă
numită reverstranscriptază, inverstranscriptază sau revertază. Această enzimă are
proprietatea de a folosi ARN-ul oncovirusului ca matriţă, pe care sintetizează o
copie de ADN. Ulterior, monocatena de ADN este trecută în stare bicatenară, fiind
apoi integrată în genomul celulei-gazdă, sub formă de provirus. În procesul de
multiplicare celulară, ADN-ul proviral se replică sincron cu ADN-ul celulei-gazdă.
Sub influenţa diferiţilor agenţi (acţiunea razelor ionizante, a substanţelor mutagene
chimice, a medicamentelor, a stresului etc.), acest ADN complementar genomului
oncovirusului ARN, aflat în cromozomul celulei-gazdă, poate fi activat şi transcris
în molecule de ARN viral, care, după împachetare în capsida proteinică, devin noi
particule ale oncovirusului ARN.
Descoperirea procesului de reverstranscripţie, precum şi acţiunii enzimei
revertază, care catalizează acest proces, a avut o deosebită importanţă ştiinţifică
prin punerea în evidenţă a fenomenului de circulaţie inversă a informaţiei genetice
de la ARN la ADN, deschizând totodată posibilitatea sintezei artificiale de gene.
Descoperirea fenomenului de reversie i-a adus lui H.Temin în 1975 laurii
Premiului Nobel.
80
 2.1.2.4. Sinteza artificială a ARN-ului.
Metoda de sinteză a ARN-ului in vitro a fost elaborată pe baza cunoştinţelor
privind mecanismul sintezei ADN-ului in vivo. Sinteza ARN-ului artificial a fost
realizată pentru prima dată de M.Grumberg-Manago, P.Ortiz şi S.Ochoa în anul
1955. Pentru această reacţie s-au folosit următoarele componente: cele patru
ribonucleotide, enzimă ARN-polimeraza şi ioni de magneziu (Mg ++). Ca amorsă
(matriţă) pentru sinteza ARN-ului s-a folosit un ADN monocatenar. În urma
reacţiei s-a obţinut un tip de ARN artificial, care are aceeaşi structură chimică ca şi
cel natural.
Cercetările privind sinteza in vivo şi in vitro a ADN-ului şi ARN-ului au
demonstrat că mecanismele principale sunt aceleaşi: în ambele cazuri se respectă
principiul complementarităţii, fiind utilizaţi nucleozidtrifosfaţi, o matriţă
polinucleotidică şi un complex de enzime catalizatoare.

2.1.3. Codul genetic şi biosinteza proteinelor.

2.1.3.1 Codul genetic.
În anul 1953, la numai câteva luni după descoperirea structurii
macromoleculei de ADN, la Simpozionul de la Cold Spring Harbour (SUA) s-a
consemnat unanimitatea participanţilor în legătură cu ideea existentei unui cod
genetic, care asigură traducerea informaţiei genetice din limbaj de acid nucleic
într-un limbaj proteic.
Se ştie, că proteinele sunt alcătuite din lanţuri polipeptidice, formate din cei 20
de aminoacizi principali, dispuşi într-o succesiune specifică pentru fiecare
proteină. În legătură cu aceasta, apare întrebarea: în ce mod succesiunea celor 4
nucleotizi (A, G, C, T) din molecula de ADN determină succesiunea celor 20 de
aminoacizi din proteine?
Primul model teoretic al codului genetic a fost elaborat de către ciberneticianul
George Gamov în anul 1954. Potrivit concepţiei acestuia, codul genetic se bazează pe
cele patru baze azotate: adenina, guanina, citozina şi timina, indicate prin simbolurile
A, G, C şi T (A, G, C şi U la riboviruşi). Simbolurile folosite formează alfabetul. În
cazul că fiecare simbol ar reprezenta un cuvânt, codul ar fi foarte limitat (cod univoc
sau cod simplu) şi nu ar putea codifica decât 4 din cei 20 de aminoacizi. Prin urmare,
se admite ideea că, deşi alfabetul codului genetic conţine doar patru simboluri, în
cazul când ele participă în diferite combinaţii la alcătuirea cuvântului de cod, este
posibilă realizarea a numeroase grupe de cod sau “cuvinte”. Nici două simboluri nu
pot constitui un cuvânt de cod, pentru că cele patru simboluri luate câte două (4 2)
formează numai 16 combinaţii (cuvinte), rămânând necodificaţi 4 aminoacizi. Această
grupare constituie un cod dublu, ceea ce, de asemenea, este insuficient. Dacă pentru
cele patru simboluri se iau câte trei (4 3), se obţin 64 de combinaţii, ceea ce este mai
mult decât suficient pentru codificarea celor 20 de aminoacizi. Această grupare de
baze a fost denumită cod triplu.
81
 Ulterior, F. H. Crick şi colaboratorii (1961—1963), pe baza unor cercetări
detaliate, au dovedit că “cuvintele” în cod constau din grupuri alcătuite din trei
simboluri, respectiv, trei baze azotate. Grupul de câte trei baze azotate care
codifică, adică determină poziţia unui aminoacid în lanţul polipeptidic, a obţinut
denumirea de triplet sau codon. Faptul că unitatea funcţională a codului genetic
este un codon sau triplet de baze, a făcut să se utilizeze denumirea de cod triplet.
Codul genetic a fost definit drept limbaj biochimic care asigură corespondenta
dintre secvenţa nucleotizilor din molecula de ADN (respectiv ARNm) şi secvenţa
aminoacizilor incluşi în proteinele sintetizate. Cercetările ulterioare, efectuate de
către M.W.Nirenberg şi J.H.Mathey (1961), S.Ochoa (1963), au adus numeroase
dovezi experimentale privind codificarea informaţiei genetice, deci a relaţiei
nucleotide-aminoacizi.
După stabilirea componenţei diferitelor triplete de nucleotide (codoni)
funcţionale în determinarea poziţiei diferiţilor aminoacizi, s-a trecut la descifrarea
exactă a ordinii nudeotidelor din triplet.
F.H.Crick a propus alcătuirea unui tabel, în care să fie incluşi codonii şi
aminoacizii corespunzători, pe care îi determină (tab. 2.1.). Acest tabel reprezintă
dicţionarul codului genetic, în care codonii ARNm determină poziţionarea
aminoacizilor în catena polipeptidică. Codul genetic cuprinde 64 de codoni, din
care doar 61 specifică diferiţi aminoacizi. Trei dintre codoni nu specifică nici un
aminoacid, reprezentând codonii nonsens (UAA, UGA şi UAG), care joacă un rol
important în citirea mesajului genetic purtat de ARNm. Codonii nonsens se mai
numesc codonii stop, întrucât ei marchează sfârşitul mesajului genetic şi servesc ca
semnale pentru terminarea sintezei unei catene polipeptidice. Dintre cei 61de
codoni sens codificatori de aminoacizi, doi marchează începutul sintezei unui lanţ
polipeptidic şi anume AUG şi GUG.
Codul genetic are următoarele caracteristici: este degenerat, neacoperit şi fără
virgule, universal.
Codul genetic este degenerat în sensul, că unul şi acelaşi aminoacid poate fi
codificat de mai mulţi codoni.
Cercetările efectuate au constatat că aminoacizii înrudiţi metabolic sau
asemănători structural au adesea codoni asemănători sau apropiaţi. Referitor la
importanţa nucleotizilor din codon s-a stabilit, că primii doi sunt cei mai
semnificativi, în timp ce al treilea poate fi uşor înlocuit.
Codul genetic este neacoperit sau nesuprapus, în sensul că doi codoni vecini
nu au niciodată un nucleotid comun.
Una din caracteristicile codului genetic o constituie şi faptul, că mesajul
genetic, adică succesiunea de codoni din ARNm, se citeşte secvenţial, codon după
codon, fără semne de separare. Un astfel de cod se numeşte cod “fără virgule”.
O altă însuşire importantă este modul de descifrare a mesajului genetic conţinut
într-o succesiune de nucleotizi. S-a stabilit, că citirea informaţiei genetice se face

82
 Tabelul 2.1.
Codul genetic înscris în ARNm.

Prima A doua literă A treia

literă literă

într-un singur sens, astfel că absenţa unui singur nucleotid (deleţie) sau adăugarea
unui nucleotid (adiţie), schimbă în continuare sensul mesajului genetic.
Cea mai importantă caracteristică a codului genetic este universalitatea sa, în
sensul că aceiaşi codoni specifică aceiaşi aminoacizi la toate organismele vii,
indiferent de poziţia pe care o ocupă pe scara evoluţiei.
Universalitatea codului genetic impune ideea că toate organismele vii, ce au
trăit şi trăiesc pe Terra, provin în mod nemijlocit dintr-un singur strămoş iniţial,
care a apărut în urma unui îndelungat proces de evoluţie a materiei.
2.1.3.2. Etapele biosintezei proteinelor.
În procesul de biosinteză a proteinelor se realizează ultima etapă a transferului
informaţiei genetice, conţinută în secvenţa de nucleotizi din ADN. Ea este
transcrisă sub formă de mesaj genetic în ARNm, iar acesta este translat, respectiv
decodificat, prin intermediul ribozomilor dintr-o secvenţă de triplete într-o
secvenţă de aminoacizi ce se includ într-un lanţ polipeptidic.
83
 Biosinteza proteică cuprinde, propriu-zis, două etape importante: transcripţia
şi translaţia informaţiei genetice (fig.2.6).

Celula
ADN-polimeraza
Nucleul

ADN ADN
Replicarea

ADN
ARN - polimeraza
Transcrip\ia
ADN ADN

ARNr
ARNt ARNm

ARNm

Transla\ia

Aminoacizi
Ribozomul

Enzim= Lan\ polipeptidic

Citoplasma

Fig.2.6. Schema generală a sintezei proteinelor

Transcripţia, aşa cum s-a menţionat anterior, reprezintă fenomenul prin care
are loc transcrierea informaţiei genetice de pe o porţiune din catena de ADN, în
lanţul polinucleotidic al ARN-ului. Prin transcripţie se sintetizează cele trei tipuri
de ARN: ARNm, ARNt (sau ARNs) şi ARNr. După sinteză, ARN migrează din
nucleu în citoplasmă. Moleculele ARNm sunt acelea, care copiază şi transferă
mesajul genetic de la nivelul ADN-ului, pentru a putea fi tradus în citoplasmă în
procesul biosintezei proteinelor. Celelalte tipuri de ARN nu vor fi translate, însă
vor participa nemijlocit la traducerea informaţiei genetice purtată de ARNm.
Translaţia genetică reprezintă mecanismul prin care secvenţa codonilor din
ARNm este tradusă într-o anumită succesiune de aminoacizii incluşi în lanţul
polipeptidic ce se sintetizează. Acest proces necesită participarea unui aparat
biochimic complex, ai cărui principali componenţi sunt: ARNm, diferite tipuri de
84
ARN (corespunzătoare tipurilor de aminoacizi), ribozomi, aminoacizii, un
complex de enzime activatoare şi factorii energetici.
În decodificarea mesajului genetic, ribozomilor le revine un rol primordial, ei
asigurând interacţiunea codon din ARNm – anticodon din ARNt. Integritatea
structurală şi funcţională a ribozomilor condiţionează citirea şi traducerea corectă a
informaţiei genetice într-o secvenţă de aminoacizi în catena polipeptidică.
La organismele eucariote, ribozomii activi în sinteza proteică au o constanţă
de sedimentare de 80S; la cele procariote de 70S.
Mecanismul biochimic al translaţiei poate fi împărţit în următoarele etape
principale:
a) activarea enzimatică a aminoacizilor. Aminoacizii prezenţi în mediul
celular sunt activaţi cu ajutorul ATP, reacţia fiind catalizată de enzima
aminoacil ARNt – sintetază, numită şi aminoacil ARNt – ligază şi care este
specifică fiecărui aminoacid. În urma acestei reacţii rezultă un complex
aminoacil ARNt (AA-ARNt). Enzima activatoare aminoacil ARN-sintetază
joacă un rol dublu: de activare a aminoacizilor şi de recunoaştere a ARNt
specific pentru fiecare aminoacid. Este un fapt bine stabilit că, deşi sunt
mai multe tipuri de ARN pentru acelaşi aminoacid (fenomen condiţionat de
caracterul degenerat al codului genetic), există doar o singură enzimă
aminoacil ARN – sintetază pentru fiecare aminoacid. Reacţia de
“încărcare” a diverselor tipuri de ARNt cu aminoacizii caracteristici lor
prin formarea de complexe aminoacil – ARNt, este un proces ce se
desfăşoară cu o precizie remarcabilă. Ataşarea greşită a unui aminoacid la
ARNt, altul decât cel care este specific acelui ARNt, va fi exclusă prin
intervenţia aceleiaşi enzime aminoacil ARNt – sintetază, care manifestă o
activitate de corecţie, recunoscând această “greşeală” şi hidrolizând
legătura dintre aminoacidul eronat ataşat şi ARNt;
b) iniţierea translaţiei. La această etapă, complexul aminoacil ARNt migrează
spre ribozomi şi se plasează pe locul indicat de codul ARNm şi recunoscut
de cealaltă extremă a ARNt, adică regiunea anticodon. Reacţia dintre
ARNm şi ARNt constă, de fapt, în descifrarea de către anticodonii de pe
ARN a codului purtat de ARNm, pe principiul complementarităţii, ceea ce
duce, în final, la poziţionarea aminoacizilor într-o anumită succesiune în
proteinele sintetizate. După fixarea aminoacidului, ARNt devine liber,
capabil de a transporta noi aminoacizi la locul de sinteză.
Procesul de iniţiere a lanţului polipeptidic începe cu formarea complexului de
iniţiere, alcătuit din subunitatea mică a ribozomului, trei factori de iniţiere de natură
proteică (IF1, IF2, IF3), ARN-formil metionină la bacterii şi ARNt-metionină la
eucariote. În timpul formării complexului de iniţiere, ARNm se leagă, prin secvenţa
lider, aflată la capătul “S”, de subunitatea mică (30S) a ribozomului. Ulterior, are loc
ataşarea subunităţii ribozomale 50S, constituindu-se unităţi ribozomale întregi

85
(70S), funcţionale în procesul de biosinteză a proteinelor. Cercetările recente
asupra ribozomilor au arătat, că ribozomul 70S conţine trei cavităţi sau situri:
aminoacil (A), peptidil (P) şi de ieşire-exit (E). În situl A pătrunde animoacil-
ARNt, corespunzător codului din ARNm. Situl P acceptă complexul aminoacil-
ARNt, numai dacă acesta a realizat recunoaşterea codon-anticodon.
S-a relevat faptul, că sinteza lanţului polipeptidic aproape în toate cazurile este
iniţiată de un tip special de i ARNtmet ce diferă de omologul său ce interacţionează
cu codonii AUG sau GUG, care specifică metionina;
c) elongarea sau creşterea lanţului polipeptidic. În procesul sintezei proteice
complexul de iniţiere i ARNt met se află în situl P, iar în situl A se fixează
succesiv un alt complex aminoacil ARNt. Odată cu ocuparea sitului A,
începe etapa de alungire a lanţului. Între aminoacizi se stabilesc legături
sau punţi peptidice între gruparea carboxil (-COOH) a unui aminoacid şi
gruparea amino (-NH2) a altui aminoacid, cu eliminarea unei molecule de
apă.
În timpul sintezei proteice, moleculele ARNm se mişcă de-a curmezişul
ribozomilor, plasând codonii succesivi într-o poziţie ce le permite să-şi aleagă
complexele corespunzătoare de aminoacil ARNt. Ribozomii orientează
complexele AA-ARNt, precum şi moleculele de ARNm ce servesc ca matrice în
aşa mod, încât mesajul genetic să fie citit pe triplete, iar lanţul polipeptidic în curs
de creştere să fie eliberat normal. Creşterea catenei polipeptidice se efectuează
treptat prin adăugarea succesivă a unui singur aminoacid. Formarea de punţi
peptidice succesive determină polimerizarea aminoacizilor, adică includerea lor
într-un lanţ polipeptidic, care reprezintă structura primară a proteinei. Formarea
legăturilor peptidice este catalizată de acţiunea enzimei peptidil-polimerază.
După ce un ribozom a asigurat traducerea a circa 25 de codoni, capătul 5′ al
ARNm devine liber spre a forma cel de al doilea complex de iniţiere şi, astfel, al
doilea ribozom se angajează în translaţie spre a asigura sinteza la al doilea lanţ
polipeptidic, apoi la al treilea, la al patrulea ş.a.m.d., aşa încât, la un moment dat,
aceeaşi moleculă de ARN este asociată cu mai mulţi ribozomi, formând agregate
denumite poliribozomi sau polizomi. Numărul ribozomilor din polizomi variază în
funcţie de lungimea moleculei de ARNm şi de masa moleculară a proteinelor pe
care le specifică (de la 4-6 până la 14-20 ribozomi);
d) terminarea translaţiei. Prin terminarea translaţiei se înţelege oprirea
ciclului de încorporare aminoacidică într-un lanţ polipeptidic. Terminarea
lanţului polipeptidic este semnalată de codonii stop sau nonsens: UAA,
UAG, UGA. Ca urmare, catena polipeptidică se detaşează de ribozomi şi
de catena de ARNm, care a încorporat ultimul aminoacid în proteina
sintetizată.
86
 Catenele polipeptidice ce rezultă în procesul de translaţie sunt formaţiuni
nefuncţionale, având o structură primară liniară. În transferul de informaţie genetică,
până la expresia genetică finală, polipeptidele precursoare (primare) constituie
substratul necesar al prelucrărilor prin care se formează proteinele “mature”
funcţionale. În cadrul proceselor de prelucrare are loc o spiralizare a lanţului
polipeptidic primar şi formarea structurii secundare, apoi terţiare şi cuatenare,
modificări care au drept rezultat producerea de proteine finisate, biologic active.
2.1.3.3. Dogma centrală a geneticii.
Exprimarea materialului genetic se realizează în procesul de biosinteză a
proteinelor, prin care se înfăptuieşte cea de a doua funcţie a genei, funcţia
heterocatalitică.
Gena, sau materialul din care este format un segment de ADN, nu participă şi
nu serveşte direct ca matrice pentru sinteza unui lanţ polipeptidic specific. După
cum s-a demonstrat, mesajul genetic din ADN este transmis mai întâi, ca rezultat
al procesului de transcripţie, unor molecule de ARNm care, la rândul lor,
îndeplinesc funcţia de matriţe intermediare ce determină, prin translaţie,
poziţionarea aminoacizilor într-un lanţ polipeptidic. Poziţia ADN-ului în raport cu
ARN-ul şi cu proteinele în procesul de transmitere a informaţiei genetice
reprezintă esenţa “dogmei centrale a geneticii”, avansată de F.Crick în 1956, fiind
exprimată prin formula:
replicare – transcripţie – translaţie
ADN  ARN Proteină
Această concepţie a dăinuit în biologie până la descoperirea, în anul 1970, a
fenomenului de reverstranscripţie. Transcrierea inversă a informaţiei genetice de
la ARN la ADN a fost pusă în evidenţă de către H.Temin, D.Baltimare şi
H.Mizutani la grupul de virusuri oncogene la animale.
În legătură cu descoperirea reverstranscripţiei, astăzi dogma centrală a
geneticii moleculare este exprimată astfel:
ADN ARNProteină

Genetica nu dispune de date experimentale, care ar confirma posibilitatea
transmiterii informaţiei genetice de la:
Proteină ARN ADN
Proteină Proteină
În ultimul timp, s-a observat transmiterea mesajului genetic de la ADN
nemijlocit la proteine, fără participarea ARNm. Este adevărat, acest fapt a fost
relevat numai in vitro, în condiţii de laborator. S-a constatat, că unele antibiotice
(streptomicina, neomicina), reacţionând cu ribozomii, modifică proprietăţile lor în
aşa fel, încât în loc de ARNm, ribozomii utilizează în calitate de matriţă ADN-ul
monocatenar. În condiţii naturale un asemenea mod de transfer al informaţiei
genetice e puţin probabil.
87
 2.1.3.4. Reglarea genetică a sintezei de proteine.
Reglajul activităţii genice la procariote. Concepţia reglajului genetic la
procariote a fost formulată de geneticienii francezi F. Jacob, A. Lwoff şi J. Monod,
în anul 1961. Ei au demonstrat, experimental, că tipul (specificitatea) şi frecvenţa
proceselor celulare sunt reglate de activitatea unor gene specifice, care controlează
reacţiile biochimice individuale, sau de un grup de gene asociate, care controlează
desfăşurarea unei reacţii particulare.
F. Jacob şi J. Monod au descoperit mai multe căi de reglare genică a sintezei
proteice:
– inducţia enzimatică;
– represia enzimatică;
– retroinhibiţia enzimatică.
Inducţia enzimatică este proprietatea celulelor de a produce enzimele necesare
pentru metabolizarea substanţelor care, de obicei, nu sunt prezente în mediu.
Enzimele ce intervin la catalizarea diferitelor reacţii ale metabolismului au fost
împărţite în două categorii: enzime adaptive şi enzime constituitive. Cantitatea şi
activitatea enzimelor sau proteinelor adaptive variază considerabil în funcţie de
prezenţa sau absenţa în mediu a unor substanţe specifice. Pentru enzimele sau
proteinele constituitive este caracteristică o cantitate şi activitate aproape
constantă, nefiind influenţate de factorii mediului, deci se produc încontinuu.
Fenomenul de inducţie enzimatică se realizează numai în prezenţa în mediu a
substratului sau inductorului, iar enzimele corespunzătoare lor au fost numite
enzime inductibile. Majoritatea enzimelor inductibile au un rol catabolic, fiind
implicate în degradarea unor substanţe provenite din mediu şi folosite ca surse de
energie sau la producerea unor fragmente moleculare necesare în procesele de
biosinteză.
Represia enzimatică este un fenomen care constă în inhibarea sintezei
proteice, datorită unui produs final al unui lanţ metabolic denumit represor. Acest
fenomen mai este cunoscut şi sub denumirea de adaptare enzimatică negativă.
Represorul este o substanţă, care are însuşirea de a împiedica sinteza unei sau
a mai multor proteine în urma blocării uneia sau a mai multor gene. În general,
celulele conţin un număr mare de represori, care condiţionează inactivitatea
diferenţiată a unor gene. Producerea lor încetinează, când concentraţia
intracelulară a unor metaboliţi creşte. Substanţele capabile să modifice activitatea
represorului au fost denumite efectori. În dependenţă de sensul acţiunii lor,
efectorii pot fi inductori, când inhibă activitatea represorului, şi corepresori, când
intensifică acţiunea represorului în procesul sintezei proteice.
Retroinhibiţia enzimatică, denumită şi inhibiţie prin feedback, reprezintă un alt
sistem de control al sintezei proteice, care constă în blocarea (inhibarea) activităţii

88
catalitice a unei enzime, în urma interacţiunii cu produsul final al acesteia. În cazul
unui lanţ metabolic, există mai multe etape, fiecare fiind catalizată de o anumită
enzimă, rezultând un produs final. Când produsul final este în surplus, el
acţionează asupra enzimei din prima treaptă a lanţului metabolic şi întreaga cale
metabolică este blocată.
Retroinhibiţia şi represia enzimatică au acelaşi rezultat al acţiunii şi anume
blocarea funcţionării operonului. Dar există diferenţe de esenţă între aceste două
mecanisme. În cazul represiei enzimatice, proteina reglatoare (represorul)
acţionează nemijlocit asupra unei gene, în timp ce în cazul retroinhibiţiei produsul
final al unei căi metabolice blochează desfăşurarea ei prin interacţiunea cu prima
enzimă a acestei căi metabolice.
Reglarea genetică a sintezei proteice prin inducţie şi represie. Pe baza
cercetărilor efectuate asupra locusului lac (lactoza) de la E.coli, privind
fenomenele de inducţie şi represie enzimatică, F. Jacob şi J. Monod (1961) au tras
concluzia că reglarea sintezei proteice este de natură genetică şi se realizează la
nivelul transcripţiei. Ei au clasificat genele în trei categorii: gene structurale, gene
reglatoare şi gene operatoare.
Genele structurale sunt segmente ale moleculei de ADN, ce conţin informaţia
genetică pentru sinteza unor polipeptide în celulă.
Genele reglatoare sunt segmente ale moleculei de ADN, care conţin
informaţia genetică pentru sinteza represorilor specifici ce controlează activitatea
genelor structurale.
Genele operatoare reprezintă elemente genetice care controlează iniţierea sau
blocarea sintezei proteinelor prin intermediul interacţiunii lor cu represorii. O genă
operatoare are o funcţie dublă: pe de o parte, primeşte “semnalele” genelor
reglatoare, iar pe de altă parte, le exteriorizează printr-o acţiune asupra genelor
structurale.
Genele reglatoare şi genele operatoare se mai numesc şi gene de control.
Jacob şi Monod au stabilit modul de interacţiune a genelor de control şi a
celor
structurale şi au propus modelul privind reglarea genetică a sintezei proteice prin
inducţie şi represie. Ei au emis ipoteza, conform căreia moleculele de ADN sunt
constituite din unităţi de transcripţie denumite operoni. Un operon reprezintă un
segment al ADN-ului, alcătuit din următoarele subunităţi dispuse în ordinea ce
urmează: promotorul (P), operatorul (O) şi genele structurale.
Promotorul reprezintă o secvenţă de nucleotide din macromolecula de ADN,
care serveşte ca loc de recunoaştere pentru enzima ARN-polimerază, determinând
astfel iniţierea transcripţiei.
Operatorul se află înaintea genelor structurale, reprezentând o regiune
a macromoleculei de ADN, care poate exista în două stări: închis-blocată

89
sau deschis -deblocată. În stare blocată, operatorul nu permite trecerea ARN-
polimerazei spre genele structurale pentru realizarea transcripţiei. Când operatorul
se află în stare deblocată, enzimă ARN-polimeraza are acces la genele structurale
şi se realizează transcrierea lor.
Alături de operon sunt situate genele reglatoare, ce sintetizează represorii prin
care controlează activitatea genelor de structură. Starea operatorului este
dependentă de asocierea sau neasocierea sa cu represorul. Când represorul este
activ, el se cuplează cu operatorul şi blochează sinteza ARN-ului de-a lungul
genelor structurale. Când, însă, represorul este inactiv (în urma interacţiunii cu
inductorul – produsul final al căii metabolice considerate), operatorul şi
promotorul iniţiază transcripţia ARNm, deci sinteza proteică.
În sistemele inductibile represorul este inactivat de către inductor şi, ca
urmare, genele structurale ale operonului se includ în procesul de transcripţie a
ARNm şi de sinteză a proteinei .

Reglajul activităţii genelor la eucariote. Reglajul genetic la eucariote are un

caracter mult mai complex, pe de o parte, datorită faptului că genomul conţine un
număr foarte mare de gene (câteva zeci de mii), iar pe de altă parte, din cauza că în
celulele diferenţiate în cursul ontogenezei funcţionează simultan anumite gene,
majoritatea însă fiind inactivă.
Activitatea genelor la eucariote este controlată în procesul descifrării
mesajului genetic la trei niveluri:
a) reglajul la nivelul transcripţiei se manifestă prin faptul că proteinele
cromozomale se cuplează cu un fragment din macromolecula de ADN, de
pe care trebuie să fie transcrisă informaţia genetică, blocând, în felul
acesta, sinteza ARNm;
b) reglajul la nivelul translaţiei se manifestă prin degradarea ARNm-ului de
către enzime (nucleaze), localizate pe ambele părţi ale membranei
nucleare;

c) reglajul posttranscripţional se efectuează la nivelul lanţurilor polipeptidice

în urma intervenţiei unor factori ce blochează agregarea monocatenelor
pentru a forma structura catenară a proteinelor, care este cea funcţională.
La eucariote se deosebesc două tipuri de reglare a activităţii genelor: reglare
genetică pe termen scurt şi reglare genetică pe termen lung.
Reglarea pe termen scurt se realizează la nivelul transcripţiei genetice. Ea este
reversibilă, controlând modificările în rata sintezei intracelulare de proteine
enzimatice sau structurale, de hormoni, precum şi variaţiile în intensitatea
proceselor de sinteză ale ADN-ului şi ARN-ului. Reglarea genetică pe termen lung
este ireversibilă. Ea controlează procesele legate de citodiferenţiere, desfăşurate în
cadrul dezvoltării individuale, pornite iniţial de la un ou fecundat şi ajungând la
90
creşterea şi dezvoltarea unui individ cu circa trei miliarde de celule, ce formează
circa 100 de tipuri diferite de celule în cazul organismului uman.
În concluzie, se poate menţiona că controlul expresiei genelor se realizează de
către mai multe mecanisme, pe mai multe căi.

2.2. Metodele utilizate în ingineria genetică

Manipularea artificială a genelor pentru obţinerea de organisme transgenice a

devenit posibilă prin inginerie genetică sau tehnologia ADN-recombinat.
Tehnologia ADN-recombinat cuprinde următoarele metode şi tehnici moderne:
– izolarea ADN şi secvenţierea rapidă a nucleotidelor, tăierea macromolecu-
lelor de ADN cu ajutorul enzimelor de restricţie,
– hibridarea moleculară a ADN şi ARN, donarea ADN şi amplificarea
genelor, transferul de gene în mod direct sau cu ajutorul unor vectori etc.

2.2.1. Izolarea ADN.

Pentru realizarea manipulării artificiale a genelor, primul pas constă în

izolarea moleculelor de ADN de diferite dimensiuni. Izolarea ADN este relativ
dificilă, datorită faptului că adesea el este cuplat cu diferite proteine histonice şi
nonhistonice, cu ARN, lipide şi zaharuri. La organismele eucariote, ADN se
izolează, de obicei, prin centrifugarea nucleilor. Această manipulare permite
obţinerea ulterioară de ADN, fără ca acesta să fie contaminat de cel citoplasmatic,
din mitocondrii şi cloroplaste. În continuare se realizează digestia enzimatică a
ARN şi a moleculelor proteice, iar ADN este precipitat.
În cazul bacteriilor, celulele sunt înconjurate cu perete celular şi membrană
plasmatică. De aceea, suspensia celulară este tratată cu enzima lizozimă şi cu
diferiţi detergenţi, cum este, de exemplu, sodium dodecil sulfatul. În acest fel,
peretele celular şi membrana plasmatică sunt degradate şi conţinutul celular este
eliberat, după care, prin digestie cu diferite enzime, este solubilizat ARN şi
proteinele celulare, iar ADN este obţinut prin precipitare.
Pentru izolarea ADN plasmidial, se utilizează ultracentrifugarea în soluţii de
CsCl care conţin ethidium bromid. Prin intercalarea acestei substanţe între
perechile de nucleotide ale ADN, se realizează reducerea densităţii ADN, mai
puternică la moleculele lineare şi mai redusă pentru ADN circular-plasmidial.
În unele cazuri, izolarea de gene se poate porni de la ARNm al genei
respective. Utilizând proprietăţile enzimei reverstranscriptaza se obţine mai întâi o
copie de ADNc, după care, cu ajutorul unor alkalini, este eliminat ARN şi prin
intermediul ADN-polimerazei se obţine ADN dublu-catenar.
91
 2.2.2. Secvenţierea nucleotidelor acizilor nucleici.
Secvenţierea moleculelor de acizi nucleici s-a realizat în perioada anilor ‘60 la
Universitatea Cornele în SUA.
R.Holley şi colaboratorii au folosit diverse enzime care rup molecula de
ARN în bucăţi tot mai mici, astfel că au realizat decodificarea exactă a acestei
molecule.
Secvenţierea rapidă a fragmentelor de ADN a fost pusă la punct în anii ‘70.
Au fost secvenţiate zeci de milioane de secvenţe de ADN, cum este genomul
virusului Epstein-Barr, genomul cloroplastului la plante, sau mai mulţi cromozomi
din genomul drojdiei. Tehnica aceasta este foarte rapidă, încât pentru a cunoaşte
structura unei proteine, este mai simplă determinarea secvenţei nucleotidelor genei
respective. Tehnica de secvenţiere se bazează pe:
– obţinerea de ADN monocatenar;
– plasarea ADN pe un gel de acrilamidă sau agaroză pentru a separa cu
ajutorul electroforezei fragmentele de ADN, după lungime, mobilitatea lor
fiind invers proporţională cu lungimea.
Pentru secventierea ADN-ului sunt folosite următoarele metode:
a) metoda chimică, prin care un agent chimic distruge preferenţial una din
cele 4 baze azotate. Prin acest tratament pot fi distruse, de exemplu, numai
nucleotidele care conţin adenina (A), obţinându-se astfel o familie de fragmente
ADN, care reflectă locusurile de plasare ale bazei azotate – adenina. Aceste
fragmente sunt separate prin electroforeză, în gel, şi detectate prin autoradiografie;
b) tehnica Maxam-Gilbert, care constă în marcarea capătului 3′ al moleculei
ADN cu 32P, după care se clivează ADN şi se izolează un fragment, apoi se separă
cele două catene ale ADN pentru a obţine o populaţie de catene identice, marcate
la un capăt. În continuare, amestecul se împarte în 4 probe, fiecare fiind utilizată
pentru acţiunea la diverşi reactivi, care distrug una sau două baze azotate. Rezultă
un amestec de fragmente de mărimi diferite, având la un capăt 32P. Aceste
fragmente sunt apoi separate în gel, astfel că ele pot fi aranjate în ordine după
mărime, iar bazele distruse pot fi determinate prin notarea ordinii benzilor, în
funcţie de mărime. Secvenţierea ADN poate fi, astfel, realizată prin simpla citire a
succesiunii benzilor pe gel;
c) metoda enzimatică. În acest caz, fragmentul ADN este folosit ca matriţă
pentru sinteza ADN in vitro cu ajutorul enzimei ADN-polimerază. În acest scop,
se folosesc didezoxiribonucleotid trifosfaţi, în care grupul dezoxiriboza 3’-OH,
prezent în molecula normală, este absent. Când o astfel de moleculă modificată
este încorporată în ADN, ea blochează adiţia nucleotidei următoare. Deci, fiecare
catenă nou sintetizată de ADN cu ajutorul ADN-polimerazei, va fi stopată

92
probabilistic în locusul A (adeninei). Astfel sunt generate o mulţime de fragmente
ADN, la fel ca în cazul metodei chimice. Aceste fragmente sunt detectate prin
marcare chimică sau radioactivă;
d) tehnica “plus-minus”, care constă în utilizarea enzimei ADN-polimerază
pentru a mări lungimea segmentelor ADN. F. Songer a elaborat o tehnică mai
eficientă care utilizează ADN monocatenar şi nucleotide dideoxi, cărora le lipseşte
un grup hidroxil. Respectivele molecule de trifosfat pot fi încorporate într-un lanţ
polinucleotidic în creştere, însă ele blochează creşterea de mai departe a lanţului,
datorită absenţei hidroxilului care asigură legătura cu nucleotida următoare. Cu
ajutorul a 4 tuburi de reacţie, fiecare conţinând o mică cantitate din cele 4
nucleotide trifosfat, secvenţa ADN poate fi descifrată prin examinarea dimensiunii
fragmentelor obţinute, după fiecare reacţie pe gel de acrilamidă.
În ultima vreme au fost construite aparate automate de secvenţiere, care sunt
foarte eficiente, sporind considerabil posibilitatea de manipulare a informaţiei
genetice. De asemenea, au fost create aparate automate pentru a sintetiza segmente
de ADN cu o secvenţă cunoscută de nucleotide, fapt, care oferă posibilitatea de a
sintetiza artificial genele de interes. Elaborarea acestor metode moderne au
condiţionat progrese importante în secvenţierea genomului la diverse specii de
procariote şi eucariote.

2.2.3. Enzime de restricţie folosite pentru fragmentarea ADN.

Prima enzimă de restricţie a fost izolată de la bacteria Haemophilus
influente , pornind de la observaţia lui H. Smith (1970), care a reuşit să izoleze
ADN-ul unui fag pătruns în bacterie, şi care foarte rapid a fost rupt în bucăţi.
Enzimele de restricţie sunt capabile să “taie” moleculele de ADN în anumite
locusuri de recunoaştere. În tabelul 2.2 sunt prezentate câteva enzime de restricţie
sau endonucleaze de restricţie, originea lor şi secvenţele de nucleotide de
recunoaştere.
Enzimele de restricţie sunt produse de către bacterii, care îşi protejează celula
proprie de atacul viral, prin degradarea ADN viral. Fiecare enzimă, de acest fel,
recunoaşte o secvenţă de 4-8 nucleotide. Aceste secvenţe se pot găsi şi în genomul
bacterian, dar ele sunt protejate prin metilarea nucleotidelor A (adenină) sau C
(citozină). În prezent, peste 100 de endonucleaze de restricţie sunt comercializate,
fiind identificate câteva sute de enzime de restricţie de origini diferite.

Unele enzime de restricţie taie molecula de ADN decalat cu câteva nucleotide,

în aşa fel, că rămân margini adezi (cohesive ends) la fiecare capăt, unde pe bază de
complementaritate se pot lega segmente de ADN între ele. Astfel, se pot obţine
molecule de ADN-recombinat.

93
 Tabelul 2.2.
Endonucleaze de restricţie

Enzime Microorganismul Secvenţa de recunoaştere

de restriţie de origine

5′….GGCC…..3′
Hae III Haemophilus aegytius
3′…..CCGG….5′

5′….GATATC ….3′
Eco RV Escherichia coli
3′….CTATAG….5′
5′….GAATTC….3′
Eco RI Escherichia coli
3′….CTTAAG….5′
5′….T CGA….3′
Taq l Thermus aquaticus
3′….AGCT….5′
5′….GCGGCCCGC…..3′
Notl Nocardia otitidis-caviarum
3′…..CGCCGGGCG…..5′

Prin acţiunea mai multor enzime de restricţie se realizează aşa-numitele hărţi

de restricţie, prin care pe genomul respectiv sunt plasate succesiv locusurile de
recunoaştere a diferitelor enzime de restricţie. Prima hartă de restricţie a fost
realizată de D. Nathans (1971) la virusul simian (SV 40). Se pot astfel compara
aceleaşi regiuni ale ADN de diferite origini. Aşadar, cu ajutorul enzimelor de
restricţie, într-un anumit fragment de ADN poate fi localizată o anumită genă.
Izolarea fragmentelor de ADN, obţinute sub acţiunea unei anumite enzime de
restrictie, se realizează prin electroforeză. În ingineria genetică, se utilizează un tip
special de electroforeză – cea pe gel de agaroză sau de poliacrilamidă.
Tehnica electroforezei în gel permite separarea fragmentelor de ADN de
diferite mărimi. Metoda este mai simplă decât pentru proteine, deoarece fiecare
nucleotidă în ADN sau ARN posedă o singură sarcină electrică negativă. Benzile
de ADN pe agaroză sau gel de poliacrilamidă sunt invizibile, de aceea ele trebuie
expuse acţiunii ethidium bromidului, care devine fluorescent în UV atunci, când se
cuplează cu ADN.
O tehnică mai sensibilă constă în încorporarea unui radioizotop în ADN
înaintea electroforezei. De obicei, se utilizează 32P, care este încorporat în fosfatul
din ADN şi emite particule beta (β) care pot fi detectate prin autoradiografie.
Prin utilizarea succesivă a diferitelor enzime de restricţie, fiecare având un alt
locus de recunoaştere a unei secvenţe de nucleotide, este posibilă separarea

94
diverselor fragmente de nucleotide, care pot fi izolate electroforetic în gel de
poliacrilamidă. Se poate stabili, astfel, o anumită ordine a locusurilor de restricţie
în molecula de ADN, apare posibilitatea de a elabora o hartă de restricţie, adică un
alt tip de hartă cromozomială.

2.2.4. Hibridarea moleculară a acizilor nucleici.

La ADN bispiral bazele complementare se separă şi ADN devine monocatenar
prin încălzirea unei soluţii de ADN la 100°C sau prin expunere la un pH mai mare
sau egal cu 13. În felul acesta, se efectuează denaturarea ADN. Catenele sunt
capabile să se reunească la 65°C timp îndelungat, proces denumit renaturarea
ADN. În acest mod, se poate realiza hibridarea ADN/ADN, ADN/ARN sau
ARN/ARN conform principiului de complementaritate a bazelor. Deoarece între
perechile de baze G-C sunt trei legături de hidrogen, iar între cele A-T sunt numai
două, devine posibilă separarea moleculelor de ADN cu conţinut diferit de perechi
de baze G-C şi, respectiv, A-T. ADN-ul care are un conţinut relativ ridicat de
perechi de baze A-T, se denaturează la o temperatură mai joasă decât cel bogat în
perechi de baze G-C. Folosind tehnica de denaturare a ADN-ului se poate realiza
hibridarea moleculară in situ, fapt care permite localizarea genelor pe cromozomi
direct pe preparate microscopice. Tehnica constă în următoarele: se efectuează
preparate microscopice “squash”, după care se realizează denaturarea ADN-ului
cu un tratament uşor alcalin, care rupe legăturile de hidrogen, iar catenele de ADN
sunt prezervate de renaturare prin intermediul unui tratament cu formamide. În
continuare, ARN marcat radioactiv cu uridină tritiată se foloseşte pentru incubarea
preparatelor. După un timp, suficient pentru hibridarea moleculară, ARN-ul rămas
nehibridat se elimină prin tratament cu ribonuclează. Apoi, prin tehnica
microautoradiografiei, se utilizează o emulsie fotografică, care se aplică pe
preparate pentru a identifica hibrizii ADN-ARN marcaţi radioactiv. Probele de
ADN pot fi marcate radioactiv sau chimic, astfel că ele nu vor hibrida decât cu
secvenţe complementare. Locusurile, astfel marcate radioactiv, pot fi evidenţiate
prin autoradiografie, iar cele marcate chimic prin colorare diferenţiată.
Tehnica hibridării fluorescente in situ (FISH=Fluorescence In Situ
Hibridization). Sondele moleculare pot fi, în prezent, marcate prin procedee
neradioactive. Principiul metodei se bazează pe legarea de ADN-ul sondei, fie a
biotinei, fie a unei haptene (de pildă, digoxigenina), care le face vizibile după
hibridare, de exemplu, cu un anticorp marcat cu un fluorocrom. De obicei,
semnalul respectiv este fluorescent. Denumirea metodei a fost extinsă şi în cazul
absenţei fluorescenţei, când este vorba de hibridare in situ cu un marker oarecare.
Metoda permite vizualizarea simultană a mai multor sonde marcate de fluorocromi
diferiţi. Rezultatele se obtin în câteva zile, în loc de câteva săptămâni prin
marcajul in situ radioactiv.
95
 Aplicarea metodei FISH permite vizualizarea unor ţinte unice de ordinul l kb,
cu ajutorul unor sonde mici. Datorită acestei metode, poate fi identificată o genă
pe cele două cromatide – surori. De regulă, metoda FISH se utilizează pentru
marcarea unor ţinte mai mari, prin utilizarea unor sonde mai mari, cum sunt
cosmidele, YAC (Yeast Artificial Chromosome) şi chiar a unor cromozomi sau
fragmente cromozomiale translocate.
Metoda FISH poate fi utilizată în următoarele scopuri:
– pentru identificarea unor cromozomi sau a unor segmente cromozomiale, de
exemplu, după un tratament radioactiv, când se realizează numeroase
macroleziuni, la nivel cromozomial;
– pentru marcarea fluorescentă a cromatinei interfazice şi localizarea anumitei
gene;
– pentru identificarea precisă a cromozomilor, în cazul hibridării celulare
somatice interspecifice.
S-a constat că hibridarea acizilor nucleici este o metoda extrem de sensibilă,
cu mari posibilităţi:
a) chiar şi în cazul prezenţei unei singure molecule complementare per celulă,
se poate realiza hibridarea;
b) poate estima câte copii ale unei anumite secvenţe de nucleotide sunt
prezente per genom;
c) se poate determina dacă o anumită genă este activă, prin hibridarea cu
ARNm a genei respective.

2.2.5. Analiza ADN şi ARN prin metoda “Petelor”.

Pentru analiza structurii genomului şi genelor ADN sunt folosite următoarele
metode:
– metoda petelor lui Southern;
– metoda petelor Nothern;
– metoda petelor Western.
Metoda petelor lui Southern a fost elaborată de către E.M.Southern (1975) şi
este cunoscută în literatura de specialitate sub denumirea de “Southern blotting”.
Iniţial, genomul ADN este “tăiat” prin acţiunea uneia sau a mai multor enzime de
restricţie în fragmente numeroase ce sunt separate după mărime, prin electroforeză
în gel de agaroză. Apoi, gelul este acoperit cu o placă de nitroceluloză sau cu o
membrană de nylon, astfel că fragmentele de ADN denaturate sunt transferate prin
capilaritate pe placa respectivă. Se obţine, astfel, o “replică” a ADN- ului de pe
gel, pe placa de nitroceluloză. Placa respectivă este expusă unei sonde de ADN
marcat, a ARN sau unor oligonucleotide de asemenea marcate, cu care unele
fragmente de ADN denaturat pot hibrida conform principiului de

96
complementaritate. În continuare, plăcile respective sunt spălate, astfel că rămâne
pe ele numai ADN imobilizat prin hibridare moleculară, ce se prezintă sub formă
de benzi radioactive prin autoradiografie.
Metoda s-a dovedit a fi foarte eficientă în studiul comparativ al genomului
unor specii şi permite determinatrea unor modificări apărute în cursul evoluţiei, or,
identificarea mutaţiilor unor gene vegetale, animale sau umane. Datorită acestei
metode se stabileşte modificarea mărimii fragmentelor de restricţie, cunoscută sub
denumirea de polimorfismul lungimii fragmentelor de restricţie (RFLP=
Restriction Fragments Length Polymorphism), ce permite realizarea hărţilor de
restricţie şi identificarea restructurărilor în genom şi gene.
Metoda petelor Northern a fost elaborată de Thomas (1980) şi este utilizată
pentru studiul moleculelor de ARN. Este cunoscută sub denumirea de “Northern
blotting”. Iniţial, are loc denaturarea ARN prin amestecul cu un agent chimic; de
pildă, formaldehida care rupe legăturile de hidrogen dintre baze şi ARN devine
complet linear. După aceea, se procedează ca şi în cazul metodei precedente:
electroforeză în gel, trecerea pe un filtru de nitroceluloză, hibridarea cu ADNc
radioactiv. Urmează autoradiografia pentru identificarea hibrizilor moleculari.
Metoda respectivă este eficientă pentru a examina mărimea şi expresia ARNm în
anumite celule şi ţesuturi.
Pentru a determina cantitatea de proteine produsă de genele transferate,
proteinele celulare totale sunt separate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă,
după care sunt colorate cu albastru Coomassie, prin care noua proteină produsă de
genele transferate poate fi privită direct.
Metoda petelor Western a fost elaborată de Towbin şi colab. (1975), fiind
cunoscută sub denumirea de “Western blotting”. În cazul acestei metode,
proteinele de pe gel sunt transferate pe plăci de nitroceluloză şi acestea sunt
examinate cu anticorpi specifici proteinei respective. Anticorpii pot fi marcaţi cu
iodină 125 şi ei pot fi, astfel, detectaţi prin autoradiografie.

2.2.6. Metoda PCR de amplificare a genelor.

Metoda PCR (Polymerase Chain Reaction= Reacţia în lanţ a polimerazei) a
fost elaborată de către K.Mullis (1983). Împreună cu tehnica secvenţierii ADN ea
a revoluţionat genetica moleculară.
Pentru amplificarea unor fragmente scurte de ADN se foloseşte metoda
reacţiei în lanţ cu polimeraza (metoda PCR – polymerase chain reaction). Această
metodă constă în următoarele: un preparat genomic de ADN este mai întâi “tăiat”
cu enzime de restricţie în fragmente, după care este denaturat, iar secvenţele
monocatenare de nucleotide sunt legate de două secvenţe primer de cca 20 de baze
fiecare, complementare cu capetele opuse ale fragmentului de ADN-ţintă.
97
Cu ajutorul ADN-polimerazei se realizează catene complementare cu fiecare
dintre cele două catene monocatenare – ţintă. Ciclul se repetă prin denaturarea şi
utilizarea repetată a ADN-polimerazei, numărul de astfel de copii creşte
exponenţial, el dublându-se la fiecare ciclu. Prin utilizarea ADN-polimerazei de la
o bacterie termofilă, Thermus aquaticus, enzima rămâne activă în fiecare ciclu de
denaturare-renaturare. Un astfel de ciclu se realizează în cca 5 minute şi include
denaturarea prin încălzire (un minut), răcire (două minute), în care se leagă
primerii de fiecare catenă, încălzire (1.5 minute), în care are loc dedublarea
fiecărei catene cu ajutorul ADN-polimerazei. O secvenţă ADN poate fi amplificată
de 4.106 ori în 25 de cicluri. Mărimea fragmentelor de ADN, măsurată după
distanţa dintre locusurile de legare cu cei doi primeri, este de până la 40 kb. Se
obţine, astfel, un număr imens de copii în timp foarte scurt.
Sursele de ADN. Pentru utilizarea tehnicii PCR se utilizează ADN genomic
total, extras din celule, fără a fi nevoie de purificare. Matriţa de ADN poate clona
plasmida bacteriană, ADN genomic, ADNc, ADN din bănci de gene. Se poate
utiliza şi ADN cu o vechime relativ mare, deoarece molecula are o mare
stabilitate, iar metoda o mare posibilitate.

2.2.7. Clonarea ADN şi molecule de vectori.

În ingineria genetică, tehnica izolării ADN prevede manipularea cu gene de
interes, cu alte cuvinte, cu segmentul din molecula de ADN (sau molecula de ARN
la ribovirusuri), care conţine informaţia genetică necesară pentru sinteza unei
catene polipeptidice şi care determină un caracter valoros, ce urmează să fie
obiectul unui transfer la un alt organism. Acest ADN dublu-catenar poate fi clonat
pentru obţinerea cantităţii mari ale genei, care devine astfel un clon molecular.
Clonarea ADN implică inserţia unor segmente de ADN în vectori de donare.
Vectorii sunt molecule de ADN, care au capacitatea de a accepta ADN-ul străin şi
de a asigura replicarea, expresia şi transferul lui în alte organisme. Prin
reintroducerea într-o celulă-gazdă a acestor vectori de donare, ei sintetizează prin
multiplicare un mare număr de molecule de ADN identice. Aşadar, vectorii se
utilizează pentru clonarea (amplificarea) genei de interes şi, în acelaşi timp, pentru
transferul acestei gene în celula-gazdă.
Actualmente, este creat un număr mare de vectori, clasificaţi în următoarele
grupe:
1) vectori de clonare, care reprezintă molecule de ADN capabile de replicare
autonomă, în care este posibilă inserarea unor segmente de ADN exogen
(străine) în vederea introducerii şi menţinerii în celula-gazdă. Vectorii de
clonare sunt reprezentaţi, mai ales în celula-gazdă, de plasmide şi viruşi;
2) vectori de expresie, care posedă regiunea codificatoare a unei gene între
semnalele necesare pentru expresia ei;

98
 3) vectori de transformare (vectori binari), care se folosesc pentru
introducerea segmentului de ADN străin în genomul recipientului. De
obicei, acest tip de vectori posedă extremităţile de dreapta şi stânga ale
ADN în celula-gazdă.
Vectorii pentru transferul de gene trebuie să posede anumite caracteristici şi
anume:
– să se replice activ în celula-gazdă, independent de ADN celular;
– să posede locusuri de tăiere pentru enzimele de restricţie, pentru a putea
insera ADN exogen;
– să posede gene markeri selectabili, care să facă posibilă selecţia rapidă
a celulelor în care au fost încorporaţi;
– să se menţină în celula-gazdă, fără a se modifica, de-a lungul generaţiilor;
– să posede talia cea mai mica posibilă, fiind, astfel, capabili să insere o
cantitate mare de ADN exogen;
– să fie uşor de izolat, sub formă pură.
Cei mai utilizaţi vectori sunt: plasmidele, fagii, vectorii virali ai eucariotelor,
cosmidele, cromozomii artificiali etc.
Plasmidele sunt segmente de ADN circulare, extracromozomale, de origine
bacteriană. Majoritatea din ele au fost evidenţiate în celulele bacteriene, în stare
liberă, idependente de ADN-ul cromozomal. Plasmidele se transmit stabil
urmaşilor (celulelor bacteriene), fiind capabile la o reproducere autonomă. Există
plasmide cu un spectru larg de organisme-gazde, de aceea, cu ajutorul lor se poate
efectua transmiterea genelor între speciile neînrudite.
Pe lângă plasmidele ce se întâlnesc în natură, au fost construite artificial aşa-
numitele plasmide-vectori, cum este, de exemplu, pBR322. În prezent, se folosesc
plasmide de a treia generaţie derivate, de pildă, din pBR322. Vectorul pBR322 a
fost construit pe baza a trei plasmide: ColE I; pSC 101 şi Redrd. Acest plasmid
posedă două gene pentru rezistenţa la ampicilină şi tetraciclină (Tet r şi Ampr), el
având, totodată, capacitatea de autoreplicaţie independentă (fig. 2.7).
Vectorul pBR322 este reprezentat de o macromoleculă de ADN ce conţine
mai multe locusuri pentru recunoaşterea enzimelor de restricţie. Dacă, de pildă,
ADN exogen (gena de interes) şi ADN-ul acestui plasmid sunt tăiate cu aceeaşi
enzimă de restricţie, cum este Eco RI, iar apoi sunt puse împreună în aceeaşi
soluţie, capetele lor se vor asocia şi vor da naştere unui vector ADN-recombinat.
Fragmentele genomice de restricţie pot fi inserate în astfel de plasmid, cum este
pBR322.
Fagii sunt virusuri bacteriene cu o capacitate de multiplicare rapidă, cu un
sistem de penetrare în celulă şi de multiplicare autonomă. În genomul fagic se
poate insera ADN exogen de o talie mai mare, decât cel inserat în plasmide.
Proliferarea fagilor în celula bacteriei duce la liza acesteia. S -au realizat fagi-
vectori de a doua generaţie, care pot încorpora secvenţe de 15-20 kb, ce se
utilizează pentru construcţia băncilor genomice.
99
 Cla.I

EcoRI
Hind III

Bam H I
0

Tcr Sal. I
Hind II 4

1
Apr
Pvu I

Ava I
3
Pst I
Bal I
2

Pvu II
Fig. 2.7. Plasmida pBR322 posedă gene pentru rezistenţa la două antibiotice
(tetraciclină şi ampicilină) şi poate fi utilizată ca vector pentru transferul de
gene

Cosmidele sunt vectori artificiali alcătuiţi dintr-o plasmidă, la care se adaugă

secvenţa cos de la fagul λ, secvenţă care permite împachetarea unui recombinant
de cca. 45 kb. Cosmidele reprezintă, deci, nişte hibrizi între plasmide şi fagi. Ele
sunt utilizate exclusiv pentru construcţia băncilor genomice.
4) Vectorii navetă sunt vectori artificiali care conţin o genă necesară pentru
selecţia lor la procariote (rezistenţa la antibiotice), o genă pentru selecţia la
eucariote şi capacitatea de replicaţie în ambele tipuri de celule (fig. 2.8.).
5) Vectori virali ai eucariotelor. Din acest grup fac parte unii vectori utilizaţi
mai frecvent: SV40, adenovirusurile, virusurile de tip herpes, vaccinii şi
retrovirusurile.
6) Cromozomi artificiali ai drojdiei (YAC~-Yeast Artificial Chromosome). Ei
permit donarea unor segmente foarte mari de ADN. Vectorul YAC conţine:
un centromer necesar pentru segregarea în celulele-fiice, o origine a
replicării şi telomerele ce marchează capetele cromozomului. În cazul YAC
pot fi donate segmente cuprinse între 150-1000 kb, media fiind de 350 kb,
şi care poate fi propagat în drojdii.

100
 S. cerevisiae
leu 2

Ampr
VECTOR-NAVET+

Drojdie
ori C ori C
Bacterie

Transformare
E.coli
Transformare
drojdie

Plasmide
navet=

E.coli S. cerevisiae

Fig. 2.8. Plasmidele navetă servesc ca vectori pentru transferul de gene la

bacteria E.coli şi la drojdia de bere (S.cerevisiae) – (după P. Raicu).

2.2.8. Construirea ADN-ului recombinat.

ADN-recombinat reprezintă o moleculă “hibridă” compusă din ADN exogen

(străin) inclus într-o moleculă de ADN a vectorului. Prima dată ADN-recombinat a
fost construit în anul 1972 de către P.Berg cu colab. la Universitatea din Stanford,
California (SUA).
Capacitatea de a lega un segment de ADN de un vector, constituie esenţa
tehnologiei ADN-recombinat.
Construirea ADN-ului recombinat constă din patru etape:
1. Izolarea genei de interes. Se izolează segmentul ADN genomic, gena care
trebuie să fie transferată în celula-gazdă. În principiu, există două căi de bază
pentru obţinerea genei de interes:
– sinteza artificială a segmentului de ADN necesar, folosind proprietatea
enzimei de reverstranscripţie;
101
 – sau izolarea segmentului de ADN cu ajutorul enzimelor de restricţie (vezi
p.p. 2.2.1-2.2.3).
2. Alegerea sau construirea unui vector ADN plasmidial, care posedă
semnalele utile expresiei genei şi selecţiei transformanţiilor (vezi p. 2.2.7).
3. Pregătirea capetelor monocatenare complementare (coezive) sau drepte a
celor două tipuri de fragmente de ADN.
Două segmente de ADN se pot lega atunci, când au capete coezive
complementare, adică au terminal, mici secvenţe de nucleotide complementare.
Pentru aceasta se efectuează trecerea ADN plasmidal şi ADN genomic cu aceeaşi
enzimă de restricţie.
De exemplu, dacă trebuie să includem fragmentul ADN genomic în plasmida
pSC101, cu ajutorul enzimei restrictaza EcoRI se taie ADN plasmidial şi ambele
capete ale fragmentului ADN genomic. În rezultat, se formează molecula lineară
de ADN genomic cu capete complementare: AATT------- şi TTAA----- . Capetele
libere monocatenare la ADN plasmidial au tot aceiaşi componenţă din patru
nucleotizi complementari. Ambele fragmente de aceste două tipuri de ADN sunt
pregătite pentru realizarea etapei a IV de construire a ADN-recombinat: pentru
legarea între aceste segmente a ADN-ului.
De asemenea, pot fi legate şi segmente de ADN, care nu au capete coezive. În
acest caz, se folosesc enzimele denumite terminal transferaze, enzime care au
capacitatea de a adăuga nucleotide de un anumit tip la capetele moleculei de ADN.
Astfel, dacă se adaugă la capete nucleotide ce conţin adenină, se obţin secvenţe
unicatenare de tip poli-A. Dacă se utilizează un alt tip de terminal transferare, la
capetele moleculei de ADN se pot adăuga nucleotide ce conţin timină, realizându-
se secvenţe monocatenare de tip poli-T. În situaţia când cele două tipuri de baze
azotate (adenină şi timină) sunt complementare, capetele celor două fragmente de
ADN se pot lega între ele.
4. Unirea ADN genomic cu ADN plasmidial. Cele două tipuri de fragmente de
ADN obţinute se incubează cu enzima ADN-ligaza. În consecinţă, se formează
unele legături covalente fosfodiesterice între nucleotizii de ADN genomic şi ADN
plasmidial. Rezultă recombinanţi circulari (fig. 2.9.).

102
 ADN genomic
ADN plasmidial

Digestie cu endonucleaze
de restric\ie (EcoR I)

AATTC G AATTC G
G CTTAA G CTTAA

Fragmente de restric\ie

AATTC G
G CTTAA ADN

ligaza

ADN-recombinat

Fig. 2.9. Recombinarea ADN genomic cu ADN plasmidial.

2.2.9. Transferul de gene (transgeneza).

Includerea vectorului ADN-recombinat în celule bacteriene sau celule
eucariote, se realizează prin tratamente cu soluţii de săruri. Astfel, ADN exogen
poate pătrunde în celule, unde este replicat în mai multe exemplare, proces
denumit clonare. Acest ADN clonat poate fi produs în câteva ore de o cultură
bacteriană, apoi poate fi izolat şi purificat.
În acelaşi timp, introducerea de ADN-recombinat cu ADN-exogen în celula-
gazdă are şi alt scop – transformarea programei genetice în celula-gazdă. De aceea,
acest proces poartă denumirea de transformare.
Permeabilitatea bacteriilor pentru ADN exogen se realizează prin incubare la 0°C
în prezenţa clorurii de calciu (50 mM), timp de o oră, după care bacteriile devin
103
competente. Plasmidele recombinate sunt puse în contact cu bacteriile 30′ la 0°C, după
care se realizează un şoc termic la 37°C timp de 30-60′. Dacă vectorul este un
plasmid, celulele cultivate pe un mediu solid, care au adiţionat ADN-recombinat
exogen, vor avea un fenotip particular, astfel că ele pot fi identificate şi izolate.
În vederea selecţiei celulelor care conţin plasmide cu ADN-recombinat, se
utilizează ca marker gene pentru rezistenţa la antibiotice. Prin cultura celulelor pe
un mediu suplimentat cu antibioticul respectiv, celulele ce conţin vectorul cu
ADN-recombinat sunt cu uşurinţă selecţionate, iar cele care n-au inclus vectorul
sunt eliminate, neposedând gene pentru rezistenţa la antibiotice. Pentru selecţia
celulelor care conţin vectori reprezentaţi de virusuri recombinate se folosesc alte
tehnici, care permit izolarea celulelor respective.
Aşadar, transferul de gene (sau transgeneza) constă în introducerea în
genomul unei celule a unei gene ce provine de la alt organism.

2.2.10. Biblioteci genomice.

Pentru realizarea bibliotecilor genomice sau a băncilor de gene, se
fractionează genomul ADN-lui unei specii, cu ajutorul enzimelor de restricţie, într-
un număr mare de fragmente de ADN, care sunt incluse în vectori de donare
(plasmide, virusuri, cosmide). Fiecare vector conţine însă un singur fragment de
ADN al genomului, întreaga colecţie de fragmente ADN reprezentând o bibliotecă
genomică a speciei respective. Prin reintroducerea într-o celulă-gazdă a acestor
vectori de donare, ei formează prin replicare molecule identice.
Utilizarea tehnologiei ADN-recombinat a condus la realizarea unor biblioteci
genomice din care este posibilă izolarea unor segmente de ADN, sau gene în
cadrul unor celule cu ADN-recombinat. Se obţin, astfel, colecţii de celule
procariote sau eucariote, care conţin vectori recombinaţi, ce posedă, practic, toate
genele unei specii.
Pentru a utiliza, de pildă, plasmidele în calitate de vectori, se folosesc
molecule de ADN circular plasmidial purificat, care se taie cu enzime de restricţie
pentru a obţine molecule de ADN linear. ADN celular, care trebuie utilizat pentru
alcătuirea unei biblioteci genomice, este tăiat cu ajutorul aceleiaşi enzime de
restricţie. Se amestecă moleculele de ADN plasmidial linear cu fragmentele de
ADN celular, realizându-se molecule de ADN circular-recombinate, obţinându-se,
astfel, plasmide ce conţin ADN exogen. Legătura dintre ele se realizează cu
ajutorul enzimei ADN-ligază.
Moleculele circulare de ADN plasmidial recombinat sunt introduse în celulele
bacteriene care au fost făcute permeabile pentru ADN exogen. Deoarece celulele
bacteriene se pot reproduce la fiecare 30 de minute, plasmidele recombinate se pot şi
ele replica, producând cu aceiaşi viteză un număr enorm de copii ale moleculelor
104
de ADN circular, ce conţin ADN străin. O seamă de plasmide bacteriene conţin
gene pentru rezistenţa la antibiotice, fapt care poate fi utilizat pentru selecţia
celulelor ce conţin plasmide recombinate.
Prin “tăierea” ADN-ului genomic de la mamifere, cu ajutorul enzimelor de
restricţie, se poate obţine un număr enorm de fragmente ADN, cca. l milion. Prin
includerea acestor fragmente de ADN în plasmide şi apoi în celule bacteriene, se
obţin astfel cca. l milion de cloni celulari, fiecare clon provenind dintr-o singură
celulă originară. O astfel de plasmidă conţine un clon de ADN genomic, iar
colecţia întreagă de plasmide reprezintă o bibliotecă de ADN genomic.
O tehnică alternativă pentru donare, presupune pornirea de la ARNm al genei
dorite. Acesta este extras din celulă şi pe baza lui se realizează ADN-ul
complementar (ADNc), reacţie catalizată de reverstranscriptază. Fiecare clon
obţinut pe această cale se numeşte clon ADNc, iar colecţia întreagă de cloni devine
o bibliotecă de ADNc.
Biblioteca clonală genomică ordonată se obţine prin fragmentarea genomului
ADN şi prin realizarea de cloni, care conţin astfel de fragmente şi sunt dispuşi în
ordine de- a lungul cromozomului. Astfel de biblioteci genomice s-au realizat la
mai multe specii de procariote şi eucariote (Escherichia coli, Saccharomyces
cerevisiae, Drosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana etc.).
De exemplu, genomul drojdiei de bere (Saccharomyces cerevisiae) a fost
secţionat în fragmente cu ajutorul enzimelor de restricţie, care au fost apoi
introduse într-o plasmidă-vector Col El de Escherichia coli. Coloniile bacteriene,
conţinând vectori plasmidali recombinaţi, au fost izolaţi şi apoi s-au păstrat în
condiţii speciale la -80°C pentru un timp nedeterminat. Genomul haploid de la
drojdia de bere are mărimea ADN de 1,3×104 perechi nucleotide.
S-a calculat că o bibliotecă genomică formată din 4600 de colonii diferite
conţine, cu o probabilitate de 99%, oricare genă din genomul drojdiei. La
Drosophila melanogaster, care are un genom mai mare, s-a calculat că sunt
necesare 300000 de colonii celulare, pentru a avea o probabilitate de 99% de a
prezenta oricare genă din genom. Evident, în cazul mamiferelor cu genom mult
mai mare, numărul de colonii în biblioteca genomică este şi mai mare. Dacă, însă,
se utilizează enzime de restricţie care secţionează ADN în segmente mai mari,
numărul de colonii poate fi redus substanţial.
Din cauză că fragmentele de ADN uman obţinute cu ajutorul enzimelor de
restricţie sunt relativ mici, întreg genomul uman este secţionat prin acţiunea acestor
enzime, iar fragmentele sunt introduse ca vectori plasmidiali în celule bacteriene unde
sunt clonate, realizându-se, astfel, o bibliotecă genomică umană. De pildă, în cazul
unei biblioteci umane alcătuite din segmente de ADN cu o mărime medie de 1.7 kb,
sunt necesare pentru clonare 8100000 de plasmide care să includă întreg genomul
uman. Prin utilizarea enzimei de restricţie EcoRI, genomul uman este
105
“tăiat” în aproximativ 2 milioane de fragmente ADN. Există, însă, şi enzime de
restricţie care “taie” genomul mamiferelor în fragmente de ADN mai mari. De
exemplu, prin utilizarea enzimelor de restricţie (Not I şi Sfi I), care au ca secvenţă
de recunoaştere un segment de 8 nucleotide, se produc în genomul mamiferelor
tăieturi din care rezultă fragmente mari de ADN cu o lungime de la 5×l0 4 până la
9×l06 pb. Folosind tehnica electroforezei în gel cu impulsuri electrice (PFGE),
aceste fragmente mari de ADN sunt separate şi, prin donarea lor, se realizează
biblioteci genomice, care conţin toate genele unui organism. Cu ajutorul tehnicilor
de secţionare a fragmentelor de ADN sub acţiunea enzimelor de restricţie, de
secvenţiere a fragmentelor şi de analiză a ordinii secvenţelor în genom, a devenit
posibilă studierea genomului în ansamblu. Datele obţinute, până în prezent, în
analiza secvenţelor de ADN din genomul uman, se găsesc centralizate în banca de
date GenBank de la Los Alamos National Laboratory (SUA), la European
Molecular Biology Laboratory din Heidelberg.

2.3. Particularităţile ingineriei genetice la plante

2.3.1. Avantajele ingineriei genetice în fitotehnie.

Metodele tradiţionale de selecţie bazate, în mod general, pe hibridarea sexuată
şi selecţie, permit de a obţine genotipuri noi de plante. Ele asigură obţinerea unui
număr mare de soiuri şi hibrizi ai culturilor agricole. Amelioratorii de vază au adus
un aport decesiv în această direcţie. Metodele clasice de selecţie se vor afla şi în
continuare la baza obţinerii soiurilor noi, cu o capacitate de producţie înaltă.
Concomitent cu progresul semnificativ al selecţiei, bazat pe realizările geneticii
clasice, în condiţiile exploziei demografice din a doua jumătate a secolului XX a
devenit tot mai acut dificitul global în alimentaţia umană, cu extinderea subnutriţiei pe
areale în creştere continuă. Pentru sporirea producţiei agricole pe actualele suprafeţe
cultivate, apare necesitatea elaborării şi implementării unor noi tehnologii în
fitotehnie, bazate pe folosirea unor soiuri şi hibrizi intensivi.
Îmbunătăţirea genetică a culturilor agricole trebuie accelerată considerabil nu
doar în legătură cu necesităţile populaţiei umane, dar şi în legătură cu majorarea
puternică a stresurilor biotice şi abiotice. A apărut necesitatea creării şi cultivării
unor soiuri rezistente la boli şi dăunători, în special în legătură cu adaptarea
patogenilor la pesticide, ceea ce măreşte pericolul folosirii unor cantităţi înalte de
chimicate în fitotehnie. Majoritatea savanţilor consideră, că realizarea cu succes a
acestei probleme este posibilă datorită folosirii metodelor noi de biotehnologie în
fitotehnie.
În această privinţă, cele mai promiţătoare sunt cercetările în domeniul ingineriei
genetice. Descoperirea rolului ADN şi ARN în ereditatea organismelor, realizarea

106
sintezei proteinelor, dezvoltarea metodelor biologiei moleculare au încurajat
cercetările din domeniul ameliorării plantelor. În cercetările biologice din ultimele
decenii, un rol important l-au jucat şi următorii factori:
– perfecţionarea şi aprobarea metodelor biologiei moleculare;
– folosirea largă a metodelor de transformare genetică cu ajutorul
Agrobacterium tumefaciens;
– unificarea obiectelor biologice de cercetare, inclusiv folosirea
arabidopsisului.
Eficacitatea plantelor transgenice în sporirea producţiei şi reducerea preţului
de cost este destul de evidentă. Drept exemplu pot servi soia transgenică, rezistentă
la erbicide, şi porumbul transgenic, rezistent la atacul unor insecte. În anul 2003,
mai mult de 60 mln. ha au fost cultivate cu specii de plante transgenice. Cea mai
largă răspândire au obţinut-o plantele rezistente la erbicide şi pesticide.
Actualmente, sunt create multe soiuri de plante transgenice cu următoarele
caracteristice importante pentru alimentaţie şi agricultură:
– rezistenţa la boli şi dăunători;
– modificarea maturizării fructelor, îmbunătăţirea păstrării lor;
– modificarea conţinutului în scopul îmbunătăţirii calităţii uleiului,
amidonului, proteinei etc;
– rezistenţa la erbicide;
– majorarea rezistenţei la stresurile abiotice (temperatură, apă, conţinut ridicat
de săruri, metale grele, aciditatea solului, secetă, frig etc.);
– schimbarea structurii anatomo-morfologică (scurtarea tulpinilor, modifi-
carea limitelor de înflorire);
– reducerea scuturării cerealelor în perioada maturizării;
– mărirea conţinutului de vitamine, minerale, substanţe biologice active
(vitamina A, fier, vaccine etc.);
– înlăturarea alergenilor din unele cereale.
În aşa fel, manipulările genoinginerice permit rezolvarea unor probleme
referitor la majorarea rezistenţei formelor noi, a liniilor, soiurilor şi hibrizilor
plantelor agricole la patogeni şi reducerea duratei de creare a soiurilor noi.
Se ştie, că în selecţia clasică, în aparatul ereditar al formelor noi create,
caracterele plantelor studiate de multe ori se fixează întâmplător. Acest fapt, ce
obligă amelioratorii să efectueze în unul şi acelaşi timp un număr mare de
încrucişări şi să selecţioneze plantele cele mai valoroase, necesită zeci de ani. În
domeniul ingineriei genetice, în principiu, savanţii purced pe altă cale. În acest
caz, crearea combinaţiilor genetice a formelor noi de plante se bazează pe
încorporarea anumitei gene – genă de interes – în genotipul formelor recipiente ce
corespunde unui program concret de ameliorare.

107
 Ingineria genetică introduce două modificări esenţiale în programul de
ameliorare:
– economia potenţială a spaţiului şi a timpului, deoarece creşterea materialului
în condiţii de laborator evită necesitatea de a folosi suprafeţe mari pentru a
cultiva mii de plante şi de a reduce epoca de maturizare a lor;
– introducerea elementului de precizie în procesul de amelioratre, deoarece
cercetătorul dispune de posibilitatea de a manipula cu un anumit material
genetic, bine determinat, în forme de secvenţe de nucleotide deja bine
cunoscute.
Tehnologia ADN-recombinat permite:
– izolarea genei de origine atât procariotă, cât şi eucariotă;
– includerea aceastei gene în cromozomii plantei recipiente;
– asigurarea expresiei acestor gene în plantă.
Aplicarea acestei tehnologii înlesneşte realizarea unor programe de ameliorare
mult mai concrete şi lărgeşte semnificativ posibilităţile manipulării cu materialul
genetic.
O prioritate importantă a plantelor, în comparaţie cu animalele, constă în
posibilitatea obţinerii unei plante întregi – mature, fertile dintr-o celulă, bazată pe
capacitatea de totipotenţă. Eficacitatea ingineriei genetice a plantelor depinde de
realizarea tehnologică a următoarelor etape:
– alegerea, izolarea şi clonarea genei din celula vegetală;
– alegerea genotipului plantei-recipiente;
– transferarea genei şi expresia ei în genomul plantei-recipiente;
– regenerarea celulelor transformate şi selecţia plantelor transgenice.

2.3.2. Alegerea, izolarea şi clonarea genei din celula vegetală.

Alegerea genei se determină în funcţie de necesitatea transmiterii la specia
respectivă a caracterului valoros (de interes). În prezent, pentru transformarea
plantelor se folosesc, în special, gene care determină caractere monogenice (rezistenţa
la erbicide şi pesticide, rezistenţa la alte tipuri de stresuri biotice şi abiotice etc.).
Majoritatea genelor care condiţionează aceste caractere, sunt extrase din genomuri
bacteriale. În ultimul timp, în calitate de donori de gene, care determină caracterele
rezistenţei la diferiţi factori de stres se aleg genomurile speciilor sălbatice de plante.
Aşa fel de gene nu pot fi introduse în genomul plantei-recipiente pe calea hibridării
sexuate din cauza incompatibilităţii biologice a plantelor, ce aparţin la diferite specii,
genuri şi chiar familii. O problemă mai complicată apare în cazul alegerii şi izolării
genelor, care determină grupa caracterelor cantitative: calitatea seminţelor, rezistenţa
la secetă, la temperaturi joase şi înalte, etc.
Pe parcursul ciclului de viaţă al unei plante superioare, în funcţie de specie, se
exprimă aproximativ de la 30.000 până la 100.000 de gene. Există gene care
108
se manifestă în toate celulele unei plante şi care sunt relativ uşor de identificat şi
izolat. Există însă şi gene, care se exprimă diferenţiat în timp şi spaţiu: numai o
scurtă perioadă de timp în cursul dezvoltării (este cazul genelor care se exprimă în
tapetum, adică în stratul de celule ce căptuşeşte pereţii lojelor anterelor) sau numai
într-un anumit tip de celule (de exemplu, numai în celulele meristematice).
Identificarea şi izolarea acestor gene reprezintă, desigur, operaţiuni extrem de
dificile.
Pentru izolarea genelor cu funcţii cunoscute sau definite numai prin mutaţie
ori transcrise diferenţiat în celule, ţesuturi, organe etc. sunt disponibile următoarele
metode şi tehnici:
A. Tehnica “hibridarea clonilor”. Izolarea genelor ale căror funcţii sunt
cunoscute se face prin screening în bănci, cu sonde moleculare specifice. O sondă
este o moleculă de ADN monocatenară, marcată radioactiv sau chimic. Metoda se
bazează pe capacitatea de asociere a două molecule de ADN monocatenare
complementare. Procedeul presupune:
– construirea băncilor de gene (plăci cu colonii bacteriene, dacă vectorii de
clonare sunt plasmide sau cu plaje de liză, când donarea se face prin
intermediul fagelor);
– realizarea unei replici de pe fiecare vas din banca de gene;
– denaturarea ADN-ului;
– incubarea cu sonda;
– eliminarea excesului de sondă;
– autoradiografierea, pentru identificarea coloniei / plajei de liză în care se
află fragmentul de ADN complementar cu sonda.
Această tehnică a fost folosită pentru izolarea genelor care codifică proteinele
de rezervă de la cereale; genelor pentru enzimele chitinază şi gluconază de la
cartof; genelor care codifică superoxid dismutaza la tomate etc.
B. Tehnica “hibridarea diferenţiată” (screening diferenţiat) – izolarea
genelor, care se exprimă diferit în timp şi spaţiu, în diferite celule, ţesuturi şi
organe. Pentru aplicarea acestei metode nu sunt necesare informaţii despre genele
respective sau despre produşii lor. Izolarea are la bază diferenţele existente între
două sau mai multe probe în privinţa concentraţiilor produşilor de expresie. Prin
această tehnică se izolează genele, care au un mecanism comun de reglare.
Procesul presupune: 1) extracţia de ARN din două probe; 2) izolarea de
ARNm din ambele probe (+ şi -); 3) realizarea de copii de ADNc din proba + (în
care una sau mai multe gene de interes sunt transcrise); 4) construirea unei bănci
de ADNc din proba +; 5) realizarea a două replici şi hibridarea acestora cu sonde
reprezentate de ADNc din probele + şi -; 6) autoradiografierea; 7) izolarea clonilor
cu intensităţi ale semnalului de hibridare diferite, care conţin genele transcrise
diferenţiat; 8) caracterizarea clonilor selecţionaţi.
109
 Este de regretat faptul, că această metodă nu permite identificarea moleculelor
de ARNm, aflate în număr foarte mic (5-20 molecule/celulă).
C. Tehnica “Etalarea diferenţiată a ARNm”. Această metodă se bazează pe
sinteza PCR a ADNc. Etalarea diferenţiată a ARNm permite izolarea unor gene,
care se exprimă la un nivel foarte scăzut – 30 de copii de ARNm/celulă – în două
sisteme diferite, în prezenţa unor nucleotide marcate care reprezintă numai o parte
dintr-o populaţie de ARNm, folosind un primer 3′ oligo (T), primer ce renaturează
cu capătul poli (A) şi o altă secvenţă scurtă, arbitrară, de nucleotide. Dacă se
utilizează primeri diferiţi, se pot face copii de ADNc după toate moleculele de
ARNm izolate dintr-o probă. Produşii PCR proveniţi din probe diferite se separă
alăturat pe gel, obţinându-se un model de benzi ce poate fi studiat comparativ.
Benzile unice reprezintă ARNm exprimat specific.
La plante, prin această metodă au fost izolate foarte multe gene care se exprimă
diferenţiat în cursul embriogenezei, germinării, dezvoltării polenului, florilor,
fructului, meristemelor sau în condiţii de stres osmotic, termic, de poluare etc.
Înţelegerea modului de dezvoltare a florilor, fructului sau a biologiei
reproducerii se află deja la baza unor aplicaţii biotehnologice. De exemplu, au fost
obţinute plante androsterile cu un promotor specific pentru tapetum ataşat
secvenţei, care codifică o ribonuclează. Au fost obţinute, de asemenea, tomate cu
procesul de coacere modificat prin izolarea genelor transcrise în fruct în curs de
maturare.
D. Tehnica clonării prin “hibridarea prin diferenţă” (subtractive
hibridization). Acest procedeu se bazează pe tehnologia PCR. Principiul PCR este
prezentat în capitolul 2.2.6. Hibridarea prin diferenţă permite izolarea unor cloni
genomici sau ADNc printr-o îmbogăţire selectivă cu secvenţa ce va fi izolată.
Etapele procedeului în cauză sunt următoarele:
– se izolează acizii nucleici (din organismul mutant, care nu posedă secvenţa
“ţintă”, şi din organismul normal, care o posedă);
– se denaturează;
– se hibridează, pentru a se elimina secvenţele comune ambilor acizi nucleici
şi a se obţine o populaţie îmbogăţită în secvenţe “ţintă”.
Când se utilizează ADNc, secvenţele rămase după hibridare se folosesc ca
sonde pentru screening în bănci de ADNc, sau pentru a construi bănci cu mult mai
mici decât cele convenţionale, în care pot fi mult mai uşor detectaţi clonii induşi
specific.
Prin această metodă, a fost izolat ADNc exprimat în anumite ţesuturi sau ca
răspuns la tratamente cu hormoni, ori la acţiunea unor factori de stres, biotici sau
abiotici.

110
 E. Tehnologia “Screening în bibliotecile de expresie”. Această metodă
permite izolarea genelor care codifică proteine faţă de care se pot obţine anticorpi,
dar care nu sunt sintetizate în cantităţi mari pentru a fi analizate. Se pot identifica,
de asemenea, clonii ce codifică proteine cu funcţii în reglarea expresiei genelor,
care recunosc secvenţe specifice de ADN. În primul caz, sondele utilizate sunt
anticorpi, iar în al doilea caz – secvenţe de ADN dublu catenar. Etapele parcurse:
a) construirea băncii de expresie; b) transferul pe hârtie de nitroceluloză; c)
incubarea cu sonda-anticorp; d) detectarea complexului anticorp-antigen.
Prin această metodă au fost izolate genele pentru fenilalaninamoniuliaza
(PAL) de la lucernă, pentru poligalacturonaza de la tomate, pentru chitinaza de la
fasole etc.
F. Tehnica clonării poziţionale sau “mersul pe cromozom”. Această tehnică
poate fi folosită numai pentru identificarea genelor la care există mutaţii sau care
pot fi cartate. Aplicarea ei nu necesită cunoaşterea naturii mutaţiei sau a
produsului genei.
Prin această metodă au fost identificate gene implicate în: semnalizarea cu
ajutorul hormonilor; rezistenţa la boli; biosinteza acizilor graşi; fotomorfogeneză
etc.
G. Metoda “Mutageneza de inserţie”. Este o metodă care presupune folosirea
unor secvenţe de ADN-transpozoni sau ADN-T – ca mutageni de inserţie, cu rol de
“etichete” pentru genele mutante. Dacă nu există alte gene care să complementeze,
parţial sau total, funcţia genei mutante, se obţine o descendenţă homozigotă cu fenotip
anormal ce poate fi detectat morfologic, biochimic sau fiziologic.
Prin mutageneza de inserţie, au fost clonate gene care reglează:
– dezvoltarea florii (agamous, apetala flower), numite şi homeotice;
– creşterea vegetativă (dwarf = piticism).

H. Tehnologia “Complementarea funcţională în drojdii sau în Echerichia

coli”. Complementarea funcţională face posibilă restaurarea fenotipului normal al
unei mutante prin transferul unei alele de tip sălbatic. Pentru aplicarea acestei
metode este nevoie de:
– mutante cu fenotipul uşor de detectat;
– un procedeu de transformare eficient;
– o bancă de cloni ce pot fi exprimaţi în mutante.
Exemple de gene de la plante izolate prin complementare: gene care codifică
transportori de membrană (K+, aminoacizi etc.); gene care codifică factori de
transcripţie; gene care codifică enzime implicate în sinteza nucleotidelor); gene
care codifică enzime implicate în sinteza aminoacizilor (A – l – pirolidin – 5 –
carboxilat reductaza, implicată în sinteza prolinei).

111
 Alegerea genotipului plantei-recipiente. În variantă ideală, în calitate de
recipient se aleg plante de aşa soi sau linie, care ar răspunde cerinţelor după
capacitatea lor de producţie, calitate a fructelor, rezistenţă la stresurile biotice şi
abiotice, dar care ar fi avut numai o însuşire negativă, de exemplu – lipsa de
rezistenţă la insecte. În asemenea caz, introducerea în genomul plantei de acest soi,
de exemplu, a genei bacteriene bt2, cu expresia de proteină prototoxină, care
provocă moartea insectelor, ar fi dus la îmbunătăţirea semnificativă a acestuia.
Totodată, alegerea genotipului plantei-recipient depinde şi de capacitatea
regenerativă a celulelor sale din planta întreagă fertilă.

2.3.3. Tehnologiile transferării genelor la plante şi expresia lor

în genomul plantei-recipiente.
Scopul principal al transferului genelor la plante este introducerea în genomul
celulei-gazdă a unei (unor) gene ce provin de la alte specii. Datorită manipulărilor
in vitro se înfăptuieşte transformarea genetică – modificarea genomului unui
organism prin ingineria genetică. Pentru a obţine şi a confirma statutul de plantă
transformată genetic, este nevoie de utilizarea următoarelor grupe de metode:
– tehnici de transfer a genelor;
– tehnici de cultură in vitro a celulelor, protoplaştilor, ţesuturilor, organelor,
plantelor întregi;
– tehnici de confirmare a integrării stabile şi a expresiei genelor transferate în
genomul plantelor regenerate.
Actualmente, există mai mult de 20 de tehnici de transfer a genelor la plante,
însă nici una din acestea nu are un caracter universal. Aceste metode se clasifică în
două grupe mari:
1) Metodele indirecte, prin intermediul vectorilor biologici;
2) Metodele directe, prin metode chimice şi fizice.
Pentru prima grupă de metode pot fi utilizaţi următorii vectori biologici:
a) sistemul Agrobacterium, cu vectori binari;
b) virusurile;
c) transpozonii (gene săritoare);
d) ADN-mitocondrial sau ADN al cloroplastelor.
Pentru grupa a doua sunt folosite următoarele tehnici, metode chimice şi
fizice:
1) Incubarea protoplaştilor cu polietilen glicol (PEG);
2) Electroporarea protoplastelor, celulelor şi ţesuturilor;
3) Microinjecţia ADN exogen în protoplaste, polen, embrioni;
4) Electroforeza embrionilor;
5) Bombardamentul cu particule purtătoare de ADN exogen (metoda
biolistică);
6) Agitarea ţesuturilor în amestec cu fibre de carbid silicon şi ADN exogen.

112
2.3.3.1. Transferul indirect al genelor la plante cu ajutorul vectorilor biologici.
Fitovectorii pentru transferul de gene la plante trebuie să posede un spectru
mai larg de anumite caracteristici comparativ cu vectorii bacterieni:
– să se transfere şi să se menţină în celula-gazdă fără a se modifica de-a lungul
generaţiilor;
– să se replice activ în celula gazdă, independent de ADN-ul celular;
– să posede locusuri de tăiere pentru enzimele de restricţie, pentru a putea
insera ADN-ul exogen;
– să posede gene marker selectabile, care să facă posibilă selecţia rapidă a
celulelor, care le-au încorporat;
– să aibă capacitatea de a se răspândi în diferite organe ale plantei;
– să aibă aptitudinea de a transforma diferite specii ale plantelor agricole;
– să se transmită stabil urmaşilor;
– să nu fie patogeni.
Specia Agrobacterium tumefaciens induce tumori la nivelul coletului, iar
specia Agrobacterium rhizogenes – dezvoltarea unor rădăcini firoase.
Informaţia genetică transferată de bacterii este conţinută, după caz, de o
plasmidă Ti (Tumor-inducing, la Agrobacterium tumefaciens) sau de o plasmidă
Ri (Root-inducing, la Agrobacterium rhizogenes). Regiunea specifică de ADN
transferată (ADN-T), care se integrează în genomul celulei vegetale, conţine gene
ce codifică enzime implicate în biosinteza fitohormonilor. Expresia acestor gene
determină formarea tumorilor şi a rădăcinilor firoase, adevărate nişe ecologice ale
bacteriilor. De asemenea, ADN-T conţine şi gene care codifică enzime implicate
în producerea şi secreţia opinelor (derivaţi ai aminoacidului arginină) – octopină şi
nopalină, opine pe care bacteriile le utilizează ca surse de carbon şi azot.
Agrobacterium rhizogenes mai posedă în ADN-T şi genele rol, a căror funcţionare
este mai puţin cunoscută (fig. 2.10).
MORFOLOGIA SINTEZA
MORFOLOGIA SINTEZA
TUMORII OCTOPINEI
TUMORII OCTOPINEI
CATABOLISMUL
VIRULEN|A VIRULEN|A NOPALINEI

ADN-T CATABOLISMUL ADN-T

OCTOPINEI

PLASMID PLASMID

OCTOPINA NOPALINA

CATABOLISMUL
AGROCINOPINEI

Fig. 2.10. Harta genetică a două plasmide Ti de la Agrobacterium

tumefaciens (după P. RAICU).

113
 Nici una dintre aceste gene nu este implicată în transferul şi integrarea ADN-T în
genomul celulei vegetale. În excizia şi transferul ADN-T sunt implicate extremităţile
lui, în lungime de câte 25 de perechi de baze, şi regiunea vir (regiunea de virulenţă).
Genele din regiunea vir sunt activate de un “mesager chimic” – acetosiringona – emis
de o plantă rănită. Unul dintre produşii acestor gene este o endonuclează, care va
decupla o singură catenă din ADN-T, operând două tăieturi, la nivelul celor două
extremităţi constituite din câte 25 de perechi de baze. Acest segment de ADN-T
monocatenar va fi transferat în celula vegetală (fig. 2.11.).

Cromozom
-T
ADN

ES ED
Regiune T
ES ED ADN
cromozomi
Plasmid= Ti

Nucleu
Regiune Vir

Agrobacterium tumefaciens
Celul= vegetal= r=nit=

Fig. 2.11. Schema transferului de gene mediat de Agrobacterium

Odată elucidat, acest mecanism natural de excizie şi transfer al ADN-T a

arătat că:
– orice gene care vor fi amplasate între cele două extremităţi vor fi transferate
şi integrate în nucleul celulei vegetale;
– regiunea vir rămâne funcţională şi atunci, când este plasată pe un replicon
diferit de cel care conţine ADN-T: ADN-T şi regiunea vir se
complementează în poziţie trans pentru a determina apariţia fenotipului de
oncogenitate (tumori si rădăcini firoase);
– plasmidele Ti, de mari dimensiuni (140-235 kb), sunt greu de manipulat, iar
din celule tumorale nu pot fi regenerate plante normale.
Pentru valorificarea acestui sistem natural de transfer de gene, au fost
efectuate câteva modificări: .
– dezarmarea plasmidelor Ti, prin eliminarea ADN-T;
– construirea unor vectori de transformare (vectori binari), din plasmide de
mici dimensiuni, provenite de la bacteria Escherichia coli;

114
 – transferul vectorilor binari în tulpini de Agrobacterium cu plasmide
Ti dezarmate, dar capabile să exercite funcţia de virulenţă în poziţie
trans.
Particularităţile construirii vectorului de transformare pentru celula vegetală.
Pentru construirea acestui vector sunt folosite plasmidele de mici dimensiuni, care
sunt utilizate ca vectori de clonare în E.coli pBR 322 şi pUC. Au fost realizate
construcţii genetice prin introducerea în ADN plasmidial (procariote) a unor casete de
expresie, care conţin toate componentele necesare pentru exprimarea genelor în plante
(eucariote): un promotor, un polilinker, o secvenţă de poliadenilare.
Promotorul poate fi prezentat în unul din două tipuri:
– sau promotor constitutiv (care asigură exprimarea genei/genelor în toate
celulele plantei);
– sau promotor care asigură expresia specifică, într-un anumit tip de ţesut/
organ, sau expresia inductibilă prin rănire, stres termic etc.
La nivelul polilinkerului se pot introduce: gene de interes (pentru gena de
transfer); gene marker selectabile (pentru selecţia celulelor transformate); gene
raportor, care permit cuantificarea expresiei genetice (tabelul 2.3);
Tabelul 2.3
Genele marker selectabile şi identificabile, utilizate pentru selecţia celulelor
transformate şi cuantificarea expresiei genetice (după Badea şi Săndulescu, 2001)

Produsul genei marker Specia de origine Fenotipul

NPT II (Neomicinfosfo- Escherichia coli Rezistenţa la canamicină
transferaza)
PAT (Fosfinotricinacetil- Streptomyces Rezistenţa la fosfinotricin
transferaza) hygroscopicus (erbicid)
ALS (Acetolactatsintaza) Arabidopsis thaliana Rezistenţa la sulfoniluree
Nicotiana tabacum (erbicid)
GUS (β-glucuronidaza) Escherichia coli Formarea unor compuşi
coloraţi
LUX (Luciferaza) Photinus pyralis Emisie de lumină
Vibrio harveyi
GFP (proteină care emite Aequirea victoria Emisie de lumină
fluorescenţa verde) fluorescentă în UV

Secvenţa de poliadenilare asigură, ca ARNm al genei respective să se

transmită corect.
Aşadar, structura casetei de expresie construită pentru introducerea în vectorul
de transformare la plante, prezintă, parţial, rezolvarea următoarelor probleme:
115
 1. Dovada transformării plantelor prin includerea genelor markeri selectabile
în caseta de expresie a fitovectorului. Aceste gene codifică proteine care
detoxifică substanţele chimice incluse în mediul de cultură, permiţând
selecţia celulelor în ale căror nuclei au fost integrate. Cele mai folosite
codifică enzime ce conferă celulelor rezistenţă la antibiotice şi erbicide (NP
I II; PAT; ALS).
2. Asigurarea expresiei genei de interes prin intermediul sistemei
Agrobacterium (originea procariotă) în celula eucariotă a plantei cu
ajutorul genelor-raportor şi promotorilor constituitivi sau inductibili.
Genele de interes codifică proteine a căror sinteză conferă plantelor
transformate caractere importante din punct de vedere economic (toleranţa la
erbicide, rezistenţa la salinitate, rezistenţa la dăunători şi/sau agenţi patogeni etc.).
Genele-raportor (sau gene marker identificabile) codifică proteine care
determină formarea unui produs vizibil, ce permite identificarea celulelor
transformate (GUS; LUX; GFP).
Promotorii constitutivi cei mai utilizaţi la plante sunt: 35 S (de la virusul
mozaicului conopidei), pentru dicotiledonate, cel al genei actinei (de la orez), iar
pentru monocotiledonate – cel al genei ubiquitinei (de la porumb). Exemple de
promotori organ sau ţesut specifici:
– pentru sămânţă, promotorii vicilinei (de la mazăre), gluteninelor (de la grâu),
alfa-amilazei (se exprimă în stratul de aleuronă al seminţelor cerealelor);
– pentru ţesuturile fotosintetizatoare, promotorul Rubisco (ribuloz-
bifosfatcarboxilazei), promotorul CAB (asociat genelor care codifică
proteine ce leagă clorofila a/b);
– pentru antere, promotorii cu expresie specifică în tapetum.
În construcţiile genetice folosite pentru transformare cu ajutorul sistemului
Agrobacterium, se introduc şi cele două extremităţi, în lungime de 25 de perechi
de baze, provenite de la ADN-T din plasmida Ti, amplasate astfel, încât să
delimiteze segmentul de ADN care trebuie să ajungă în genomul celulei vegetale
ce trebuie transformată (fig. 2.12.).
Construcţia plasmidială folosită pentru transformare se numeşte vector binar,
pentru că posedă o origine a replicării care-i permite să se multiplice atât în E. coli,
cât şi în Agrobacterium. Experimenţele, în care se utilizează Agrobacterium ca
vector de transfer al genelor la plante, încep în E. coli, unde sunt realizate şi
amplificate construcţiile genetice. Aceste construcţii (vectori binari) sunt apoi
introduse în Agrobacterium, care posedă o plasmida Ti dezmembrată, ce exercită
însă funcţia de virulenţă în poziţie trans.
Pentru fiecare specie vegetală, trebuie elaborat un sistem de transformare care
să permită obţinerea unui număr mare de plante. Totodată, indiferent de specie,
etapele unui protocol de transformare sunt următoarele (fig. 2.13. Anexa):
116
Hind III

BamH I

EcoR I
Sma I
Sal I
Pst I
Situs de clonare
sau expresie multipl=

Gen= marker identificabil=

sau selectabil= la plant= Gen= de interes

Promotor de plant=
Promotor de plant=

Extremitate st=ng=
Extremitate dreapt=
ori E.coli
Gen= marker
pentru bacterie

Fig. 2.12. Vector pentru transformare şi expresie la plante

(după E. Badea şi D. Săndulescu).

– incubarea ţesutului vegetal în suspensia bacteriană (timp de câteva minute,

până la câteva ore);
– co-cultura ţesutului vegetal cu bacteria (timp de 48 de ore, până la 7-8 zile);

– selecţia celulelor transformate pe medii de cultură care conţin două

antibiotice (unul pentru eliminarea bacteriei şi altul pentru eliminarea
celulelor netransformate);
– regenerarea plantelor, fie direct, din celulele explantului, fie indirect, din
calus.
Prin intermediul sistemului de vectori Agrobacterium sunt folosite
următoarele tehnici:
– co-cultivarea cu protoplaste;
– transformarea cu discuri de frunze.
Tehnica co-cultivării cu protoplaste. Protoplaştii sunt expuşi timp de 24-40 h într-
o suspersie de Agrobacterium tumefaciens (cca 100 de bacterii pe protoplast), după
care ei sunt imediat cultivaţi pe mediu solid sau după ce au format microcalusuri.

117
Calusurile transferate genetic pot fi apoi regenerate pentru a da naştere plantelor
transgenice. Pentru a obţine plante transgenice, sunt necesare cca 6 luni.
Tehnica de transformare cu discuri de frunze. Se folosesc discuri (0.2 mm) de
la frunze tinere co-cultivate cu o cultură de Agrobacterium tumefaciens (5-10×106/
ml). Discurile se transferă pe hârtie de filtru pentru două zile, pe un mediu
conţinând kanamicină, pentru a elimina bacteriile. După aceea discurile se
transferă pe un mediu, care favorizează diferenţierea, astfel că plante transgenice
se pot obţine după 4-7 săptămâni. Sunt recomandate frunzele, deoarece ele posedă
o structură genetică uniformă şi au o mare capacitate de regenerare.
Transformarea cu ajutorul discurilor de frunze nu presupune formarea
calusului sau protoplaştilor, dar succesul regenerării plantelor normale este foarte
mare. Metoda este simplă şi permite obţinerea, relativ rapidă, a plantelor
transgenice; 10-60% de plante modificate genetic în dependenţă de specia plantei.
În afară de sistemul Agrobacterium, în calitate de fitovectori sunt folosite
virusurile, mai ales că numeroase virusuri sunt sintetice, astfel că genele pot fi
introduse în toate celulele plantelor. Ca vectori se folosesc: virusul conopidei
(Cauliflower mosaic virus – CaMW), care are 8 kb şi un genom de ADN bicatenar,
virusul mozaicului la Bromus (Bromus mosaic virus – BMW), care infectează
unele monocotiledonate şi care are genom ARN.
Utilizarea virusurilor ca vectori nu a depăşit stadiul de “studiu de fezabilitate”,
deoarece acest sistem prezintă, pe lângă avantaje, şi unele limite.
Avantajele sunt următoarele:
a) infecţia sistemică determină formarea unui număr mare de copii ale
transgenei în fiecare celulă (ceea ce echivalează cu sinteza unei cantităţi
mari de produs genic);
b) nu se mai pune problema regenerării plantelor din celulele transformate.
Limitele sunt următoarele:
a) specificitatea de gazdă;
b) integrarea instabilă a genei transferate în genomul plantei nu asigură
transmiterea fidelă la descendenţi;
c) riscul inducerii simptomelor bolii virale;
d) imposibilitatea transferării unor fragmente de ADN de mari dimensiuni;
e) în cazul ribovirusurilor, imposibilitatea utilizării directe ca vectori (în
asemenea situaţii, ARN-ul viral trebuie transformat, în prealabil, în ADN
complementar).

2.3.3.2. Transferul direct al genelor la plante.

Grupa a doua a tehnologiilor de transfer direct a genelor în celula vegetală
include următoarele metode:
1) Transformarea protoplaştilor;

118
 2) Electroporarea celulelor şi ţesuturilor etc;
3) Microinjecţia;
4) Bombardamentul cu particule pe care se precipită ADN-ul plasmidial.
Transformarea protoplaştilor şi electroporarea. Aşa cum s-a menţionat,
protoplaştii sunt celule vegetale ale căror pereţi celulari au fost înlăturaţi prin
digestie enzimatică, fapt ce permite folosirea lor în experimente de inginerie
genetică legate de hibridarea somatică şi transferul de gene.
Pentru facilitarea pătrunderii ADN-ului transformant prin membrana plas-
matică se utilizează polietilen glicol (PEG) sau se aplică electroporarea. În primul
caz, protoplaştii proaspăt izolaţi sunt incubate cu ADN plasmidial în prezenţa PEG
şi a ionilor de Ca2+ sau Mg2+, la un pH optim (6,0-6,5). În cazul tratamentului cu
PEG, frecvenţa transformării depinde de: concentraţia ADN; raportul ADN /
protoplaşti; concentraţia PEG (25%); greutatea moleculară a PEG. În al doilea caz,
suspensiei care conţine protoplaşti şi ADN plasmidial i se aplică şocuri electrice,
care induc formarea unor pori reversibili în membrana plasmatică. În această
situaţie, eficienţa transformării depinde de: durata şi numărul impulsurilor
electrice; tensiunea folosită (200-600 V/ cm 2); mediul utilizat; concentraţia de
ADN plasmidial (1-10 mg/ml); dimensiunile şi configuraţia plasmidei (super-
răsucită sau linearizată); densitatea protoplaştilor în mediu (0,5-10 6/ml).
Recent, a fost testată şi tehnica microinjecţiilor cu ADN exogen în soluţie.
Experienţele efectuate cu ajutorul acestei tehnici nu au dat rezultate prea bune,
încorporând gene străine numai 1/10 000 din plantele regenerate.
În 1987, T. M. Klein de la Universitatea Cornel din New York a elaborat
metoda bombardării celulelor cu microbile metalice învelite în ADN plasmidial
(Particles gun systems). În acest scop se folosesc microbile de tungsten (sau aur
iridiu, platină, paladiu, radiu) cu un diametru de 4 µ. S-a constatat, că 100 de
micrograme de tungsten sau aur, pot transporta 0.1 micrograme de ADN.
Bombardamentul cu aceste microbile se realizează în culturi de celule în
suspensie. Pentru propulsarea microbilelor cu viteza de 430 m/sec se foloseşte un
jet de aer comprimat, sau un câmp electric cu ajutorul unui aparat elaborat de
firma “Agracetus” din SUA. Actualmente, bombardamentul cu aceste microbile
metalice se realizează direct asupra unor ţesuturi vegetale (frunze, tulpini, rădăcini
etc.), din care pot fi apoi regenerate plante, care posedă ADN-ul exogen. Acestea
sunt plantele transformate genetic.
Tunul pentru microbile metalice constituie o adevărată balistică biologică sau
biolistică, el poate fi utilizat pentru transferul de gene atât la plante, cât şi la
animale.
Cu ajutorul balisticii biologice au fost transformate genetic plantele
monocotiledonate: porumb, orez, grâu, orz, – şi au fost obţinute plante transgenice
stabile. Pe lângă aceasta, balistica se foloseşte pentru transferarea directă a

119
ARN-ului plasmidial în polenul embriogen şi pentru obţinerea plantelor
transgenice dihaploide, care prezintă un material important pentru procesul de
ameliorare. Prin acestă metodă a fost efectuată transformarea plantelor la tutun şi,
după regenerarea plantelor haploide, au fost obţinuţi transformanţi stabili.

2.3.3.3. Tehnologia antisens.

Obiectivul experimentelor de inginerie genetică poate consta nu numai în
manifestarea unor transgene, ci şi în suprimarea selectivă a expresiei anumitor
gene preexistente în planta transformată (endogene). Tehnologia antisens recurge
la o construcţie genetică în care regiunea codificatoare a genei este orientată în
sens invers. Introdusă în plantă, această construcţie va determina sinteza unui
ARN-antisens, iar în consecinţă – sinteza proteinei considerată “inoportună” va fi
blocată (fig. 2.14. Anexa).
Tehnica ARN-antimesager permite blocarea selectivă a expresiei anumitor
gene. Ea asigură lupta contra unor virusuri prin blocarea selectivă a unor gene
virale. Principala limită a acestei metode este determinată de faptul, că plantele
transgenice manifestă niveluri foarte variate de exprimare a transgenei.
Variabilitatea efectului antisens s-ar putea datora variabilităţii de poziţie, adică
locului din genom în care se integrează transgena. Pentru a depăşi problemele
apărute, se preconizează utilizarea unor transgene cât mai asemănătoare cu genele
naturale, prin flancarea ADN-ului de către regiunile de ataşare la matricea nucleară
(SAR = scaffold attachement regions), sau prin folosirea unor promotori cu
activitate transcripţională intensă în ţesutul-ţintă. Dacă va putea fi majorată şi
controlată expresia transgenelor introduse, inhibarea genelor specifice în plantă,
prin utilizarea expresiei genelor ARN-antisens, va deveni o metodă extrem de
eficientă în ameliorarea plantelor cultivate.
A. R. Van der Krol (1988) a folosit ARN-antimesager al genelor privind
culoarea florilor de Petunia. Metoda se bazează pe faptul, că ARNm formează un
complex stabil cu ARN-antisens, pe baza principiului de complementaritate a
nucleotidelor. Acest complex nu poate fi decodificat în proteine. ARNm al unei
gene, blocat de un ARN-antisens, face ca proteina codificată de genă să nu mai fie
sintetizată. Deci, în celula vegetală trebuie introdusă gena-antisens care produce un
ARN-antisens, complementar cu cel normal (ARNm). Astfel, se obţine un hibrid
molecular, care blochează total sau parţial sinteza proteinei respective. Hibridul
ARNm/ARN-antisens format în nucleu împiedică migrarea ARNm în citoplasmă,
locul sintezei proteice.
La Petunia, pigmentaţia roşie este legată de expresia unui ansamblu de gene
responsabile de sinteza unor compuşi esenţiali, denumiţi flavonoizi. O enzimă din
această cale metabolică este chalcon-sintetaza, codificată de o familie de gene. Una
dintre ele, gena A, este dominantă. Cercetătorii au construit artificial gena-antisens
120
a enzimei respective, care apoi a fost introdusă în celule de Petunia, din care au
regenerat plante. Plantele transgenice au încorporat gena antichalcon-sintetazei. Ca
urmare, se produce o alterare a pigmentaţiei, plantele prezentând decolorări mai
mult sau mai puţin pronunţate, din cauză că gena enzimei este blocată.
Prima plantă de “cultură-antisens” comercializată este tomata cu întârzierea
procesului de coacere.

2.3.4. Regenerarea celulelor transformate.

Regenerarea plantelor mature din celulele transformate depinde, în mare
măsură, de totipotenţa celulelor. Totipotenţa se manifestă bine la celulele plantelor
dicotiledonate, de exemplu, la tutun, cartof, sfecla de zahăr, rapiţă, soia, lucernă,
tomate, morcov, varză etc. La monocotiledonate, îndeosebi la cereale, această
proprietate se manifestă destul de slab, de aceea, procesul de regenerare a celulelor
în planta întreagă se realizează cu mari dificultăţi.
Aplicarea cu succes, într-un program de ameliorare, a unei metode de
transformare genetică necesită o regenerare eficientă şi un nivel înalt de
reproducere, pentru ca un număr mare de plante să ajungă în experienţele de câmp
(fig. 2.15. Anexa).
Deci, tipul şi frecvenţa regenerării sunt factorii decesivi pentru transformarea
genetică a plantelor.

2.4. Plante transgenice

Pe baza elaborării metodelor eficiente de transfer al genelor au fost create
numeroase plante transgenice de diverse specii, în scopul ameliorării diferitelor
caractere valoroase ale plantelor pentru folosire în agricultură, industrie, medicină
etc.
Clasificarea acestor plante transgenice se bazează pe diferite principii:
Principiul 1: repartizarea plantelor transgenice create la momentul dat pe trei
generaţii:
a) prima generaţie – cu caractere “input” – caractere care generează valoare,
asigurând creşterea producţiei prin protejarea culturilor (exemple:
rezistenţa la erbicide, insecte, virusuri, etc.) (fig. 2.16. Anexa).
b) a doua generaţie – cu caractere «output» – produse vegetale cu însuşiri
nutritive ameliorate (exemple: modificări ale conţinutului de amidon,
proteină, uleiuri; modificarea însuşirilor de panificaţie la grâu etc.)
(fig. 2.17. Anexa);
c) a treia generaţie – plantele biofabrici, care produc molecule terapeutice sau
vaccine.
Principiul 2: repartizarea plantelor transgenice pe baza următoarelor criterii
biologice şi agronomice valoroase pentru agricultură, alimentaţie şi medicină:
121
 – rezistenţă la factori biotici (maladii şi insecte);
– toleranţă la factori abiotici reglatori (erbicide, îngrăşăminte) şi nereglatori
(îngheţ, secetă, salinitate, stres oxidativ etc.);
– fitoremediere;
– modificarea caracterelor ontogenetice şi de reproducere a organismelor;
– ameliorarea calităţilor biochimice a produselor vegetale;
– modificarea calităţilor tehnologice;
– modificarea caracterelor valoroase pentru industrie;
– utilizarea terapeutică.

2.4.1. Plante transgenice rezistente la maladii.

a) Argumentarea necesităţii transferării de gene pentru rezistenţa la boli.
Actualmente, pe plan mondial, pierderile de recoltă cauzate de diferiţi agenţi
fitopatogeni – virusuri, bacterii, ciuperci sunt estimate aproximativ la 13,5% din
potenţialul genetic al tuturor culturilor. Principalele mijloace de combatere a
bolilor plantelor sunt: cultivarea varietăţilor de plante rezistente; aplicarea
practicilor agrotehnice adecvate (rotaţia culturilor etc.); aplicarea tratamentelor cu
pesticide. Fiecare dintre aceste mijloace prezintă, însă, limite nete.
Astfel, opţiunea cultivării varietăţilor de plante rezistente se confruntă cu
dificultăţi legate de faptul că: pentru numeroase boli, nu există surse de rezistenţă
eficace; plantele pot fi rezistente doar faţă de câteva subspecii ale patogenilor; cu
timpul, pot să apară forme ale patogenilor ce depăşesc chiar rezistenţa unor
varietăţi cunoscute ca foarte rezistente, reducând mult durata de utilizare a acestora
din urmă.
Utilizarea pesticidelor generează probleme prin selecţia unor tulpini ale
patogenilor rezistente la diferite substanţe active, ca şi prin efectele lor nocive
asupra mediului şi sănătăţii oamenilor.
În consecinţă, a devenit absolut necesară elaborarea unor noi mijloace de
protecţie a culturilor împotriva bolilor, a căror aplicare să nu genereze măcar o
parte dintre problemele menţionate. În primul rând, desigur, pe cele legate de
sănătatea oamenilor şi de impactul asupra mediului.
Progresele înregistrate în domeniul biologiei moleculare au permis înţelegerea
şi acceptarea aplicării mecanismelor moleculare complexe de recunoaştere plantă-
patogen, a strategiilor naturale de apărare a gazdelor vegetale, au făcut posibilă
obţinerea prin transgeneză a unor plante rezistente la diverşi patogeni.
b) Strategiile aplicate pentru obţinerea plantelor transgenice rezistente la
patogeni.
Pentru a obţine varietăţi ale plantelor cultivate rezistente la patogeni, sunt
utilizate transgene ale căror produşi interferează, direct sau indirect, cu dezvoltarea

122
parazitului. În dependenţă de originea şi funcţia iniţială a transgenei utilizate,
există următoarele strategii:
– folosirea transgenelor derivate de la patogen;
– folosirea transgenelor derivate de la plante;
– folosirea transgenelor derivate de la organismele heteroloage (insecte,
bacterii, drojdii, animale superioare).
c) Transgene derivate de la patogeni.
Pentru manipularea rezistenţei au fost utilizate gene virale care codifică:
– proteina învelişului viral (capsidei);
– ARN-polimeraza dependentă de ARN, sau replicaza, implicată în replicarea
virusului;
– ARN, cu orientare sens sau antisens;
– ARN-sateliţi sau ARN-defectivi interferanţi.
Rezistenţa mediată de proteina capsidei. S-a demonstrat, că infecţia unei
plante cu o tulpină virală mai puţin virulentă protejează organismul contra unei
infecţii ulterioare cu o tulpină mai virulentă, datorită faptului că replicarea primei
tulpini interferează cu cea de a doua. S-au făcut experienţe de constituire a unui
vector care să introducă în plantele de tomate gena proteinei din capsida VMT
(virusul mozaicului tutunului). Acest virus are un genom ARN cu o mărime de 6,5
kb. În genom există 4 gene ce codifică: două subunităţi ale polimerazei, o proteină
a capsidei şi o proteină importantă pentru legătura celulă-la-celulă. Gena proteinei
capsidei a fost clonată, apoi legată de un vector ADN-T de la plasmidul Ti din
Agrobacterium tumefaciens. Plasmidul recombinat a fost introdus în celulele de
tutun prin metoda discurilor de frunză. Plantele transgenice obţinute exprimau în
diferite niveluri proteina capsidei VMT şi posedau o rezistenţă mărită la atacul
viral. În timp ce plantele-martor infectate manifestau simptome după 3-4 zile,
plantele transgenice erau rezistente la infecţie şi după 30 de zile. Pentru a mări
expresia genei respective, s-a utilizat un promotor de la virusul mozaicului
conopidei (CaMV).
Specificitatea rezistenţei mediate de proteina virală a fost studiată la câteva
sisteme. Plantele de tutun transgenice care exprimau gena proteinei virusului
mozaicului soiei, un virus pentru care tutunul nu este gazdă, au fost rezistente la
două virusuri neînrudite serologic. Plantele transgenice de tutun, care exprimau
gena proteinei-capsidă a virusului mozaicului salatei, au fost rezistente şi la virusul
Y al cartofului.
Testarea în câmp a plantelor transgenice rezistente la virusuri este obligatorie,
pentru a evalua durabilitatea rezistenţei în condiţii naturale şi, de asemenea, pentru a
constata, dacă au fost păstrate caracterele importante din punct de vedere agronomic
ale soiului iniţial, după parcurgerea protocolului de transformare. Faptul că strategia
rezistenţei mediate de proteina învelişului este aplicată pe o scară largă
123
încă de la mijlocul anilor 80, a făcut ca, până în prezent, să fie evaluate mai multe
linii transgenice de cartof, tomate şi castraveţi. În toate cazurile, rezultatele au
confirmat persistenţa în timp atât a rezistenţei în condiţii de câmp, cât şi a valorii
comerciale, în cazul liniilor obţinute.
Rezistenţa mediată de replicaza virală. Aproape toate virusurile codifică
enzime implicate în replicarea lor. Virusurile ARN necesită enzime pentru sinteza
ARN, pe matriţă de ARN. Pentru cele mai multe virusuri al căror genom a fost
secvenţializat, au fost identificate genele, al căror produs este implicat în replicare.
Acest fapt a făcut posibilă obţinerea plantelor transgenice care conţin fie întreaga
genă pentru replicază, fie versiuni modificate ale acesteia, cu anumite secvenţe
schimbate sau delestate (ARN-sens şi ARN-antisens).
Protecţia mediată de replicaza virală a fost obţinută pentru prima dată la
plantele transgenice de tutun cu o genă (P54) de la VMT. Plantele transgenice ce
posedau această genă manifestau un nivel de rezistenţă foarte ridicat atât faţă de
VMT, cât si faţă de acidul ribonucleic al acestui virus.
ARN-sens şi ARN-antisens. Rezistenţa mediată de ARN-antisens a fost
raportată faţă de virusul mozaicului auriu al tomatelor şi faţă de VMT. Plantele de
tutun transgenice, care exprimau transcripţii antisens ai genei AL1 a virusului
mozaicului auriu al tomatelor, au manifestat simptome mult atenuate în cazul
infectării cu virusul respectiv. Transgena antisens utilizată pentru obţinerea
rezistenţei la VMT a fost direcţionată împotriva capătului 5′ al genomului viral.
A fost investigată, de asemenea, capacitatea transcripţilor de ARN viral – sens
(în afara celor derivaţi din transgenele proteinelor virale) de a conferi rezistenţă
plantelor transgenice. Plantele transgenice, care exprimau regiunea 3′ netranslată a
genomului virusului mozaicului galben al tomatelor, au fost parţial protejate faţă
de patogenul respectiv.
ARN-satelit. Sateliţii sunt ARN virali mici (aproximativ 300 de nucleotide),
care nu se pot replica singuri şi nici nu pot infecta, dar care sunt paraziţi
moleculari esenţiali ai unor virusuri. Unii sateliţi nu au nici un efect, alţii reduc
simptomele şi nivelurile de replicare ale virusurilor, iar o altă grupă agravează
simptomele generate de infecţii virale. Studiul plantelor transgenice care exprimau
copiile ADNc ale ARN, sateliţi ce atenuează simptomele virusului mozaicului
conopidei şi virusului petelor inelare al tutunului, plante inoculate cu virusurile
parentale, – a relevat o creştere semnificativă a transcriptului ARN satelit şi,
implicit, a rezistenţei. Strategia ARN satelit este limitată la virusurile care au acest
tip de ARN şi prezintă dezavantajul că unele combinaţii satelit-virus pot agrava
simptomele, cu efecte dezastruoase.
d) Transgene derivate de la plante.
Gene care codifică proteine antitoxice. La unele specii de plante a fost
identificată o clasă de polipeptide antivirale, cunoscute ca proteine care
inactivează
124
ribozomii (RIP - ribosome-inactivating proteins). La Phytolacca americana au fost
identificate trei proteine antivirale: una în frunzele de primăvară, alta în frunzele de
vară şi o a treia, în seminţe. Inhibarea funcţiei ribozomilor poate fi determinată de
capacitatea lor de a modifica ARN ribozomal, interferând cu translaţia. RIP posedă, de
asemenea, şi o activitate antivirală cu spectru larg, deşi nici particula virală şi nici
genomul viral nu sunt afectate prin activitatea lor. Se pare că activitatea antivirală a
Rip-ului este consecinţa inactivării ribozomilor din celulele-gazdei.
Au fost obţinute plante transgenice de tutun şi cartof care exprimau o proteină
antivirală de la Pbytolacca. Testarea rezistenţei acestor plante la trei virusuri
neînrudite (virusurile X şi Y ale cartofului şi virusul mozaicului castravetelui) a
evidenţiat faptul, că sinteza proteinelor antivirale conferea rezistenţă la inocularea
mecanică, o rezistenţă corelată pozitiv cu cantitatea de proteină sintetizată.
Purificate, proteinele de la orz au o acţiune antifungică notabilă in vitro,
acţiune care se intensifică în prezenţa enzimelor ce degradează pereţii celulelor,
adică a celulazelor şi glucanazelor. Au fost deja obţinute plante transgenice de
tutun care exprimă gena RIP de la orz. Experienţele ulterioare vor confirma sau
vor infirma posibilitatea utilizării membrilor acestei familii de peptide toxice,
pentru protecţia plantelor transgenice faţă de atacurile patogenilor.
Defensinele compun o altă familie de peptide mici cu acţiune antifungică.
Unele dintre ele, izolate din seminţe de Raphanus sativus, Amaranthus caudatus,
Mirabilis jalapa, Urtica dioica, Triticum sp. şi Hordeum sp., sunt active in vitro
împotriva unui spectru larg de patogeni. O genă de la ridiche, care codifică o
defensină, a fost exprimată în plantele transgenice de tutun, care au manifestat un
nivel înalt de rezistenţă faţă de Alternaria alternata.
În endospermul şi frunzele cerealelor se sintetizează încă o clasă de peptide
toxice: tioninele. Plantele transgenice de tutun, în care se exprima la niveluri înalte
gena α-tioninei, provenită de la orz, au fost rezistente faţă de doi patogeni
bacterieni – P. syringae pv. tabaci şi P. syringae pv. syringae, după inoculare
artificială.
Gene care codifică enzime litice.
Multe dintre proteinele corelate cu patogeneza au acţiune antifungică in vitro.
Cele mai bine studiate sunt enzimele litice produse de plante: chitinazele şi 6-1-3
glucanazele.
Chitinazele hidrolizează chitina, componenta majoră a pereţilor celulari la cei mai
mulţi dintre fungii filamentoşi. Au fost izolate mai multe gene pentru chitinază, de la
diferite specii de plante, gene, care au fost transferate şi exprimate în plante
transgenice. De exemplu, plantele transgenice de rapiţă, care exprimau constitutiv o
genă ce codifică o chitinază, provenită de la tomate, au manifestat în testele de câmp o
toleranţă sporită faţă de trei patogeni fungici diferiţi: Cylindrosporium concentricum,
Phoma ingam şi Sclerotinia sclerotiorum, iar expresia constitutivă
125
a ADNc care codifică 6-1-3 glucanaza, provenit de la soia, a conferit plantelor
transgenice de tutun rezistenţă la atacurile fungilor care conţin glucan: Phytophthora
tabacina şi P. parasitica var. nicotianae. Cea mai eficientă protecţie antifungică a fost
asigurată însă de coexpresia genelor chitinazei şi glucanazei în aceeaşi plantă, mult
mai eficientă decât protecţia asigurată de expresia fiecărei gene în parte.
Gene care codifică sinteza fitoalexinelor.
Biosinteza fitoalexinelor este indusă de atacurile agenţilor fitopatogeni sau de
unele molecule, numite elicitori. Orice schimbare în compoziţia acestor compuşi ar
putea ameliora capacitatea de apărare a plantelor. De exemplu, mai multe specii de
plante cultivate în perioada, când sunt atacate de patogeni, sintetizează fitoalexina
de tip stilben-resveratrol, printre ele aflându-se şi tutunul. Biosinteza stilbenului
necesită prezenţa enzimei stilben sintază şi a moleculelor precursoare. Plantele
transgenice de tutun, care posedă gena pentru stilben sintază provenită de la viţa de
vie, au fost mai rezistente la infecţia cu Botrytis cinerea, decât plantele de tutun
convenţionale.
e) Transgene derivate de la organismele heteroloage.
Organismele heteroloage (insectele, bacteriile, drojdiile, animalele
superioare ...) constituie o a treia sursă de gene de rezistenţă la atacurile
patogenilor, gene care codifică, în general, proteine implicate în protecţia
organismelor donoatoare.
Cecropinele alcătuiesc o familie de polipeptide mici, care au acţiune litică
asupra bacteriilor fitopatogene. Au fost obţinute plante transgenice cu gene
himere, care asigură un nivel înalt şi un mod specific de expresie a genelor ce
codifică cecropinele. Primele evaluări a rezistenţei acestor plante la patogenii
bacterieni sunt încurajatoare.
Chitinazele microbiene, de altfel, ca şi cele de natură vegetală, pot conferi
plantelor transgenice rezistenţă la atacurile patogenilor. Au fost izolate mai multe
gene care codifică chitinazele, de la diferite tipuri de microorganisme. Plantele
transgenice de tutun, care conţin asemenea gene, s-au dovedit a fi rezistente la
atacurile unor patogeni redutabili. Primele rezultate demonstrează utilitatea acestor
gene pentru dobândirea unei protecţii sporite împotriva patogenilor fungici.
Lizozimele dezvoltă o activitate hidrolitică specifică asupra pereţilor celulelor
bacteriene. Expresia genelor pentru lizozime în plantele transgenice a fost propusă
ca un procedeu de sporire a rezistenţei faţă de unele bacterii patogene. Primele
transgene folosite au fost gena pentru lizozimul din albumina oului de găină, o
genă de la fagul T4 şi o genă provenită de la om.
Interferonul reprezintă un component care nu are activitate antivirală directă,
ci induce sinteza unor proteine capabile să inhibe multiplicarea virusurilor.
Primele rezultate indică faptul, că utilizarea genelor implicate în răspunsul
antiviral indus de interferon este o soluţie, care asigură un nivel înalt de rezistenţă
şi un spectru larg de acţiune.
126
 Producerea anticorpilor specifici pentru antigene. Recunoaşterea şi
neutralizarea agentului patogen sunt mediate de anticorpi, prin urmare s-a
considerat că expresia în plantele transgenice a genelor care codifică anticorpi, mai
mult sau mai puţin modificaţi (planticorpi, anticorpi monocatenari), ar putea să
confere niveluri ridicate de rezistenţă la patogeni specifici. Au fost, astfel, obţinute
plante transgenice de tutun, care sintetizează anticorpi monocatenari ce conţin
numai domeniile necesare pentru recunoaşterea şi legarea antigenei, adică a
proteinei virale. Această tehnologie, deocamdată puţin valorificată, va pune la
dispoziţia ingineriei genetice o gamă nelimitată de anticorpi specifici.
Aşadar, au fost realizate progrese substanţiale pe această cale. Primele
succese: plante rezistente la virusuri. De exemplu, în SUA a fost comercializată o
varietate transgenică de dovlecel, rezistentă la două virusuri: virusul mozaicului
galben al dovlecelului şi virusul mozaicului pepenelui verde. În curând, se aşteaptă
pe piaţă varietăţi de cartof rezistente la virusurile X şi Y.
Producţia de plante transgenice cu niveluri de rezistenţă la boli de natură
bacteriană sau fungică utile în culturi comerciale este, deocamdată, din unele
considerente mult mai restrânsă.

2.4.2. Plante transgenice rezistente la insecte.

a) Argumentarea necesităţii transferării de gene pentru rezistenţa la insecte.
Valorile pierderilor globale de recoltă, cauzate de insecte şi costul insecticidelor
chimice folosite în agricultură, atinge suma de 3-5 miliarde dolari pe an. Din
această cauză, un obiectiv prioritar al biotehnologiilor agricole este ameliorarea
rezistenţei plantelor cultivate la insecte.
Chiar în condiţiile aplicării tratamentelor cu insecticide, se estimează că
producţia agricolă este redusă cu 13%, în raport cu potenţialul nominal al
culturilor, ca urmare a atacurilor insectelor.
Pentru protecţia plantelor cultivate împotriva insectelor dăunătoare, se
folosesc diverse metode: crearea unor soiuri rezistente; rotaţia culturilor;
prelucrarea solului; instalarea capcanelor în culturi; epoca optimă de semănat;
aplicarea tratamentelor cu insecticide; stimularea activităţii entomofaunei utile,
care include şi numeroşi paraziţi şi prădători ai dăunătorilor; combaterea
integrată, care presupune asocierea cât mai raţională a metodelor de mai sus, în
vederea menţinerii populaţiilor dăunătorilor sub nivelul la care ar putea
produce daune.
De altfel, s-a constatat însă că numeroase microorganisme, bacterii şi
fungi, “se hrănesc” cu insecte. De exemplu, bacteria Bacillus thuringiensis
omoară insectele cu o proteină insecticid şi apoi trăieşte pe insectele moarte.
Această proteină-insecticid are o acţiune selectivă, afectând, exclusiv, câteva
specii de dăunători redutabili ai culturilor agricole.
127
 Producerea în plantă a proteinelor toxice pentru insecte prezintă numeroase
avantaje comparativ cu utilizarea insecticidelor chimice sau biologice. Prin
ingineria genetică, genele ce codifică sinteza acestor pesticide naturale pot fi
transferate, de la bacterie, la plantele de interes economic, care intră, astfel, în
posesia unei arme eficiente împotriva dăunătorilor ce reduc drastic recoltele.
b) Strategii pentru obţinerea plantelor transgenice rezistente la insecte.
Strategia 1.
Pentru obţinerea plantelor modificate genetic, rezistente la atacurile unor
insecte, până în prezent au fost folosite gene de origine bacteriană şi vegetală. Cea
mai exploatată sursă de asemenea gene de rezistenţă este bacteria Bacillus
thuringiensis (Bt). Această bacterie produce după sporulare toxina Bt, o proteină
cristalizată, toxică pentru larvele unor specii de insecte, dar ea nu afectează
animalele vertebrate. Bacteria respectivă sintetizează toxine cu o mare
specificitate, denumite delta-endotoxine; unele din ele sunt active contra unor
Diptere (cry II şi cry IV), altele contra unor Lepidoptere (cry I şi cry II) sau
Coleoptere (cry III). Prezenţa toxinei se limitează la planta în cauză şi, în
consecinţă, sunt afectate numai insectele fitofage. Astfel, devine posibilă
combaterea insectelor miniere, la fel ca şi a celor care atacă rădăcinile.
Această strategie este, deci, mult mai ecologică, decât utilizarea insecticidelor
sintetizate artificial. Rezultatele obţinute, în ultimii ani, în realizarea unor plante de
cultură modificate genetic, rezistente la dăunătorii din această categorie, sunt
impresionante. Ele au fost posibile graţie utilizării unor pesticide microbiene
naturale, produse de Bacillus thuringiensis.
Strategia 2.
În timp ce primele soiuri rezistente la insecte au ajuns deja pe piaţă, se fac
eforturi de a descoperi alte proteine insecticide. În plante au fost descoperite mai
multe proteine, cum sunt, de exemplu, lectinele, inhibitorii amilazei şi inhibitorii
proteazelor care, atunci când sunt ingerate în doze mari, pot întârzia creşterea şi
dezvoltarea insectelor, dar nu provoacă o rată atât de înaltă a mortalităţii acute ca
în cazul folosirii proteinelor Bt.
Strategia 3.
Această strategie este similară procedeului “coctail” (tratamentul cu mai multe
medicamente concomitent), aplicat în terapia umană, şi se bazează pe principiul
conform căruia este aproape imposibil ca o insectă să devină rezistentă la mai
multe proteine insecticide în acelaşi timp. În această ordine de idei, într-o specie
de plantă pot fi cumulate fie mai multe gene Bt, fie o genă Bt şi o genă de altă
provenienţă, care codifică o altă proteină insecticid. Dacă, însă, şi această strategie
128
eşuează, se pierd simultan, practic, toate mijloacele de apărare ale plantei şi devine
necesară revenirea la tratamentele cu insecticide chimice, ceea ce, evident, nu este
de dorit.
c) Rezistenţa mediată de proteina Bt de la Bacillus thuringiensis.
Pornind de la strategia 1, s-a reuşit transferul genei toxinei Bt la plante. Gena
toxinei codifică 1178 de aminoacizi. Ea este tăiată cu enzime de restricţie. S-a
sintetizat artificial segmentul ADN care codifică segmentul 1-453 de aminoacizi,
segment care este eficient în combaterea insectelor. Acesta este legat apoi cu
ajutorul enzimei – ligaza de un segment natural al genei ce codifică aminoacizii
454 -615. Segmentul dat este introdus într-un vector plasmidial ADN-T, care are
un promotor de la virusul CaMV al conopidei.
Prin infecţia cu Agrobacterium tumefaciens având plasmidul recombinat, s-au
obţinut plante transgenice de bumbac care sintetizează toxina. Prin utilizarea
tehnicii descrise, s-au obţinut plante care sintetizează de 100 de ori mai multă
toxină, decât plantele transgenice la care s-a transferat gena întreagă. Folosirea
promotorului viral de la CaMV măreşte de cca 5 ori procesul transcripţiei genei
respective; se măreşte, deci, eficienţa sintezei toxinei de către plantele de bumbac.
Plantele transgenice de bumbac devin rezistente la atacul mai multor specii de
insecte. Toxina acţionează prin cuplarea cu receptorii de pe suprafaţa celulară.
Transferul genei acestei endotoxine la soiul de tutun Petit Havana SR l a
demonstrat că rezistenţa la lepidopterul Manduca sexta se manifestă prin
toxicitatea ce determină o mortalitate a larvelor între 75 şi 100%. Plantele
transgenice de tutun manifestau diferite grade de rezistenţă la insecta respectivă,
deoarece produceau diferite cantităţi ale toxinei, în funcţie de poziţia genei
transferate. La cartof, s-au obţinut plante rezistente la gândacul de Colorado.
Recent, s-au obţinut plante transgenice rezistente la nematozii paraziţi sau la
ţânţarii care transportă agentul malariei. Proteina bacteriană produsă de plantele
transgenice reprezintă numai 0, l % din totalul de proteine al plantelor respective.
Primele varietăţi transgenice rezistente la atacurile unor insecte au fost
obţinute în 1987. În anul 2000, varietăţile transgenice de porumb şi bumbac au
ocupat milioane de hectare, iar peste 40 de gene de rezistenţă au fost transferate
la cca 20 de specii de plante cultivate.
Tehnologia Bt reprezintă pentru fermieri o nouă opţiune, care oferă
posibilitatea reducerii considerabile a costurilor de producţie şi minimalizării
efectelor adverse ale insecticidelor chimice asupra mediului.
În SUA, au fost calculate beneficiile cultivării porumbului Bt. S-a constatat
că, pentru obţinerea producţiei actuale, cultivarea în exclusivitate a porumbului
Bt ar permite economisirea a:
1) 2,5 milioane hectare de teren;
2) 100.000 tone de îngrăşăminte;
129
 3) 100 milioane tone de combustibil fosil;
4) 20-30 milioane dolari (valoarea tratamentelor care nu ar mai fi
necesare).
Pe de altă parte, pe aceleaşi suprafeţe şi cu aceleaşi cheltuieli totale ca şi
până acum, comparativ cu cazul utilizării hibrizilor tradiţionali de porumb,
cultivarea numai a porumbului Bt ar putea reduce pierderile de recoltă cu 15
milioane tone de boabe, ceea ce echivalează cu 33% din exporturile americane.
În acelaşi timp, este cunoscut faptul că, în plan mondial, la cultura porumbului
se folosesc anual 115.000 tone de pesticide, pentru ca pierderile de recoltă să
fie de “numai” o treime din producţia potenţială.
Efectele tratamentelor cu pesticide asupra mediului sunt dramatice: 70 de
milioane de păsări şi zeci de miliarde de insecte utile (polenizatoare, parazite şi
prădătoare ale dăunătorilor) sunt omorâte anual. Daunele sunt estimate la 1
miliard de dolari (USD) /an. Analogice sunt şi efectele asupra sănătăţii
oamenilor: 110.000 cazuri de intoxicaţii şi 10.000 cazuri de boli incurabile
anual.
Prin aplicarea măsurilor de combatere integrală, inclusiv prin introducerea
continuă în culturi a unor noi plante transgenice rezistente la atacurile
insectelor, va fi posibilă ameliorarea productivităţii în condiţiile reducerii
consumului de pesticide cu 50%. Ceea ce înseamnă, de fapt, apropierea de ceea
ce ar trebui să fie o agricultură durabilă.
d) Rezistenţa mediată de gene de origine vegetală.
În unele organe vegetale, în special în seminţele leguminoaselor şi cerealelor,
se găsesc polipeptide ce joacă un rol important în apărarea contra insectelor, dar şi
cu funcţii în reglarea dezvoltării (inhibitorii proteazelor), sau în fenomenele “de
recunoaştere celulară” (lectinele). Cea mai mare parte din insectele fitofage
utilizează proteazele pentru a digera proteinele ingerate. Se cunosc patru clase de
proteaze stabilite, în funcţie de mecanismul de reacţie şi tipul de rezidiu din situsul
lor activ:
– proteaze cu serină;
– proteaze cu cisteină;
– metaloproteaze;
– aspartil proteaze.
Se cunosc şi patru clase de inhibitori, care corespund proteazelor. Inhibitorii
vegetali ai proteazelor sunt proteine mici (5 – 25 kDa). Cei mai cunoscuţi sunt
inhibitorii proteazelor cu serină.
Inhibitorii proteazelor acţionează ca analogi ai substratului, dar formează cu
proteazele complexe necovalente stabile. Primele plante transgenice, care sintetizau un
inhibitor al proteazelor cu serină, au fost obţinute în 1987. Această strategie a fost
testată la mai multe specii de plante şi numai pentru protecţia împotriva

130
atacului lepidopterelor care posedă proteaze digestive. La plop, de exemplu, a fost
introdusă o genă care codifică orizacistatina (izolată de la orez). Plantele
transgenice au devenit rezistente la atacul larvelor de Chrisomela tremulae.
Un alt exemplu poate servi acţiunea unei gene, care codifică inhibitorul α-
amilazei (α-AI) în seminţele de fasole. Atunci când este exprimată în seminţele
plantelor trangenice de mazăre, ea determină acumulări mari ale proteinei şi, în
consecinţă, blocarea dezvoltării larvelor gărgăriţei mazării (Bruchus) într-un stadiu
foarte timpuriu, un dăunător de depozit redutabil. Proteina α-AI combate, deci, în
mod eficient, dăunătorii unor plante din familia leguminoaselor.
O genă, care determină sinteza unei proteine insecticide foarte eficace
împotriva gărgăriţei capsulelor de bumbac, a fost izolată din filtratul culturii de
Streptomyces. Ulterior, s-a constatat că această proteină este o colesterol-oxidază.
Când a fost exprimată la bumbac, gena care codifică această proteină a determinat
moartea larvelor gărgăriţei capsulei. Dacă se va reuşi sinteza colesterol-oxidazei în
bumbac, va deveni posibilă combaterea eficientă a acestui dăunător. Actualmente,
în laboratoarele academice şi industriale se fac eforturi intense pentru a descoperi
noi proteine-insecticide. Astfel, viitorul biotehnologiilor agricole care vizează
combaterea dăunătorilor pare a fi foarte promiţător.

2.4.3. Plante transgenice tolerante la erbicide.

a) Argumentarea necesităţii transferului de gene, care determină rezistenţa
la erbicide.
Erbicidele sunt substanţe chimice, care distrug buruienile dăunătoare
agriculturii, având o acţiune toxică limitată la unele specii vegetale sau pentru
orice specie.
Actualmente, erbicidele reprezintă principalul mijloc de combatere a
buruienilor. Folosirea lor se bazează pe acţiunea diferenţiată a substanţelor active
asupra plantelor de cultură şi buruienilor prezente în câmp.
După destinaţia lor, erbicidele trebuie să acţioneze, afectând doar buruienile,
nu şi cultura în care sunt aplicate. S-a constatat, că cele mai multe dintre ele sunt
specifice în tehnologia de cultivare a anumitor specii de plante agricole. Există
însă şi “erbicide totale”, care distrug toate speciile vegetale.
Pentru a putea fi utilizat, un compus chimic cu acţiune erbicidă trebuie să
îndeplinească următoarele condiţii:
– să fie eficient în combaterea buruienilor vizate, la o doză şi frecvenţă de
aplicare redusă;
– să fie selectiv, distrugând buruienile fără a afecta plantele cultivate;
– să fie degradabil, spre a nu lăsa reziduuri în sol şi/sau în apa freatică;
– să nu fie toxic pentru om şi animale.

131
 Un erbicid are, deci, patru caracteristici majore: toxicitatea, selectivitatea,
degradabilitatea şi eficacitatea.
Implementarea unui erbicid prin testare chimică şi sinteză este foarte scumpă.
Costurile, inclusiv ale înregistrării unui nou produs, ajung până la 20-25 milioane
dolari US. Pentru fiecare nou compus activ găsit, se testează cca 20000 de substanţe.
Noile erbicide trebuie să satisfacă mai multe condiţii: eficacitate erbicidă, dar şi o cât
mai mare inocivitate pentru mediu, în general, şi pentru mamifere, în special.
Ingineria genetică oferă posibilitatea de a simplifica mult lucrurile, sporind
considerabil selectivitatea tratamentelor cu erbicide prin modificarea plantelor
cultivate. Mai precis, prin obţinerea de plante trangenice rezistente sau tolerante
selectiv la cele mai performante substanţe active.
b) Strategii utilizate pentru obţinerea plantelor transgenice rezistente la
erbicide.
Pentru a crea plante tolerante la erbicide se pot utiliza cel puţin trei strategii:
1) mărirea expresiei genei enzimei-ţintă, care afectează un anumit erbicid;
2) utilizarea unei gene, care determină sinteza unei enzime rezistente la erbicide;
3) expresia unei gene care detoxifică erbicidul, metabolizându-l etc (tab. 2.4).

Tabelul 2.4
Mecanisme de rezistenţă la erbicide
(după E. Badea şi al., 2000)

Mecanisme Erbicide Enzime

supraexpresia ţintei glifosat (roundup) EPSP sintaza
fosfinitricin glutamin sintaza
mutaţia ţintei glifosat fosfinotricin acetiltransferaza
clorsulfuron nitrilază
atrazin spbA
detoxificarea fosfinotricin fosfinotricin acetiltransferază
Bromoxinil nitrilază
2.4-D 2.4D monooxigenază
EPSP sintaza = 5-enolpiruvil shikimat-3-fosfat sintaza SpbA
= proteină cloroplastică care participă la fotosinteză
c) Rezultatele obţinerii plantelor transgenice genetic, tolerante la erbicide.
Erbicidul glifosat constituie ingredientul activ al erbicidului comercial
Roundup. Acesta omoară buruienile prin inhibarea unei enzime sintetizate de
cloroplast, denumită 5-enolpiruvil shikimate 3-fosfat-sintaza – enzimă importantă
în calea metabolică de biosinteză a unor aminoacizi aromatici esenţiali. Erbicidul
este activ în doze foarte mici.
132
 Gena rezistenţei la glifosfat (gena pentru EPSP sintaza) de la bacterii a fost
clonată şi integrată într-un vector plasmidial ADN-T şi legată de un promotor viral
(CaMV). În plante, enzima este sintetizată în citoplasmă şi apoi transferată în
cloroplaste. Au fost obţinute plante transgenice, în care nivelul activităţii enzimei a
fost de peste 20 de ori mai mare decât în plantele obişnuite.
Gena pentru EPSP-sintaza a fost introdusă în genomul mai multor specii:
tomate, soia, bumbac, rapiţă etc. Plantele transgenice au devenit rezistente sau
tolerante la tratamentul cu erbicidul Roundup care, în acelaşi timp, distruge
buruienile.
În culturile de plante transgenice, erbicidul Roundup – care are ca substanţă
activă glifosatul, poate fi aplicat postemergent, în funcţie de necesităţi.
Posibilitatea extinderii utilizării acestui produs are o importanţă foarte mare,
datorită avantajelor incontestabile pe care le posedă: combate, practic, toate
buruienile; se leagă rapid de sol; este biodegradabil; are o toxicitate extrem de
mică pentru mamifere, păsări, peşti etc.
Soiul comercial de soia Roundup Ready, de asemenea tolerant la glifosat,
posedă o genă transferată de la o bacterie din sol (Agrobacterium sp.). Proteina
codificată de această genă este insensibilă Ia glifosat si, ca urmare, plantele de soia
transformate sintetizează aminoacizi aromatici si în prezenţa erbicidului.
Soiul comercial de porumb Roundup Ready, si el tolerant la glifosat,
posedă o genă izolată tot de la porumb, dar modificată prin mutageneză in vitro
si apoi transferată în genomul unei linii utilizate pentru producerea hibrizilor
comerciali. Hibrizii Roundup Ready oferă fermierilor o nouă posibilitate de
combatere eficientă a buruienilor, cu impact pozitiv asupra tehnologiei de
cultură a porumbului.
Pentru obţinerea plantelor transgenice tolerante la erbicidele sulfoniurea şi
imidazoline a fost aplicată a doua strategie. De exemplu, acetolactat-sintetaza
(ALS) este enzima ţintă pentru aceste erbicide, care catalizează prima etapă din
biosinteza aminoacizilor cu catenă ramificată (valină, leucină şi izoleucină). Gena
ALS a fost donată de la mutante rezistente de tutun, care posedau o enzimă
insensibilă la cele două substanţe erbicide active. Prin transferul acestei gene au
fost obţinute plante transgenice tolerante sau rezistente la compuşii respectivi.
A treia strategie presupune evidenţierea şi transferul la plantele de cultură a unor
gene care codifică sinteza unor enzime ce degradează substanţele active. De exemplu,
fosfinotricinul (PPT), un inhibitor al glutamin-sintetazei, este inactivat de o
acetiltransferază codificată de gena bar donată de la Streptomyces hygroscopicus.
Plantele, la care a fost transferată această genă, au devenit rezistente la fosfinotricin
bromoximilul – erbicid nitrilic, care poate fi degradat eficient de unele bacterii din sol.
Astfel, bacteria Klebsiella ozaenae foloseşte bromoxilmilul ca sursă de azot, deoarece
posedă enzima nitrilaza, care îl converteşte în acid 3,5-dibromo-4-
133
hidroxibenzoic. Gena care codifică această enzimă a fost folosită cu succes pentru
a obţine plante rezistente la acest erbicid: la bumbac, rapiţă, tutun etc.
d) Avantajele utilizării plantelor transgenice tolerante la erbicide în
agricultură:
1. Reducerea consumului de erbicide. Faptul că un erbicid poate fi aplicat
postemergent permite executarea tratamentelor numai atunci, când este nevoie,
ceea ce înseamnă mai puţină muncă, evitarea risipei de erbicide şi, implicit,
cheltuieli mai mici. De exemplu, în cultura de soia Roundup Ready se foloseşte
numai erbicidul Roundup Ready, în timp ce într-o cultură a unui soi de soia
convenţional trebuie să se aplice până la cinci produse chimice diferite.
În SUA, soia Roundup Ready a fost introdusă în cultură în anul 1996. În
cultivarea acestui soi, a fost folosită o cantitate de erbicide mult mai mică,
decât în culturile soiurilor convenţionale, în acelaşi timp producţia de boabe a
fost însă cu 5 – 24% mai mare.
2. Extinderea sistemelor de agricultură cu lucrări minime ale solului. An de
an, pe 1,5 miliarde de hectare sunt executate lucrările tradiţionale ale solului,
cu efectele negative de rigoare: distrugerea formelor de viaţă telurice şi
expunerea solului la acţiunea erozivă a vântului şi ploilor. Cultivarea unor
plante rezistente la erbicide face posibilă combaterea radicală a buruienilor in
condiţiile practicării lucrărilor minime ale solului.
3. Crearea premiselor pentru o nouă opţiune de combatere postemergentă
a buruienilor, în condiţiile în care toate celelalte metode şi produse rămân
valabile.
4. Rezolvă problema remanenţei unor produse toxice pentru culturile
postmergătoare şi, în general, asigură combaterea buruienilor cu efecte
ecotoxicologice minime datorită faptului că erbicidele Roundup Ready şi
Liberty Link sunt rapid biodegradate în sol.
5. Sporeşte flexibilitatea în alegerea momentului erbicidării, procedeu,
care poate fi realizat de la răsăritul până la înfloritul culturii.
6. Permite aplicarea unui produs cu spectru larg de acţiune – spectru, care
include buruieni anuale şi perene, mono- şi dicotiledonate, aflate în toate fazele de
dezvoltare, inclusiv speciile devenite rezistente la unele substanţe active folosite
până acum, în locul mai multor erbicide ce conţin diferite ingrediente active.
e) Riscurile asociate de cultivrarea plantelor rezistente la erbicide.
1. Apariţia unor buruieni rezistente faţă de erbicidele la care rezistă plantele
transgenice. În asemenea situaţie, buruienile în cauză pot fi combătute, desigur,
prin aplicarea altor erbicide.
2. Apariţia superburuienilor – în cazul speciilor a căror înmulţire nu poate fi
controlată. Avem în vedere două situaţii posibile:

134
 – transferul transgenei, pe cale sexuată, de la specia de cultură, în populaţia
unei buruieni cu care aceasta este înrudită;
– comportamentul invaziv al speciei cultivate rezistente la erbicide.
Companiile producătoare de plante transgenice sunt interesate în asigurarea
longevităţii produselor lor. Din această cauză, au fost elaborate sisteme de
combatere a buruienilor care reduc probabilitatea apariţiei necontrolate a unor
specii rezistente la erbicide. În acest scop a fost lansat, de exemplu, conceptul
rotaţiei erbicidelor.
3. Dependenţa fermierilor de companiile internaţionale. Dependenţa
fermierilor de unul sau de câţiva furnizori atât ai seminţelor, cât şi ale programelor
/ produselor de protecţie a loturilor. Companiile producătoare de seminţe crează o
gamă variată de produse (soiuri, linii), cu tipuri diferite de rezistenţă încorporată,
pentru ca fermierii să poată practica o adevărată rotaţie a programelor de
erbicidare, exact aşa cum se realizează şi rotaţia culturilor. Numai procedând în
acest fel, ele pot menţine la cote minime riscul apariţiei buruienilor rezistente la
erbicide şi, implicit, pot asigura longevitatea pe piaţă a plantelor transgenice pe
care le produc.

2.4.4. Plante transgenice tolerante la factori abiotici nereglatori.

Factorii de stres abiotici joacă un rol important în cultivarea plantelor agricole.

S-a stabilit, că productivitatea şi calitatea recoltei culturilor sunt puternic afectate
de majoritatea factorilor abiotici nereglatori. Din această cauză, printre obiectivele
ingineriei genetice figurează şi ameliorarea toleranţei plantelor cultivate la secetă,
la băltire, la temperaturi ridicate, scăzute şi chiar la îngheţ, la radiaţii, la salinitate
etc.
a) Principiile strategiilor utilizate pentru obţinerea plantelor transgenice
tolerante la factorii de stres abiotic. În general, organismul vegetal reacţionează la
stres prin adaptări biochimice şi fiziologice, dintre care cel puţin unele sunt
rezultante ale modificării expresiei unor gene. Deoarece capacitatea plantelor de a
se adapta la stres variază în limite foarte largi, se poate presupune că o serie de
gene utilizate în programele de ameliorare prin manipulare genetică ar putea fi
identificate chiar în regnul vegetal. Alte surse potenţiale de gene amelioratoare ale
toleranţei la factorii de stres abiotic sunt numeroasele bacterii şi animale capabile
să supravieţuiască în condiţii extreme de mediu.
Genele a căror expresie este indusă de factori de stres codifică:
– enzime implicate în anumite căi metabolice;
– proteine cu funcţie de reglare;
– proteine cu proprietăţi specifice de protecţie.

135
 Cu excepţia băltirii şi radiaţiei, factorii enumeraţi provoacă stres osmotic
pe fondalul deficitului hidric.
Celulele plantelor răspund la stresul osmotic prin:
– eliminarea ionilor;
– exportul ionilor;
– modificări ale pereţilor celulari;
– ajustări osmotice;
– osmoprotecţie;
– captarea speciilor reactive de oxigen.
Pentru ameliorarea toleranţei plantelor cultivate la stresul osmotic, pot fi
aplicate mai multe strategii, care presupun folosirea unor gene ce codifică:
– enzime care transformă substraturi existente în plantă, în mod natural, în
produşi osmoprotectori;
– enzime care modifică membranele;
– enzime implicate în captarea radicalilor;
– proteine induse de stres.

b) Toleranţa la salinitate. Pentru crearea plantelor transgenice tolerante la

salinitate sunt folosite următoarele gene: BetaA şi Mltd.
Bacteriile Escherichia coli sintetizează glicin betaină cu ajutorul colin
dehidrogenazei codificate de gena BetaA. Prin transferul acestei gene la plantele de
tutun, au fost obţinute forme tolerante la salinitate.
O genă bacteriană (Mltd) care codifică manitol l – fosfat dehidrogenaza-genă
pusă sub controlul promotorului constitutiv 35S – a fost transferată la tutun şi la
Arabidopsis thaliana. Au rezultat plante transgenice care sintetizează şi
acumulează manitol (osmoprotector) şi care au manifestat toleranţă la salinitate.
Cantităţile de manitol acumulate – de 100-150 mM – au avut mai degrabă funcţie
osmoprotectoare (de exemplu, stabilizarea membranelor subcelulare şi/sau
structurilor macromoleculare), decât de ajustare osmotică.
c) Toleranţa la secetă şi termotoleranţa (temperaturi extreme).
În vederea toleranţei la secetă şi termotoleranţă au fost depistate şi izolate
mai multe gene atât de natură bacteriană, cât şi vegetală. În cointinuare,
menţionăm realizările mai importante în această direcţie.
Gena p 505. Eubacteriile, algele şi plantele superioare acumulează prolină
liberă ca răspuns la stresul osmotic. Calea de biosinteză a prolinei a fost bine
studiată la Escherichia coli, şi la unele specii de plante şi de animale. Mai mult, au
fost clonate şi secvenţializate o serie de gene ce codifică sinteza acestui aminoacid
la Escherichia coli şi Vigna aconitifolia (printre ele, gena p 505). ADNc care
codifică A′-pirolin-5-carboxilat-reductaza – enzimă ce catalizează primele două
etape ale sintezei prolinei – a fost transferat la tutun. Plantele transgenice
136
obţinute au sintetizat în cantităţi foarte mari enzima respectivă şi, în consecinţă,
au produs de 10-18 ori mai multă prolină decât plantele netransformate, în
condiţii de stres salin. Această supraproducţie de prolină a corelat pozitiv cu
producţia de biomasă.
Gena TPS1. Trehaloza – un dizaharid nereducător – a fost supraprodusă în
plantele de tutun ca urmare a transferului genei TPS1, care codifică enzimă
trehaloz-6 fosfat-sintaza, de la drojdie. Deşi concentraţia trehalozei în citosol a
fost mică, plantele transgenice modificate au manifestat toleranţă la
deshidratare şi o ameliorare a retenţiei apei, probabil, datorită proprietăţilor
osmoprotectoare ale acestui zahăr.
Gena sac B. În scopul ameliorării toleranţei la secetă, la plantele de tutun a
fost transferată o genă de la Bacillus subtilis (sac B), care codifică fructozil
transferaza – enzimă ce intervine în sinteza fructanului. Această enzimă a fost
direcţionată spre vacuolă, cu ajutorul unei peptide semnal de la drojdie. Plantele
transgenice obţinute au produs o cantitate mai mare de biomasă, în condiţii de
secetă. Se presupune că fructanul ar putea stimula dezvoltarea rădăcinilor, sporind
capacitatea de absorbţie a apei.
Genele HSP şi HSF. Fiecare organism manifestă un anumit nivel de
termotoleranţă. S-a constatat că nivelul de bază poate fi, substanţial, sporit printr-
un tratament cu “doze subletale” de stres termic. Dobândirea unui nivel de
toleranţă mai înalt, face ca celulele şi organismele să reziste unui posibil stres
termic, de intensitate letală. În acelaşi timp, se cunoaşte că răspunsul la şocul
termic este o reacţie conservativă a organismelor la stresul generat de mediu, mai
ales la temperaturile înalte. O trăsătură comună a acestui răspuns constă în
inducerea rapidă a sintezei proteinelor de şoc termic (heat shock protein = HSP).
Diversele HSP pot avea proprietăţi funcţionale diferite, dar toate au capacitatea de
a interacţiona cu alte proteine şi de a acţiona ca şaperoane moleculare. La mai
multe specii, au fost stabilite corelaţii între sinteza HSP şi termotoleranţă. Expresia
genelor care codifică HSP este reglată de un activator transcripţional preexistent –
factorul de şoc termic (HSF). Acest factor este reglatorul principal al răspunsului
la şocul termic. Gene care codifică HSF au fost izolate de la mai multe specii de
plante. Primele rezultate experimentale sugerează faptul, că plantele care exprimă
constituitiv genele ce codifică HSP au o rezistenţă mai mare şi faţă de alţi factori
de stres din mediu.
Gena HVA. În condiţii de stres abiotic (salinitate, secetă, temperaturi
extreme), este activată sinteza proteinelor LEA (late-embryogenesis-abundent),
care se acumulează în mod normal în embrioni în stadiul târziu de dezvoltare a
seminţei, altfel spus, în stadiul de deshidratare. S-a presupus că aceste proteine au
un efect protector şi, prin expresia constitutivă a genelor care le codifică în plante
transgenice, ar putea ameliora toleranţa la stres. În unele cercetări ulterioare aceste
137
prognoze s-au confirmat. Astfel, gena HVA 1, provenită de la orz, care codifică o
proteină LEA, a fost transferată în plante de orez. Plantele transgenice rezultate au
tolerat stresul osmotic generat de deficitul hidric (sau de salinitatea mare), nivelul
toleranţei corelându-se pozitiv cu acumularea proteinei LEA.
e) Toleranţa la îngheţuri şi termotoleranţa (temperaturi scăzute şi de
congelare). Această însuşire s-a dovedit a fi controlată genetic de mai mulţi
factori.
Gena Fad 7. La diferite plante superioare, există o corelaţie între sensibilitatea la
îngheţ şi gradul de nesaturare al acizilor graşi din membranele plastidelor. Prezenţa
dublelor legături cis, poziţionate central în lipidele din membrană, scade temperatura
de tranziţie a fazei, aproximativ la 0°C. Prin includerea în arsenalul enzimatic al
plantelor a unei enzime capabile să catalizeze formarea legăturilor duble cis în acizii
graşi saturaţi sau monosaturaţi, s-ar putea, deci, obţine forme tolerante la îngheţ. În
această ordine de idei, a fost transferată la tutun o genă (Fad 7) care codifică o enzimă
cloroplastică ce catalizează formarea acizilor graşi dienoic şi trienoic. Plantele
transgenice de tutun, astfel obţinute, au conţinut cei doi acizi graşi în cantităţi mai
mari şi au fost rezistente la temperaturi foarte scăzute.
Gena Des 9. Tot la tutun, de la cianobacteria Anacystis nidulans a fost
transferată gena Des 9, care codifică o desaturază cu specificitate mare, desaturază
ce introduce duble legături cis în acizii graşi saturaţi specifici, din diferite lipide
membranare. Deoarece la plantele superioare biosinteza lipidelor este localizată în
plastide şi reticulul endoplasmatic, această enzimă a fost fuzionată cu o peptidă
tranzit, pentru a atinge ţinta corect. În plantele astfel modificate, cantitatea de acizi
graşi afectaţi a crescut de 17 ori. Spre deosebire de plantele netransformate,
plantele transgenice nu au manifestat semne de cloroză, după ce au fost expuse la
temperatura de 1°C, timp de 11 zile.
Au fost obţinute, de asemenea, plante transgenice care exprimă gene ce codifică
proteine anticongelante de origine vegetală. De exemplu, la tutun a fost introdusă o
asemenea genă, izolată de la morcov. Expresia acestei gene este indusă în timpul
procesului de călire ce are loc atunci când plantele se adaptează la condiţii de îngheţ.
La morcov, proteina anticongelantă menţionată previne formarea cristalelor de gheaţă
şi distrugerea ulterioară a rădăcinilor în solurile îngheţate.
Gena Bet A, care codifică sinteza proteinei glicin betaină, a fost transferată la
plante de cartof. În rezultat, au fost obţinute genotipuri tolerante la îngheţ.
Capacitatea de a sintetiza glicin betaină poate fi conferită unei plante de cultură şi
prin transferul în genomul acesteia al genei Cod A, care codifică enzima colin
oxidază la Arthrobacter globiformis. Această enzimă catalizează ambele etape ale
conversiei colinei în glicin betaină. Plantele transgenice de Arabidopsis thaliana
care au exprimat gena Cod A au fost, şi ele, tolerante la îngheţ şi la salinitate,
probabil, datorită ajustării osmotice.
138
 f) Toleranţa la stresul oxidativ.
Gene Mn-SoD. Stresul oxidativ este determinat de secetă, salinitate şi
îngheţ şi este asociat cu formarea speciilor reactive ale oxigenului. Aceste
molecule toxice afectează membranele, structurile legate de membrană şi
macromoleculele, mai ales din mitocondrii şi cloroplaste.
La plante, sistemele antioxidante sunt constituite din enzime care pot capta
radicalii oxigen. Exemple: superoxid/dismutazele (SOD), peroxidazele,
catalazele şi glutation reductazele.
Au fost obţinute plante transgenice de lucernă prin transferul unui ADNc
pentru Mn-SOD de la Nicotiana plumbaginifolia. Prin intermediul a două
peptide tranzit, această informaţie s-a exprimat fie în cloroplaste, fie în
mitocondrii. Rezultatele testării plantelor în câmp, timp de trei ani, au
demonstrat o ameliorare semnificativă a producţiei şi a ratei supravieţuirii.
Pentru testarea capacităţii transgenei de a proteja plantele de la stresul oxidativ,
a fost folosit ozonul. Plantele transgenice care exprimau Mn-SOD în
cloroplaste au avut mult mai puţine leziuni pe frunze, decât plantele de tip
sălbatic şi decât cele care exprimau aceeaşi genă în mitocondrii.
g) Toleranţa la elemente chimice. Foarte multe terenuri agricole sunt
contaminate cu aluminiu – element ce reduce drastic randamentele culturilor. O
echipă mexicană de cercetători a transferat o genă ce codifică o enzimă
implicată în sinteza acidului citric la diferite plante (tutun, papaia ş.a.). S-a
constatat, că plantele transgenice obţinute cresc semnificativ mai bine decât
plantele normale (obişnuite) pe soluri care conţin aluminiu în cantităţi mari.
Problema creării plantelor transgenice tolerante la elemente chimice este
strâns legată cu principiile de fitoremediere. Noţiunea de fitoremediere se
referă la un ansamblu de tehnologii, care presupun recurgerea la plante pentru
eliminarea, distrugerea sau stabilizarea contaminanţilor mediului din sol,
sedimente, apă şi aer.
Fitoremedierea este de trei feluri, în funcţie de soarta finală a
contaminantului: fitodegradare, fitoextracţie şi fitostabilizare. În primul caz,
plantele produc enzime care degradează contaminanţii organici,
transformându-i în molecule inofensive (CO 2 şi H2O). În al doilea caz, unele
plante extrag contaminanţii din sol, sedimente, apă. În sfârşit, în al treilea caz,
plantele previn migrarea contaminanţilor prin reducerea levigării, scurgerilor
de suprafaţă, eroziunii solului etc. sau prin producerea unor compuşi care îi
leagă în complexe insolubile, netoxice.
Aducem câteva exemple de plante modificate genetic în vederea folosirii
lor pentru fitoremediere:
– plopul galben care posedă două gene de origine bacteriană ce-i permit să
convertească mercurul ionic şi metil mercurul, în mercur volatil;
139
 – muştarul caracterizat printr-o toleranţă sporită faţă de cadmiu;
– tutunul care sintetizează enzime ce degradează hidrocarburile poluante;
– diferite specii de arbori care exprimă gena pentru nitratreductază, eliminând
oxizii de azot ce se acumulează în imensele aglomerări urbane.

2.4.5. Plante transgenice cu dezvoltarea modificată.

2.4.5.1. Controlul androsterilităţii/fertilităţii.

O aplicaţie practică a ingineriei genetice constituie obţinerea şi producerea
plantelor androsterile. Fenomenul de androsterilitate are o importantă deosebită în
producerea seminţelor hibride, deoarece elimină necesitatea castrării manuale a
genitorului matern. Dintre cele trei tipuri de androsterilitate (nucleară,
citoplasmatică şi nucleo-citoplasmatică) androsterilitatea nucleo-citoplasmatică
este folosită pe scară mai largă la porumb, floarea soarelui, sfecla de zahăr etc. La
multe alte specii cultivate nu sunt însă disponibile mutaţii similare. De asemenea,
pentru ca liniile consangvinizate să poată fi multiplicate şi folosite pe sectoarele de
hibridare, trebuie să dispună de gene fixatoare de sterilitate şi de gene
restauratoare ale fertilităţii.
La unele specii de plante cultivate, printre care Brassica napus, a fost aplicat
un sistem de androsterilitate şi restaurare a fertilităţii manipulat genetic. În acest
caz, sterilitatea este condiţionată de o ribonuclează extracelulară, numită barnaza ,
produsă de bacteria Bacillus amyloliquefaciens. Barnaza reprezintă o toxină
celulară foarte nocivă. Regiunea genei bacteriene, care codifică acest caracter a
fost ataşată unui promotor TA 29, care are o expresie – ţesut specifică în stratul de
celule tapetum, ce înconjoară sacii polinici din antere. Plantele la care a fost
transferată gena artificială TA 29-barnaza au fost androsterile, ca urmare a morţii
celulelor tapetumului din cauza degradării ARN de către barnaza.

În scopul restaurării fertilităţii se foloseşte o altă proteină, numită barstar,

produsă tot de bacteria Bacillus amyloliquefaciens. Barstar este o proteină
intracelulară care inactiveaza barnaza, formând un complex stabil enzimatic
inactiv în citoplasmă. Deci, această proteină protejează celulele bacteriene de
propria lor toxină. Plantele transformate cu o genă artificială TA 29- barstar s-au
dovedit a fi fertile. Ele produc barstar în tapetum, graţie specificităţii de ţesutul
promotorului TA29. În cazul încrucişării plantelor androsterile TA29- barstar cu
genitorii masculi care posedă TA29-barstar, în F 1 se obţin hibrizi fertili.

140
 2.4.5.2. Modificarea procesului de coacere şi perioadei de păstrare.
a) Argumentarea necesităşii întârzierii procesului de coacere a fructelor şi
legumelor.
Maturitatea naturală a fructelor şi legumelor este însoţită de producerea etilenei,
care dezlănţuie o serie de procese biochimice ce au ca urmare formarea gustului şi
aromelor specifice şi sinteza unor substanţe valoroase (vitamine, polizaharide, acizi
organici etc.). Concomitent, se realizează şi procesele de degradare care condiţionează
înmuierea fructelor şi legumelor. Fiind coapte, acestea sunt foarte sensibile pentru a
mai putea fi transportate, la distanţe mari, fără pierderi. Din aceste considerente, sunt
recoltate “verzi”, transportate la temperaturi scăzute şi tratate cu etilenă la destinaţie,
pentru a accelera procesul de coacere. În legătură cu cele menţionate, apare necesitatea
în elaborarea tehnologiilor noi, care ar permite:
– păstrarea fructelor şi legumelor timp mai îndelungat după recoltare şi,
implicit, realizarea fără pierderi pe pieţe mai îndepărtate;
– recoltarea după sinteza, în mod natural, a substanţelor care dau savoare şi
valoare nutritivă şi, implicit, contribuie la ameliorarea calităţii produselor
în stare proaspătă.
Folosirea metodelor de inginerie genetică deschid noi perspective în
rezolvarea cu succes a acestor probleme.
b) Strategii utilizate pentru obţinerea plantelor transgenice cu modificarea
procesului de coacere a fructelor.
Tomatele (Lycopersicon esculentum) se pretează în mod deosebit la
ameliorarea prin inginerie genetică, din mai multe motive: au un genom relativ
mic, o hartă genetică alcătuită foarte detaliat, mai multe mutaţii bine caracterizate
care afectează procesul de coacere şi pot fi uşor transformate prin intermediul
sistemului Agrobacterium. Primele rezultate cu ecou practic, notabil, se referă la
modificarea procesului de coacere a fructelor.
Pentru modificarea procesului de coacere a tomatelor, au fost aplicate două
strategii.
Prima a fost concepută pornind de la faptul că înmuierea fructelor, în general,
se produce atunci când pereţii celulelor sunt degradaţi de enzime specifice; două
dintre aceste enzime au fost identificate şi la tomate. S-a procedat prin strategia
ARN antisens (fig. 2.18. Anexa).
Strategia ARN antisens folosită pentru obţinerea tomatelor modificate
genetic presupune donarea şi inserţia într-o orientare inversă (sau antisens) fie
a ADNc, fie a unui segment genomic care reprezintă gena, între un promotor şi
o secvenţă de terminalizare, care vor fi recunoscute şi active în genomul
plantei. După transformarea mediată de Agrobacterium, secvenţa dintre cele
două borduri ale ADN T este integrată stabil în genomul plantei şi, atunci când
este transcrisă, produce un ARN antisens. Transcripţia ARN antisens
condiţionează
141
o acumulare considerabilă a ARNm sens şi, în consecinţă, un nivel scăzut al
produsului codificat, reducându-se sau blocându-se astfel funcţia biochimică a
genei.
Există cel putin patru moduri de a stopa coacerea fructului de tomate:
– inhibarea activităţii poligalacturonazei;
– inhibarea activităţii ACC sintazei;
– inhibarea activităţii ACC oxidazei;
– intensificarea activităţii ACC dezaminazei.
Plantele de tomate transformate cu gene antisens pentru poligalacturonaza
(PG) - enzimă care metabolizează peretele celular – au format fructe cu modificări
semnificative în privinţa fermităţii în stadiile finale ale coacerii, în plus, aceleaşi
fructe posedau noi caracteristici, care le ameliorau valoarea pentru comercializare
şi prelucrare. Indicele care exprimă potenţialul de a produce pasta a fost cu 80%
mai mare în cazul fructelor transgenice cu activitate PG redusă la 99%. Fructele au
fost, de asemenea, mai rezistente la o serie de patogeni care atacă după recoltare.
După teste şi analize multiple ale produselor, cercetătorii de la Calgene, din Davis
(California), au comercializat fructele proaspete sub indicativul FlavrSavr™.
Tomatele comercializate în stare proaspătă sub această denumire sunt primul produs
alimentar obţinut de pe plante transgenice, care a fost aprobat pentru consum.
A doua strategie se bazează pe faptul, că într-o anumită fază a dezvoltării lor,
fructele produc etilenă, hormon natural, implicat în coacerea fructelor. Acest
hormon, aşa cum s-a menţionat, declanşează şi accelerează procesul de coacere.
Biosinteza etilenei în plante implică conversia S-adenosil metioninei în acid-
aminociclopropan-1-carboxilic (ACC), catalizată de ACC-sintetază, şi
transformarea ACC în etilenă de către ACC-oxidază. Evident, dacă se suprimă
sinteza acestui hormon, apoi sinteza în care sunt implicate aceste două enzime şi
întregul proces de coacere întârzie. Or, şi sinteza etilenei poate fi blocată prin
aplicarea tehnologiei ARN antisens. În acest scop, se folosesc genele care codifică
una sau alta dintre cele două enzime implicate în sinteza acestui hormon, dar
orientate în sens invers.
Fructele ACC-oxidază antisens la coacere au un fenotip modificat. Când
fructele sunt detaşate de pe plantă la începutul maturării şi sunt lăsate să se coacă
în aer, fenotipul se modifică şi mai mult, în sensul că acumularea licopenului,
“responsabil” pentru înroşirea fructului copt, este redusă substanţial. Rezultă fructe
galben oranj, care au o longevitate sporită în regim de păstrare. Fenotipul se
restaurează parţial prin aplicarea etilenei, dar reversia nu este niciodată completă şi
fructele îşi păstrează în continuare rezistenţa la zbârcire şi crăpare.
Acelaşi rezultat a fost obţinut de către cercetătorii Companiei Monsanto, dar
printr-un alt procedeu. Ei au transferat la tomate o genă bacteriană care codifică o
enzimă ce degradează ACC pe măsură ce acesta se formează; în acest fel, sinteza
142
etilenei este blocată si coacerea fructelor este întârziată. Or, fructele care se coc
mai încet pot fi lăsate pe plantă mai mult timp. Ele pot fi recoltate când încep să se
înroşească, urmând să fie transportate si să ajungă în realizare minim cu o
săptămână înainte de a deveni complet moi sau roşii.
c) Rezultatele comercializării plantelor transgenice cu coacerea modificată.
Analiza informaţiei din literatura de specialitate cu privire la produsele cu
coacerea modificată deja existente pe piaţă (Badea E. şi Săndulescu, 2001), în linii
generale, ne permit să constatăm următoarele realizări:
– tomate FlavrSavr™ (producător: “Calgene”), menţionate mai sus,
comercializate în stare proaspătă, cu procesul de coacere modificat prin
tehnologia antisens;
– tomate Endless Summer® (producător: “DNAP Holding Corporation”),
care pot fi păstrate după recoltare timp de 30-40 de zile. Produse cu
coacerea modificată, care urmează să apară pe piaţă;
– tomate, zmeură şi căpşun la care sinteza etilenei este controlată
(producător: “Agritope”);
– ardei care îşi păstrează fermitatea după recoltare; banane, ananas şi
căpşun cu durata de comercializare prelungită – toate acestea, prin
modificarea genetică a procesului de sinteză a etilenei (producător: “
DNAP Holding Corporation”);
– tomate ameliorate în privinţa gustului, culorii şi conţinutului de vitamine
antioxidante şi banane mai rezistente la transport şi păstrare (producător:
“Zeneca Plant Sciences”).

2.4.6. Plante transgenice cu conţinut biochimic sau valoare

nutritivă ameliorată.
a) Modificarea conţinutului de aminoacizi al proteinelor de rezervă.
La unele specii de cereale şi legume, proteinele de rezervă sunt sărace în unul
sau mai mulţi aminoacizi esenţiali. De exemplu, orezul este deficitar în cisteină,
metionină şi lizină, orzul şi sorgul sunt sărace în treonină şi lizină, porumbul – în
lizină şi triptofan, iar legumele - în aminoacizi cu sulf. Pentru ameliorarea valorii
nutritive a proteinelor de rezervă, se preconizează utilizarea următoarelor strategii:

1. Schimbarea compoziţiei în aminoacizii a unei singure proteine (exemple

experimentale):
– creşterea cantităţii de metionină din cartof; modificarea funcţională a
glicinei din soia.
2. Adăugarea unei proteine complet noi, codificate de o genă izolată de la alte
specii sau sintetizată artificial.
143
 Aplicarea acestei strategii poate fi ilustrată prin următoarele rezultate:
– pentru ameliorarea conţinutului de metionină la rapiţă se efectuează
transferul genei ce controlează conţinutul zeinei de la porumb;
– sinteza proteinei de rezervă artificială după tehnologia elaborată de
Compania Du Pont. Această proteină “proiectată” conţine metionină în
proporţie de 31% şi lizină în proporţie de 20%. Gena artificială care
codifică această proteină a fost ataşată unui promotor – sămânţă specific;
– conţinutul de aminoacizi liberi poate fi sporit prin transferul unor gene
mutante, care codifică enzime insensibile la acest gen de control şi, astfel,
se realizează superproducţia aminoacidului respectiv. Prin intermediul
acestei strategii se încearcă ameliorarea conţinutului de lizină la orez,
utilizându-se o genă de la Escherichia coli, care codifică o enzimă mai
putin sensibilă la retroinhibitie;
– pentru ameliorarea conţinutului de aminoacizi în sulf la orez se foloseşte o genă
de la floarea soarelui, care codifică proteina SFA8, pusă sub controlul unui
promotor endosperm specific. Această proteină conţine reziduuri de cisteină în
proporţie de 8% şi de metionină în proporţie de 16%. Strategia bazată pe
sinteza acestei proteine în organele vegetative ale plantelor furajere urmăreşte
ameliorarea conţinutului de aminoacizi esenţiali cu sulf pentru
producţia de lână. A fost deja transferată la Festuca şi la Lolium gena
pentru proteina SFA8 sub controlul unui promotor reglat de lumină.
În afară de cercetările efectuate la tomate, nici unul dintre aceste exemple
experimentale nu a avut însă drept rezultat, obţinerea unei varietăţi comerciale. În
primele produse comercializate, obţinute în seminţe de porumb transgenic, sunt
enzima 6-glucuronidază (GUS), codificată de o genă provenită de la bacteria
Escherichia coli, şi avidina, care se găseşte şi în oul de găină.
În literatură se aduc exemple şi în vederea creşterii valorii nutritive a
proteinelor, cum ar fi gene care codifică proteinele din laptele uman. Gena care
codifică proteina 6-cazeină a fost introdusă în cartof, iar genele pentru oc-
lactalbumină şi bactoferină – proteine cu proprietăţi antibacteriene, antifungice şi
antivirale au fost introduse în tutun. Aceste realizări deschid perspective de
reconstituire a compoziţiei laptelui uman în plante, ca modalitate de înlocuire a
laptelui de vacă din hrana copiilor.
b) Majorarea conţinutului componenţilor neproteici a fitoenzimelor
(vitamine, ioni metalici).
Este cunoscut faptul că enzimele din organism sunt omogene (componenţa
proteică) şi heterogene (componenţa proteică şi o componenţă neproteică denumită
cofactor). Cofactorii se clasifică în coenzime, grupări prostetice, ioni metalici.
Pentru ridicarea activităţii enzimelor în celula vegetală o mare importanţă prezintă
caracteristica cantitativă a coenzimelor derivate de la vitamine şi a ionilor metalici.

144
 Se ştie, că β-carotinul este provitamina A convertită de organismul uman în
vitamina A. Orezul decorticat nu conţine nici provitamina A, nici vitamina A. Din
această cauză, locuitorii din China, India, Malaezia, Indonezia, care se alimentează
aproape exclusiv cu orez, suferă de maladii condiţionate de deficienţa vitaminei A.
Organizaţia Mondială a Sănătăţii estimează că, anual, 230 de milioane de copii şi
adolescenţi sunt afectaţi de aceste boli. Practic, lipsa vitaminei A scade rezistenţa
organismului la patogeni, cu urmări grave pentru 1,3-2,5 milioane de oameni în
fiecare an. Tot anual, 350.000 de copii preşcolari îşi pierd vederea, parţial sau
total.
Cercetătorii de la Institutul Federal de Tehnologie din Zürich (Elveţia) au
transferat la orez trei gene care codifică enzimele- cheie ale biosintezei β-carotinului
(provitamina A), cu expresie în sămânţă, bobul devenind auriu (fig. 2.19. Anexa).
În acelaşi institut, pentru a rezolva o altă problemă de alimentaţie a oamenilor
din regiunile menţionate – deficitul de fier în organism, tot la orez, a fost
transferată o genă izolată de la soia care codifică feritina, proteină ce fixează
fierul. Acţiunea acestei gene, sub controlul unui promotor cu expresie sămânţă-
specifică, a majorat de trei ori cantitatea de fier din bobul de orez.
Actualmente, în această direcţie se elaborează teste, în laborator, în ce priveşte
cercetări de inginerie genetică pentru ameliorarea următoarelor caractere:
– conţinutul majorat de β-carotin în cartof şi rapiţă;
– papaya cu conţinutul majorat de β-carotin;
– conţinutul majorat de vitamina E în orez.

c) Modificarea conţinuturilor de poliglucide.

La plante poliglucidul – amidonul este o substanţă de rezervă stocată în organe
vegetative, cum sunt rădăcinile (la manioc) şi tuberculii (la cartof), sau în seminţe
(la cereale, leguminoase). Capacitatea energetică a amidonului este folosită de
milenii în nutriţia omului şi animalelor.
Amidonul – glucid puternic polimerizat, conţine doi componenţi esenţiali:
amiloza, moleculă lineară, şi amilopectina, moleculă ramificată, cu greutate
moleculară foarte mare (107-108). Particularităţile structurii moleculare conferă
acestor componenţi proprietăţi reologice foarte diferite, care sunt folosite în
industria alimentară: amiloza formează uşor geluri, iar amilopectina este un agent
de îngroşare foarte eficace.
În sinteza amidonului în plante se presupune participarea a trei tipuri de
enzime:
– ADP – glucoz pirofosforilaza;
– amidon sintetazele (SSS = soluble starch synthases şi GBSS = granule
baund starch synthases);
– enzimele de ramificare.

145
 Cunoaşterea acestor enzime permite unele intervenţii care pot consta în
modificarea fie a genelor care le codifică, fie a modului de expresie şi reglare a
acestor gene.
Deşi, cea mai folosită sursă de amidon este porumbul (care asigură cca 60%
din producţia mondială), obiectul principal ale modificării genetice a devenit
cartoful (care asigură numai 15% din producţia mondială), pentru care au fost
elaborate tehnici eficiente de transformare (sistemul Agrobacterium).
În ultimii ani, în mai multe ţări, cartoful se consumă în cantităţi mari sub
formă de “chips” sau cartofi franţuzeşti prăjiţi. Pentru a putea fi consumat în
acest fel, ei trebuie să conţină 25% amidon. O cantitate de amidon mai mică, de
exemplu, de numai 21-22%, duce la evaporarea unei cantităţi mari de apă, şi la
absorbţia unei cantităţi mai mari de ulei în timpul preparării. Folosind o
transgenă de origine bacteriană, cercetătorii companiei Monsanto (SUA) au
reuşit să majoreze conţinutul amidonului în tuberculii de cartof de la 22 până la
25%.
d) Modificarea compoziţiei uleiurilor vegetale (în scopul alimentar).
Cele mai multe plante acumulează uleiuri în seminţe, ca substanţe nutritive
ce urmează să fie folosite la germinaţie. Aceste uleiuri vegetale sunt utilizate în
alimentaţia omului şi animalelor sau în diferite domenii ale industriei.
Plantele produc o mare varietate de combinaţii de acizi graşi, saturaţi şi
nesaturaţi, cu catene lungi sau scurte. Fiecare combinaţie conferă uleiurilor
anumite proprietăţi.
Până în prezent, ameliorarea plantelor oleaginoase s-a bazat pe variabilitatea
genetică existentă, în cadrul speciilor în cauză sau al speciilor înrudite cu acestea,
pentru a crea varietăţi producătoare de uleiuri cu compoziţii adecvate anumitor
utilizări. Au fost, astfel, obţinute varietăţi de rapiţă ce nu conţin aproape deloc acid
erucic, care are proprietăţi antinutritive pentru om şi animale. Dar este nevoie de
mulţi ani pentru a modifica proprietăţile unei plante cultivate, mai ales dacă
aceasta este perenă (de exemplu, palmierul de ulei, măslinul). Prin aplicarea
metodelor de inginerie genetică, a devenit însă posibilă modificarea compoziţiei şi
proprietăţilor uleiurilor vegetale cu mare precizie şi într-un timp mult mai scurt.
Primul ulei vegetal obţinut din rapiţă modificată, cu un conţinut mare de acid
lauric, a fost produs din varietatea “Laurical”, propusă pentru introducere în
cultura comercială în 1995 în SUA şi în 1998 în Canada.
Modificarea genetică a constat în transferul la rapiţă a unei gene provenite de
la Umbellularia californica, un copac ce creşte în nordul Californiei, în ale cărui
seminţe acidul lauric este prezent într-o proporţie de 58%. Respectiva transgenă
codifică o enzimă din calea biosintetică a acidului gras în cauză. Introducerea ei în
rapiţă a ameliorat producţia de acid lauric saturat şi, într-o măsură mai mică, de
acid miristic, în detrimentul conţinutului acizilor oleic şi linoleic.
146
 Până în prezent, au fost create câteva “varietăţi proiectate” de rapiţă
specializate, fiecare pentru producerea unui acid gras. Au fost obţinute plante
transgenice de rapiţă, care produc seminţe din care se obţine un ulei ce conţine, în
proporţii de 25-30%, acid stearic, un ingredient major al margarinelor şi
substituent al untului de cacao.
Un alt caz de schimbare a compoziţiei uleiului prin modificare genetică este
soiul de soia Optimum, care produce ulei cu conţinut mare de acid oleic (80% sau
chiar mai mult, faţă de numai 23%, cât este ponderea acidului oleic în uleiul
produs de un soi de soia convenţional).
Uleiul produs de soiul Optimum este mai sănătos, deoarece conţine cantităţi
mai mici de grăsimi saturate, grăsimi care determină creşterea riscului bolilor
cardiovasculare.
Au fost izolate şi caracterizate funcţional genele pentru desaturaze, de la unele
specii de plante, şi genele pentru elonaze – enzime a căror activitate constă în
alungirea catenei hidrocarbonate. Au fost obţinute plante de rapiţă care produc
acizi graşi omega-3, necesari pentru nutriţia copiilor şi pentru dieta persoanelor
afectate de unele maladii cronice.
e) Modificările compoziţiei substanţelor fenolice.
Antocianidinele şi antocianii sunt principalii pigmenţi de natură fenolică, care
dau culoarea roşie şi albastră florilor şi fructelor. Se găsesc în natură de obicei sub
formă de glucozide.
În scopul obţinerii plantelor transgenice cu culorile schimbate s-a efectuat
transferul la petunie a unei gene de la porumb, genă ce codifică o enzimă
(chalone sintetaza-CHS) în calea metabolică a antocianului, un pigment roşu
din florile şi boabele de porumb. S-a folosit ca vector ADN-T plasmidial.
La trandafiri s-a constatat că nu se pot obţine soiuri cu flori albastre din cauza
că plantele n-au enzimele care sintetizează pigmentul albastru. În vederea
rezolvării acestei probleme o genă ce codifică o proteină implicată în biosinteza
pigmentului albastru, denumit delfinidum, a fost izolată de la petunie şi se studiază
transferul ei la trandafir.
Plante transgenice ornamentale sunt pe piaţă încă din 1996: o garoafă mov –
Moondust™ – obţinută prin introducerea genelor ce codifică pigmenţii
corespunzători într-un soi cu flori albe, precum si o garoafă care poate fi păstrată
tăiată, în vază, timp relativ îndelungat. Nu excludem că, în curând, piaţa va fi
inundată de plante ornamentale cu culoarea florilor modificată.
f) Eliminarea substanţelor alergice şi inhibitoare.
Posibilitatea utilizării transgenezei pentru diminuarea caracterului alergen al
unui aliment a fost demonstrată practic de cercetătorii japonezi, care au creat o
varietate de orez transgenic ce sintetizează mai puţină globulină – substanţă
considerată alergen major.
147
 În alte experimente s-a reuşit doar reducerea cantităţii de proteină alergenă
din arahide, al căror consum putea provoca un şoc anafilactic şi, în final,
moartea persoanelor sensibile.
Plantele de manioc produc o substanţă care eliberează cianuri foarte toxice.
Maniocul este consumat frecvent şi în stare proaspătă, mai ales de copii, care îşi
pun astfel viaţa în pericol. Prin metodele tradiţionale de preparare, laborioase şi de
durată, conţinutul de cianide poate fi redus, dar nu şi complet eliminat, ceea ce
afectează atât gustul produsului, cât şi sănătatea consumatorilor. Iată de ce
eliminarea completă a cianidelor din manioc este un obiectiv important al
ameliorării prin metodele ingineriei genetice.

2.4.7. Plante transgenice cu calităţile tehnologice modificate.

În afară de crearea plantelor transgenice utilizate pentru alimentaţie şi furaj un
mare interes prezintă informaţia despre plante transgenice ca o sursă iniţială
organică pentru diferite tehnologii tradiţionale.
a) Panificaţia grâului.
Calităţile pentru panificaţie ale grâului depind, în mare măsură, de tipul
subunităţilor gluteninelor, cu masa moleculară mare, care se găsesc în făină;
subunităţi care determină şi elasticitatea aluatului. Boabele unei varietăţi tipice de
grâu conţin 4-5 asemenea proteine. Manipularea lor este absolut posibilă prin
metodele ingineriei genetice şi poate avea rezultate benefice pentru calităţile de
panificaţie. De exemplu, adăugarea unor subunităţi la un soi de grâu care, în mod
natural, nu posedă decât două, a dus la ameliorarea netă a calităţilor aluatului.
b) Fabricarea berii.
Pentru ameliorarea procesului de fabricaţie a berii, a fost izolată o genă
bacteriană care codifică o glucanază termostabilă astfel, încât, transferată la orz, să
se exprime la niveluri înalte în timpul germinării seminţelor. S-a constatat că
reducerea vâscozităţii malţului prin scăderea conţinutului de β-glucan solubil
modifică procesul de fabricare a malţului şi îmbunătăţeşte net rata filtrării.
c) Biomasa pentru industria textilă.
Cele mai importante produse obţinute din bumbac sunt fibrele. Acestea
necesită însă multiple prelucrări înainte de a fi utilizate în industria textilă. După
crearea unor soiuri de bumbac rezistente la insecte şi erbicide, care se cultivă pe
suprafeţe mari în SUA, Australia, China, s-a purces la studierea posibilităţilor de
ameliorare a caracteristicilor fibrelor. De exemplu, în scopul reducerii consumului
de coloranţi sintetici, care sunt toxici, poluanţi şi destul de scumpi, a fost
transferată la bumbac capacitatea de a sintetiza pigmenţi (melanină, pigmenţi
albaştri) în lumenul fibrei. Concomitent, se desfăşoară cercetări în vederea
obţinerii unor fibre mai lungi, mai rezistente, ce conţin, tot în lumen, un miez
similar cu materialul plastic, care ameliorează proprietăţile termoizolante.
148
 d) Biomasa pentru industria hârtiei.
Laboratorul de Genetică din Institutul Interuniversitar de Biotehnologie al
Universităţii din Gent (Belgia), în colaborare cu grupuri de cercetare din întreaga
Europă şi cu suportul financiar al Uniunii Europene, efectuează cercetări ce
vizează ameliorarea lemnului utilizat în industria hârtiei prin inginerie genetică.
Unul dintre obiective se referă la modificarea nivelului şi/sau compoziţiei
ligninei din lemn. Lignina este un polimer aromatic prezent, mai ales, în celulele
care formează lemnul. Practic, fibrele de celuloză din care este făcută hârtia sunt
incluse într-o matrice de lignină. Or, expusă la lumină, hârtia care conţine cantităţi
mari de lignină se îngălbeneşte. Pentru evitarea acestui inconvenient, se aplică
metoda Kraft de obţinere a pastei, care asigură separarea ligninei de celuloză.
Această metodă, chimică, este însă poluantă, energofagă şi scumpă.
Pentru început, a fost studiată în detaliu calea biochimică de sinteză a ligninei.
Au fost identificate două enzime importante care intervin în acest proces. S-a
considerat că prin aplicarea strategiei antisens – ar putea fi redusă activitatea
acestor enzime la arbori şi, respectiv, ar putea fi redusă cantitatea de lignină din
lemn. Au fost realizate construcţii genetice antisens pentru ambele enzime, care au
fost introduse, separat, la plop prin sistemul Agrobacterium de transfer al genelor.
La plantele transgenice obţinute, s-a constatat că inactivarea uneia dintre enzime a
modificat doar compoziţia ligninei, nu şi ponderea ei în lemn. Nici inactivarea
celeilalte enzime nu a redus semnificativ cantitatea de lignină din lemn, dar a
făcut-o mult mai uşor extractibilă, fapt ce a permis reducerea consumului de
chimicale poluante în procesul de prelucrare a materiei prime.
e) Biomasa pentru industria mobilei.
Xilemul plantelor de plop transgenic nu este alb-gălbui, ca la plopul
nemodificat genetic, ci roşu. Or, lemnul colorat poate fi foarte util în industria
mobilei, deoarece nu mai necesită vopsirea.
În continuare, aceeaşi strategie se aplică şi la eucalipt – o altă specie de arbore
intens cultivată ca materie primă pentru producerea hârtiei, în speranţa obţinerii
unor rezultate cel puţin asemănătoare celor înregistrate la plop.
f) Biomasa pentru obţinerea combustibilului.
Pe măsură ce se vor aduna mai multe informaţii referitoare la funcţiile
enzimelor implicate în biosinteza ligninei, vor creşte şansele de obţinere a unor
arbori transgenici mai adecvaţi destinaţiilor plantaţiilor.
Pentru obţinerea etanolului sunt utilizate speciile de arbori cu creştere rapidă
(plopul, eucaliptul), care alimentează cu combustibil solid centralele electrice sau
furnizează materie primă pentru producerea unui combustibil lichid – etanolul. În
aceste scopuri au fost testate numeroase plante transgenice. Unele supraexprimă
genele care codifică enzimele celuloz-sintaze, altele – genele ce codifică
celulazele, folosite pentru conversia biomasei celulozice în etanol.
149
 Mai multe specii de plante oleaginoase au fost ameliorate pentru a produce
uleiuri comestibile de calitate superioară. Prin transferul unor gene străine, de la
alte organisme se pot obţine plante transgenice pentru producerea de uleiuri
superioare industriale. Este posibilă donarea genelor implicate în sinteza oricărui
tip de acid gras de la oricare fel de organism, şi transferarea lor la speciile
oleaginoase de interes. Elaborarea acestei tehnologii este deja aplicată cu succes la
rapiţă. La această specie, în afara celor două varietăţi naturale existente, una cu
conţinut ridicat în acid erucic, alta bogată în acid oleic, au fost create trei noi
varietăţi transgenice cu conţinut ridicat în acid stearic, lauric şi γ-linoleic.
Uleiul de rapiţă nu contine acid lauric. Prin transferul unei gene de la
Umbellutaria californica, care codifică enzima lauroil-ACP tioesteraza, a fost
obţinută, însă, o varietate nouă, din ale cărei seminţe se obtine un ulei ce contine
acid lauric în proporţie de 25%. Uleiul de rapiţă nu contine nici acidul
petroselinic, folosit în industria detergenţilor şi maselor plastice, caracteristic
pentru mai multe specii de Umbeliferae. Gena implicată în sinteza acidului
petroselinic a fost clonată de la Coriandrum sativum şi transferată la plante de
rapiţă, obţinundu-se o varitate nouă transgenică.
Acidul ricinoleic se găseşte în cantităţi mari în seminţele de Ricinus
communis, dar lipseşte în uleiul de rapiţă. Acest acid este folosit ca materie primă
pentru producerea de polimeri, lubrifianţi şi produse farmaceutice. În prezent, se
încearcă izolarea genei pentru oleathidroxilază de la ricin, care nu poate fi cultivat
în anumite zone, pentru a fi transferată la rapiţă.
Acidul erucic este prezent în uleiurile produse de la majoritatea Brassicaceae.
Ponderea sa maximă fiind de 45-55%, este considerată relativ mică faţă de
cantităţile mari, necesare pentru producerea de învelişuri plastice, polimeri,
lubrifianţi. Se speră, ca prin inserţia unei gene donate de la Umnanthes alba în
rapiţă, să se obţină uleiuri cu un conţinut de acid erucic mai mare de 90%.
Se intenţionează, de asemenea, crearea unei noi varietăţi de rapiţă care să
conţină ceară jojoba, utilizată în industria farmaceutică, în producerea de
cosmetice şi ca lubrifiant. Această ceară lichidă se găseşte în uleiul conţinut de
seminţele unui arbust – Jojoba simmondsia chinensis din deşertul nord-american.
g) Sinteza unor “glucide noi”, de interes industrial.
Metabolismul plantelor poate fi modificat în vederea sintetizării unor molecule de
interes pentru industrie, prin introducerea unor gene ce codifică noi complexe
enzimatice. Pe această cale s-a mers în scopul sintezei unor oligozaharide – a
ciclodextrinelor. Acestea au o structură ce le conferă capacităţi de adsorbţie utile în
industria farmaceutică, în agrochimie sau în industria agroalimentară, pentru
stabilizarea parfumurilor şi aromelor, pentru complexarea produşilor cu eliberare
treptată, la fel şi pentru extragerea unor substanţe speciale (cofeină, colesterol).

150
Încorporată în genomul cartofului, o genă izolată de la o bacterie a condiţionat
sinteza enzimei ce determină formarea ciclodextrinelor în tuberculi.
Tot la cartof s-a demonstrat faptul, că dacă se blochează sinteza enzimei
amidonsintaza prin expresia unei gene antisens, se pot căpăta plante transgenice al
căror amidon este compus, aproape în întregime, din amiloză. Amiloza prezintă
interes pentru aplicaţii industriale de a nu flocula, o dată solubilizată.

2.4.8. Plante transgenice producătoare de molecule terapeutice.

La plante se încearcă transferul de gene ce determină sinteza unor proteine
utile, cum sunt encefalina, un neuropeptid uman, albumina serică umană, anticorpi
monoclonali etc. În felul acesta, plantele în viitorul apropiat vor deveni
bioreactore, biofabrici pentru producerea diverselor proteine de interes.
a) Avantajele sintezei unor molecule terapeutice sau vaccinuri în plante:
– producţia de materie vegetală este relativ uşoară şi ieftină;
– vaccinurile obţinute pot fi păstrate la temperatura mediului ambiant, în
“ambalajul” lor natural (fructe, rizomi, tuberculi);
– sunt evitate riscurile contaminărilor virale sau bacteriene asociate în
cazul folosirii vaccinurilor produse din ţesuturi umane sau animale.
Conceptul general al producerii vaccinurilor antivirale de către plante a
fost patentat în SUA în 1977. Primele vaccinuri comestibile au apărut în 1995.
Actualmente, mai multe laboratoare activează în direcţia producerii comerciale
a vaccinurilor comestibile, a antigenelor şi anticorpilor în plante transgenice.
b) Plante – vaccinuri.
Societatea Britanică Axis Genetics a pus la punct tehnologia “Epicoat”, care
utilizează un virus ca vector pentru introducerea unei antigene în plantă. Prima
aplicaţie de acest gen – virusul himeră purtător al antigenei parvovirusului,
produsă de plante transgenice, a protejat deja nurci infectate cu parvovirusul de tip
sălbatic.
Au fost create varietăţi de cartof – vaccin contra virusului Norwalk – virus
care produce o altă formă de enterită, şi varietăţi de cartof care imunizează
împotriva holerei. Eficacitatea plantelor-vaccinuri a fost testată mai întâi pe
şoareci. Concomitent, au debutat încercările de producere a unui vaccin împotriva
virusului Norwalk în porumb. A fost obţinută o varietate de salată care sintetizează
un vaccin contra hepatitei B şi au ajuns într-o fază avansată cercetările cu privire la
obţinerea unor plante transgenice cu rol de vaccin împotriva unor maladii specifice
animalelor domestice.
Rezultate promiţătoare au fost obţinute şi în încercările de prevenire a
febrei aftoase prin hrănirea animalelor cu o lucernă modificată genetic, ce
sintetizează o anumită proteină structurală. Sursa genei care codifică această
proteină este chiar virusul care cauzează febra aftoasă.
151
 Au fost obţinute plante de cartof, tutun şi morcov care sintetizează
decarboxilaza acidului glutamic (DAG 65), un antigen major în diabetul
mellitus dependent de insulină. Enzima umană produsă de plantă are o
imunoreactivitate corectă şi manifestă o activitate constantă. Şoarecii hrăniţi cu
tuberculi proaspeţi de cartof care conţineau autoantigenul DAG 65, au fost
complet protejaţi de diabet.
Au fost testaţi cartofi transgenici care sintetizează fie insulina umană
(autoantigenul major), fie o proteină hibridă care include şi insulina. În al
doilea caz, insulina este ataşată porţiunii terminale din subunitatea B a toxinei
holerei, în scopul direcţionării ei spre ţesutul limfatic asociat intestinului. La
şoarecii diabetici, hrăniţi cu tuberculi care conţineau proteina hibridă, s-a
observat reducerea evidentă a inflamării pancreasului şi întârzierea apariţiei
simptomelor bolii.
O varietate de soia a fost modificată genetic pentru a sintetiza anticorpi
monoclonali ce protejează contra virusului herpex simplex. Aceşti anticorpi s-au
dovedit la fel de stabili şi de eficienţi în prevenirea infecţiilor vaginale la şoareci,
ca şi cei produşi de linii celulare de mamifere.
c) Producţia unor enzime farmaceutice active în plante.
Glucocerebrozidaza – o enzimă umană lizozomală care la momentul actual
este singurul medicament ce poate fi administrat persoanelor afectate de boala
lui Gaucher. S-a constatat că chiar o singură plantă de tutun transgenic poate
sintetiza doza de glucocerebrozidaza necesară unui bolnav timp de o
săptămână, doză care, deocamdată, prin metodele tradiţionale este extrasă din
2000 de placente. Alte enzime, care sunt produse de plante modificate genetic,
sunt cele ce alcătuiesc complexul lipază-colipază, necesar persoanelor cu
activitate pancreatică deficitară.
Printre primele produse comerciale sintetizate de plante transgenice se numără
şi 6-glucuronidaza, codificată de o genă transferată de la Escherichia coli, şi
avidina – un compus existent în albuşul de ou. Aceste două proteine au o pondere
esenţială în boabele unei linii de porumb transgenice: 5,7% si, respectiv, 0,7%.
Purificate, ele sunt comercializate de Sigma Chemicals Co, din St. Louis, Missouri
(SUA), pentru a fi utilizate în teste de diagnostic.
d) Alţi compuşi cu utilizări terapeutice sintetizaţi de plante sunt factorii de
creştere de la mamifere (printre care interleukina-2, interleukina-4 şi factorul de
creştere epidermal), cu valoare comercială mare, ca şi hemoglobina umană,
colagenul şi hirudina (anticoagulant la care se recurge în cazul atacurilor de cord).

Se află în teste de câmp plante transgenice de rapiţă care conţin acid γ-

linoleic, folosit ca agent terapeutic analgezic pentru tratarea unei serii de maladii.
Gena care codifică sinteza respectivă a enzimelor a fost clonată de la câteva specii
de cianobacterii, iar transferul ei la rapiţă a dus la acumularea acidului γ-linoleic în
seminţe.
152
 2.4.9. Etapele obţinerii unui soi transgenic.
De tehnologia transferului de informaţie genetică beneficiază agricultura
mondială. Pentru efectuarea acestei tehnologii, genele de interes trebuie
încorporate în varietăţi comerciale. În continuare, este necesar de demonstrat că
ele funcţionează eficient şi că tot acest proces nu a afectat celelalte caracteristici
valoroase ale varietăţilor în cauză (fig.2.20. Anexa). Deci, o linie transgenică
trebuie să-şi demonstreze prioritatea parcurgând o serie de teste, care încep în
laborator şi continuă în câmp, pe suprafeţe din ce în ce mai mari, în condiţii de
producţie. Ultimul test va fi dat, desigur, în cultură comercială, după înscrierea în
catalogul naţional al soiurilor şi lansarea pe piaţă.
În ultimii ani au fost propuse următoarele principii generale ale programei
obţinerii unui soi transgenic (Badea, Săndulescu, 2001)
I. Teste de laborator. Orice experiment de transformare genetică se
finalizează cu analiza moleculară şi biochimică a populaţiei de plante obţinute,
care urmăreşte stabilirea:
– prezenţei transgenei în genom;
– numărului de copii ale transgenei;
– nivelului de expresie al transgenei;
– prezenţei proteinei codificate de transgenă;
– activităţii proteinei codificate de transgenă.
Este de dorit să fie studiată descendenţa obţinută prin autofecundarea plantelor
regenerate, pentru a se confirma transmiterea transgenei în procesul de
reproducere sexuată.
Pentru stabilirea prezenţei transgenei în genom se recurge la reacţia în lanţ a
polimerazei (PCR), cu primeri oligonucleici adecvaţi amplificării genei. ADN
amplificat este evidenţiat prin electroforeză.
Numărul de copii ale transgenei în genom se stabileşte prin hibridarea
moleculară de tip Southern, bazată pe utilizarea unor sonde marcate
corespunzătoare secvenţei codificatoare a genei transferate. Printr-o hibridare de
tip Northern, se pune în evidenţă apoi rata transcripţiei, adică nivelul de expresie al
transgenei. În acest scop, se foloseşte o sondă ADN sau ARN corespunzătoare
catenei complementare cu mesajul.
Pentru confirmarea faptului că transgena este funcţională, se pune în evidenţă
proteina prin hibridare de tip Western, utilizându-se un anticorp corespunzător. În
sfârşit, activitatea proteinei codificate de transgenă este cuantificată prin teste
biochimice şi biologice, teste care pot fi folosite, ulterior, şi pentru identificarea
sau detectarea unor culturi de plante transgenice în câmp.
II. Cuantificarea expresiei genelor raportor. Expresia genelor raportor
poate fi evidenţiată, atât cantitativ, cât şi calitativ, prin metode specifice produşilor

153
lor. De exemplu, expresia genei GUS este cuantificată prin aprecierea activităţii β-
glucuronidazei prin fluorimetrie, utilizând substratul 4-metilumbeliferil-13-D-
glucuronid (MUG). La fel, expresia genei Lux se cuantifică prin măsurarea emisiei
de lumină a luciferazei pe substratul numit luciferin. Pentru aceasta, se foloseşte
un sistem de captare a fotonilor.
Studiul calitativ al expresiei genelor raportor urmăreşte determinarea locului
în care acestea funcţionează (celulă, ţesut, organ). Localizarea expresiei genei
GUS se face cu ajutorul unui substrat specific, X-gluc (5 – bromo – 4 cloro – 3
indolil – 13 – glucuronid), care, sub acţiunea enzimei, eliberează un produs de
culoare indigo. În cazul genei Lux, se foloseşte acelaşi substrat, dar detectarea se
face prin fotografiere.
III. Teste efectuate în condiţii de mediu controlate. Rezultatele estimării
activităţii fenotipice a transgenei în plantele transformate – estimare efectuată în
camere de creştere sau în seră – sunt folosite, mai întâi, pentru eliminarea liniilor
deficiente. Din materialul rămas, sunt selecţionate liniile cele mai promiţătoare,
care se testează în condiţii de câmp. Există caractere care nu pot fi evaluate corect
decât în condiţii de izolare. De exemplu, rezistenţa la atacurile insectelor. Pentru
că, într-un mediu închis, se poate controla atât populaţia dăunătorilor, cât şi
pagubele pe care aceasta le produce. Alte caractere nu pot fi însă evaluate corect,
decât în câmp. Exemplu: rezistenţa la erbicidele sulfonilureice, erbicide care se
aplică în doze atât de mici (4,5 g/ha), încât este aproape imposibilă administrarea
lor uniformă în condiţii controlate, în ghivece.
Tot la această etapă, se determină şi modul de segregare, pentru a se compara
transmiterea în descendenţă a genelor transferate cu modul de transmitere normală,
mendeliană. Regeneranţii primari sunt hemizigoţi pentru gena de interes. Altfel
spus, transgena este integrată numai în unul dintre cei doi cromozomi omologi. În
descendenţa acestor plante, vor fi selecţionate liniile homozigote – singurele care
vor fi utilizate în evaluarea caracterelor, în câmp.
În sfârşit, se stabileşte dacă protocolul de transformare aplicat nu a condus
cumva la apariţia unor variaţii somaclonale care afectează performanţele soiului
supus modificării sau unor efecte (infertilitate, viabilitate redusă etc.).
IV. Teste de câmp. O evaluare corectă a potenţialului comercial al liniilor
selecţionate poate fi făcută doar într-un cadru similar condiţiilor de producţie.
Analiza unei linii transgenice destinate producţiei comerciale, trebuie să
urmărească dacă:
– expresia noului caracter atinge un nivel ce va asigura beneficii cultivatorilor;

– celelalte caractere agronomice, care au determinat alegerea soiului pentru

transformare, se menţin la nivelul anterior transgenezei.

154
 La înfiinţarea câmpurilor de testare trebuie respectate regulile tehnicilor
experimentale – existenţa repetiţiilor, randomizarea – pentru a se obţine date
interpretabile statistic. Evaluarea trebuie făcută timp de mai mulţi ani, în localităţi
diferite. Martor: soiul parental netransformat.
Întregul proces de producere şi testare a unui soi transgenic presupune
parcurgerea a nu mai puţin de zece etape (după McHughen, 1994), prezentate în
cele ce urmează (fig. 2.21).

Rezerv=

Transfer ]n Autofecundare
condi\ii controlate Analiza
Regeneran\i descenden\ei
primari

}nmul\ire

Autopolenizare

Testarea descenden\ei sub form= de linii

Liniile pure amestecate Se elimin= liniile de tip

s=lbatic [i cele care
segreg=

Studiul popula\iei Studiul nivelului Studiul ]nsu[irilor

Rezerv=
timp de mai mul\i ani de expresie al transgenei agronomice

S=m`n\a Informa\ii referitoare Informa\ii referitoare Rezerv=

amelioratorului la eficien\a caracterului la performan\ele
transferat agronomice
}nregistrare/Comercializare

Fig. 2.21. Reprezentarea schematică a etapelor parcurse pentru obţinerea

unui soi transgenic la o plantă de cultură autonomă (după E. Badea şi D.
Săndulescu, 2001).

155
 1. Din ţesuturile transformate sunt regenerate mai multe plante. Fiecare dintre
acestea este supusă unui test biochimic (GUS) sau molecular (PCR), pentru
certificarea prezenţei transgenei/transgenelor în genom.
2. Plantele la care este confirmată prezenţa transgenelor în genom, sunt trecute în
ghivece cu sol şi plasate în condiţii controlate (seră, cameră de creştere). Ele
constituie transformanţii primari care sunt crescuţi în condiţii optime şi
autofecundaţi, pentru a se obţine o descendenţă cât mai numeroasă.
3. Seminţele obţinute de la un singur transformant – numit şi eveniment de
transformare – sunt împărţite în trei loturi:
– un lot semănat în vederea înmulţirii;
– un lot semănat pentru obţinerea materialului ce va face obiectul testelor
biochimice şi moleculare menite să confirme transmiterea ereditară a
transgenelor şi, implicit, statutul de linie transgenică;
– un lot păstrat ca rezervă.
4. Dacă testele la care au fost supuse plantele rezultate din al doilea lot de
seminţe confirmă modul de segregare mendelian, caracteristic pentru inserţia
genei într-un singur locus, se seamănă seminţele produse de plantele
obţinute din primul lot. Fiecare plantă astfel obţinută este testată în vederea
evaluării nivelului de expresie al transgenei.
Daca transgena s-a integrat în genom la nivelul unui singur locus, sunt
aşteptate următoarele rezultate:
– 4-6 rânduri de plante homozigote recesive (aa) (plante de tip sălbatic,
netransformate);
– 4-6 rânduri de plante homozigote dominante (AA) (plante transgenice);
– 8-12 rânduri de plante heterozigote care segregă (Aa) (plante cu expresie
pozitivă sau negativă a transgenei).
5. Seminţele recoltate de la plantele homozigote dominante se amestecă,
constituind stocul pentru un nou soi transgenic, – stoc ce se împarte apoi în
patru loturi.
6. Seminţele din primul lot sunt folosite pentru obţinerea unei populaţii ce va
fi studiată timp de mai mulţi ani. Vor fi eliminate rândurile pe care plantele
nu sunt uniforme. Sămânţa obţinută reprezintă materialul necesar
amelioratorului.
7. Al doilea dintre cele patru loturi de seminţe este folosit pentru testele de
eficacitate – teste referitoare la nivelul de expresie cu valoare comercială al
transgenei. În primul an, aceste teste sunt realizate pe suprafeţe mici. În
anul următor, având la dispoziţie o cantitate mai mare de sămânţă, pot fi
realizate repetiţii pe suprafeţe mai mari şi în mai multe localităţi.
8. Al treilea dintre cele patru loturi de sămânţă este folosit pentru înmulţire în
vederea evaluării însuşirilor agronomice. Într-o primă fază se înfiinţează
câmpuri de testare pe o suprafaţă mică, unde linia transgenică este comparată

156
 cu soiul parental netransformat sau cu alte soiuri comerciale. În continuare,
suprafaţa câmpurilor de testare creşte, deoarece studierea însuşirilor
agronomice necesită multe repetiţii. Evaluarea completă a performanţelor
agronomice presupune efectuarea studiilor de rigoare în mai multe
localităţi, în condiţii pedo-climatice diferite.
9. Ultimul dintre cele patru loturi de seminţe se păstrează ca rezervă.
10. Dacă este cazul, se înregistrează noul soi. Pentru aceasta, fiecare ţară are
propria legislaţie. În general, pentru înregistrarea unui soi transgenic în
catalogul naţional, trebuie îndeplinite următoarele condiţii:
– în cazul fiecărui eveniment de transformare, noul caracter trebuie să fie
eficace;
– presupunând că noul caracter este exprimat la un nivel comercial, noul soi
trebuie să fie cel puţin egal soiurilor curente în privinţa performanţelor
agronomice.

Verificarea cunoştinţelor

1. Caracterizaţi elementele principale ale geneticii şi biologiei moleculare folosite

în ingineria genetică.
2. Ce fel de metode şi tehnici moderne cuprinde tehnologia ADN-recombinat?
3. Enumeraţi şi caracterizaţi metodele care sunt folosite pentru secvenţierea ADN-
ului.
4. În ce scop şi cu ajutorul căror metode sunt utilizate enzimele de restricţie în
ingineria genetică?
5. Ce fel de însuşiri ale ADN-ului se află la baza efectuării hibridării moleculare a
acizilor nucleici?
6. Enumeraţi posibilităţile tehnicii hibridării fluorescente in situ a acizilor nucleci
pentru ingineria genetică. Care sunt avantajele acestei metode?
7. Ce diferenţă există dintre cele trei metode de analiză a structurii genomului şi
genelor ADN?
8. Explicaţi, din ce cauză metoda PCR de amplificare a genelor a revoluţionat
genetica moleculară în ultimii ani?
9. Ce este vector şi ce feluri de vectori cunoaşteţi?
10. Enumeraţi cerinţele faţă de vectorul bacterian.
11. În ce constă deosebirea principală dintre vectorii de clonare şi vectorii de
transformare?
12. Care sunt cei mai utilizaţi vectori?
13. Caracterizaţi şi explicaţi etapele construirii ADN-ului recombinat.

157
14. Ce înseamnă “transgeneza la plante”?
15. În ce scop şi cum se realizează activitatea bibliotecilor genetice (sau a băncilor
de gene)?
16. Ce fel de avantaje apar în ameliorarea plantelor bazată pe principiile de
inginerie genetică în comparaţie cu selecţia clasică, dacă ambele au acelaşi
scop – obţinerea soiurilor noi?
17. Care metode şi tehnici sunt disponibile pentru izolarea genelor de interes?
18. Cum se efectuează alegerea genotipului plantei-recipiente?
19. Numiţi şi caracterizaţi metodele principale de transfer a genelor de plante.
20. În ce constă diferenţa dintre cerinţele faţă de vectorul bacterian şi fitovector?
21. Caracterizaţi particularităţile construirii vectorului de transformare pentru
celula vegetală.
22. Ce fel de gene sunt folosite pentru simplificitatea aprecierii expresiei genelor
de interes în genomul plantei-gazdă?
23. Enumeraţi etapele unui protocol de transformare genetică a plantelor
superioare cu ajutorul vectorilor biologici.
24. Ce fel de tehnici de transformare sunt utilizate prin intermediul sistemului de
vectori Agrobacterium?
25. Numiţi avantajele şi limitele metodei de transformare genetică a plantelor
superioare cu ajutorul virusurilor.
26. Enumeraţi şi caracterizaţi metodele de transfer direct al genelor în celula
vegetală.
27. Ce posibilităţi noi deschide tehnologia antisens în procesul de transformare
genetică a plantelor?
28. Ce fel de principii sunt folosite pentru clasificarea plantelor transgenice?
29. Care strategii sunt aplicate pentru obţinerea plantelor transgenice rezistente la
patogeni?
30. Cum se obţin plantele transgenice rezistente la insecte?
31. Ce fel de strategii sunt utilizate pentru obţinerea plantelor tolerante la
erbicide?
32. Caracterizaţi avantajele şi riscurile asociate de cultivarea plantelor rezistente
la erbicide.
33. Ce fel de gene sunt folosite pentru crearea plantelor transgenice tolerante la
factorii abiotici nereglatori?
34. Ce avantaje au plantele transgenice cu coacerea modificată?
35. Ce fel de strategii sunt utilizate pentru obţinerea plantelor transgenice cu
conţinutul biochimic (sau valoarea nutritivă) ameliorată?
36. Numiţi culturile agricole la care au fost modificate genetic calităţile
tehnologice.
37. Ce înseamnă “plante-biofabrici” şi ce fel de avantaje au aceste plante
transgenice?
38. Caracterizaţi principiile generale ale programei obţinerii unui soi transgenic.
158
 3. MARCAREA MOLECULARĂ A GENOMULUI
VEGETAL – O ETAPĂ IMPORTANTĂ
A INGINERIEI GENETICE ÎN FITOTEHNIE

Una din cauzele principale care reduc din intensitatea şi eficacitatea lucrărilor
ce ţin de rezolvarea problemei transgenezei, rămâne dezvoltarea relativ slabă a
cercetărilor cu privire la identificarea genelor eficiente, crearea băncilor de gene,
baza limitată a ingineriei genetice. Totodată, soluţionarea multiplelor problemele
ce ţin de ameliorare necesită, la rândul lor, metode şi atitudini noi.
Amelioratorii utilizează cu succes observaţiile fenotipice, măsurătorile şi
unele metode statistice sofisticate, pentru selectarea indivizilor cu caractere
superioare din populaţiile de plante. Toate aceste practici se confruntă, pe de o
parte, cu interacţiunea mediului înconjurător şi complexitatea genetică a
caracterelor importante din punct de vedere agronomic, iar pe de altă parte, unele
caractere se exprimă cu întârziere şi de multe ori validarea metodelor statistice
necesită un număr mare de indivizi şi multe repetiţii (Rafalski, 1994).
În ultimii ani, metodele clasice de evaluare a diversităţii genetice au fost
completate cu tehnici moleculare, care includ analiza constituienţilor chimici şi
caracterizarea macromoleculelor, care permit diagnosticul molecular.
Metodele marcării moleculare se folosesc pentru determinarea diversităţii
genetice în cercetările populaţiilor (determinarea legăturilor dintre populaţii), în
cercetările filogenetice (determinarea nivelului de înrudire între genotipuri), în
cercetările evoluţioniste, pentru marcarea genelor ce controlează caracterele de
interes şi în selecţia noilor soiuri şi hibrizi.
Identificarea genotipurilor prin intermediul metodelor marcării moleculare
permite:
– evidenţierea la timp a impurificării unei populaţii ce se presupune a fi
omogenă;
– obţinerea informaţiei despre distanţa genetică între soiurile şi liniile folosite
în selecţie;
– controlul procesului de efectuare a selecţiei;
– asigurarea protecţiei drepturilor de autor şi paşaportizarea soiurilor deja
create (Кonarev şi al., 1993).
Marcarea moleculară a genomului vegetal se bazează pe particularităţile
biopolimerilor principali ai celulelor vii ale organismului – polimorfismul
proteinelor şi acizilor nucleici.
Diferenţele genetice dintre organisme se exprimă prin polimorfismul lungimii
sau secvenţei unor fragmente de ADN, rezultate fie în urma restricţionării

159
enzimatice, fie prin amplificarea ADN-ului genetic. Variaţia în lungime sau
secvenţa nucleotidică este utilizată pentru stabilirea gradului de înrudire între
organismele individuale sau a eredităţii descendenţilor într-o populaţie.
Metodele indirecte de selecţie pot utiliza martori morfologici, markeri
biochimici, cum ar fi izoenzimele şi proteinele de rezervă sau markeri moleculari.

Polimorfismul proteinelor este plasat la baza primei grupe de metode de marcare

moleculară – acestea sunt metodele electroforetice pentru studiere: a sistemelor de
izofermenţi, a proteinelor uşor solubile şi a proteinelor de rezervă (Comarov, 1998). În
prezent, din metodele enumerate metoda electroforezei proteinelor de rezervă a fost
abordată oficial în ISTA (International Seed Testing Assosiation), care funcţionează în
UPOV (International Union of Potection of New Varieties of Plants). În Republica
Moldova, pe baza utilizării metodei electroforezei proteinelor de rezervă, în anul 2003
a fost elaborat şi aprobat Standardul Naţional pentru determinarea purităţii biologice a
seminţelor de porumb (Standard M 233, 2003).
A doua grupă de metode a markării moleculare a genomului vegetal include
tehnologii în care se manipulează cu purtători iniţiali de informaţie genetică – acizi
nucleici şi, în primul rând, ADN (Smith, 1992). La ele se referă:
– tehnologiile RFLP bazate pe utilizarea polimorfismului lungimilor
fragmentelor de restricţie a ADN-ului;
– tehnologiile amplificării ADN-ului bazate pe polimerizarea reacţiei în lanţ
(PCR).
Pe baza tehnologiei PCR au fost elaborate un şir de metode:
– RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA);
– AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR) ;
– DAF (DNA Amplification Fingerprinting) ;
– ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) ;
– AFLP (Amplified Fragments Length Polymorphism) ;
– ISTR(m) (Inverse Sequence Tagged Repeats (mite).
Markerii moleculari reprezintă caractere detectabile asociate cu unele însuşiri
fenotipice la loci genetici de interes.
L. Allen încă în anul 1994 sublinia, că metoda indirectă de selecţie cu ajutorul
markerilor moleculari este preferabilă selecţiei directe în unele cazuri, cum ar fi:
– identificarea indivizilor în stadii timpurii de creştere şi dezvoltare, pentru
backross sau pentru programele de ameliorare a unor populaţii;
– în cazul unor caractere ereditare care implică mai mulţi loci, sau în cazul
inoculărilor şi infecţiilor adesea neuniforme, când precizia măsurărilor
directe este mai scăzută;
– selecţia simultană pentru mai multe caractere.
În cazul când markerii moleculari se utilizează la cartografierea genomică, ei
se identifică în populaţii de linii recombinate RIL (Recombinant Inbred Line) sau
în generaţii backcross ale unor linii aproape izogene NIL (Near Isogenic Line).
160
În cazul descendenţilor populaţiilor F 2 vor fi luaţi în consideraţie numai markerii
detectaţi, a fi, în faza conpling. Pentru identificarea markerilor mai pot fi utilizate
genotipuri dublu haploide, derivate din microspori sau megagametofite.
Cu toate realizările obţinute până acum în cartografierea genomică, utilizând
markeri RFLP, se simte o necesitate acută de creştere a eficienţii diagnosticărilor
genetice. După A. Rafalski (1994), aceasta se poate realiza prin:
– utilizarea unor tehnici eficiente, care să permită identificarea markerilor
asociaţi strâns cu caracterele importante urmărite;
– adoptarea unor tehnici automate de extracţie a ADN-ului de la mii de
organisme individuale, colectarea rapidă a probelor şi menţinerea identităţii
acestora în timpul procesării;
– automatizarea tehnologiilor, reducerea costurilor şi utilizarea unei cantităţi
mici de ADN;
– existenţa unei logistici eficiente pentru analiza datelor şi luarea deciziilor de
ameliorare.

3.1. Metodele de analiză a markerilor moleculari

Există 2 categorii de markeri moleculari care utilizează tehnici diferite (tab.

3.1):
1. Tehnici de hibridare.
2. Tehnici bazate pe PCR.
Tabelul 3.1
Etapele tehnicilor RFLP şi PCR (după Badea şi al., 2000)
RFLP PCR
1. Izolarea şi purificarea ADN 1. Izolarea ADN
2. Digestia cu enzime de restricţie 2. Amplificarea PCR
3. Electroforeză pe gel de agaroză;
3. Electroforeză pe gel de agaroză
fotografiere
4. Transferul Southern
5. Identificarea şi marcarea sondei
6. Hibridare
7. Eliminarea excesului de sondă prin
spălare
8. Autoradiografie

3.1.1. Tehnici bazate pe hibridarea moleculară ADN-ADN.

Această categorie include markerii RELP şi implică tăierea ADN-ului genomic cu
enzime de restricţie (restrictaze), separarea electoforetică a fragmentelor rezultate,
transferul pe o membrană specială liberă de ADN (procedeul Southern

161
Blotting) şi testarea polimorfismelor modelelor de benzi prin hibridare cu o
secvenţă complementară de ADN marcată, denumită sondă moleculară.
Polimorfismul lungimii fragmentelor de restricţie (RFLP = restriction
fragments length polymorphism). Digestia ADN genomic cu o enzimă de restricţie
produce o populaţie de fragmente de acid dezoxiribonucleic cu lungimi variabile.
Etapele tehnicii RFLP sunt prezentate în tabelul 3.1.
Când genomurile a doi sau mai mulţi indivizi sunt comparate, prin intermediul
acestei tehnici este posibilă detectarea unor diferenţe sau a unui polimorfism în ce
priveşte lungimea fragmentelor de restricţie. Polimorfismul apare ca urmare a unor
modificări în secvenţa nucleotidelor de la nivelul situsurilor de restricţie sau a
rearanjamentelor (inserţie/deleţie) din regiunea genomului ce conţine fragmentul
de ADN clonat, utilizat ca sondă (fig. 3.1).

Sond= ADN
Alela 1

Alela 2

Situs de restric\ie Situs de restric\ie

modificat

A
1 2

3 4 5 6

Indivizi 1 3 4 5 6 2
B A1 A1 A1 A1 A2 A1
Genotip
A2 A1 A2 A2 A2 A2

Fig. 3.1. Polimorfismul ADN evidenţiat prin tehnica RFLP

(după E. Badea şi al).
A: Substituţia unei nucleotide ( marcată cu X) elimină un situs de restricţie din
molecula de ADN. Ca urmare, în regiunea detectată de sonda ADN, alelele l şi
2 se deosebesc prin faptul că fragmentele de restricţie au mărimi diferite.
B: Segregarea RFLP în situaţia în care ambii părinţi sunt heterozigoţi A 1 şiA 2. În
descendenţă, segregarea are loc în raportul l:2:l(A 1A1: A1A2: A2A2). Diagrama
gelului evidenţiază modelul aşteptat de benzi. La indivizii homozigoţi 3 A 1A1 şi
6 A2A2 , un singur fragment de restricţie hibridează cu sonda ADN. Indivizii
heterozigoţi prezintă ambele benzi.

162
 Polimorfismul este, deci, rezultatul absenţei sau prezenţei unui situs de
restricţie. Ca urmare, în fiecare locus, în populaţie, există două alele.
Markerii RFLP necesită o prealabilă cunoaştere a secvenţei ADN, sonde
donate şi caracterizate. Sondele pentru analiza RFLP se obţin din băncile ADNc
sau genomice. În cazul utilizării băncilor genomice ca sursă pentru sonde, se
impune eliminarea secvenţelor repetate, prezente într-un număr mare de copii,
deoarece ele vor determina formarea unui număr mare de fragmente de restricţie,
fapt ce diminuează rezoluţia gelurilor. Secvenţele repetate, care abundă
genomurile eucariotelor, se exclud parţial din băncile genomice, în caz dacă pentru
construcţia lor se utilizează o enzimă de restricţie sensibilă la metilare (secvenţele
repetate sunt metilate, fiind inactive genetic). Cu enzimă Pst I se obţin fragmente
de restricţie de mari dimensiuni, care nu pot fi clonate în plasmide. Băncile de
sonde genomice sunt astfel îmbogăţite în secvenţe unice, sau secvenţe în număr
mic de copii. O sondă reprezentată de o secvenţă unică va hibrida cu un singur
fragment de restricţie (un singur locus), dar cu condiţia să nu existe situsuri de
recunoaştere pentru enzima de restricţie, în porţiunea din genom omoloagă cu
sonda. Sondele construite din secvenţe prezente într-un număr redus de copii pot
hibrida cu cel mult cinci loci. Sunt selecţionate sondele care hibridează cu numai
unul sau doi loci, deoarece capacitatea de a identifica fragmentele de restricţie cu
acurateţe scade pe măsură ce creşte numărul locilor.
Pentru a putea stabili locul unde se fixează sonda, se impune marcarea fie
radioactivă, fie chimică. Marcarea radioactivă se face cu P 32 sau S35. Marcarea
chimică se face cu nuclcotide modificate, care conţin digoxigenină sau biotină. În
primul caz, sonda este detectată prin autoradiografie, iar în cel de-al doilea caz se
utilizează un anticorp cu o fosfatază alcalină (în cazul biotinei, cu avidina), pentru
a vizualiza banda printr-o reacţie de culoare.
Băncile de ADNc pot fi utilizate ca sursă de sonde deoarece conţin puţine
secvenţe reperate şi, ca urmare, nu mai este necesară o selecţie prealabilă. Sondele
ADNc corespund genelor exprimate şi evidenţiază cu precădere locusurile unice.
RFLP este determinat de schimbări ale dimensiunii fragmentelor omoloage cu
sonda, nu de pierderea lor. De exemplu, atunci când un anumit situs de restricţie
este prezent în molecula de ADN aparţinând unui cromozom, dar lipseşte din
ADN-ul cromozomului omolog, este produs un fragment de restricţie scurt, în
primul caz, şi unul mai lung, în cel de-al doilea caz. Individul este heterozigot
pentru acest RFLP. El este, deci, informativ la nivelul locusului respectiv şi cei doi
cromozomi pot fi identificaţi pe baza RFLP. De asemenea, poate fi studiat modul
de transmitere a cromozomului de la o generaţie la alta, urmărind transmiterea
fragmentelor markeri.
RFLP se transmite codominant în raport de segregare în F2 de 1:2:1. La un
individ heterozigot sunt vizibile ambele benzi alele, ceea ce face posibilă
163
diferenţierea lui de ambii părinţi homozigoţi. Tehnica RFLP furnizează markeri
codominanţi şi cu specificitate de locus, evidenţiind polimorfismul la nivelul
anumitor secvenţe.
Minisateliţii. Genomurile eucariotelor conţin secvenţe repetate, care pot fi
utilizate ca markeri genetici. Polimorfismul este rezultatul numărului variabil de
repetiţii dispuse în tandem. Minisateliţii conţin o secvenţă lunga de 16-64 perechi
de baze, care se repetă, dar sunt mai puţin numeroşi şi nu au acelaşi grad de
dispersare în genom ca microsateliţii. Se pun în evidenţă prin RFLP, utilizând o
enzimă de restricţie care taie în exteriorul minisatelitului şi folosind ca sondă o
secvenţă din minisatelit. Lungimea fragmentelor de restricţie produse la diferiţi
indivizi depinde de numărul de repetiţii de la nivelul locusului. În general, numărul
variază de la 3 la 20. Markerii minisateliţi sunt dominanţi, fără specificitate de
locus.

3.1.2. Tehnici bazate pe reacţia în lanţ cu polimeraza

(metoda PCR-Polymerase Chain Reaction).

Metoda PCR se foloseşte pentru obţinerea unui număr mare de copii ale unei
molecule de ADN (amplificarea ADN-ului) în procesul ciclic de fermentare (V.
Glazko, G. Glazko, 2001). Metodele elaborate pe baza tehnologiilor PCR în
prezent se apreciază ca metode de cea mai mare perspectivă la nivel molecular,
fiind caracterizate cu un şir de avantaje, şi anume:
a) ADN-ul se poate extrage din orice material biologic, chiar şi din cel
destructurat (ţesuturi, produse alimentare, obiecte ale mediului
înconjurător);
b) pentru efectuarea unor analize diverse se poate utiliza unul din seturile de
instrumente şi un set de reactive accesibile;
c) pentru efectuarea analizelor este suficientă o microcantitate de ADN;
d) timpul cercetărilor ADN-ului variază în limitele de 6-8 ore, după unele
metode timpul nu depăşeşte 3 ore.
În legătura cu aceea, că PCR se utilizează în majoritatea laboratoarelor
contemporane şi se foloseşte într-o mare parte de cercetări din biologia
moleculară, considerăm oportun să trecem la o analiză mai detailată a tehnologiei
PCR şi a metodelor elaborate pe baza acestei tehnologii.

3.1.2.1. Reacţia în lanţ a polimerazei (PCR).

Tehnica PCR a fost elaborată de Kary Mullis şi a fost implementată în
biologia moleculară în anul 1985 (Paul Rabinow, 1997). Actualmente, tehnica
PCR se aplică în sute de laboratoare.
164
 Aplicarea metodei PCR se bazează pe câteva trăsături esenţiale ale replicării
ADN-ului. Astfel, se ştie că în procesul replicării enzima ADN-polimeraza
foloseşte o catena a ADN-ului ca matriţă pentru formarea unei noi catene
complimentare. Însă enzima ADN-polimeraza nemijlocit nu poate iniţia replicarea
ADN-ului. Ea este ajutată de enzima ARN-polimeraza, care determină sinteza unui
segment monocatenar scurt de ARN, denumit primer (secvenţă de iniţiere a
replicaţiei, decamer oligonucleotidic cu o secvenţă arbitrară, dar cu un conţinut în
CG de 50% sau mai mare). Acest segment de ARN oferă ADN-polimerazei un
capăt liber 3`-OH, necesar acesteia pentru iniţierea replicaţiei.
Există 2 categorii de primeri: primeri arbitrari şi primeri specifici (“sens” şi
“antisens”, – corespunzător).
Primerii arbitrari sunt fragmente de 5-20 nucleotide. Ei se fixează la situsurile
ţintă ale matriţei de ADN, recunoscute prin complementaritatea bazelor azotate:
A-T, G-C. Ei definesc astfel regiunile individuale de ADN amplificat, denumite
ampliconi.
Primerii specifici sunt acei primeri, care necesită cunoaşterea prealabilă a
secvenţei matriţei pentru definirea primerului, în vederea amplificării catenei de
ADN.
În reacţie participă 3 componente principale:
a) segmentul dublu catenar ce trebuie amplificat – matriţa;
b) două segmente simple catenare formate din oligonucleotide care flanchează
fragmentul aplicat – primer;
c) componentul proteic – ADN-polimeraza.
Amestecul de reacţie mai conţine 4 deoxinucleotide trifosfatice, un tampon de
reacţie cu săruri şi se acoperă cu un strat de ulei mineral steril.
Importantă este concentraţia ionilor de Mg ++; odată cu creşterea concentraţiei
lor unele fragmente de ADN sunt amplificate mai eficient, în timp ce altele, mai
puţin eficient.
Primerul se adaugă în exces faţă de matriţa de ADN, concentraţia optimă fiind
de 0,1-2 MM. El este aşezat pe catena opusă a ADN-ului, fiind orientat cu capătul
31 astfel, încât la sinteza cu ADN-polimeraza, care catalizează creşterea noii catene
în direcţia 51-31, să se extindă de-a lungul segmentului. Pornind de la o cantitate
foarte mică de ADN (2-10 ng) se produc milioane de copii (fig. 3.2. Anexa).
Reacţia PCR se caracterizează printr-o mare viteză, selectivitate şi
sensibilitate. Într-o reacţie tipică există o alternanţă de 3 temperaturi controlate,
care sunt repetate în 25-50 de cicluri. Tehnologia producerii unui număr mare de
copii ale unei secvenţe specifice de ADN (amplificării) cuprinde următoarele etape
(Vlaic, 1997; Palii, 1998):
a) Sinteza artificială a primerilor sau utilizarea primerilor spontani. Se
sintetizează secvenţe scurte de ribonucleotide complementare capetelor
secvenţei de ADN care urmează a fi amplificată. Aceşti primeri se adaugă,
165
 în surplus, în soluţia tampon, în care se află secvenţa de interes a ADN
(gena specifică), ADN-polimeraza, dezoxinucleotizi-trifosfaţi, etc.
b) Denaturarea ADN-ului prin încălzirea soluţiei tampon la 94 °C timp de 5
min., procedeu ce asigură separarea celor două catene pin ruperea
legăturilor de hidrogen (fig. 3.3).

Denaturarea probelor de ADN

pentru separarea catenelor de ADN
(94°C, 5 min)

Legarea primerilor la
catenele de ADN
(30-65°C, 30 s.)

Denaturarea pentru separarea

catenelor de ADN (94°C, 30 s.) Polimeraza sintetizeaz=
catene noi de ADN (65-
75°C, 2-5 min.)

Fig. 3.3. Ciclul PCR (Polimerase Chain Reaction) – (după A. Vlaic, 1997).

c) Ataşarea primerilor în urma răcirii soluţiei tampon la 40-60°C. Primerii se

leagă la capetele 3′ a genei specifice pe cele 2 catene. Aşadar, este nevoie
de 2 primeri, fiecare dintre ei fiind complimentar fragmentelor de ADN de
pe catena opusă. Sunt numiţi „sens şi antisens”.
Timpul şi temperatura necesară de răcire a soluţiei sunt variabile în funcţie de
secvenţele de amplificare. Neataşarea pimerilor stopează realizarea amplificării.
d) Replicarea ADN-ului se efectuează la temperatura de 70-72 0C pentru
asigurarea condiţiilor optime de activitate a ADN-polimeraza. Numărul de
cicluri necesare pentru amplificarea optimală depinde de cantitatea
materialului iniţial şi eficacitatea fiecărei etape de amplificare (de regulă,
25-40 de cicluri pot fi suficiente pentru a obţine 100 ng-1 µg de ADN
sintetizat).
În urma ciclurilor repetate ale sintezei şi denaturării secvenţei moleculei de
ADN de interes, se măreşte exponenţial (în progresie geometrică) numărul de
secvenţe replicate (fig. 3.4).
În primele experienţe, amplificarea copiilor respective de ADN se efectua cu
ajutorul enzimei ADN-polimeraza de la E.Coli, dar, fiindcă era denaturată
166
 1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
7 128
8 256
9 512
10 1.024
11 2.048
12 4.096
13 8.192
14 16.384
15 32.768
16 65.536
17 131.072
18 262.144
19 524.288
20 1.048.576
21 2.097.152
22 4.194.304
23 8.388.608
24 16.777.216
25 33.554.432
26 67.108.864
27 134.217.728
28 268.435.456
29 536.870.912
30 1.073.741.824
CICLURI COPII

Fig. 3.4. Aplificarea exponenţială a ADN-ului.

la temperatura ridicată, a fost necesară adăugarea ei la începutul fiecărui ciclu.

Aceasta problemă a fost rezolvată folosind ADN-polimeraza Taq, termostabilă,
extrasă din bacteria Thermos aquaticus ce vieţuieşte în apă la 75°C. Este suficientă
includerea ei în soluţia tampon la începutul procedurii de copiere, rămânând activă
pe parcursul tuturor ciclurilor de amplificare.
Principiul tehnicii PCR, prin care se poate amplifica mult o copie a unei gene
sau unei secvenţei specifice dintr-o gena de interes, este prezentat în fig. 3.5:

167
 Amplificarea secven\elor \int=
ADN dublu catenar
\inta original=

(a)
Separarea catenelor
[i ata[area primerilor

(b) Primer Primer 1

Extinderea primerilor
(c)
Secven\e Secvente
complementare complementare
primer 2 primerul 1
Separarea catenelor
[i ata[area primerilor

(d) Primeri
noi

Extinderea primerilor
(e)
Catene cu Catene de
lungime aceea[i lungime
variabil=

Separarea catenelor
[i ata[area primerilor
(f)
Secven\e Secvente
complementare complementare
primerului 2 primerului 1
Extinderea primerilor

(g)

Fragmente dorite
(catenele cu lungime variabil=
nu sunt ar=tate)

{i a[a mai departe

Fig. 3.5. Principiul tehnicii PCR (după A:Griffiths şi al., 1993).

168
 a) Se izolează sau sintetizează gena sau secvenţa ADN de interes;
b) Se aleg sau se sintetizează primerii corespunzători. Catenele se separă la
încălzire, fapt ce permite primerilor să se ataşeze la fragmentele catenei
complimentare. Primerii de pe catenele opuse se extind în direcţii opuse,
unul către celălalt;
c) ADN-polimeraza Taq sintetizează primele fragmente complimentare.
Aceste două fragmente sunt de lungimi diferite, deoarece nu un semnal
unic de stopare. În consecinţă, ele sunt mai lungi decât secvenţa de ADN
analizată;
d) Două catene din nou se încălzesc, formând patru fragmente de ataşare a
primerilor. Doi primeri din nouă se leagă cu catenele corespunzătoare la
capătul 3′ al secvenţei de interes;
e) ADN-polimeraza Taq din nou sintetizează două fragmente complimentare.
Deşi la aceasta fază catenele matriţe sunt diferite după lungime, două
fragmente nou-sintetizate au aceiaşi lungime cu secvenţa de interes.
Aceasta se datoreşte faptului că sinteza fiecărui fragment nou începe în
locul ataşării primerilor şi continuă până la sfârşitul matriţei;
f) Fiecare catenă nouă începe cu o secvenţă complimentară unui primer şi se
termină cu secvenţa complimentară altui primer. După aceasta, are loc
separarea catenelor, primerii din nou se ataşează la catene şi se extind până
la lungimea secvenţei de interes;
g) Procesul poate să se repete de nenumărate ori, de fiecare dată formând două
molecule bicatenare de ADN, identice secvenţei de interes.
Repetarea ciclurilor de sinteză şi denaturare a ADN-ului asigură, aşa cum s-a
mai menţionat, o amplificare în progresie geometrică a numărului de copii ale
genei.
Replicarea ADN-ului nu este un proces absolut perfect, deoarece uneori ADN-
polimeraza include incorect o nucleotidă în procesul de sinteză a catenei de ADN.
Frecvenţa de adiţionare greşită într-o moleculă de ADN, replicată în mod natural,
este aproximativ 1×109 nucleotide. O asemenea precizie de încorporare în celule se
realizează graţie mecanismului replicării ADN-ului care elimină nucleotidele
adiţionate greşit la catena de ADN. Însă, in vitro enzima ADN-polimeraza Taq nu
poate face corecţia respectivă şi include greşit o nucleotidă la aproximativ 2×10 4
nucleotide.
Aşadar, în reacţia PCR participă trei componente principale: segmentul dublu
catenar care urmează a fi amplificat, denumit matriţă, unu sau două segmente
monocatenare formate din oligonucleotide care flanchează segmentul de amplificat
– primerii sau amorsele, precum şi un component proteic, ADN-polimeraza (Inns
şi colab., 1990).
Reacţia PCR se caracterizează printr-o mare viteză, selectivitate şi sensibilitate.
Eficienţa amplificării depinde de numărul şi localizarea potrivirilor imperfecte

169
(„mismatching”) între primer şi matriţa de ADN, de stabilitatea la diferite
temperaturi de ataşare şi extensia catenei, precum şi de eficienţa cu care ADN-
polimeraza recunoaşte şi extinde duplexul primer-matriţă (Weisiling şi colab.,
1995).

3.1.2.2. Metodele de amplificare a ADN-ului bazate pe tehnologiile PCR.

În prezent, pe baza tehnologiilor PCR a fost elaborată o serie întreagă de
metode pentru amplificarea segmentelor specifice de ADN şi, totodată, pentru
modificarea secvenţei amplificate (V. Glazko, G. Glazko, 2001). Aceste metode
sunt bazate pe amplificarea secvenţelor întâmplătoare (RAPD), fragmentelor de
restricţie (AFLP), sectoarelor amplasate între repetiţiile de microsatelite (SSR).
Există, de asemenea, posibilitatea de a folosi în acest scop elementele genetice
mobile (Mitina, 2002).
Din markerii şi metodele bazate pe PCR, putem evidenţia următoarele:
a) Markerii RAPD. Acest tip de markeri se obţin prin reacţia de amplificare a
ADN-ului genomic utilizând un primer cu secvenţa arbitrară de 10 nucleotide, care
va da naştere unor produşi ce se separă electroforetic pe gel de agaroză sub forma
unor benzi distincte şi sunt vizualizaţi prin colorarea cu etidiu bromid. Diferenţele
dinte indivizi se manifestă prin polimorfismele lungimii sau secvenţei unor
fragmente de ADN, ce sunt vizibile ca prezenţă a unor benzi particulare RAPD.
Markerii RAPD necesită cantităţi mici de ADN, se realizează în câteva ore, în
condiţii simple şi se obţin fără utilizarea radioactivităţii, de aceea ei au devenit
foarte populari (Williams şi colab., 1990).
b) AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR) – procedeu descris de Welsh şi
McClealand, în 1990. Ei au utilizat primeri cu secvenţe arbitrare de 18-32 nucleotide
care amplifică ADN-ul în condiţii de temperatură joasă de sinteză a catenei de ADN,
pentru câteva cicluri. Tehnica folosită generează produşi multipli de amplificare,
aceştia fiind analizaţi pe un gel de poliacrilamidă, sau prin autoradiografiere, care
permite o rezoluţie a modelelor fragmentelor. Metoda permite determinarea
polimorfizmului între suşele de bacterii şi ciuperci, şi la diferite soiuri de plante.
c) DAF (DNA Amplification Fingerprinting) – este metoda analitică bazată pe
tehnologia de amprentare a ADN-ului. Ea a fost descrisă pentru prima dată şi
utilizată de Caetano-Anolles şi colaboratorii (1991). Lungimea primerului analizat
a fost de 8 nucleotide, care amplifică optim matriţa de ADN, în prezenţa ADN Taq
polimerazei. Produşii de amplificare PCR sunt analizaţi prin separarea
electroforetică în sistem vertical, pe un gel subţire de poliacrilamidă, şi se
colorează cu argint după o metodă descrisă de Bassam şi colab.(1991).
Profilele DAF conţin aproximativ 20-40 benzi identificabile, permiţând o
analiză mai superioară a genomului faţă de profilul RAPD.

170
 d) SSR (Simple Sequence Repeats). Markerii SSR, sau fragmente simple
repetate în tandem, definesc tehnica prin care sunt puse în evidenţă secvenţele
foarte scurte de 1-4 nucleotide care apar frecvent în genomul eucariotelor şi sunt
foarte polimorfe. Ele mai sunt denumite „microsateliţi” şi se utilizează mult la
cartarea genomului uman şi al vertebratelor. Microsateliţi sunt, prin urmare,
fragmente simple repetate în tandem şi flancate de secvenţe de ADN conservativ.
În ultimii ani, microsateliţi sunt din ce în ce mai mult evidenţiaţi în analiza
genomului plantelor. Aceşti markeri se bazează pe amplificarea ADN-ului prin
PCR, urmând un protocol de manipulare relativ simplu. Aceşti markeri nu
utilizează radioactivitatea şi se pretează la automatizare (Hamada, 1982).
e) AFLP (Amplified Fragments Lenght Polymorphism) – este metoda de
analiză a fragmentelor de restricţie ale ADN-ului genomic, identificate prin
amplificare în reacţia PCR. Aceasta tehnică de amprentare a ADN-ului genomic
combină unele aspecte ale tehnicii RFLP cu câteva etape din tehnologia RAPD, şi
anume, extensia secvenţei arbitrare în PCR printr-un primer, pentru selectarea
acelor fragmente, care apoi sunt vizualizate (Zabeau şi Voss, 1993).
f) Reacţia în lanţ a polimerazei cu o transcriptază inversă (RT-PCR, Reverce
Transcription-Polymerase Chain Reaction). Varianta metodei reacţiei în lanţ a
polimerazei, modificată pentru analiza moleculelor de ARN. La prima etapă a
metodei, pe matriţa moleculei testate de ARN cu utilizarea fermentului de
reverstranscripţie se obţine ADN-monocatenar, care mai apoi se amplifică prin metoda
standard PCR. Includerea metodei RT-PCR a dat posibilitatea de a studia ARNm care
este prezentat în celule într-o cantitate mică, de exemplu: ARNm-factor-proteic de
creştere în embrionii timpurii. În prezent, în acest scop se folosesc ADN-polimeraza
termostabile, care posedă o activitate de reverstranscripţie.
g) PCR PRINS. PCR in situ pe preparate cromosomale. Metoda PRINS
(Polymerase Reaction In Situ) reprezintă combinarea metodelor de PCR şi de
hibridare in situ. Aceasta metodă permite de a efectua reacţia amplificării nu
numai în soluţii, dar nemijlocit pe preparate comozomale. În acest caz se utilizează
nucleotide marcate, care după hibridare permit de a depista segmente
complimentare de ADN pe cromozomi.
h) PCR–hibridarea in situ. ADN se amplifică şi se manifestă pe celulele
intacte morfologic sau pe ţesuturi. Pentru aceasta, celulele sau ţesutul se fixează,
se întăreşte pe lamelă pentru examinarea la microscop şi se prelucrează cu
protează. După ce se adaugă reagenţii necesari pentru PCR, lamela microsopică se
amplasează direct pe termoblocul amplificatorului, se adaugă Taq-polimeraza şi
slaidul se acoperă cu ulei mineral. Produsul amplificat poate fi manifestat prin
hibidarea in situ sau prin încorporarea directă în produsul PCR al nucleotidelor
marcate cu biotină sau dioxigenină. În metoda dată, în calitate de primeri se
folosesc primeri multipli suprapuşi.

171
 i) PCR-mediated site directed mutagenesis – crearea artificială a unui sait de
restricţie în secvenţa mutagenă şi analiza de restricţie ulterioară.
j) PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism). O metoda actuală
în studierea ADN-ului reprezintă metoda PCR-RFLP, care, spre deosebire de
metoda RFLPs, mai întâi amplifică ADN-ul studiat, după care acidul
dezoxiribonucleic este supus acţiunii diferitor restrictaze. Metoda dată se foloseşte
atât în studiul polimofizmului lungimii fragmentului de restricţie, cât şi în
dactiloscopia genomului organismelor. Avantajul principal al metodei date în
comparaţie cu metoda clasică RFLP constă în efectuarea cercetărilor în care se
foloseşte o concentraţie mică de ADN. Metoda PCR-RFLP se utilizează împreună
cu metoda simplă RFLP pentru depistarea markerilor genetici ai productivităţii, ai
bolilor genetice, legate de saiturile de restricţie ale anumitor restrictaze.

3.2. Folosirea tehnicii bazate pe PCR pentru identificarea

genomului plantelor agricole
Markerii ADN sunt utilizaţi, pe de o parte, ca martori genetici pentru cartarea
şi delimitarea caracterelor de interes, iar pe de altă parte, ca indicatori ai
diversităţii genetice. Diversitatea genetică este evaluată prin încărcătura de
informaţii şi numărul de benzi (Monica Juoras, 1999).
În vederea alegerii tehnologiei adecvate pentru o anumită aplicaţie, sistemele
de markeri sunt analizate pe baza a două măsuri: conţinutul de informaţii şi
proporţia de multiplex.
Sistemele de markeri diferă şi prin capacitatea lor de a determina înrudirea
dintre forme, bazată pe estimarea similitudinii genetice. Această informaţie poate
fi utilizată în procesul de întocmire a programelor de ameliorare.
Cea mai importantă trăsătură a markerilor este informativitatea. Alegerea
markerilor se face în funcţie de scopul urmărit.
Heterozigoţia aşteptată este un bun indicator al confuziei de informaţii. Ea este
definită ca probabilitatea, că cele două alele luate în studiu la întâmplare dintr-o
populaţie să poată fi distinse, utilizând un marker molecular. Prin urmare, se
măsoară capacitatea unui sistem de markeri de a identifica polimorfismele ADN-
ului la genotipurile studiate.
Proporţia de multiplex este definită ca fiind numărul de loci (benzi) analizaţi pe
gel. Aceasta variază în dependenţă de schimbarea condiţiilor experimentale. În cazul
markerilor RAPD, ar putea fi: diferite condiţii de amplificare, diferite metode de
colorare cu bromura de etidiu sau argint, or, detectarea radioactivă. Acestea pot da
valori diferite ale proporţiilor de multiplex (1 la SSR, 1-2 pentru RELP, 5-20 pentru
RAPD şi 5-100 pentru AFLP) (Rafalski, 1996, W. Powell şi col. 1996)

172
au propus calcularea unui indice de marker, ca fiind măsura universală pentru
cantitatea de informaţii, obţinută prin experiment, pentru un sistem de markeri.
Autorii menţionaţi au analizat markerii RELP, RAPD, AFLP şi SSR pentru 12 linii
de soia.
De regulă, markerii SSR au cea mai ridicată heterozigoţie aşteptată, markerii
AFLP sunt caracterizaţi printr-o proporţie ridicată de multiplex, iar markerii RAPD
sunt intermediari în privinţa heterozigoţiei şi proporţiei de multiplex. Markerii RELP
au o heterozigoţie moderată, în schimb, sunt cei mai potriviţi pentru studii de sintenie
(sintenia defineşte relaţiile de înlănţuire dintre doi loci genetici presupuşi a fi pe
acelaşi cromozom, pe baza analizei hibrizilor somatici sau celulari).
La ora actuală, există multe clase de markeri genetici precum şi tehnici de
diagnoză a ADN-ului (tab. 3.2). Eficienţa aplicării acestora în ameliorarea
plantelor depinde de dezvoltarea tehnologiilor, care ar permite reducerea costurilor
prin automatizarea diagnozei genetice într-un mod similar celui folosit în multe
diagnoze clinice umane.

Tabelul 3.2
Caracteristica sistemelor de marcare

Caracteristicile Sistema de marcare a genelor

sistemei de
RELP RAPD, DAF, Metoda CAT
marcare a genelor
AP-PCR microsateliţilor
Metodele folosite Restricţia, Amplificaţia PCR Restricţia
pentru marcare hibridarea ADN-ului produsului
cu primeri PCR
întâmplători
Tipul Delecţia, Delecţia, Schimbarea Delecţia,
polimorfismului insercţia insercţia lungimii insercţia
repetiţiei
microsateliţilor
Nivelul Mediu Mediu Înalt Mediu
polimorfismului
Caracterul Codominant Dominant sau Codominant Codominant
moştenirii codominant
Conţinutul de 2-10 mg. 10-25 ng. 50-100 mg. 50-100 mg.
ADN necesar
pentru analiză

173
 3.2.1. Folosirea markerilor pentru construirea hărţilor genetice
ale plantelor.
Există mai multe tipuri de markeri moleculari care pot răspunde unor cerinţe
diferite legate de marcare. De exemplu, markerii dominanţi pot fi utilizaţi pentru
studiul diversităţii structurale intra- sau interpopulaţională: distanţelor genetice;
clasificărilor; identificării vanetale; pentru donarea poziţională şi pentru saturarea
rapidă a hărţilor genetice, îndeosebi la speciile mai puţin studiate. Markerii
codominanţi sunt utilizaţi pentru construirea hărţilor genetice, cartografierea
comparată, cartografierea genelor cu efecte cantitative (QTL – quantitative trait
loci). Alegerea tehnicii depinde de specia luată în studiu. De exemplu,
microsateliţii sunt o sursă de markeri pentru speciile puţin polimorfe, în timp ce
pentru o specie cu un nivel ridicat de polimorfism şi numeroase gene ADNc sau
sonde deja clonate sunt mai potriviţi markerii RFLP sau, şi mai indicat, STS.
Construcţia unei hărţi de linkage genetic cu markeri ADN. Indiferent de
motivul elaborării hărţii, câţiva factori au o importanţă deosebită:
– părinţii aleşi pentru încrucişare;
– alegerea populaţiei segregante;
– dimensiunile populaţiei segregante;
– generaţiile utilizate pentru analizele ADN şi fenotipice.
Între cei doi părinţi trebuie să existe un polimorfism foarte mare al secvenţei
ADN. În caz contrar, analiza segregării şi construcţia hărţii de linkage sunt
imposibile. La speciile alogame, polimorfismul ADN este amplu. Practic, orice
încrucişare între doi indivizi neînrudiţi furnizează suficient polimorfism pentru
cartare. La speciile autogame, nivelul variaţiei secvenţei ADN este, în general, mai
scăzut şi, din această cauză, se recurge la părinţi îndepărtaţi filogenetic.
Pentru elaborarea hărţilor de linkage, se pot utiliza mai multe tipuri de populaţii
genetice. Cele mai simple sunt populaţiile F2 şi cele rezultate din retroîncrucişări
(încrucişarea unui hibrid FI cu unul dintre părinţi). Deşi uşor de obţinut, aceste
populaţii nu sunt permanente. La plantele perene sau la speciile care se reproduc
asexuat, populaţiile F2 sunt permanente şi pot fi, deci, utilizate pentru cartare. Dar cea
mai utilă populaţie permanentă de cartare trebuie să fie homozigotă şi să poată fi
reprodusă prin seminţe. La unele specii, astfel de populaţii se pot obţine prin
descendenţă “monosămânţă” (SSD = single seed descendent). Mai precis, este vorba
de linii recombinate obţinute prin autofecundări succesive, pornindu-se de la indivizii
F2. În fiecare generaţie, este ales un singur individ din fiecare familie, care se va afla
la originea generaţiei viitoare. Liniile recombinate sunt homozigote şi pot fi propagate
prin seminţe. Fiecare cromozom al unei linii recombinate conţine segmente care
alternează de la cei doi părinţi. Markerii care sunt linkaţi vor rămâne împreuna în
cursul încrucişărilor şi autofecundărilor realizate pentru

174
obţinerea liniilor şi vor cosegrega, facilitând construcţia hărţilor de linkage.
Populaţii similare pot fi obţinute prin dublarea haploizilor cu originea în micro-sau
macrospori.
În cele mai multe cazuri, cartarea urmăreşte elaborarea unei hărţi genetice
care, în final, trebuie să acopere toţi cromozomii. Realizarea unor asemenea hărţi
este necesară pentru selecţia asistată de markeri, cartarea QTL şi caracterizarea
cromozomilor. Există însă situaţii, în care interesează numai o anumită regiune din
genom. De exemplu, în donarea pe bază de hartă. În acest caz, se caută markeri
amplasaţi cât se poate de aproape de gena-ţintă, de la care să înceapă “mersul
cromozomal”. În consecinţă, se construieşte o hartă de linkage cu densitate mare
numai în jurul genei de interes. Pentru marcarea genelor în vederea donării
poziţionale se utilizează linii aproape izogene şi amestecuri de indivizi cu acelaşi
genotip (bulked segregant analysis = BSA).
Liniile aproape izogene pentru o genă sau un locus dat posedă acelaşi genotip,
cu excepţia unui locus care a fixat alele diferite. În practică, un asemenea material
se obţine prin retroîncrucişări succesive între o linie donatoare a genei şi o linie
receptoare sau recurentă, în fiecare generaţie. Sunt selecţionaţi indivizii care
posedă gena respectivă, împreună cu regiunea din cromozom, pe care aceasta se
află. Numeroase gene majore au fost marcate folosind liniile aproape izogene. Dar,
pentru că obţinerea acestui fel de material durează mult timp, mai frecvent se
utilizează tehnica analizei segregării în amestec (BSA). Se porneşte de la o
populaţie care segregă pentru o genă majoră, se amestecă ADN de la indivizi
având acelaşi genotip şi se compară amestecurile. În general, s-a constatat că, cu
cât populaţia de cartare este mai mare, cu atât şi rezoluţia este mai mare, mai ales
dacă se urmăreşte o anumită regiune din genom, sau cartarea QTL.
Hărţile de linkage alcătuite pe bază de markeri ADN se corelează cu hărţile
citogenetice. Cea mai folosită metodă pentru corelarea hărţilor genetice întocmite
pe bază de markeri ADN cu anumiţi cromozomi (grupe de linkage) face apel la
aneuploizi (monosomici, trisomici) şi la liniile de substituţie. La speciile, la care s-
au obţinut linii aneuploide pentru fiecare cromozom, clonii ADN pot fi localizaţi
prin hibridare cu acizi nucleici.
Relaţia între hărţile genetice şi hărţile fizice. Atunci, când principalul scop al
analizei unei hărţi pe bază de markeri ADN este donarea poziţională, trebuie
stabilită distanţa genetică şi distanţa fizică. Distanţa dintre doi loci pe o hartă
genetică este exprimată în cM (centimorgani). Numărul mediu de perechi de baze/
cM variază în funcţie de specie, mai precis de cantitatea de ADN/celulă, cantitate,
care este speci- specifică. De exemplu, la Arabidopsis, un cM corespunde cu 140
kb, iar la grâu – cu 4500 kb. La orez, au fost făcute comparaţii între distanţele
fizice şi genetice, combinând datele obţinute prin cartografierea cu markeri RFLP
şi hibridarea in situ. S-a constatat, că relaţiile dintre cele două tipuri de distanţe
variază în funcţie de cromozom şi chiar de regiunile aceluiaşi cromozom.
175
 Cartografie comparată. Posibilitatea de a construi cu uşurinţă hărţi genetice şi
de a utiliza sonde heteroloage (sonde care nu provin de la specia studiată) a permis
compararea ordinii genelor la specii, care aparţin aceleiaşi familii.
La Solonaceae s-a demonstrat, că genomurile tomatelor şi ale cartofului sunt
colineare, cu excepţia a cinci inversii paracentrice. Utilizarea markerilor a
evidenţiat, deci, o foarte bună conservare a sinteniei (se vorbeşte de sintenie atunci
când, la specii relativ îndepărtate, locii se află pe acelaşi cromozom). Între tomate
şi ardei, remanierile sunt mai numeroase, dar ordinea genelor este conservată local.
La Leguminoase, o comparare a hărţilor la linte şi mazăre a evidenţiat
conservarea a opt regiuni, reprezentând 40% din genom. În tribul Triticeae s-a
constatat că ordinea markerilor este bine conservată la grâu, orz şi secară. În tribul
Andropogonae, a fost evidenţiată conservarea grupelor de linkage şi a ordinii
markerilor la porumb şi sorg. Grupele de linkage comune pentru sorg şi trestia de
zahăr au două regiuni omoloage.
Comparaţii similare au fost făcute şi între alte triburi ce aparţin familiei
Poaceae. Orezul, grâul şi porumbul conservă numeroase regiuni genomice
colineare. Cartografia comparată permite deci reconstituirea structurii genomului
ancestral al familiei Poaceae. Tot cartografia comparată face posibilă utilizarea
markerilor unor specii apropiate pentru saturarea unei anumite regiuni din
genomul unei plante cu grad înalt de ploidie, specie la care cartarea întregului
genom este imposibilă. În sfârşit, prin cartografie comparată poate fi clonată o
genă de la o plantă cu genom de mici dimensiuni, la care există bănci YAC,
secvenţa obţinută putând fi folosită pentru izolarea genei la specia studiată.
Prioritatea folosirii markerilor pentru construcţia hărţilor genetice a fost
demonstrată la întocmirea hărţii genetice la Arabidopsis thaliana. Pentru aceasta
au fost folosiţi circa 1200 de primeri şi s-a demonstrat că doar 245 din ei manifestă
polimorfismul între două linii. Suma totală de fragmente polimorfe de ADN
alcătuieşte 392, însă doar 225 au segregat în F 1 după legile mendeliene. În aşa fel,
a fost obţinută harta genetică A.thaliana, care apoi a fost integrată cu hărţile
clasice.
Una din priorităţi la folosirea markerilor constă în economia de timp şi a forţei
de muncă. Astfel, pentru scanarea a 1200 de primeri, identificarea a 225 de
markeri-locuşi şi cartarea lor în genomul A. thaliana au fost încadraţi doar 2
colaboratori timp de numai 4 luni.
Pe baza saturării cu RAPD-markeri a unei parţi specifice a genomului se
realizează marcarea locală. Partea marcată poate avea dimensiuni de la o suprafaţă
mică ce înconjoară locusul dat, până la un cromozom întreg. Marcarea locală se
poate înfăptui şi cu sondele RELP, însă markerii RAPD sunt mult mai efectivi
datorită posibilităţii de analiză rapidă a unui număr mai mare de primeri. Folosind
această tehnologie în laboratorul din Tingey, în cromozomul unu la A. thaliana au
176
fost cartaţi 23 de markeri RAPD, la 47 de fragmente RELP deja existente. Deşi A.
thaliana este considerată o sistemă model, folosirea markerilor pentru construirea
hărţilor genetice este efectivă şi pentru alte specii, cum ar fi: cartoful, tomatele,
grâul, orezul, porumbul, arahisul, viţa de vie, soia, lucerna, orezul şi altele.
În urma folosirii metodei RAPD PCR, pentru prima dată a fost obţinută harta
genomului de eucalipt, care este una din primele hărţi genetice ale plantelor
silvice. Astfel, actualmente, strategia folosirii fragmentelor induse-RAPD este
unica posibilitate pentru markarea genomului la speciile lemnoase.
Unicul neajuns a folosirii markerilor este considerat caracterul dominant al
transmiterii markerilor RAPD, pe când moştenirea în alte generaţii a markerilor
RELP are un caracter codominant. În 1965 Allard a stabilit că în F 1 markarea a doi
markeri codominanţi este mai efectivă decât marcarea a doi markeri dominanţi.
Însă Reiter în lucrările sale a arătat că markerul RAPD, cât şi RELP, au aceiaşi
eficacitate la hibridizare, în unele lucrări fiind demonstrat faptul, că transmiterea
markerilor RAPD poate avea şi un caracter dominant.

3.2.2. Folosirea microsateliţilor în marcarea genomului vegetal.

Repetările micrtosateliţilor sunt cunoscute ca simple repetări ale nucleotidelor,
repetate încontinuu: (AC)n, (AG)n, (CT)n, (ATC)n şi altele. Astfel de repetări sunt
larg răspândite în genomul eucariotelor. Repetiţiile AT sunt foarte des întâlnite în
genomul vegetal. De exemplu, în seminţele de soia locii markerilor RELP se
prezintă, de regulă, cu doar 2 alele, iar AT- microsatelite – cu 8 alele sunt analizate
în baza amplificarii prin metoda PCR a unor fragmente de ADN relativ scurte.
În ultimul timp se fac experimente în vederea folosirii microsateliţilor în
alcătuirea hărţilor genetice la orez, grâu, porumb, tomate. Polimorfismul la 238
linii şi soiuri de orez s-a constatat pe baza folosirii a 10 microsateliţi de ADN, în
rezultat fiind identificate 93 alele. În genomul Discorea tokoro s-a reuşit de marcat
şase loci prin microsateliţi polimorfi.
La grâul comun Triticum aestivum a fost studiat potenţialul microsateliţilor ca
markeri genetici din punct de vedere a localizării lor în genom, variabilităţii şi
localizării în cromozomi, fiind sintetizaţi primerii care erau folosiţi pentru
marcarea RAPD a genomului secarei şi orezului (Korneva, 1999).
În cercetările efectuate la soia s-a constatat că microsateliţii sunt mai
informativi în comparaţie cu markerii RFLP, nivelul detectării variaţiei de către ei
este de 2 ori mai înalt şi ei sunt mai simpli în analize (Morgante şi al., 1994).
În concluzie, putem menţiona că microsateliţii, datorită hipervariabilităţii,
dimensiunii şi prezenţei lor în genomul vegetal, reprezintă o clasă de markeri
principali, larg utilizaţi în depistarea polimorfismului şi construirea hărţilor
genetice la diferite specii.

177
 3.2.3. Metodele marcării genelor ce determină caracterele
principale în ameliorarea plantelor.
În ultimul timp au fost obţinute realizări considerabile în construirea hărţilor
genetice la unele culturi agricole. Majoritatea acestor hărţi au fost elaborate pe
baza markerilor RELP şi prin folosirea în comun a RAPD şi microsateliţilor.
Este cunoscut faptul, că marcarea caracterelor monogenice în prezenţa hărţii
genetice este relativ simplă, în timp ce identificarea markerilor genelor ce
determină mai multe caractere este destul de dificilă. Multe caractere sunt
determinate de mai multe gene, expresia cărora, în mare măsură, este influenţată şi
de factori externi. Până nu demult, încercarea de a marca caracterele valoroase se
reducea la folosirea RFLP-markerilor. Însă această metodă nu s-a aplicat pe larg
din mai multe cauze: este destul de costisitoare (folosind restrictazele, markerii
radioactivi), necesită folosirea liniilor consangvinizate, imposibilitatea de a marca
mai mult de 3 locuşi într-o singură încrucişare etc. Folosirea microsateliţilor şi,
îndeosebi, a RAPD esenţial măreşte posibilităţile alcătuirii hărţilor genetice.
Utilizarea coloranţilor fluorescenţi la sinteza primerilor pentru RAPD oferă
posibilitatea de a marca concomitent până la 8 caractere diferite.
Se consideră că una din metodele ce permite cartarea rapidă a genelor care
determină caracterele valoroase este metoda sau metodele bazate pe PCR, cu
primeri întâmplători (cum este RAPD, DAF) sau cu primeri determinaţi (metoda
STS). Pentru identificarea genelor ce determină caractere valoroase a fost propusă
şi metoda îmbogăţirii materialului cu “factori” rezultaţi la segregare (metoda
BSA), care dă posibilitate pentru cartarea genelor ce segregă în una din populaţii şi
segregarea indivizilor ce se deosebesc fenotipic. Obiectele de studiu sunt scanate
cu ajutorul primerilor RAPD pentru identificarea markerilor polimorfismului.
Această metodă a fost larg folosită în studiul unor plante decorative, precum şi în
identificarea genelor rezistente la unele boli la grâu, orz, orez, a genelor ce
determină coacerea tomatelor etc. Analogic au fost cartate genele rezistenţei
tomatelor la nematozi, care mai târziu şi-a găsit întrebuinţare în ameliorarea unor
noi soiuri de tomate.
O analiză referitor la folosirea metodelor moleculare în marcarea caracterelor
valoroase este prezentată în tabelul 3.3.

3.2.4. Folosirea metodei RAPD pentru paşaportizarea noilor

soiuri şi linii.
Biotehnologia contemporană permite de a moderniza considerabil selecţia
plantelor şi de a o face mai efectivă. Analiza polimorfismului genetic molecular cu
ajutorul reacţiei în lanţ a polimerazei a devenit un instrument efectiv şi se
utilizează pe larg în practica de ameliorare mondială (Arcis, Morena-Gonzalez,
1992; Коcieva, 1999; Pouк, 2003).
178
 Tabelul 3.3
Surse bibliografice despre folosirea metodelor de marcare moleculară a caracterelor
valoroase la culturile agricole

Cultura Metoda Scopul marcării Autorul Date

marcării bibliografice
genelor
1 2 3 4 5
Sfecla RAPD Cartarea markerilor Giorio G., Plant Bred.,
de zahăr înlănţuiţi cu gena Galitelli M., 1977, N 5,
rezistenţei la rizomanie Carriero F. p.401-408,
Engl.
Grâu RAPD Înlănţuirea markerilor Niu Yoghum, High.Technol.
RAPD cu gena Wu Liren Lett 1998,
rezistenţei la rugină N 12, p.11-14,
China
Grâu RAPD, Paşaportizarea Gupta P., Plant Bred.,
AFLP, şi identificarea Sharma P. 1998, N 5,
SSR, genotipurilor la grâu p.369, Engl.
DAF
Porumb RFLP Identificarea markerilor Ming R., Maydica, 1999,
RFLP înlănţuiţi cu gena Moon H., N 4, p.319-323,
SW Brewbaker I. Engl.

Porumb AFLP Analiza diversităţii Jia Jianhang, High Technol.

genetice la liniile Jin Demid, Lett, 1999, N 4,
inbrede Wang Bin p.43-47 Engl.

Porumb RFLP, PCR Analiza dependenţei Verbiţkaia T., Docladî

hibrizilor de Sivolap I., Academii s-h
polimorfismul liniilor Sokolov V. nauk, 1997, N 4,
p.10-12, Rus.

Porumb PCR Determinarea infectării Sidorenko A., Citologie

seminţelor cu ciuperca Sokolova E. genetică, 2001,
Fusarium moniliforma N 1, p. 34-37
Rus.
Porumb RFLP Localizarea genei ce Li Lijia, Song Wuhan Univ.,
determină infectarea cu Yonchum, You 1998, N 4,
Helminthosporium Huimin p.495-498,
Engl.

179
Porumb RFLP, Analiza asemănărilor Pejic I., Theoretic and
RAPD, liniilor consangvinizate Margante M., Appl.Genetic,
SSR, AFLP Costigloni P. 1998, N 8,
p.1278-1355
Engl.
Orez SSR Analiza diversităţii Dong Van, Agr.and Food
genetice a plantelor în Hoang Huy Ind. 1999, N 1,
parte p.27-28 Engl.
Orez RAPD Markerii RAPD în Bouh D., Sala In vitro cell,
cultura celulelor în F. 1996, N 3, p.1.
condiţii de salinitate Engl.
Orez RAPD Identificarea markerilor Jeon Hee, Ahn Euphitica, 1999,
RAPD înlănţuiţi cu gena Song-Nay N 1, p.223-228.
rezistenţei la cicadă Engl.
Căpşun RAPD Construirea hărţii Davis T., Yu H. I Heved, 1997,
genetice N 3, p.215-221.
Engl.
Mazăre RAPD Moştenirea şi Kakaeva I., Dokladî RAN,
caracteristica markerilor Boblova V., 2000, Nr.4,
identificaţi la variantele Troiţki L. p.565-567, Rus.
somaclonale
In RAPD Analiza productivităţii Stegnii V., Genetica, 1999,
soiurilor de cultură Cidinov Iu., N.10, p.1370-
Salina E. 1373. Rus.
Viţa de SSR Determinarea Sefc K., Viticul and Enol
vie genotipului diferitor Regner F., Abstr.,, 2000, N
specii ale genului Vitis Gloss I. 1-2, p.27. Engl.
Viţa de RAPD Influenţa numărului de Faniza G., Viticul and Enol
vie markeri la determinarea Resta P., Abstr.,, 2000,
genotipului Colonna G. N 1-2, p.25-26.
Engl.
Mandarin RAPD Folosirea ADN- Filho Coletta, Genet. And
ului amplificat Marcos Molec.Biol.,
la determinarea Antonio, 2000, N 1, p.
variabilităţii plantelor Targon Luiza 169-172, Engl.
Cartof RAPD Analiza variabilităţii Gvanama C., Euphitica, 2000,
genetice Botha A. N.1, p.19-24.
Engl.

180
Cartof RAPD Analiza variabilităţii Gvanama C., Euphitica, 2000,
genetice Botha A. N.1, p.19-24.
Engl.
Tomate RFLP Determinarea markerilor Moreira L., Euphitica, 1999,
înlănţuiţi cu gena Molema C. N3, p.149-156,.
rezistenţei la Liriomyza Engl.
Trifoli
Tomate RAPD Identificarea Kocieva, Genetica, 1999,
polimorfismului soiurilor Suprunov N10 p.1386-
1389.Rus.
Grâu Folosirea markerilor Bezpalova L., Citologia şi
gliadinici în ameliorarea Neudacin B., genetica, 2000,
grâuliui Kolesnikov F. N2, p.24-31,
Rus.
Mango SSR Identificarea soiurilor Eiadthong Sci.Hort., 1999,
şi analiza variabilităţii Wichan, N 1-2, p.57-66.
genetice Yonemori Engl.
Keizo
Soia RAPD, Construirea hărţii Erreira A., J.Hered., 2000,
RFLP genetice a markerilor Foutz K. n5, p.392-396.
RAPD pe baza hărţii Engl.
RFLP
Lens sp. RAPD, Construirea hărţii Eujay I., Theor. And
AFLP genetice cu folosirea Baum., Apll. Genet.,
liniilor inbrede Powall W. 1998, N1-2,
p.83-89. Engl.
Salcie RAPD, Caracteristica varietăţii Barker J., Genome, 1999,
AFLP genetice şi formarea Mitthes M., N 2, p.173-183.
biomasei Arnold G. Engl.
Specii SSR Caracteristica Echt C., Can.J.Forest.
conifere microsateliţilor ADN Vendramin G. Resurse 1999,
N3, p.365. Engl.

Markerii ADN sunt utilizaţi, pe de o parte, ca markeri genetici pentru cartarea

şi delimitarea caracterelor de interes, iar pe de altă parte ca indicatori ai diversităţii
genetice. Diversitatea genetică este evaluată prin încărcătura de informaţii şi
numărul de benzi.
Sistemele de markeri diferă prin capacitatea lor de a determina înrudirea între
forme bazate pe estimarea similitudinii genetice. Această informaţie poate fi
utilizată şi la întocmirea programelor de ameliorare (Iuoraş, 1999).

181
 La sfârşitul anului 1996 existau peste 800 de referinţe bibliografice cu privire
la markerii RAPD (Rafalski, 1996). Prezentarea în continuare a câtorva exemple
de analiza genomică cu ajutorul markerilor RAPD nu epuizează domeniul vast al
posibilităţilor de utilizare a acestei tehnologii.
Reiseberg şi colab. (1993) au întocmit hărţi de înlănţuire detailate pentru
Helianthus anomalus, un hibrid între Helianthus annuus şi Helianthus petiolaris,
distribuind cei 161 de markeri RAPD identificaţi în 18 grupe, acoperind 2338 cM.
Studiul a permis descrierea fragmentelor provenite de la cei doi părinţi. Autorii
consideră că introgresiunile provenite de la formele parentale au contribuit la o mai
mare flexibilitate a speciei hibride faţă de speciile parientale alopoliploide, în sensul
unei mai bune adaptări a genomului pentru o nouă nişă ecologică. Asemenea studii
furnizează informaţii utile pentru înţelegerea evoluţiei genului Helianthus.
Koebner şi Martin (1994) au comunicat despre utilizarea tehnicii RAPD-PCR
în selecţia recombinărilor grâu×secară.
Koebner (1995) a utilizat primeri oligonucleotidici în cercetări pentru evidenţierea
cromozomilor sau a unor fragmente de cromozomi de secară, în genomul grâului, cu
ajutorul tehnicii bazate pe reacţia PCR. El a propus dezvoltarea unui program pentru
identificarea introgresiunilor provenite de la secară, ceea ce ar deschide posibilitatea
reducerii conţinutului acestora în translocaţia grâu×secară, cu avantaje în privinţa
producţiei faţă de cromozomul 1B normal de la grâu.
În prezent, metoda RAPD-PCR se foloseşte pe larg pentru identificarea şi
marcarea speciilor şi, îndeosebi, a soiurilor diferitor culturi agricole, cum ar fi:
orezul (Loarce şi al, 1996), brocoli (Hu, Quiros, 1991; Dorohov, Klone, 1993),
mărul (Koller şi al, 1993), viţa de vie (Collins, Symons, 1993), soia (Echt şi al.,
1991), cartoful (Demeke şi al., 1993), secara, ovăzul (Sivolap şi al., 1997),
porumbul (Comarova şi al., 1996).
Identificarea spectrelor specifice polimorfe ale ADN-ului diferitor genotipuri
de porumb, efectuată prin RAPD-analiză, deschid perspective noi pentru
paşaportizarea liniilor şi hibrizilor de porumb, pe larg utilizate în selecţie pe
teritoriul Republicii Moldova (Jacotă, Barabacari, Bacian, 2003).

3.2.5. Folosirea markerilor SSR pentru analiza polimorfismului

la plante.
În ultimul deceniu se efectuează de asemenea şi analize pe baza ISSR-PCR –
experienţe bazate pe folosirea microsateliţelor la formarea hărţilor genetice ale
diferitor specii, în special la culturile bine studiate, cum sunt: orezul, porumbul,
grâul, tomatele şi arapidopsisul şi, de asemenea, la culturile puţin studiate, cum
sunt pinul şi arborii tropicali (Kocieva, 1999).
La 18 linii de grâu a fost demonstrată variaţia a 15 markeri microsateliţi.
Polimorfizmul înalt s-a detectat după aceşti microsateliţi, în urma utilizării lor
182
în calitate de markeri RFLP; prin aceasta, frecvenţa marcării a ajuns la 4,6 alele
diferite pentru un microsatelit. Analogic au fost marcate şi genomurile
porumbului, grâului şi ale tomatelor.
Analizele pe baza microsateliţelor au fost folosite, de asemenea, pentru
determinarea gradului de înrudire genetică a liniilor autopolenizate de porumb
(A344 şi VIR44). S-a constatat că distanţa genetică între aceste linii este de 0,257-
0,314, ceea ce corespunde datelor analizei comparative ale liniilor de porumb din
grupele de heterozis diferit. Compararea datelor analizelor SSR şi ISSR a permis
autorilor (Kojuhova şi al., 2003a) să presupună că variaţia VIR44 şi A344 este
legată de schimbarea regiunilor ADN-ului repetat, şi nu de genele structurale.
Autorii constată, că în procesul de ameliorare şi producere a seminţelor liniilor
VIR44 şi A344 sunt implicate secvenţele mediare ale ADN-ului, care, posibil,
joacă un rol adaptiv.
În experienţele îndeplinite de către Kojuhova şi colab. (2003b) a fost studiată
corespunderea dintre distanţele genetice între liniile de porumb obţinute pe baza
tehnologiei PCR cu microsateliţi şi nivelul heterozisului după producţia de boabe a
hibrizilor simpli, în următoarele trei etape:
Etapa I a constat în aprecierea omogenităţii a 20 de linii autopolenizate cu
ajutorul SSR-PCR după trei locusuri MZEADH2N, phi 015, phi 116 (GENEBANK).
Linia se socotea omogenă dacă spectrele ADN la 6 exemplare ale liniei date erau
identice după trei locusuri de microsatelite studiaţi. În continuare au fost alese 12 linii,
care ulterior au luat parte la hibridare după o schema dialelică întreagă.
La etapa a II-a pe baza analizei PCR a fost studiat polimorfismul molecular
al liniilor alese prin utilizarea a 10 ISSR primeri şi calculul distanţelor genetice
între ele. După datele de distanţă genetică a fost efectuată separarea combinaţiilor
hibride cu heterozigoţie contrastă şi prognozarea hibizilor cu gradul înalt de
heterozigoţie între cele mai divergente, în plan genetic, forme parientale.
Etapa III a constat în aprecierea capacităţii de prognozare a markerilor
moleculari. În prezent se efectuează controlul potenţialului de prognozare a
markerilor PCR pe calea testării productivităţii a 66 hibrizi simpli şi 12 linii
parientale, analiza corelaţiei distanţelor genetice între linii şi indicii productivităţii
hibrizilor.
Deci, datorită hipervariaţiei dimensiunilor şi răspândirii în genomul vegetal,
microsateliţii sunt o clasă principală de markeri ADN şi pot fi utilizaţi pe larg
pentru determinarea polimorfizmului, construirea hărţilor genetice la diferite
plante, determinarea nivelului înrudirii genetice între linii şi, de asemenea, pentru
alegerea formelor parientale cu scopul obţinerii hibrizilor înalt productivi.
Un interes teoretic şi practic prezintă, de asemenea, mărirea eficacităţii selecţiei
pe baza informaţiei markerilor ADN ale locusurilor unei cantităţi determinante de
simptome (markeri ADN QTL`s – Quality Trait Locus) – (Arus, Moreno-Gonzalez,
1992). S-a constatat o majorare considerabilă a eficacităţii alegerii în populaţiile

183
cu segregare din contul utilizării markerilor ADN a locusurilor simptomelor
cantitative. S-a stabilit (Domeniuk şi al., 2003) necesitatea utilizării minimale a doi
markeri pentru selectarea pozitivă şi păstrarea lor la descendenţii vegetali, care au
fost selectaţi după markeri de ADN QTL’s.
Utilizarea markerilor depinde şi de tehnologia calculatoarelor, care ar putea
pune la dispoziţie datele unor experimentări complexe (bioinformatică), într-un
mod uşor de înţeles şi accesibil amelioratorilor.
J. A. Rafalski şi Tingey (1993) au propus o schema de ameliorare care să ia în
calcul eficienţa selecţiei pe baze genetice (fig. 3.6). În parte, aceasta ar putea fi
realizată odată cu completarea hărţilor genetice, prin saturarea cu markeri a
regiunilor specifice şi secvenţierea acestora, care să permită o bună caracterizare a
materialului. Utilitatea informaţiilor obţinute prin diagnosticarea ADN-ului
depinde de accesibilitatea acestora şi de corelarea lor cu rezultatele studiilor
fenotipice şi biochimice.

Colectare \esut Considera\ii Experiment biochimic

economice
Extrac\ia ADN Ulei, proteine,
carbohidra\i
Experiment
ADN Sta\iunea
Genotip de
ameliorare

Fenotip Decizia de ameliorare

Observa\ii de c`mp NOUL CULTIVAR

Fig. 3.6. Fluxul de informaţii în ameliorarea plantelor asistată de markeri

(după J. Rafalski şi S. Tingey, 1993)

184
 Verificarea cunoştinţelor

1. Din ce cauză este redusă intensificarea şi eficacitatea lucrărilor în domeniul

ingineriei genetice vegetale?
2. În ce scop sunt folosite metodele markării moleculare în fitotehnie?
3. Ce permite identificarea genotipurilor la nivel molecular?
4. Numiţi particularitatea biopolimerilor principali ai celulelor vii a organismului,
pe care se bazează marcarea moleculară a genomului vegetal.
5. Ce fel de metode de marcare moleculară a genomului vegetal se folosesc în
Republica Moldova?
6. Din care tehnologii constă a doua grupă de metode a marcării moleculare a
genomului vegetal?
7. Ce fel de metode au fost elaborate pe baza tehnologiilor PCR?
8. Cum se descifrează PCR şi care sunt particularităţile acestei tehnologii?
9. Cum se descifrează RFLP şi ce necisită folosirea markerilor RFLP?
10. Ce diferenţă există între etapele tehnicilor RFLP şi PCR?
11. Ce prezintă minisateliţii?
12. În ce scop sunt folosiţi primerii şi câte categorii de primeri cunoaşteţi?
13. Enumeraţi etapele tehnologiei PCR-reacţiei în lanţ a polimerazei.
14. Ce diferenţă există între RAPD şi ISSR-analize, utilizate pentru identificarea
genomului vegetal?
15. Cum sunt folosite tehnicile bazate pe PCR pentru identificarea genomului
plantelor agricole?
16. Ce factori au o importanţa deosebită pentru elaborarea hărţilor genetice cu
aplicarea markerilor de ADN?
17. La ce cultură vegetală a fost demonstrată prioritatea folosirii markerilor
moleculari pentru construcţia hărţilor genetice?
18. Daţi exemple de utilizare a microsateliţilor în marcarea genomului vegetal.
19. Ce fel de probleme ale selecţiei clasice pot fi rezolvate cu ajutorul RAPD şi
ISSR-analize?

185
 4. BIOTEHNOLOGII ŞI BIOSECURITATEA

Problema privind diversitatea biologică constituie una din principalele

preocupări ale omenirii în mileniul III. Problema constă în faptul, că o dată cu
avansarea progresului tehnologic şi a utilizării intense a resurselor naturale, a
sporit considerabil impactul antropogen asupra diversităţii biologice, diminuând
esenţial numărul speciilor şi varietăţilor de organisme vii care populează globul
pământesc. În rezultatul activităţilor umane, zilnic de pe suprafaţa Terrei dispare
câte o specie. Această situaţie critică a pus în gardă comunitatea internaţională şi
societăţile civile din multe ţări. În rezultatul discuţiilor la nivel înalt a fost
elaborată Convenţia privind Diversitatea Biologică, deschisă pentru semnare la
conferinţa Naţiunilor Unite pentru Mediu şi Dezvoltare din 5 iunie 1992 la Rio de
Janeiro, şi care a intrat în vigoare la 29 decembrie 1993. Convenţia are ca obiectiv
principal protecţia, conservarea şi utilizarea durabilă a diversităţii biologice.

Una din problemele principale abordate de Convenţie ţine de aspectul

securităţii biologice. Această problemă se referă la necesitatea protejării sănătăţii
umane şi a mediului de efectele adiţionale, care pot fi cauzate de utilizarea
rezultatelor biotehnologiilor moderne. În acelaşi timp, e bine cunoscut faptul că
biotehnologiile moderne dispun de un potenţial considerabil pentru promovarea
bunăstării umane, în particular, pentru atingerea necesităţilor critice în alimentaţie,
agricultură şi sănătatea umană.
Începând cu anii 60 ai secolului trecut, s-au dezvoltat cercetările ştiinţifice în
domeniul biotehnologiilor, care au căpătat un aspect aplicativ în anii 80, o dată cu
acceptarea pentru cultivare a plantelor modificate genetic. Din acest moment, cercurile
academice şi societatea civilă s-au plasat pe două poziţii, în unele cazuri chiar
diametral opuse, privind beneficiile şi riscurile posibile, rezultate în urma utilizării
organismelor modificate genetic (OMG) asupra mediului şi sănătăţii umane. Astfel, la
22 ianuarie 2000, la întâlnirea extraordinară a Părţilor la Convenţia privind
Diversitatea Biologică (Montreal, Canada), a fost adoptat Protocolul de la Cartagena
privind Biosecuritatea. Acest document reglementează, la nivel global, activităţile
legate de asigurarea unui nivel adecvat de protecţie pentru siguranţa transferului,
manipulării şi utilizării organismelor modificate genetic, rezultate în urma utilizării
biotehnologiilor moderne şi care pot avea efecte negative asupra procesului de
conservare şi utilizare durabilă a diversităţii biologice, ţinând de asemenea cont de
riscurile pentru sănătatea umană şi concentrându-se în special asupra mişcării lor
transfrontaliere. Semnarea Protocolului a fost apreciată ca un pas semnificativ prin
faptul, că el asigură cadrul de reglementare la nivel

186
internaţional privind reconcilierea necesităţilor respective de comerţ şi protecţie a
mediului, determinate de utilizarea biotehnologiilor. Astfel, Protocolul crează un
mediu favorabil pentru aplicarea ecologică a biotehnologiei moderne, ceea ce
permite utilizarea beneficiilor din potenţialul oferit de ele, minimalizând în acelaşi
timp riscurile pentru mediu şi sănătatea umană.
Republica Moldova s-a implicat în acest proces la nivel global prin ratificarea
în 1995 a Convenţiei privind Diversitatea Biologica şi, în 2002, a Protocolului de
la Cartagena privind Biosecuritatea. În conformitate cu angajamentele luate până
la momentul actual, au fost întreprinse mai multe măsuri în vederea implementării
prevederilor acestor documente internaţionale. În special, au fost elaborate şi
aprobate Primul Raport Naţional privind Diversitatea Biologică, Strategia
Naţională şi Planul de Acţiuni în domeniul diversităţii biologice, Legea privind
Securitatea Biologică. În prezent, Republica Moldova întreprinde paşi întru
fortificarea capacităţilor în domeniul securităţii biologice prin dezvoltarea cadrului
naţional de biosecuritate şi contribuie la procesul de conştientizare a populaţiei
privind problemele în cauză. Aceste activităţi au menirea de a contribui la
dezvoltarea sistemului de luare a deciziilor în vederea reglementării activităţilor
legate de obţinerea, transportarea, importul-exportul şi comercializarea
organismelor modificate genetic şi a produselor rezultate din astfel de organisme.
În acest scop, a fost elaborat conceptul Cadrului Naţional de Securitate Biologică,
document ce va determina direcţiile prioritare de dezvoltare ale sistemului de
reglementări şi monitorizare a organismelor modificate genetic, în vederea
respectării cerinţelor Protocolului de la Cartagena. Cadrul Naţional de Securitate
Biologică include următoarele componente:
– Politicile Guvernului în domeniul securităţii biologice;
– Cadrul legislativ în domeniul securităţii biologice;
– Cadrul instituţional şi sistemul de notificare şi autorizare;
– Sistemul de luare a deciziilor, monitoring şi evaluare a riscurilor asupra
mediului şi sănătăţii umane;
– Mecanismele de conştientizare, educaţie şi participare a publicului în
procesul de luare a deciziilor.
Organul suprem naţional, care va dirija cu aceste activităţi, este Comisia
Naţională pentru Securitatea Biologică, abilitată cu funcţia de luare a deciziilor şi
autorizării activităţilor legate de utilizarea organismelor modificate genetic. Ca act
normativ de aplicare a Legii privind Securitatea Biologică, a fost aprobat
Regulamentul privind autorizarea activităţilor legate de obţinerea, testarea,
utilizarea şi comercializarea organismelor modificate genetic. Atât Legea, cât şi
Regulamentul se axează pe reglementări asupra utilizării în condiţii izolate,
introducerii deliberate în mediu, introducerii deliberate pe piaţă, cât şi în importul/
exportul organismelor modificate genetic. Cu funcţii de testare şi evaluare a
riscurilor potenţiale, determinate de obţinerea, utilizarea şi comercializarea OMG,
este abilitat Centrul pentru Securitatea Biologică.
187
 4.1. Cadrul legislativ internaţional în domeniul
securităţii biologice

4.1.1. Convenţia cu privire la Diversitatea

Biologică (Rio de Janeiro, 1992).
Actualmente, problema conservării diversităţii biologice depăşeşte limitele
problemelor ştiinţifice şi se plasează la nivelul obiectivelor stringente ale statelor
şi organismelor internaţionale, obiective care sunt menite să asigure condiţii
favorabile de trai a populaţiei prin intermediul utilizării durabile a resurselor
naturale şi protecţiei mediului ambiant. Unul din documentele importante la nivel
global, care reglementează această activitate, este Convenţia cu privire la
Diversitatea Biologică (Rio de Janeiro, 1992). Convenţia solicită statelor să acorde
o atenţie sporită activităţilor de conservare a diversităţii biologice în habitatele
naturale, utilizării raţionale a resurselor biologice, controlului strict asupra
procedeelor biotehnologice etc. Republica Moldova a ratificat Convenţia privind
Diversitatea Biologică la16 mai 1995 (Hotărârea Parlamentului nr. 457-XIII).
Protocolul de la Cartagena privind Biosecuritatea la Convenţia cu privire la
Diversitatea Biologică a fost semnat de Republica Moldova la New-York la 14
februarie 2001 şi ratificat prin Legea nr. 1381-XV la 11 octombrie 2002.
Obiectivul Protocolului este de a contribui la asigurarea unui nivel adecvat de
protecţie pentru siguranţa transferului, manipulării şi utilizării organismelor
modificate genetic, rezultate din biotehnologia modernă. Protocolul stabileşte
norme şi proceduri care permit ţărilor importatoare să controleze operaţiunile de
import/export cu organisme vii modificate genetic, obţinute prin tehnicile
biotehnologiei moderne.

4.2. Politici şi strategii naţionale şi sectoriale de mediu a

Republicii Moldova

4.2.1. Politici şi strategii naţionale.

Politica Republicii Moldova în domeniul protecţiei mediului reprezintă o
sarcină actuală şi ţine de consolidarea cursului ţării spre o dezvoltare durabilă şi
integrarea europeană, spre intensificarea colaborării internaţionale în domeniu. În
prezent, Republica Moldova a ratificat 18 Convenţii internaţionale de mediu,
îndeplinirea prevederilor cărora necesită o reexaminare a cadrului legislativ şi
normativ naţional, şi armonizarea lui cu prevederile acestei Convenţii la nivel
regional şi global. În acest scop au fost adoptate:
Hotărârea Parlamentului RM nr. 1267-XV din 19.07.2002 asupra rezultatelor
controlului executării Legii nr. 851-XIII din 29 mai 1996 privind expertiza
188
ecologică şi evaluarea impactului asupra mediului înconjurător. Articolul 3 al
Legii stipulează că Ministerul Ecologiei şi Resurselor Naturale va armoniza
legislaţia de mediu a Republicii Moldova cu cea internaţională din domeniul
respectiv;
Decretul Preşedintelui Republicii Moldova nr. 957-III din 13 noiembrie 2002
privind constituirea Comisiei Naţionale pentru integrarea europeană;
Întru îndeplinirea angajamentelor luate ca Parte a Convenţiei cu privire la
Diversitatea Biologică, Guvernul R.M. a elaborat şi aprobat Strategia şi Planul de
acţiune în domeniul conservării diversităţii biologice şi Primul Raport Naţional cu
privire la Diversitatea Biologică.
Strategia Naţională şi Planul de Acţiune în domeniul conservării diversităţii
biologice (Hotărârea Parlamentului R.M. nr. 112-XV din 27 aprilie 2001) prevede
elaborarea unui complex de acţiuni urgente pentru asigurarea securităţii biologice
a ţării. Ele se referă la:
– reglementarea importului şi exportului de organisme obţinute pe cale
transgenică;
– crearea cadrului legislativ şi instituţional respectiv;
– perfecţionarea cadrelor şi crearea laboratorului de control al organismelor
modificate genetic;
– elaborarea programelor speciale de informare a populaţiei despre pericolul
utilizării organismelor modificate genetic.
Strategia Naţională şi Planul de Acţiuni acordă o atenţie deosebită
transparenţei şi activităţilor preventive în utilizarea organismelor transgenice. Se
prevede realizarea unui complex întreg de măsuri imediate în scopul asigurării
securităţii biologice a ţării.

4.2.2. Politici şi strategii sectoriale.

Obţinerea, utilizarea şi comercializarea organismelor genetic modificate la nivel
naţional este direct sau indirect reglamentată şi de un şir de acte normative ce
determină politicile şi strategiile sectoriale. Luând în considerare importanţa sectorului
agricol pentru economia ţării, Guvernul R.M. a aprobat Concepţia naţională privind
agricultura ecologică, producerea şi comercializarea produselor alimentare ecologic
pure şi nemodificate genetic (HGRM nr. 863 din 21.08.2000). Documentul pune un
accent considerabil pe tehnologiile ecologic pure de obţinere a produselor agricole.
Reieşind din necesitatea adoptării măsurilor urgente de îmbunătăţire a situaţiei în
domeniul comerţului extern şi integrării economiei ţării în sistemul mondial de
comerţ, Guvernul a aprobat lista măsurilor de îndeplinire a angajamentelor Republicii
Moldova faţă de Organizaţia Mondială a Comerţului (OMC) (HGRM nr.1035 din
16.10.2000). Ministerul Economiei a fost desemnat în calitate de organ de coordonare
a activităţii ministerelor şi departamentelor în

189
problema aderării la OMC. În februarie 2001 tratativele de aderare a Republici
Moldova la OMC au fost finalizate (HGRM nr. 173 din 28.02.2001). În acelaşi an,
Moldova a fost acceptată ca membru cu drepturi depline al OMC. Concomitent, în
conformitate cu angajamentele respective, a fost adoptată Legea despre certificare
(nr.652-XIV din 28.10.1999), care stabileşte bazele legislative ale certificării ce se
efectuează în scopul creării condiţiilor de activitate a agenţilor pe piaţă. În
contextul angajamentelor faţă de OMC, Moldova a stabilit bazele legislative ale
înlăturării barierelor tehnice în comerţ şi în procesul elaborării, adoptării şi
aplicării reglementărilor tehnice, standardelor şi procedurilor de apreciere a
calităţii (Legea privind barierele tehnice în comerţ nr. 866-XIV din 10.03.2000).
Reglementările tehnice nu trebuie să poarte un caracter mai restrictiv pentru
comerţ, decât este necesar pentru asigurarea securităţii naţionale, protecţiei
sănătăţii şi securităţii oamenilor, protecţiei lumii animale şi vegetale, protecţiei
mediului înconjurător.
În 1997 Moldova a aderat la Statutul Comisiei Codex Alimentarius (HPRM
nr.1342 –XIII din 8.10.1997). Devenind membru al acestei Comisii, Republica
Moldova şi-a asumat angajamentul să asigure protecţia sănătăţii consumatorilor, să
contribuie la comerţul internaţional şi să aproximeze cerinţele naţionale faţă de
produsele alimentare la normele internaţionale prevăzute de Codex Alimentarius.
Aceste măsuri erau prevăzute în calitate de măsuri prioritare pentru facilitarea
intrării Republicii Moldova în OMC. În scopul colaborării cu Comisia Codex
Alimentarius, Guvernul a creat Comitetul Naţional Codex Alimentarius (CNCA) cu
statut de organ consultativ (HGRM nr. 866 din 21.09.1999).
Regulamentul privind CNCA (HGRM nr. 419 din 03.05.2000) prevede, că
unul din obiectivele de bază ale acestei Comisii va fi protecţia sănătăţii
consumatorului din punct de vedere alimentar, simplificarea comerţului
internaţional prin înlăturarea barierelor şi asigurarea relaţiilor de parteneriat în
comerţ. Prevalarea importurilor în balanţa comerţului exterior al ţării, precum şi
cota înaltă de produse alimentare importate, obligă Guvernul să întreprindă toate
măsurile pentru protejarea consumatorului de potenţialele consecinţe negative,
rezultate de pe urma consumului produselor alimentare obţinute prin utilizarea
OMG.

4.2.3. Acorduri bilaterale şi multilaterale.

În prezent, Republica Moldova are încheiate un şir de acorduri internaţionale
în domeniul protecţiei mediului înconjurător, care au tangenţe cu problemele
conservării diversităţii biologice şi asigurării securităţii biologice.
Protocolul privind colaborarea între Ministerul Protecţiei Mediului
Înconjurător al Ucrainei şi Departamentul Protecţia Mediului Înconjurător şi
190
Resurselor Naturale al Republicii Moldova, încheiat la Kiev la 19 noiembrie 1993.
Acest Protocol stipulează direcţiile principale de colaborare cu privire la protecţia
florei şi faunei, monitoringul mediului, informarea operativă despre poluarea
transfrontieră, cât şi ajutorului reciproc în lichidarea urmărilor catastrofelor de
producţie sau a calamităţilor naturale.
Acordul de Parteneriat şi Cooperare (APC) al Republicii Moldova cu
Uniunea Europeană, semnat în 1998. Articolul 50 al acestui acord stipulează că
Republica Moldova se angajează să-şi aducă treptat legislaţia sa în conformitate cu
legislaţia Comunităţii Europene.
Acordul între Departamentul Protecţia Mediului Înconjurător al Republicii
Moldova şi Ministerul Resurselor Naturale şi Protecţiei Mediului Înconjurător al
Republicii Belarusi privind colaborarea în domeniul mediului înconjurător,
semnat la Chişinău la 23 decembrie 1994 şi intrat în vigoare din 14 aprilie 1997.
Acordul stipulează direcţiile principale de colaborare în domeniul perfecţionării
metodologice, normativ-instructive şi juridice privind folosirea resurselor naturale,
monitoringului ecologic şi asigurării informaţionale, activităţilor privind ariile
protejate, protecţia fondului genetic a speciilor rare de plante şi animale.
Acordul de colaborare între Inspectoratul Ecologic de Stat din Republica
Moldova şi Inspectoratul Ecologic de Stat şi Inspectoratul Piscicol ale regiunii
Viniţa, încheiat la 13 iunie 1996 în or.Viniţa (Ucraina), care prevede asigurarea
schimbului de informaţie ecologică, schimbului de experienţă şi implementarea
unor programe comune.
Acordul de colaborare între Departamentul Protecţia Mediului Înconjurător
al Republicii Moldova şi Ministerul Apelor, Pădurilor şi Protecţiei Mediului al
României în domeniul mediului înconjurător şi folosirii durabile a resurselor
naturale, semnat la 18 martie 1997. Acordul prevede perfecţionarea bazei
metodologice, normative, instructive şi juridice a protecţiei mediului şi folosirii
resurselor naturale, armonizarea legislaţiei, reglementărilor şi normelor tehnice în
domeniul protecţiei mediului.
Acordul între Ministerul Mediului şi Protecţiei Teritoriului al Republicii
Italiene şi Ministerul Ecologiei, Construcţiilor şi Dezvoltării Teritoriului al
Republicii Moldova privind colaborarea în domeniul protecţiei mediului şi
folosirii resurselor naturale, semnat la Chişinău la 10 iunie 2002. Acordul
stipulează direcţiile de colaborare în domeniul legislativ-normativ, monitoringului
ecologic, cercetărilor ştiinţifice în domeniul protecţiei mediului şi folosirii
raţionale a resurselor naturale, ariilor protejate, protecţiei fondului genetic şi
educaţiei ecologice.
E necesar de menţionat că aceste acorduri nu stipulează relaţii specifice de
colaborare şi parteneriat cu ţările menţionate, pentru asigurarea securităţii
biologice. Cu toate acestea, acordurile semnate stipulează clauze, sub incidenţa
cărora cad şi organismele modificate genetic.
191
 4.3. Legislaţia cadru a Republicii Moldova în domeniul
securităţii biologice
În scopul îndeplinirii prevederilor Legii cu privire la ratificarea Protocolului
de la Cartagena privind Biosecuritatea, Guvernul a desemnat Ministerul Ecologiei
şi Resurselor Naturale în calitate de autoritate naţională responsabilă de legătura
cu Secretariatul Convenţiei privind Diversitatea Biologică, precum şi pentru
coordonarea acţiunilor de implementare a prevederilor acesteia în Republica
Moldova (HGRM nr. 197 din 25.02.2003). În temeiul prevederilor Convenţiei
privind Diversitatea Biologică şi a Protocolului de la Cartagena privind
Biosecuritatea, în Republica Moldova a fost elaborat un set de acte legislative, care
au menirea să asigure cadrul legal în domeniu.

4.3.1. Legea privind Securitatea Biologică.

Legea privind Securitatea Biologică (nr. 755-XV din 21.12.2001, MO nr. 75
din 13.06.2002) este armonizată la Directiva Europeană 2001/18/EC privind
introducerea deliberată în mediu a organismelor modificate genetic şi
reglementează activităţile legate de obţinerea, testarea, producerea, utilizarea şi
comercializarea organismelor modificate genetic prin tehnicile biotehnologiei
moderne.
Dispoziţiile Legii se aplică pentru următoarele activităţi:
– obţinerea, multiplicarea, testarea şi utilizarea în condiţii izolate, pentru
diferite scopuri, a microorganismelor, plantelor şi animalelor modificate
genetic prin tehnicile biotehnologiei moderne;
– introducerea deliberată în mediu şi introducerea pe piaţă a organismelor
modificate genetic prin tehnicile biotehnologiei moderne, inclusiv a
oricărei structuri vii capabile să reproducă un organism, cum sunt
seminţele, bulbii, butaşii, polenul, sporii şi altele asemenea;
– eliberarea neintenţionată în mediu a organismelor modificate genetic;
– introducerea deliberată în mediu şi introducerea pe piaţă a produselor
procesate care conţin organisme modificate genetic şi/sau componente
nevii din organisme vii modificate genetic, în stare neprelucrată sau
procesate;
– toate felurile de cercetări ale organismelor modificate genetic, inclusiv
cercetări de laborator, clinice, de câmp, de experimentare în producţie;
– operaţiile deliberate de import/export cu organisme modificate genetic şi cu
produse rezultate din astfel de organisme;
– transportul neintenţionat peste frontieră al organismelor modificate genetic;

192
 – depozitarea, înhumarea, nimicirea organismelor modificate genetic şi/sau
produselor rezultate din astfel de organisme, folosirea deşeurilor rezultate
din utilizarea tehnicilor biotehnologiei moderne.
În funcţie de nivelul pericolului potenţial pentru sănătatea umană şi mediu,
generat de activităţile reglementate prin prezenta lege, pentru sistemele izolate
sunt stabilite următoarele clase de risc:
– clasa I: activităţi cu risc neglijabil, comparabil cu riscul de utilizare a
microorganismelor nepatogene, sau fără risc;
– clasa II: activităţi cu risc scăzut, comparabil cu riscul de utilizare a
microorganismelor convenţional patogene;
– clasa III: activităţi cu risc moderat, comparabil cu riscul de utilizare a
microorganismelor potenţial capabile să transmită infecţii;
– clasa IV: activităţi cu risc agravat, comparabil cu riscul de utilizare a
microorganismelor capabile să propage infecţii foarte periculoase.

4.3.2. Regulamentul privind autorizarea activităţilor legate de

obţinerea, testarea, utilizarea şi comercializarea organismelor
modificate genetic.
Regulamentul privind autorizarea activităţilor legate de obţinerea, testarea,
utilizarea şi comercializarea organismelor modificate genetic (HGRM nr. 1153 din
25.09.2003) este elaborat în acord cu prevederile Legii privind Securitatea
Biologică şi este armonizat cu Directiva 2001/18/EC privind diseminarea
deliberată în mediu a organismelor modificate genetic, Directiva 90/219/EEC
privind utilizarea controlată a microorganismelor modificate genetic şi Directiva
98/81/EEC privind utilizarea controlată a microorganismelor modificate genetic.

Regulamentul prevede modul de autorizare a activităţilor cu OMG şi atestă

dreptul titularului de a desfăşura un anumit gen de activitate cu respectarea
condiţiilor prevăzute în autorizaţie. Autorizarea activităţilor ce ţin de obţinerea,
utilizarea şi comercializarea a astfel de organisme este efectuată de către Comisia
Naţională pentru Securitate Biologică. Regulamentul prevede autorizarea
următoarelor tipuri de activităţi:
– utilizarea în condiţii izolate a organismelor modificate genetic;
– introducerea deliberată în mediu a organismelor modificate genetic;
– introducerea deliberată pe piaţă a organismelor modificate genetic şi a
produselor rezultate din acestea;
– importul/exportul organismelor modificate genetic şi/sau a produselor
rezultate din acestea.

193
 4.4. Legislaţia sectorială

Legislaţia naţională include şi legi, care, deşi nu conţin prevederi directe

referitoare la problemele securităţii alimentare şi biologice, reglementează
domeniile de activitate legate indirect cu problemele date. Acestea sunt Legile cu
privire la zootehnie, pomicultură, protecţia plantelor, medicamente şi altele (în
total 12 legi). La categoria actelor care au tangenţe cu problemele securităţii
biologice se referă şi unele Hotărâri ale Parlamentului şi Guvernului Republicii
Moldova. În contextul minimalizării riscurilor ce ţin de domeniul securităţii
biologice, o atenţie deosebită urmează a fi acordată aplicării corecte a
biotehnologiilor moderne în diverse sectoare ale agriculturii.

4.4.1. Aspecte privind protecţia consumatorilor.

În acest context trebuie menţionată Legea privind protecţia consumatorilor
(nr. 105-XV din 13.03.2003), intrată în vigoare la 27.10.2003, înlocuind legea
analogică precedentă (nr. 1453-XII din 25.05.1993). În conformitate cu această
lege, acele produse şi servicii sunt considerate inofensive, care nu prezintă risc
pentru viaţa, sănătatea, ereditatea şi bunurile consumatorilor sau mediul
înconjurător. Legea interzice producerea, depozitarea, introducerea pe piaţă şi
comercializarea produselor, prestarea serviciilor care nu corespund cerinţelor
obligatorii, stabilite în documentele normative, sau care în condiţii normale de
utilizare pot să supună riscului viaţa, sănătatea, ereditatea şi siguranţa
consumatorilor. Pentru punerea în aplicare a acestei legi, Guvernul a adoptat
Hotărârea despre intensificarea măsurilor de protecţie a consumatorilor (nr. 1297
din 27.11.2001). În acest document se stipulează că contractele de import a
produselor destinate comercializării pe piaţa internă trebuie să prevadă în mod
obligatoriu indici concreţi de calitate şi siguranţă corespunzătoare a produsului sau
referinţe la standarde naţionale sanitare şi tehnice şi reglementări, care stabilesc
cerinţe obligatorii în privinţa produsul dat. Deşi hotărârea menţionată nu conţine
prevederi directe despre OMG, prevederile ei permit stabilirea controlului asupra
utilizării a astfel de organisme sau produse, obţinute pe baza lor. În acelaşi scop,
Guvernul a aprobat şi Hotărârea privind crearea reţelei naţionale de monitoring şi
control de laborator a poluării mediului înconjurător cu agenţi bacterieni
(biologici) (nr. 477 din 19.05.2000). Funcţia de bază a reţelei de control constă în
stabilirea gradului de poluare cu agenţi bacterieni, realizarea controlului în
laborator, expertizei produselor alimentare, materiei prime alimentare, furajului şi
apei, eliberarea concluziilor despre utilitatea lor şi consum. Pentru lărgirea
spectrului măsurilor de protecţie a consumatorilor, inclusiv şi în cazul utilizării
produselor modificate genetic, Guvernul a ordonat Ministerului Sănătăţii (MS)
194
să elaboreze şi să aprobe normele sanitare de etichetare a produselor alimentare
modificate genetic (HGRM nr. 996 din 20.08.2003).

4.4.2. Sectorul fitotehnic.

În scopul asigurării securităţii biologice este foarte important de a stabili reguli
clare de producere şi control a utilizării seminţelor. Legea despre seminţe (nr. 659-
XIV din 29.10.1999) stabileşte bazele juridice, economice şi organizaţionale de
producere, de control al calităţii, comercializării şi utilizării seminţelor de plante
agricole şi reglementează relaţiile legale dintre organele de stat, producătorii şi
consumatorii de seminţe. Legea prevede, că implementarea politicii de stat şi
reglementarea de stat în domeniul seminţelor se efectuează de către Ministerul
Agriculturii şi Industriei Alimentare (MAIA) şi Comisia de Stat pentru încercarea
soiurilor de plante (CSÎSP) de pe lângă acesta, Inspectoratul de Stat pentru Seminţe
(ISS) şi alte organe şi instituţii de stat conform competenţelor. Legea permite
producerea, comercializarea, utilizarea şi importul seminţelor de plante numai pentru
acele soiuri, care sunt înscrise în Registrul Soiurilor şi Hibrizilor de Plante al R.M.
(RSHP). Este interzisă utilizarea şi comercializarea seminţelor, calitatea cărora nu este
controlată şi certificată conform procedurii stabilite.
Toate relaţiile, care apar în procesul creării, utilizării şi protecţiei legale a
soiurilor de plante, sunt reglementate de Legea despre protecţia soiurilor de plante
(nr. 915-XIII din 11.07.1996). Organele, care implementează politica de stat în
domeniul protecţiei legale şi utilizării soiurilor în Republica Moldova, sunt
Consiliul Naţional pentru soiurile de plante (CNSP), Comisia de Stat pentru
încercarea soiurilor de plante (CSÎSP) şi Agenţia de Stat pentru protecţia
proprietăţii industriale (ASPPI).
Condiţiile generale şi particulare de producere şi comercializare a materialului
reproductiv şi săditor a culturilor pomicole sunt reglementate de Legea cu privire
la pomicultură (nr. 728-XIII din 06.02.1996). Reglementările determinate de
această lege sunt puse în sarcina MAIA. Pentru desfăşurarea activităţii în domeniul
dat este necesară obţinerea licenţei. Controlul şi certificarea materialului săditor
este efectuat de către ISS. Importul materialului săditor se permite numai în cazul
deţinerii certificatului fitosanitar, eliberat de organele de carantină fitosanitară a
ţării exportatoare şi autorizaţiei din partea MAIA şi Inspecţiei Principale pentru
Carantina Fitosanitară (IPCF).
Serviciul de Stat de carantină fitosanitară (SSCF), stabilită de Guvern (HGRM
nr. 697 din 10.10.1995) întru îndeplinirea prevederilor Legii cu privire la
carantina fitosanitară (nr. 506-XIII din 22.06.1995), în virtutea atribuţiilor sale,
trebuie să asigure sistemul măsurilor de stat privind carantina fitosanitară externă
şi internă, care este îndreptat, în particular, către protecţia teritoriului

195
Republicii Moldova de intrarea sau introducerea din alte state a buruienilor care
pot pricinui daune considerabile economiei naţionale şi biodiversităţii.
În contextul măsurilor de protecţie a sănătăţii consumatorilor, cât şi în scopul
asigurării sistemului de control de stat asupra achiziţiilor de import, testare şi
utilizare a mijloacelor biologice de luptă cu dăunătorii, bolile şi buruienii, dar şi a
celor ce stimulează dezvoltarea plantelor, Guvernul a creat Consiliul
Interdepartamental Republican de Aprobare a Mijloacelor Fitosanitare şi a celor ce
ridică fertilitatea solului (HGRM nr.897 din 08.12.1994). Concomitent, pe lângă
Ministerul Agriculturii şi Industriei Alimentare a fost creat Centrul Naţional de
Stat de Atestare şi Aprobare a Mijloacelor Fitosanitare şi de Sporire a Fertilităţii
Solului.

4.4.3. Sectorul zootehnic.

În conformitate cu Legea cu privire la zootehnie (nr. 412-XIV din
27.05.1999), elaborarea şi aplicarea biotehnologiilor în zootehnie se efectuează de
instituţii ştiinţifice de cercetare, iar aplicarea lor este pusă sub controlul instituţiilor
specializate, dar numai după aprobările corespunzătoare.
Coordonarea întregii activităţi de îmbunătăţire a raselor de animale este
atribuită MAIA. În scopul îmbunătăţirii potenţialului genetic şi ridicării
productivităţii zonale a raselor de animale sunt create oficii specializate.
Materialele importate pot fi utilizate în scopuri de reproducţie numai după
aprobarea lor de către instituţiile ştiinţifice de profil şi zonare din Republica
Moldova. Controlul de stat în zootehnie este efectuat de MAIA.

4.4.4. Sectorul farmaceutic.

Un alt factor de risc pentru securitatea biologică îl prezintă substanţele
biologic-active obţinute prin utilizarea biotehnologiilor în procesul producerii şi
preparării medicamentelor. Astfel de substanţe cad sub incidenţa Legii cu privire
la medicamente (nr. 1409 -XIII din 17.12.1997). Deşi prevederile legii nu se referă
la aditivi alimentari şi componente nutritive pentru animale, Ministerul Sănătăţii
(MS) are dreptul să le treacă sub incidenţa prezentei legi, în cazul în care acestea
posedă unele proprietăţi biologic-active sau manifestă efecte secundare asupra
organismului uman. MS efectuează expertiza, aprobarea, înregistrarea
medicamentelor, publicarea şi menţinerea Registrului de stat al medicamentelor
(RSM), precum şi controlul, supravegherea calităţii şi efectelor secundare ale
medicamentelor. Serviciul de studiu al efectelor secundare manifestate de
medicamente este parte integrantă a sistemului de stat de control, desfăşurat de
MS.

196
 4.4.5. Sectorul sanitaro-epidemiologic.

Starea sanitaro-epidemiologică reprezintă un astfel de nivel al sănătăţii

populaţiei şi mediului de trai, în care lipsesc acţiunile dăunătoare şi ostile omului
şi se asigură condiţiile favorabile de viaţă. Legea privind asigurarea sanitaro-
epidemiologică a populaţiei (nr. 1513-XII din 16.06.1993) stabileşte cadrul
legislativ de activităţi legate de prevenirea (profilaxia), descoperirea şi combaterea
contravenţiilor în domeniul asigurării bunăstării sanitaro-epidemiologice a
populaţiei. În acest scop, Legea prevede că utilizarea substanţelor biologice de
protecţie a plantelor, stimulatorilor creşterii plantelor şi animalelor nu se admite
decât după efectuarea evaluării toxicologo-igienice şi cu autorizaţia organelor
Serviciului Sanitaro-Epidemiologic de Stat (SSES). Avizul sanitaro-epidemiologic
sau certificatul igienic este de asemenea necesar la producerea, utilizarea şi
comercializarea produselor alimentare, aditivilor alimentari, aplicarea
tehnologiilor de producere. Expertize şi consultaţii speciale cu privire la evaluarea
efectului factorilor de mediu asupra sănătăţii umane se efectuează în baza
ordinului organelor administraţiei locale de către instituţii ştiinţifice de cercetare şi
altele, în limita competenţelor sale. Pentru prima dată substanţele biologice
utilizate şi preparatele produse pe baza acestora, sistemele de diagnoză
bacteriologică, care prezintă un pericol potenţial pentru viaţa şi sănătatea omului,
sunt supuse înregistrării obligatorii de stat. Supravegherea sanitaro-epidemiologică
se efectuează de către SSES al MS. Bunăstarea sanitaro-epidemiologică este unul
din componentele drepturilor constituţionale ale omului la ocrotirea sănătăţii. În
conformitate cu Legea privind ocrotirea sănătăţii (nr. 411-XIII din 28.03.1995),
dreptul la ocrotirea sănătăţii se asigură prin conservarea fondului genetic al ţării,
prin prevenirea maladiilor, susţinerea bunăstării ecologice a mediului înconjurător,
cercetări fundamentale şi aplicative pe probleme legate de situaţia fondului genetic
în dependenţă de situaţia ecologică.

4.4.6. Securitatea produselor alimentare.

Protecţia intereselor consumatorilor şi a statului, care se manifestă prin
asigurarea calităţii produselor şi serviciilor, a inofensivităţii lor pentru viaţa şi
sănătatea oamenilor, precum şi pentru mediul înconjurător, constituie scopul de
bază al Legii cu privire la standardizare (nr. 590-XIII din 22.09.1995). În acelaşi
timp, se cere ca măsurile întreprinse pentru atingerea scopurilor menţionate să nu
lezeze drepturile ţărilor în ceea ce priveşte comerţul internaţional.
Controlul şi supravegherea de stat asupra respectării cerinţelor documentelor
normative cu privire la standardizare se efectuează de organul naţional pentru
standardizare – Departamentul Standardizare şi Metrologie (DSM). În acest
context este foarte importantă asigurarea uniformităţii măsurilor de control.

197
Relaţiile din acest domeniu sunt reglementate de Legea cu privire la metrologie
(nr. 647-XIII din 17.11.1995). Controlul şi supravegherea metrologică de stat se
aplică în multe domenii, inclusiv în ocrotirea sănătăţii, medicamentelor, produselor
alimentare, protecţiei mediului. În scopul implementării eficiente în Moldova a
Programului Securităţii Alimentare a Comisiei Europene, Guvernul a format
Comitetul de monitorizare şi evaluare a acestui Program (HGRM nr. 657 din
27.05.2002). Comitetul e împuternicit să prezinte Comisiei Europene propuneri
privind alocarea surselor financiare şi efectuarea controlului privind utilizarea
surselor alocate, să supravegheze şi să determine sferele şi sectoarele de atragere a
asistenţei tehnice, să efectueze analiza mersului implementării reformelor în
corespundere cu condiţiile indicate în Memorandumul de înţelegere reciprocă.
Ţinând cont de însemnătatea sectorului agroalimentar pentru economia ţării, dar şi
în scopul stabilirii locului propriu pe piaţa internaţională agroalimentară, Guvernul
a aprobat Concepţia naţională a agriculturii ecologice, fabricării şi
comercializării produselor alimentare ecologice şi genetic nemodificate (HGRM
nr. 863 din 21.08.2000). În acest document accentul este pus pe refuzul aplicării
ingineriei genetice în producerea produselor agricole.

4.4.7. Procedurile de import-export.

Reieşind din necesitatea adoptării măsurilor urgente de îmbunătăţire a situaţiei
în domeniul comerţului extern şi integrării economiei ţării în sistemul mondial de
comerţ, Guvernul a aprobat Lista măsurilor de îndeplinire a angajamentelor
Republicii Moldova faţă de Organizaţia Mondială a Comerţului (OMC) (HGRM
nr.1035 din 16.10.2000). Ministerul Economiei a fost desemnat în calitate de
organ de coordonare a activităţii ministerelor şi departamentelor în problema
aderării la OMC. În februarie 2001 tratativele de intrare a RM în OMC au fost
finalizate (HGRM nr. 173 din 28.02.2001). Concomitent, în conformitate cu
angajamentele respective a fost adoptată Legea despre certificare (nr. 652-XIV din
28.10.1999), care stabileşte bazele legislative ale certificării produselor, utilajului,
proceselor, tehnologiilor, asigurării programate a tehnicii computerizate, a
sistemului calităţii şi prestării serviciilor. Certificarea se efectuează în scopul
creării condiţiilor de activitate a agenţilor pe piaţa Republicii Moldova, dar şi a
integrării în comerţul mondial, a asigurării securităţii naţionale, a protecţiei vieţii,
sănătăţii şi bunurilor consumatorilor, a protecţiei mediului, a confirmării indicilor
calităţii produselor realizate de persoana ce le livrează.
În contextul angajamentelor faţă de OMC, Moldova a stabilit bazele legislative
ale înlăturării barierelor tehnice în comerţ şi în procesul elaborării, adoptării şi
aplicării reglementărilor tehnice, standardelor şi procedurilor de apreciere a calităţii
(Legea privind barierele tehnice în comerţ nr. 866-XIV din 10.03.2000).

198
Sub barierele tehnice în comerţ se subînţeleg deosebirile în cerinţele naţionale şi
cele utilizate în practica internaţională, inclusiv a reglementărilor tehnice,
standardelor şi procedurilor de apreciere a corespunderii sau ignorarea lor, fapt ce
duce la cheltuieli suplimentare, comparativ cu procedurile obişnuite comerciale
pentru realizarea mărfurilor pe piaţa internă şi externă. Reglementările tehnice nu
trebuie să poarte un caracter mai restrictiv pentru comerţ decât este necesar pentru
asigurarea securităţii naţionale, protecţiei sănătăţii şi securităţii oamenilor,
protecţiei lumii animale şi vegetale, protecţiei mediului înconjurător.

4.5. Cadrul instituţional privind securitatea biologică

În conformitate cu angajamentele stipulate în Protocolul de la Cartagena şi

Legea cu privire la Securitatea Biologică, Ministerul Ecologiei şi Resurselor
Naturale a fost desemnat ca instituţie responsabilă pentru implementarea
prevederilor acestora.
Pentru asigurarea punerii în aplicare a dispoziţiilor Legii privind Securitatea
Biologică, la nivel naţional a fost creat un cadru instituţional format din:
Comisia Naţională pentru Securitatea Biologică. Ea funcţionează ca organism
interdepartamental şi este constituită din 14 membri;
Punctul focal naţional al Protocolului de la Cartagena privind Biosecuritatea
la Convenţia privind Diversitatea Biologică. Ca Punct focal naţional este
desemnată autoritatea centrală pentru mediu, care are menirea să asigure
îndeplinirea, la nivel naţional, a responsabilităţilor ce decurg din dispoziţiile
actelor juridice internaţionale referitoare la implementarea măsurilor de securitate
biologică legate de utilizarea organismelor modificate genetic;
Organizaţiile ştiinţifice competente;
Secţii / direcţii şi specialişti care activează în cadrul Ministerului Ecologiei şi
Resurselor Naturale, Ministerului Agriculturii şi Industriei Alimentare,
Ministerului Sănătăţii, precum şi în cadrul departamentelor, agenţiilor şi a altor
structuri guvernamentale care au responsabilităţi în domeniile reglementate de
această Lege.

4.5.1. Autorităţile publice centrale.

Sistemul autorităţilor publice în Republica Moldova este stabilit prin
Constituţia Republicii Moldova adoptată la 29 iulie 1994 şi Legea Republicii
Moldova despre Guvern nr.64-XII din 31.05.1990.
Parlamentul Republicii Moldova adoptă legile, asigură unitatea reglemen-tării
legislative pe întreg teritoriul ţării, aprobă direcţiile principale ale politicii interne
şi externe ale ţării, inclusiv şi în domeniul securităţii biologice,

199
organizează şi dirijează activitatea Comisiei pentru Ecologie şi Dezvoltarea
teritoriului. Parlamentul exercită controlul organelor executive, ratifică tratatele
internaţionale semnate de Republica Moldova, aprobă Bugetul de stat şi exercită
controlul îndeplinirii lui, organizează studiul şi audierile tuturor problemelor ce ţin
de interesul comunitar. Dreptul la iniţiativă legislativă le aparţine deputaţilor
Parlamentului, Preşedintelui Republicii Moldova, Guvernului şi Adunării Populare
a Gagauz-Yeri.
Preşedintele Republicii Moldova, ca şef al statului, este garantul suveranităţii,
independenţei naţionale şi unităţii teritoriale a ţării, semnează din numele
Republicii Moldova tratatele internaţionale, prezintă anual în Parlament interpelări
în problemele de interes statal, inclusiv şi în domeniul biosecurităţii. Preşedintele
promulgă legile după adoptarea lor de către Parlament.
Guvernul Republicii Moldova asigură promovarea politicii interne şi externe a
statului şi dirijează activitatea organelor de administrare publică. Întru exercitarea
funcţiilor sale, Guvernul elaborează programul de activitate adoptat de Parlament.
În domeniul securităţii ecologice şi sănătăţii populaţiei Guvernul are următoarele
funcţii:
– organizează politica de stat şi întreprinde măsuri de protecţie şi utilizare
raţională a resurselor naturale, păstrare a echilibrului biologic şi asigurare a
regenerării tuturor sistemelor biologice, exercitând controlul de stat în
domeniu dat;
– organizează politica de stat pe problemele protecţiei sănătăţii populaţiei,
întreprinde măsuri de asigurare a populaţiei cu produse alimentare,
medicamente şi prestări, asigură protecţia drepturilor consumatorilor;
– organizează politica de stat în domeniul standardizării, metrologiei,
acreditării şi certificării produselor, organizează controlul de stat asupra
calităţii lor;
– organizează elaborarea şi îndeplinirea concepţiilor, strategiilor şi
programelor naţionale, elaborarea şi implementarea normelor tehnice şi a
altor acte normative de standardizare, organizează şi coordonează controlul
de stat şi supravegherea normelor de standardizare;
– asigură respectarea şi îndeplinirea legilor, hotărîrilor Parlamentului,
decretelor Preşedintelui Republicii Moldova, acordurilor internaţionale la
care Republica Moldova este parte.

4.5.2. Organele centrale de resort.

Organele centrale de resort ale statului sunt ministerele. Ele implementează
politica Guvernului în baza legilor şi asigură politica în domeniile de competenţă,
purtând responsabilitatea pentru activitatea respectivă. Pentru conducerea şi
controlul activităţii în domeniile ce nu ţin de activitatea ministerelor, Parlamentul,
200
la propunerea prim-ministrului, formează pe lângă Guvern departamente. Pentru
exercitarea controlului asupra îndeplinirii legilor, hotărârilor şi altor acte
normative ale Parlamentului, Guvernului şi Preşedinţiei, Guvernul formează
servicii şi inspecţii de stat. Departamentele, serviciile de stat şi inspecţiile, în
limitele competenţelor, elaborează actele normative în domeniile lor. Guvernul
poate forma comisii permanente sau cu o acţiune limitată şi consilii pentru studiul
problemelor şi elaborarea deciziilor în diverse situaţii ale dezvoltării social-
economice a ţării, inclusiv şi cele ce ţin de domeniul securităţii biologice.
Autoritatea centrală de stat pentru mediu şi resurse naturale este Ministerul
Ecologiei şi Resurselor Naturale (MERN), care poartă responsabilitatea pentru
(1) elaborarea şi realizarea politicilor şi strategiilor din domeniul mediului şi
resurselor naturale; (2) elaborarea proiectelor, actelor normative, standardelor,
normelor, altor documente regulatorii; (3) implementarea la nivel naţional şi local
a managementului de mediu şi resurse naturale, efectuarea monitoringului şi
controlului; (4) elaborarea împreună cu instituţiile interesate a strategiilor şi a
măsurilor de protecţie a biodiversităţii; (5) adoptarea măsurilor de dirijare şi
control pentru asigurarea securităţii ecologice şi biologice a ţării; (6) inspecţia de
mediu; (7) pregătirea rapoartelor privind calitatea şi starea factorilor de mediu;
(8) cooperarea internaţională şi îndeplinirea angajamentelor internaţionale din
domeniu.
Ministerul Sănătăţii (MS) este organul central pentru sănătate şi poartă
responsabilitatea pentru (1) asigurarea calităţii sănătăţii publice şi acordarea
întregului spectru de servicii medicale; (2) elaborarea politicii şi programelor,
proiectelor de acte legislative şi normative, standarde, privind sănătatea umană şi
situaţia sanitaro-epidemiologică; (3) implementarea managementului sănătăţii
umane şi al activităţii sanitaro-epidemiologice, efectuarea controlului şi
monitoringului sanitar.
Ministerul Agriculturii şi Industriei Alimentare (MAIA) este organul central
de stat pentru agricultură şi industria alimentară şi poartă responsabilitatea pentru
(1) monitoringul sectorial, controlul respectării legislaţiei şi standardelor ce ţin de
utilizarea şi managementul pesticidelor şi îngrăşămintelor chimice; (2) testarea
substanţelor chimice şi biologice şi eliberarea autorizaţiilor de import/export ale
pesticidelor şi îngrăşămintelor, cât şi ţinerea Registrului lor; (3) analiza şi controlul
calităţii pesticidelor şi îngrăşămintelor şi monitoringului lor în sol, nutreţuri şi în
produse agricole; (4) asigurarea securităţii alimentare a populaţiei privind calitatea,
cantitatea şi accesibilitatea produselor agricole; (5) supravegherea corespunderii
produselor agricole certificate în domeniul agriculturii şi industriei alimentare la
cerinţele actelor normative în vigoare; (6) asigurarea respectării restricţiilor
ecologice în sectoarele agrar şi agroindustrial şi a.

201
 Camera de Licenţiere (CL) e creată pe lîngă Guvern şi este organul central ce
asigură reglementările de stat în domeniul licenţierii. De comun cu alte organe
centrale de resort, stabileşte condiţiile licenţierii în domeniile vizate, adoptă decizii
privind eliberarea licenţelor sau refuzul eliberării lor, înfăptuieşte în comun cu
aceste organe de resort controlul îndeplinirii de către beneficiar a condiţiilor de
licenţiere.

4.5.3. Organele administraţiei publice locale.

La baza organizării organelor administraţiei publice locale stau următoarele
principii: autonomia locală, descentralizarea serviciilor sociale, eligibilitatea
organelor de administrare publică locală şi consultarea cu populaţia în problemele
de interes local. Autonomia se referă nu numai la activitatea şi organizarea acestor
organe, dar şi la gestiunea problemelor de interes local. Aplicarea principiilor sus-
indicate nu afectează caracterul unitar al statului.
În domeniul protecţiei mediului şi gestiunii resurselor naturale organele
administraţiei publice locale poartă responsabilitatea pentru (1) asigurarea
respectării standardelor şi legilor aplicate la nivel local; (2) coordonarea cu MERN
a limitelor de utilizare a resurselor naturale locale; (3) elaborarea programelor
locale de protecţie a mediului şi gestiune a resurselor naturale; (4) asigurarea
transparenţei şi informării oportune, veridice a populaţiei privind calitatea şi starea
factorilor de mediu.

4.5.4. Organele de autorizare, control şi monitorizare.

Pentru îndeplinirea funcţiilor de bază şi controlul activităţilor în domeniile ce
au tangenţe directe sau indirecte cu problemele OMG, pe lângă autorităţile publice
centrale sunt create structuri consolidate. Pe lângă Ministerul Ecologiei şi
Resurselor Naturale activează Comisia Naţională pentru Securitatea Biologică,
care este organul central abilitat cu funcţiile de promovare a politicii statului în
domeniul securităţii biologice, autorizarea şi monitoringul din acest domeniu.
Activitatea de secretariat a Comisiei este asigurată de MERN.
Consiliul Naţional pentru Soiurile de Plante (CNSP) este organul care asigură
politica de stat în domeniul aprecierii şi stabilirii sortimentului de plante,
autorizează utilizarea şi asigură protecţia soiurilor. CNSP coordonează activitatea
sa cu MAIA. Pentru soluţionarea problemelor ce ţin de domeniul dat au fost
instituite Comisia de Stat pentru Încercarea Soiurilor de Plante şi Inspectoratul de
Stat pentru Seminţe. Pentru îndeplinirea funcţiilor sale, CNSP este în drept să
ceară de la aceste organe, alte servicii ale MAIA documentaţia necesară pentru
soluţionarea problemelor ce ţin de competenţa sa. Pentru adoptarea deciziilor
privind problemele OMG în diverse sectoare acţionează câteva organe
consultative.
202
 Consiliul Interdepartamental Republican de aprobare a mijloacelor cu
destinaţie fitosanitară şi a mijloacelor ce sporeşte fertilitatea solului are ca scop
crearea asortimentului noilor metode efective de protecţie a plantelor, asigurarea
controlului de stat de achiziţii pentru import, testare şi utilizare a mijloacelor
chimice şi biologice de luptă contra dăunătorilor, bolilor şi buruienilor, cât şi a
reglatorilor de creştere a plantelor. Consiliul adoptă decizii preventive privind
aprobarea sau refuzul în efectuarea noilor mijloace de protecţie a plantelor,
interdicţiile de utilizare a acestor mijloace în cazul depistării unor particularităţi
toxico-igienice periculoase pentru organismul uman, animale şi mediu.
Comitetul Naţional Codex Alimentarius (CNCA) are statut de organ
consultativ privind problemele unificării cerinţelor de calitate şi securitate a
rulajului alimentar şi propagandei principiilor unei alimentări sănătoase în
corespundere cu recomandările Comisiei Codex Alimentarius.
Inspecţia Seminceră de Stat (ISS) este organul de stat împuternicit cu dreptul
de a efectua controlul semincer şi certificarea seminţelor şi activează în cadrul
MAIA.
Centrul Naţional ştiinţifico-practic de medicină preventivă (CNŞPNP) este
creat pe lângă MS şi abilitat cu funcţii de supraveghere sanitaro-epidemologică şi
informarea permanentă a populaţiei privind situaţia sanitaro-epidemologică şi
igienică.
Inspecţia sanitară de stat privind carantina fitosanitară (ISSCF) este organul
abilitat cu funcţii de efectuare a măsurilor de carantină fitosanitară externă şi
internă, organizare a depistării, localizării şi lichidării dăunătorilor, focarelor de
boli ale plantelor, organizare a controlului de stat în domeniul fitosanitar.
Centrul de Stat de atestare şi aprobare a mijloacelor cu destinaţie fitosanitară
şi a mijloacelor de sporire a fertilităţii solului este abilitat cu funcţii de organizare
a testărilor şi aprobarea noilor mijloace şi preparate şi activează în cadrul MAIA.

4.6. Potenţialul de cercetare – dezvoltare în domeniul

biotehnologiilor
4.6.1. Capacităţile instituţionale în domeniul cercetare-dezvoltare.

Instituţiile de bază din Republica Moldova, care efectuează cercetări în

domeniul geneticii şi biotehnologiilor, sunt institutele de cercetare din cadrul
Academiei de Ştiinţe a Moldovei: Institutul de Genetică, Institutul de Fiziologie a
Plantelor, Institutul de Microbiologie, Institutul de Botanică, Institutul de
Zoologie; Institutul de Cercetare pentru Porumb şi Sorg; Institutul de Protecţie a
Plantelor ş.a. Totodată, cercetări ştiinţifice în domeniile vizate sunt efectuate şi în
cadrul instituţiilor de învăţământ superior: Universitatea de Stat din Moldova,
203
Universitatea Agrară de Stat din Moldova, Universitatea de Stat de Medicină şi
Farmacie „Nicolae Testemiţanu”.
Domeniile biotehnologiilor care sunt dezvoltate la aceste instituţii cuprind:
1. Metodologii şi tehnici netradiţionale pentru ameliorarea plantelor, cum
ar fi:
– cultura de ţesuturi;
– metode de transmitere a materialului genetic, de exemplu, prin tehnologia
fuzionării protoplasmei sau de acid dezoxiribonucleic (ADN) recombinat;

– regenerarea de plante pe cale vegetativă.

2. Produse care sunt utilizate ca instrumente în ingineria genetică:
– vectori (plasmide);
– gene sau fragmente de gene izolate din plante, virusuri, bacterii sau animale;

– promotori, actirotori, operatori, secvenţe ADN cu funcţiuni specifice;

– linii de celule (linii de celule inbred) ale plantelor de cultură;
– părţi de plante (material de înmulţire).

4.6.2. Educaţia şi pregătirea cadrelor.

Instituţiile de bază unde are loc pregătirea cadrelor universitare în domeniile
relevante ale securităţii biologice sunt:
– Universitatea de Stat din Moldova;
– Universitatea Agrară de Stat din Moldova;
– Universitatea de Medicină şi Farmacie „N.Testemiţanu” din Moldova;
– Universitatea de Ecologie şi Ştiinţe Socioumane.
Pregătirea cadrelor postuniversitare pentru acest domeniu se efectuează în
special în instituţiile de cercetare din cadrul Academiei de Ştiinţe a Moldovei şi
instituţiilor de cercetare departamentale. În aceste instituţii există sistemul de
pregătire a cadrelor conform programelor de masterat şi doctorat.
Specialităţile principale pentru domeniile respective sunt :
– Ecologie şi protecţia mediului;
– Biotehnologii industriale;
– Zootehnie;
– Medicină veterinară;
– Biologie;
– Ameliorare şi genetică;
– Protecţia plantelor;
– Silvicultură şi grădini publice;
– Biotehnologii agricole;
– Drept ecologic.
204
 4.7. Protecţia drepturilor consumatorilor

Protecţia drepturilor consumatorilor în domeniul producerii, utilizării şi

comercializării seminţelor şi materialului săditor.
Organele care realizează politica statului în domeniul protecţiei juridice şi
utilizării soiurilor în Republica Moldova sunt: Consiliul Naţional pentru Soiurile
de Plante (CNSP), Comisia de Stat pentru Încercarea Soiurilor de Plante (CSÎSP)
şi Agenţia de Stat pentru Protecţia Proprietăţii Industriale (ASPPI). Consiliul este
organul principal care stabileşte politica statului în domeniul omologării soiurilor
noi. Decizile Consiliului constituie temeiul pentru autorizarea utilizării acestor
soiuri în Republica Moldova. Comisia de Stat este organul de lucru al Consiliului
şi organul de expertiză al Agenţiei, care efectuează încercarea noilor soiuri în
vederea determinării utilităţii economice şi corespunderii lor condiţiilor de
brevetabilitate. Comisia de Stat ţine Registrul soiurilor de plante.
Încercarea soiului nou la distinctivitate, omogenitate şi stabilitate se efectuează de
Comisia de Stat în cadrul cerinţelor şi sectoarelor sale de încercare a soiurilor,
staţiunilor experimentale şi instituţiilor, laboratoarelor şi serviciilor specializate,
conform metodologiilor şi standardelor internaţionale. Soiurile urmează să fie utilizate
în procesul de producţie numai respectând prevederile legale în acest aspect şi
dispunând de certificatul eliberat de Comisia de Stat după efectuarea încercării de stat
a soiului şi înscrierea acestuia în Registrul soiurilor de plante. Soiurile, hibrizii, liniile
de culturi agricole şi ale altor plante de selecţie autohtonă şi străină, trec în mod
obligatoriu încercarea de stat pe teritoriul Moldovei.
Comisia de Stat îşi desfăşoară activitatea întru asigurarea funcţionării Legii
privind protecţia soiurilor de plante şi conform metodelor aprobate de către
Convenţia privind Protecţia Soiurilor (UPOV). Consiliul Naţional pentru Soiurile
de Plante este organul de stat care promovează politica statului în domeniul
aprecierii şi stabilirii sortimentului de plante, autorizează utilizarea şi asigură
protecţia soiurilor indiferent de provenienţa acestora. Întru soluţionarea
chestiunilor ce ţin de activitatea sa, Consiliul dispune de un organ de lucru –
CSÎSP şi conlucrează cu Agenţia şi Inspectoratul Republican de Stat pentru
Seminţe. Agenţia de Stat pentru Protecţia Proprietăţii Industriale (ASPPI)
efectuează încercarea soiurilor noi de plante în vederea determinării utilităţii
economice şi corespunderii lor condiţiilor de brevetabilitate, prevăzute de Legea
privind protecţia soiurilor de plante. Agenţii economici licenţiaţi în producerea şi
comercializarea seminţelor, incluşi în Rgistrul producătorilor de seminţe, sunt
obligaţi: (1) să respecte reglementările tehnologiei de producere, prelucrare,
condiţiile de ambalare, păstrare, transportare şi comercializare a seminţelor, în
conformitate cu normele tehnice şi instrucţiunile în vigoare; (2) să ţină

205
evidenţa sectoarelor semincere, a condiţiilor de producere, prelucrare, păstrare şi
comercializare a seminţelor; (3) să comercializeze seminţe ale căror calităţi de soi
şi culturale să corespundă standardelor în vigoare. Agenţii economici licenţiaţi în
producerea şi comercializarea seminţelor poartă răspundere, în conformitate cu
legislaţia, pentru calitatea şi autenticitatea seminţelor şi sunt obligaţi să repare
prejudiciul cauzat beneficiarilor.

4.7.1. Protecţia drepturilor consumatorilor în domeniul

produselor alimentare.
Inspectoratul de Stat pentru Produsele Cerealiere şi de Panificaţie este organul
care exercită controlul asupra calităţii cerealelor, produselor derivate, seminţelor
culturilor oleaginoase şi leguminoase, materiei prime pentru producerea
nutreţurilor şi nutreţurilor combinate, produselor cerealiere din resursele şi
rezervele de stat, calităţii pâinii, produselor de panificaţie şi pastelor făinoase, la
toate întreprinderile şi organizaţiile, indiferent de apartenenţa lor departamentală şi
forma de proprietate şi activează pe lângă Ministerul Agriculturii şi Industriei
Alimentare.

4.8. Sistemul de reglementare şi monitorizare a

activităţilor ce ţin de utilizarea OMG
4.8.1. Genuri de activitate.
Sistemul de reglementare şi monitorizare a activităţilor ce ţin de OMG este
stipulat în Legea privind Securitatea Biologică şi Regulamentul privind autorizarea
activităţilor legate de obţinerea, testarea, utilizarea şi comercializarea organismelor
modificate genetic. Conform actelor nominalizate, persoanele juridice care
practică activităţile clasificate în clasele III şi IV de risc pot obţine autorizaţia
activităţilor numai în cazul în care ele dispun de licenţă eliberată de Camera de
Licenţiere conform legislaţiei privind licenţierea. Sunt supuse procedurii de
autorizare activităţile legate de:
a) obţinerea, multiplicarea, testarea şi utilizarea în condiţii izolate, pentru
diferite scopuri, a microorganismelor, a plantelor şi animalelor modificate
genetic prin tehnicile biotehnologiei moderne;
b) introducerea deliberată în mediu şi introducerea pe piaţă a organismelor
modificate genetic prin tehnicile biotehnologiei moderne, inclusiv a
oricărei structuri vii capabile să reproducă un organism, cum sunt
seminţele, bulbii, butaşii, polenul, sporii şi altele asemenea;
c) eliberarea neintenţionată în mediu a organismelor modificate genetic;
d) introducerea deliberată în mediu şi introducerea pe piaţă a produselor
procesate care conţin organisme modificate genetic şi/sau componente

206
 nevii din organisme vii modificate genetic, în stare neprelucrată sau
procesate;
e) toate felurile de cercetări ale organismelor modificate genetic, inclusiv
cercetări de laborator, clinice, de câmp, de experimentare în producţie;
f) operaţiile deliberate de import/export cu organisme modificate genetic şi cu
produse rezultate din astfel de organisme;
g) transportul neintenţionat peste frontieră al organismelor modificate genetic;
h) depozitarea, înhumarea, nimicirea organismelor modificate genetic şi/sau
produselor rezultate din astfel de organisme, folosirea deşeurilor rezultate
din utilizarea tehnicilor biotehnologiei moderne.

4.8.2. Procedurile de autorizare.

Pentru a obţine autorizaţia activităţilor ce ţin de utilizarea în condiţii izolate,
introducerea deliberată în mediu şi pe piaţă, notificatorul prezintă Comisiei
Naţionale un set de documente:
– cererea prin care persoanele juridice comunică denumirea şi forma lor
organizatorico-juridică, adresa juridică (sediu) şi codul fiscal, persoanele
fizice comunică numele şi prenumele, datele din paşaport sau buletinul de
identitate şi codul fiscal, se indică şi genurile de activitate pentru care se
solicită autorizarea;
– o notificare specifică fiecărui gen de activitate;
– studiul de evaluare a riscurilor asupra mediului, împreună cu referinţe
bibliografice şi indicaţii privind metodele utilizate;
– rezumatul dosarului.
După primirea notificării, Comisia Naţională informează şi consultă publicul
şi solicită avizele autorităţilor centrale pentru mediu, economie, agricultură şi
industria alimentară, sănătate şi protecţia consumatorilor. Concomitent, urmează a
fi prezentat dosarul unei instituţii ştiinţifice competente pentru evaluarea riscurilor.
În baza datelor acumulate, Comisia Naţională decide eliberarea autorizaţiei sau
respingerea solicitării printr-un răspuns argumentat. Comisia Naţioană în termen
de 90 de zile de la confirmarea primirii notificării adoptă una din următoarele
decizii:
– se autorizează activitatea propusă;
– se interzice activitatea propusă;
– se cere o informaţie suplimentară;
– termenul de luare a deciziei se prelungeşte pe perioada necesară evaluării
informaţiilor suplimentare.

207
 4.8.3. Monitoringul activităţilor cu OMG.
Monitoringul activităţilor ce ţin de OMG este pus în sarcina Comisiei
Naţionale pentru Securitatea Biologică. Legislaţia naţională nu specifică care sunt
organele de control abilitate cu aceste funcţii de inspecţie şi control al activităţilor
legate de OMG. Obiectivul, regulile generale şi procedura de elaborare a planului
de monitoring sunt stipulate în Anexa nr. 52 a Regulamentului privind autorizarea
activităţilor legate de obţinerea, testarea, utilizarea şi comercializarea organismelor
modificate genetic. Cu toate că la momentul actual nu a fost înregistrată nici o
solicitare de eliberare a autorizaţiei legate de OMG, organele de resort din
Republica Moldova întreprind unele măsuri în această ordine de idei. Ministerul
Agriculturii şi Industriei Alimentare a elaborat Regulamentul cu privire la importul
şi exportul de seminţe şi material săditor aprobat prin HGRM nr. 360 din 27.03.02.
Studiul privind importul şi exportul seminţelor şi materialului săditor denotă că
până la momentul actual în R.M. nu s-au importat şi nu s-au exportat material
săditor şi semincer modificat genetic.

4.9. Informarea şi participarea publicului la luarea deciziilor

Pentru implementarea participării publicului în adoptarea deciziilor în

domeniul biosecurităţii (art. 23 din Protocolul de la Cartagena) în Republica
Moldova este creată o bază normativă. În baza datelor cuprinse în notificare,
Comisia Naţională, în conformitate cu HGRM nr. 1153 din 25.09.2003, pp. 29 şi
30, în termen de 10 zile din data recepţionării notificării o aduce la cunoştinţa
publicului şi îl consultă cu privire la informaţiile conţinute în ea; ţine evidenţa
adresărilor cetăţenilor; în acelaşi termen plasează documentele privind notificarea
pe pagina WEB a autorităţii centrale pentru mediu. La luarea deciziilor privind
activitatea solicitată, Comisia ţine cont de comentariile publicului, care au caracter
consultativ şi se primesc în termen de 30 de zile din data informării lui. În
dependenţă de comentariile primite, Comisia poate organiza audieri publice
privitor la toate aspectele problemelor examinate. Pentru a implementa în detalii
aceste stipulări, Ministrul Ecologiei şi Resurselor Naturale prin ordinul 19 din
10.02.2004 a stabilit procedurile, care reglementează accesul publicului la
informaţie cu privire la OMG şi mecanismele de influenţă la procesul discuţiilor şi
adoptării deciziilor. MERN trebuie să elaboreze şi să ţină Registrul publicului
interesat, în care pot fi incluse, la solicitare, orice persoană fizică sau juridică.
Lista publicului interesat, stabilită prin ordinului ministrului MERN, include, spre
exemplu:
– organizaţiile neguvernamentale de mediu;
– consumatorii şi asociaţiile lor;
– medicii şi asociaţiile lor;

208
 – mass-media;
– comunitatea ştiinţifică;
– fermieri şi asociaţiile fermierilor;
– importatorii de seminţe;
– autorităţile publice locale;
– comunităţile locale;
– asociaţiile profesionale.
Comisia Naţională informează publicul interesat, prin intermediul reţelei
Internet şi altor mijloace, referitor la următoarele:
– activitatea presupusă şi notificarea în baza căreia va fi luată decizia, cu
rezumatul respectiv;
– tipul deciziei luate (decizie privind eliberarea autorizaţiei pentru importul
OMG, introducerea deliberată sau plasarea pe piaţă, utilizarea şi locul);
– procedura preconizată de examinare, de oferire a informaţiei publicului,
adresa, ordinea şi termenele de expediere a comentariilor şi întrebărilor.
Comunităţile locale se consideră public interesat în cazul dacă se presupune
utilizarea OMG în teritoriile acestor comunităţi, cât şi cele din vecinătate şi vor fi
activ informate prin intermediul presei locale, standurilor plasate în încinta
autorităţilor publice locale, audierilor publice şi altor mijloace în termeni prevăzuţi
pentru informarea publicului interesat. Proiectul avizului Comisiei Naţionale cu
includerea comentariilor recepţionate şi aprecierea lor de către Comisie se
amplasează în pagina electronică a MERN, iar reprezentanţii publicului, care au
înaintat propuneri în privinţa informării, sunt în drept să primească de la Comisia
Naţională un răspuns argumentat privitor la acceptarea sau neacceptarea
propunerilor publicului. Comisia Naţională va lua decizia definitivă în termen de
20 zile după plasarea proiectului avizului în Internet. Comisia Naţională ţine şi
publică Registrul OMG şi al produselor rezultate din astfel de organisme, permise
spre utilizare, precum şi Registrul deciziilor privind autorizarea activităţilor date
cu anexarea materialelor neconfidenţiale prezentate de solicitant şi a opiniilor
instituţiilor de expertiză.

Verificarea cunoştinţelor

1. Care sunt activităţile principale în domeniul conservării Diversităţii Biologice,

determinate de Convenţia privind Diversitatea Biologică şi Protocolul de la
Cartagena al acestei Convenţii?
2. Care sunt principalele acte legislative din Republica Moldova care
reglementează activităţile cu organisme genetic modificate?
209
3. Care este tangenţa cadrului legislativ din Republica Moldova în domeniul
securităţii biologice cu legislaţia de mediu?
4. Care este modul de autorizare, control şi monitorizare a activităţilor cu
organisme genetic modificate în R.M.?
5. Care este cadrul legislativ şi instituţional care determină protecţia
consumatorilor din R.M. în domeniul securităţii biologice?
6. Care este cadrul legislativ şi modalităţile de participare a publicului la luarea
deciziilor în domeniul securităţii biologice?

210
 GLOSAR

Aberaţie (dislocaţie) cromozomală – modificare a structurii unuia (sau unora)

din cromozomii celulei, ce apare în urma pierderii sau dislocării unui segment
cromozomal.
ADN – Acidul dezoxiribonucleic: constituent esenţial al cromozomilor. ADN
– biopolimer bicatenar alcătuit din polimerizarea a 4 dezoxiribonucleotizi diferiţi
care constituie substanţa ereditară la toate vieţuitoarele cunoscute, cu excepţia
unor viruşi. ADN este o substanţă cu un rol dublu, atribuit genelor: funcţia
primară sau heterocatalitică a genei, care constă în controlul sintezei unui
polipeptid specific, şi funcţia autocatalitică, care constă în propria
autoreproducere a genei.
ADN-ligază – enzimă care “coase” rupturile polinucleotizilor dintr-o catenă
(lanţ) de ADN prin formarea de legături fosfodiesterice dintre grupul terminal 5′-
PO4 şi grupul învecinat 3′-OH.
ADN-polimerază – oricare dintre enzimele care catalizează sinteza replicativă
a ADN-ului în prezenta unei catene de ADN matrice, formând o nouă catenă.
ADN-recombinat – reprezintă o moleculă compusă din ADN străin inclus
într-o moleculă de ADN a plasmidei.
Adventiv – dezvoltarea unui organ sau embrion, altfel decât în mod obişnuit
(de exemplu: din primordii sau zigot).
Agar – produs extras din alge, utilizat pentru solidificarea mediilor de cultură.
Agricultură durabilă – agricultură care presupune creşterea sau menţinerea
producţiei agricole timp îndelungat, o dată cu conservarea resurselor naturale şi a
mediului.
Aminoacid – compus organic care conţine grupul aminic (NH 2) şi grupul
carbonic (COOH). Aminoacizii reprezintă unităţi structurale din care sunt alcătuite
proteinele. Există mai mulţi aminoacizi diferiţi, dintre care numai 20 se întâlnesc
în majoritatea proteinelor vegetale şi animale.
Androgeneză – dezvoltarea unui organism numai din nucleul gârneţului
mascul, fără participarea nucleului ovulului.
Anticodon – secvenţă din trei nucleotide din ARNt, complementară unui
codon din molecula de ARNm. Interacţiunea dintre anticodon şi codon asigură
includerea corectă a aminoacidului purtat de ARNt, în locul dictat de mesajul din
ARNm.
Anticorp – substanţă specifică sintetizată de sistemul imun al organismului ca
răspuns la pătrunderea unui antigen, inactivându-l sau distrugându-l.
Antigen – substanţă capabilă să provoace, după pătrunderea în organism,
formarea anticorpilor şi care reacţionează specific cu aceştea.
Apex, apical – extremitatea unui organ; meristeme apicale – meristeme
terminale.
211
 Apomixie (gr.apo – absent + mixis – amestecare) – formă de reproducere
asexuată, care constă în formarea embrionului la plante fără fecundarea ovulului
sau din alte celule ale gametofitului femenin.
ARN – Acidul ribonucleic: polinucleotid monocatenar constituit din
polimerizarea a 4 nucleotizi diferiţi. Se deosebeşte de ADN prin faptul că conţine
riboză în locul dezoxiribozei şi uracil în locul timinei. ARN-ul reprezintă
materialul genetic la unele virusuri şi constituie componentul de bază care asigură
desfăşurarea proceselor de transcripţie şi translaţie a mesajului genetic la toate
vieţuitoarele. În celule există trei forme de ARN: mesager (ARNm), de transfer
(ARNt) şi ribozomal (ARNr).
ARN de transfer (ARNt) sau ARN solubil (ARNs) – tip de ARN care se leagă
specific de un aminoacid – recunoaşte un codon din molecula ARNm şi transportă
aminoacidul la locul de sinteză a proteinelor (în ribozomi).
ARN-mesager (ARNm) – tip de ARN sintetizat în timpul transcripţiei
informaţiei genetice de pe o catenă de ADN, care serveşte ca matriţă în procesul
de sinteză a proteinelor.
ARN-polimerază ADN dependentă – enzimă care catalizează sinteza unei
catene de ARN pe o matrice de ADN monocatenar.
ARN-replicază (ARN – polimerază dependentă de ARN) – enzimă care
catalizează replicarea (naşterea prin copierea informaţiei) riboviruşilor – viruşi
ARN.
ARN-ribozomal (ARNr) – tip de ARN care intră în compoziţia ribozomilor şi
constituie cea mai mare parte din totalul de ARN din celule (cca 80%).
ARN-viral – constituie materialul genetic al unor viruşi (riboviruşi). Este
capabil de replicare cu ajutorul enzimei ARN-replicază.
Aseptic – steril, liber de microorganisme (ciuperci, bacterii, virusuri,
micoplasme).
Auxină – grup de hormoni (naturali sau sintetici) care induc: alungirea
celulelor; în unele cazuri, diviziunea celulelor; formarea rădăcinilor adventive.
Axilar – cu originea în axila frunzelor.
Bacteriofag – virus care pătrunde şi se multiplică în celulele bacteriene,
provocând distrugerea lor.
Banca de gene – o colecţie de plasmide sau fagi recombinaţi.
Baza azotată – moleculă organică ce intră în componenţa nucleotidelor –
elemente de structură ale acizilor nucleici.
Bioconversie – transformarea de energie şi de substanţă prin mijlocirea
sistemelor vii. De exemplu, fotosinteza constituie o bioconversie a energiei luminii
solare în energie chimică potenţială; sinteza diferitelor substanţe organice prin
mijlocirea sistemelor vii, pornindu-se de la precursori existenţi în mediul natural
sau de cultură al organismelor.
212
 Biodegradabil – poate fi descompus de microorganisme în mediu. Biodiversitate
– sau diversitatea biologică, se referă la varietatea ecosistemelor
şi speciilor de plante şi animale, care pot fi găsite în mediu. Există trei nivele
importante care determină biodiversitatea: gene, specii şi ecosisteme. Diversitatea
genetică este considerată totalul informaţiei genetice, care se conţine în genele
plantelor, animalelor şi microorganismelor, care trăiesc pe pământ. Diversitatea
speciilor este varietatea organismelor vii de pe pământ. Diversitatea ecosistemelor
este varietatea habitatelor şi proceselor ecologice în biosferă.
Biosecuritate – reprezintă un spectru larg de măsuri menite să asigure un nivel
adecvat de protecţie privind asigurarea transferului, manipulării şi utilizării
organismelor modificate genetic rezultate din biotehnologii moderne şi care pot
avea efecte adverse asupra conservării şi utilizării durabile a diversităţii biologice,
ţinând de asemenea cont de riscurile pentru sănătatea umană şi concentrându-se în
special asupra circuitului lor transfrontalier.
Biosinteză – sinteza unui compus de către celule sau plante. Biotehnologie –
un termen larg pentru un grup de tehnologii bazate pe
aplicarea proceselor biologice. Este folosită pentru a produce sau modifica
alimentele, medicamentele, a reduce deşeurile şi impactele ecologice şi pentru a
crea surse regenerabile de energie. Biotehnologia modernă este termenul folosit
pentru descrierea unui şir de procese şi tehnici, în special la nivel molecular.
Exemple de aplicaţii biotehnologice includ cultura de celule, reproducerea
moleculară, clonarea, bioprocesarea şi testarea diagnositcă, precum şi tehnologia
genelor (modificarea genetică).
Biotip – grup de indivizi cu constituţie genetică identică.
Bombardament cu particule – metodă fizică de transfer al genelor prin
accelerarea microparticulelor învelite în ADN care penetrează celulele intacte şi
ţesuturile unui organism.
Calus – ţesut neorganizat format din celule diferenţiate sau nediferenţiate care
se dezvoltă la locul rănirii sau în cultura in vitro.
Caracter – particularitate referitoare la formă, mărime, culoare, structură,
compoziţia biochimică etc., prin care indivizii se deosebesc unii de alţii.
Caractere input – caractere care generează valoare, asigurând creşterea
producţiei prin protejarea culturilor (exemple: rezistenţă la erbi-cide, insecte,
virusuri etc.).
Caractere output – caractere care determină sinteza produselor vegetale cu
însuşiri nutritive ameliorate (exemple: modificări ale conţinutului de amidon,
proteine, uleiuri; modificarea însuşirilor de panificaţie la grâu etc.).
Caseta de expresie – construcţie plasmidială care conţine componentele necesare
exprimării genelor în plante (promotorul, secvenţa de poliadenilare şi un polilinker –
numit şi situs de expresie multiplă – pentru inserarea genelor de interes).
213
 Caulogeneză – procesul de diferenţiere şi de dezvoltare a tulpinii.
Celule competente – capacitatea celulelor bacteriene de a capta ADN exogen
şi de a-l integra în propriul lor genom, celula-gazdă devenind o celulă
transformată.
Celule hibride – celule rezultate din fuzionarea a două sau mai multe celule,
formându-se un sincarion.
Cibrid – hibrid celular citoplasmatic, obţinut prin fuzionarea unei celule ce
posedă, de exemplu, nucleu şi citoplasmă cu plastidele de la un genitor şi
citoplasmă enucleată cu mitocondriile din celula altui genitor.
Ciclu celular – totalitatea proceselor morfologice, fiziologice şi biochimice
care se desfăşoară într-o celulă de la o diviziune la alta.
Citokinine – grup de hormoni (naturali sau sintetici) care induc diviziunea
celulară şi formarea mugurilor adventivi.
Clon – un grup de indivizi, descendent dintr-un singur individ prin mitoze,
fără fecundare. În culturile de celule şi ţesuturi reprezintă o populaţie descendentă
dintr-o singură celulă, prin mitoze succesive.
Clon molecular – izolarea şi amplificarea fragmentelor de ADN în cloni
celulari.
Clonarea unei gene – operaţiune care constă în izolarea şi, apoi, multiplicarea
(amplificarea) unei gene, în general, în plasmidele bacteriene.
Cod genetic – sistemul de codificare a informaţiei genetice, constituit din 64
de triplete (codoni), care stabileşte corespondenţa dintre succesiunea bazelor din
ADN respectiv ARN şi succesiunea aminoacizilor din proteine.
Codon – o succesiune de trei nucleotide (triplet) în ARN mesager, care
codifică un aminoacid într-un lanţ polipeptidic.
Colonie – agregat de celule înconjurate de o membrană sau care alcătuiesc o
masă comună.
Construcţie genetică – include o genă de interes, precum şi secvenţele-
promotor, indispensabile expresiei şi reglării funcţionării acesteia în celula
receptoare.
Cosmidă – vector capabil să cloneze în bacterii inserţii de ADN care măsoară
20-40 kilobaze (kb).
Cultura celulelor în suspensii – cultivarea de celule izolate sau de mici
agregate în mediul lichid într-un regim de aeraţie şi agitaţie realizând cu ajutorul
unei aparaturi adecvate.
Cultura celulelor – cultivarea celulelor in vitro.
Cultură de embrioni – extracţia sau izolarea aseptică a embrionului (matur
sau imatur) şi transferul lui pe mediul nutritiv steril.
Cultură in vitro – totalitatea metodelor folosite pentru creşterea
microorganismelor, celulelor, ţesuturilor şi organelor pe un mediu preparat
214
artificial (în prezenţa substanţelor de creştere: săruri, vitamine, sursă de carbon,
auxine şi citochinine). După provenienţa materialului se pot distinge mai multe
tipuri de culturi aseptice.
Cultură de meristem a lăstarilor – cultivarea aseptică pe mediul nutritiv a
lăstarilor izolaţi din apex sau din mugurii axilari ai lăstarilor conului de creştere cu
una sau două primordii foliare,
Cultură moleculară (molecular farming) – producerea de molecule cu efecte
terapeutice sau vaccinuri de către plante transgenice cultivate.
Cultură de organe – cultură unui organ in vitro, într-un mod care să-i permită
dezvoltarea şi/sau conservarea.
Cultură primară – cultura inţiată din celule, ţesuturi, organe prelevate de la un
organism.
Cultura protoplaştilor izolaţi – cultura celulelor vegetale, lipsite de pereţii
celulari, în mediu lichid sau mediu solid agarizat, care conţine în calitate de
supliment nişte stabilizatori osmotici (manitol, sorbitoţ, glucoză) în concentraţie
optimă pentru specia în cauză. Prin regenerarea pereţilor la protoplaştii izolaţi –
cultura protoplaştilor se preface în cultură celulară.
Cultură de rădăcini – cultură aseptică pe mediul nutritiv artificial în regimul
de transfer al rădăcinilor izolate.
Cultura ţesuturilor de calus – creşterea în transplantări repetate şi de lungă
durată a culturii ţesuturilor, care apare prin proliferarea celulelor de la fragmentele
sau organele întregi izolate.
Dediferenţiere – întreprinderea procesului de diferenţiere şi revenire a
celulelor în starea nediferenţiată embrionară, meristematică. Celulele
dediferenţiate pot să se înmulţească şi să prolifereze într-un ţesut nediferenţiat în
care ulterior poate să se efectueze o rediferenţiere. Dediferenţierea apare rar in
situ, dar este un fenomen obişnuit in vitro.
Deleţie – anomalie cromozomală.
Dezvoltare – totalitatea schimbărilor cantitative şi calitative pe care le suferă
un organism din momentul conceperii sale până la maturitate. Dezvoltarea implică
creştere şi diferenţiere.
Diferenţiere – pierderea progresivă a caracterelor morfologice şi
citofîziologice, specifice celulelor embrionare şi dobândirea caracteristicilor
celulare adulte, potrivite unei anumite specializări funcţionale.
Diploid – nucleul, celula, organismul, care se caracterizează cu prezenţa
setului de cromozomi dublaţi, caracteristici pentru fiecare specie aparte.
Diviziune celulară – proces prin care se produc celule. Poate fi directă, când
are loc o simplă fragmentare a nucleului şi separare a citoplasmei (amitoză), şi
indirectă prin cariokineză şi citokineză, când diviziunea se realizează în urma unor
schimbări succesive ale substanţei nucleare.
215
 Dominanţă apicală – fenomenul de reprimare a creşterii mugurilor adventivi
în prezenţa mugurelui terminal al apexului (care domină).
Duplicaţie – aberaţie cromozomală în urma căreia are loc dublarea unei
anumite porţiuni a cromozomului.
Electroforeză – metodă de separare a unor compuşi în funcţie de lungimea lor
(greutatea moleculară) şi sarcina electrică.
Embrioid – embrion nezigotic, generat în cultură. Structura sa este analoagă
cu acea a embrionului zigotic. Embrioizii pot deriva din celule diploide («embrioni
somatici») sau din celule haploide (din polen – embrioni androgenici sau din
celule haploide ale sacului embrionar şi ovulului-embrioni ginogenici).
Embrion – organism tânăr în primele stadii ale dezvoltării sale, de exemplu,
plantula din sămânţă.
Embriogeneză – proces prin care dintr-un zigot se formează un embrion sau,
asexuat, dintr-o celulă somatică ori dintr-un grup de celule somatice.
Embriogeneză somatică – procesul de formare a structurilor similare
embrionilor (embriozii) în cultura ţesuturilor şi a celulelor, după felul asemănător
embriogenezei zigotice normale.
Enzimă – proteină care catalizează o reacţie chimică ce se desfăşoară într-un
sistem biologic.
Enzimă de restricţie – enzimă care taie molecula ADN la nivelul unor
secvenţe specifice de nucleotide pe care le recunosc.
Ereditate – proprietate a organismelor de a asigura continuitatea materială şi
funcţională din generaţie în generaţie, precum şi de a condiţiona caracterul specific
de dezvoltare individuală în anumite condiţii ale mediului.
Ereditate extracromozomală (ereditate citoplasmică) – ereditate determinată
de factorii ereditari numiţi plasmogene, situaţi în citoplasmă, în afara nucleului.
Caracterele condiţionate de factori extracromozomali se transmit numai pe linie
maternă.
Eucariote – organisme care au nucleu tipic (cu membrane nucleare, cu
cromozomi), iar celulele lor se divizează prin mitoză. Din această grupă fac parte
toate macroorganismele, precum şi microorganismele unicelulare din regnul
animal.
Excizie – tăierea şi prepararea unui ţesut vegetal, organ etc. pentru cultură.
Exoni – porţiuni informaţionale din genele eucariote (ADN), corespunzătoare
secvenţilor transcriptului care se păstrează în macromolecula de ARN matur, după
eliminarea secvenţelor noninformaţionale, numite introni din ARN-ul eterogen
nuclear.
Explant – fragment dintr-un organism (apex, organ, fragment de organ)
detaşat de la locul de origine şi, eventual, cultivat in vitro, constituit de piesa care
iniţiază o nouă cultură.
216
 Expresivitate – grad de manifestare fenotipică a unui caracter determinat de o
genă.
Fenotip – totalitate a caracterelor unui organism, observate sau detectate prin
diverse mijloace (ex.: formă, culoare, dimensiuni, funcţii fiziologice, compoziţie
chimică etc.). Fenotipul este rezultatul interacţiunii dintre genotip şi mediu.
Gamet – celulă sexuală matură care prin fecundarea alteia, de sex opus,
formează un zigot. Obişnuit, gameţii sunt haploizi (n).
Gametofit (haplofază) – fază din ciclul vital al organismelor, caracterizată
prin existenţa unui număr haploid de cromozomi în celule. La majoritatea plantelor
este scurtă şi durează de la formarea sporilor (n) prin a doua diviziune a meiozei
pănă la fecundare.
Gametogeneză – proces de formare a gametelor.
Genă – în concepţia clasică, particulă materială diferenţiată în structura masei
ereditare, localizată în cromozomi care determină manifestarea unui sau a mai
multor caractere. În concepţia geneticii moleculare gena este considerată ca un
segment specific de ADN (sau ARN la unele virusuri), care determină sinteza unui
lanţ polipeptidic specific şi, respectiv, expresia fenotipică a unui caracter.
Genă de interes – genă ce determină un caracter considerat valoros, care
urmează să facă obiectul unui transfer la un alt organism.
Genă marker – secvenţă detectabilă de ADN. Detectarea se poate efectua fie
prin observarea acestui segment de ADN care conţine una sau mai multe gene cu
expresie fenotipică cunoscută (de ex.: rezistenţa la antibiotice), fie prin hibridarea
acestei secvenţe cu o sondă complementară.
Genă marker selectabilă – genă care codifică o proteină ce detoxifică o
substanţă chimică inclusă în mediul de cultură pentru a asigura selecţia celulelor
care au integrat ADN străin.
Genă operatoare – segment de ADN capabil să interacţioneze cu un represor
specific, controlând, în acest fel, activitatea uneia sau a mai multor gene
structurale.
Genă raportor – genă care codifică produşi ce pot fi cuantificaţi prin teste
biochimice.
Genă reglatoare – genă care conţine informaţia necesară pentru sinteza unui
represor specific ce controlează activitatea genelor structurale.
Genă structurală – genă care controlează sinteza unui polipeptid.
Genom – totalitatea genelor unui organism, prezente în toate celulele acestuia.

Genoterapie – tratarea genei afectate (bolnave) şi substituirea ei cu o genă

sănătoasă.
Genotip – 1. Constituţia genetică a unui organism. 2. Suma totală a întregului
material ereditar, incluzând atât genele, cât şi plasmagenele unui organism.
217
 Giberelină – grup de hormoni care induc, printre altele, alungirea şi
diviziunea celulelor.
Ginogeneză – procesul apariţiei plantei din celulele sacului embrionar.
Haploid – celulă sau organism care conţine în nucleu un singur set de
cromozomi (x sau n) la speciile diploide.
Hartă genetică (hartă cromozomală) – reprezentare grafică a poziţiei pe care o
ocupă genele în cromozomi.
Hemizigot – individ diploid care posedă în locusul dat numai o singură alelă
din pereche. Hemizigoţia se întâlneşte la organismele haploide, la indivizii cu
sexul heterogametic sau cu deleţii cromozomale parţiale.
Heterocarion – celulă în care există doi sau mai mulţi nuclei diferiţi, ca
rezultat al fuziunii celulare.
Heterozigot – organism diploid care conţine două alele diferite într-un locus al
cromozomilor omologi, obişnuit, una normală (dominantă) şi alta mutantă
(recesivă). De exemplu: Aa, Bb, etc.
Hibrid – individ rezultat din încrucişarea a doi părinţi (genitori) genetic
diferiţi.
Hibrid somatic – hibrid (celulă mononuoleată) rezultat din contopirea
celulelor somatice, derivate din părinţi diferiţi din punct de vedere genetic.
Hibridare somatică (hibridarea parasexuală) – metodă de fuzionare a două
celule somatice diferite, aparţinând unor indivizi din aceeaşi specie sau din specii
diferite. După fuziune rezultă celule hibride ce încorporează materialul genetic al
celor două celule parentale.
Hibridarea acizilor nucleici – tehnică care utilizează recunoaşterea specifică
de către o sondă de ADN marcată a unei secvenţe complementare în acidul nucleic
ţintă.
Himeră – individ, la care o parte a organismului este alcătuit din ţesuturi de
constituţie genetică diferită faţă de rest.
Homocarion – celulă în care există doi sau mai mulţi nuclei identici, ca
rezultat al fuziunii celulare.
Homozigot – organism diploid care are două alele similare pe acelaşi locus al
cromozomilor omologi. De ex.: AA sau aa.
Hormon – substanţă organică produsă de plante sau de sinteză, care, în
cantităţi scăzute, induce, inhibă sau modifică cantitativ creşterea, frecvent în altă
parte decât în locul ei de origine.
Implant – fragment excizat dintr-un organism şi introdus într-un alt organism
sau ţesut.
Implantare – operaţiune prin care o celulă, un fragment de ţesut, este inserat
sau grefat în interiorul unui organism; în cazul special al culturilor de celule şi
ţesuturi, implantarea prevede includerea celulelor şi a ţesuturilor într-un mediu de
cultură.
218
 Incubare – perioada de timp la inoculare până la sfârşitul perioadei de
creştere in vitro.
Inducere – iniţierea structurii unei plante, organ sau a unor procese in vitro,
altfel spus cauzarea iniţierii unor structuri sau procese.
Inginerie genetică – totalitatea metodelor şi tehnicilor prin care se acţionează
in vitro asupra genelor, cromozomilor sau celulelor cu scopul realizării unor
structuri genetice noi, prin includerea de gene sintetizate artificial sau prin
reorganizarea materialului genetic propriu.
Inocul – cantitatea de celule aflate sau introduse într-un mediu de cultură,
pregătit în acest scop.
Inoculare – plasarea în/pe un mediu nutritiv.
Interval de subcultură – intervalul de timp dintre două transplantări ale unei
subculturi.
Introni – secvenţe noninformationale din genele eucariote situate între
secvenţele informaţionale numite exoni. Intronii sunt prezenţi în ARN premesager,
fiind eliminaţi în procesul de maturare a ARNm.
In vitro – (din latină – în sticlă), experienţe efectuate în afara organis-mului,
în condiţii de laborator. Culturile de celule in vitro se efectuează pe medii
artificiale.
In vivo – în planta întreagă crescută, în seră, în câmp etc.
Kb – abreviere de la kilobază, l kb constituie 1000 perechi de baze azotate. ;

Liber de virusuri – plante, celule, ţesuturi sau meristeme care nu conţin

particule virale identificabile şi care nu manifestă simptome virale.
Ligază – v. ADN-ligază.
Luciferază – denumire generică a unor enzime implicate în bioluminiscenţă
(lumina emisă de unele organisme vii); emisia de lumină (562 nm) produsă în
urma reacţiei de oxidare a luciferinului dependent de ATP, catalizată de luciferază.

Macroelemente – grup de elemente esenţiale pentru dezvoltarea plantelor (N,

P, K, Ca, Mg şi S) necesare în cantităţi relativ mari.
Marker genetic – genă cu efect fenotipic distinct şi localizare cunoscută,
utilizată în studii genetice.
Mediul de bază – mediu de control al unei culturi (de regulă, compuşii
anorganici şi organici, lipsit de reglatori de creştere sau alţi fitoefectori).
Meristem – masiv celular, cu celule în proliferare, din care ulterior rezultă
toate celelalte categorii de ţesuturi.
Microcultură clonală – obţinerea in vitro pe cale asexuată a plantelor genetic
identice celulei iniţiale.
219
 Microelemente – grup de elemente – Fe, B, Zn, Mo, Mn etc. – necesare în
cantităţi mici pentru nutriţia plantelor.
Microexplante – explante de dimensiuni microscopice sau, în sens mai larg,
cele cu care se operează la culturile in vitro.
Microparticule – sfere din aur sau pudră de tungsten (cu diametrul de 0,3-5
µm) care sunt învelite în ADN şi accelerate în vid pentru a realiza transferul
informaţiei genetice în celulele intacte.
Micropropagare – propagarea (reproducerea) pe cale asexuată sau vege tativă
a plantelor in vitro.
Monoploid – celulă sau organism care are în celule somatice un singur set sau
un număr haploid de cromozomi – x.
Morfogeneză – inducerea formei şi a particularităţilor structurale asociate
unor procese de diferenţiere.
Mutagen – agent fizic, chimic sau biologic care produce schimbări în
structura materialului ereditar, inducând mutaţii.
Mutant – organism care poartă o mutaţie exprimată fenotipic.
Mutaţie – variaţie ereditară în structura materialului genetic al unui organism
neprovocată de segregarea şi recombinarea genelor. În această categorie au fost
incluse modificările specifice în structura genelor, precum şi modificările
numerice şi structurale ale cromozomilor.
Nucleotidă – subunitatea acizilor nucleici alcătuită dintr-un zahăr, un fosfat şi
o bază azotată.
OMG (organism modificat genetic) – organism al cărui genom a fost
modificat prin inginerie genetică.
Ontogeneză – seria de transformări suferite de individ, de la fecundarea oului
până la moarte, în concordantă cu norma pentru specia dată.
Operon – unitate coordonată de expresie genetică, alcătuită din situri (poziţii)
de control: un promotor şi un operator şi mai multe gene structurale implicate la
procariote, în acelaşi lanţ metabolic. Genele operonului sunt transcrise coordonat,
ca o singură moleculă de ARNm policistronic.
Organogeneză – formarea, diferenţierea, dezvoltarea organelor.
Pasaj (sinonim subcultură) – transferul sau transferarea celulelor, cu sau fără
diluarea acestora, dintr-un vas de cultură în altul.
Plantulă – tulpiniţa generată in vitro şi înrădăcinată, sau embrionul germinat.

PCR (Polymerase Chain Reaction) – reacţia în lanţ a polimerazei, tehnică

prin care se produce un număr enorm de copii (o amplificare) a unor secvenţe
specifice de ADN (gene) fără să se apeleze la clonare.

220
 Plasmidă – moleculă mică, circulară, de ADN extracromozomal, prezentă
frecvent la bacterii capabile de replicare independentă în citoplasma bacteriilor.
Conţin 0,-2,0% din totalul ADN-ului celular. Unele plasmide se folosesc în
cercetările de creare a ADN-ului recombinat în calitate de vectori de clonare a
ADN-ului exogen.
Poliploid – celulă sau organism care conţine trei (triploid), patru (tetraploid)
sau mai multe seturi de cromozomi într-un nucleu.
Primer – o secvenţă scurtă de ARN sau un segment monocatenar de ADN,
care funcţionează în calitate de punct de creştere în polimerizare.
Primeri pentru RAPD – decameri oligonucleotidici cu o secvenţă arbitrară,
dar cu un conţinut în CG de 50% sau mai mare.
Primordiu – grup de celule care reprezintă primul stadiu de dezvoltare al unui
organ.
Procariote – organisme unicelulare, fără nucleu. La procariote materialul
genetic este organizat într-o formaţiune numită nucleoid, la care nu se observă nici
membrană învelitoare, nici cromozomi condensaţi. Funcţia nucleului este
îndeplinită de o structură macromoleculară de ADN sau ARN liberă, care
formează un singur grup linkage (genofor). Principalele tipuri de procariote sunt
bacteriile şi algele albastre.
Proembrion – structură embrionară care precede formarea embrionului sau
faza iniţială de diferenţiere a celulelor, ţesuturilor, într-o formaţiune similară
embrionului.
Profag (provirus) – virus al cărui ADN este inclus în cromozomul (genoforul)
bacterian. El se replică sincron cu ADN-ul bacterian şi se transmite o dată cu
cromozomul respectiv de la o generaţie la alta. Profagul condiţionează fenomenul
de transducţie.
Proliferare (lat. proles – descendenţă, fere – a naşte) – creşterea ţesutului prin
diviziunea celulară intensă, continuă.
Promeristem – stadiul de meristem tânăr, fie el de tulpină sau de rădăcină, fie
cu structură încă nediferenţiată.
Promotor – succesiunea nucleotidelor în molecula de ADN, situată la
începutul unităţii de transcripţie.
Proteine – molecule alcătuite din lanţuri de aminoacizi; îndeplinesc diferite
funcţii în celulă, în special de structură şi enzimatice.
Protoplast – celulă vegetală cu toţi constituenţii a cărei membrană (perete
celular) a fost eliminată pe cale mecanică sau enzimatică.
QTL (quantitative trait loci) – loci implicaţi în determinarea caracterelor
cantitative (poligene).
RAPD (random amplified polymorphic DNA) – amplificarea selectivă a ADN-
ului polimorf, tehnică ce utilizează primeri oligonucleotidici (decameri)
221
cu secvenţă arbitrară pentru amplificarea segmentelor de ADN distribuite
randomizat în genom.
Recombinat – individ rezultat în urma recombinării genetice. Recombinare –
apariţie a unor fenotipuri şi genotipuri noi printre
descendenţii unei încrucişări datorită fie asortării independente a cromozomilor,
deci şi a genelor, fie recombinărilor de gene condiţionate de crossing-over.
Rediferenţiere – trecerea celulelor specializate dintr-o stare de diferenţiere în
alta, cu diviziuni precursoare sau directe.
Repicare – procedeul prin care un explant este transplantat sau răsădit
într-un alt mediu de cultură.
Replicare ADN – formarea a două molecule identice bicatenare de ADN
dintr-o singură asemenea moleculă. În cadrul duplicării cele două catene de ADN
se separă prin ruperea legăturilor de hidrogen şi fiecare devine un model sau o
matriţă pentru sinteza unei noi catene complementare. Rezultă astfel o moleculă
constituită dintr-un filament nou şi unul vechi. Replicarea ADN asigură
transmiterea exactă a informaţiei genetice.
Reproducere – proprietate de bază a organismelor vii de a da naştere la noi
indivizi asemenea lor. Reproducerea permite organismelor să-şi transmită zestrea
ereditară de-a lungul generaţiilor. În general, reproducerea se realizează pe două
căi: sexuată şi asexuată.
Reverstranscripţie – sinteza ADN-ului pe matrice de ARN catalizată de
enzima transcriptază inversă sau ADN-polimerază dependentă de ARN.
Ribozomi – particule nucleoproteice, situate în marea lor majoritate în
citoplasmă, alcătuite din ARN-ribozomal şi mai multe tipuri de proteine.
Ribozomii constituie sediul sintezei proteinelor, având rol în iniţierea şi
desfăşurarea procesului de translaţie a informaţiei genetice cuprinse în ARNm.
Rizogeneză – procesul de diferenţiere şi de dezvoltare a rădăcinii.
Secvenţializarea genomului – determinarea succesiunii tuturor bazelor care
compun ADN-ul unui organism. Această operaţiune este în curs de desfăşurare la
un număr limitat de specii: câteva bacterii, o drojdie, două plante (Arabidopsis
thaliana şi orezul), un nematod, o insectă (musculiţa de oţet) şi omul; nu permite
determinarea funcţiilor proteinelor codificate de ADN.
Selecţie celulară – metodă de evidenţiere a celulelor mutante şi a variaţiilor
somaclonale.
Somatic – referire la părţi (sau procese) vegetative.
Sondă moleculară – secvenţă de ADN sau ARN marcată (cu un compus
fluorescent sau un radioizotop), care este utilizată pentru detectarea unor secvenţe
omoloage (complementare) prin hibridare in situ sau in vivo.
Sporofit – generaţie asexuată a plantelor, caracterizată printr-un număr diploid
de cromozomi, care începe o dată cu formarea zigotului şi se termină cu formarea
sporilor în procesul de meioză.
222
 Sterilizare – procedeu folosit pentru eliminarea microorganismelor.
Subcultură – transferarea celulelor, ţesuturilor, organelor etc. de pe un
mediu nutritiv pe altul.
Suspensie celulară – tip de cultură în care celule sau agregate celulare cresc şi
se multiplică suspendate în mediu lichid.
Tehnologia ADN-ului recombinat – izolarea sau sinteza artificială a unei
gene şi introducerea genei noi, numite pasager, într-o celulă-gazdă în care se
replică şi funcţionează normal.
Testare în câmp – studierea organismelor modificate genetic în câmp, în
condiţii de mediu aflate sub control, avându-se certitudinea că aceste organisme nu
vor persista în mediu după încheierea experimentului.
Totipotenţă – potenţialul celulelor de a regenera plante.
Transcripţie – procesul de sinteză (transcriere, copiere) a ARN-ului celular
(ARNm, ARNt şi ARNr) pe o matrice de ADN. Sinteza este catalizată de enzima
ARN-polimeraza dependentă de ADN.
Transferul de tip Southern – transferul ADN de pe gelul de electroforeză pe
o membrană, unde poate hibrida cu un acid nucleic complementar. Transformare
genetică – modificarea genomului unui organism prin
inginerie genetică.
Transgeneză – transferul genelor străine în celula plantei.
Translaţie – traducerea mesajului genetic cuprins în moleculele de ARNm
într-o secvenţă corespunzătoare de aminoacizi în proteina nou-sintetizată.
Transplant – sistem viu, care este supus operaţiei de transplantare.
Transplantare – operaţiunea prin care o celulă, un ţesut sau un organ luat
din corp este grefat în altă parte a corpului, pe un alt organism sau pe un alt mediu
de cultură.
Transpozoni – elemente genetice transpozabile, altfel spus segmente de ADN
care au capacitatea de a se deplasa şi insera în unul sau mai multe locuri în genom.

Tumoare – ţesut care se dezvoltă într-un organism prin înmulţirea continuă,

anormală, a celulelor. Tumorile pot să apară în urma unei infecţii (virale sau
bacteriene) sau a tulburării echilibrului hormonal, ori pot să aibă o cauză genetică.

Variabilitate – proprietate a organismelor vii, cu diferite grade de înrudire, de

a se deosebi între ele în plan morfologic, fiziologic, biochimic etc. Diferenţele
dintre indivizi pot fi determinate de genotip şi de influenţa condiţiilor de mediu.
Variaţie epigenetică – variaţie neereditară frecvent reversibilă, consecinţă a
schimbării în expresia genelor.
Variaţie somaclonală – variaţia manifestată de plantele regenerate din culturi
in vitro.
223
 Vector de clonare – moleculă de ADN capabilă de replicare autonomă în care
este posibilă inserarea unor segmente de ADN străine, în vederea introducerii şi
menţinerii în celula-gazdă.
Vector de expresie – vector care posedă regiunea codificatoare a unei gene
între semnalele necesare pentru expresia ei.
Vector de transformare (vector binar) – plasmidă, vector de donare în
Escherichia coli, care posedă extremităţile dreaptă şi stângă ale ADNt ce
încadrează secvenţele care vor ajunge în celula vegetală.
Vector naveta – vector capabil să se replice în cel puţin două organisme
diferite, graţie originilor de replicare adecvate.
YAC (yeast artificial chromosome) – cromozom artificial de drojdie, capabil
să cloneze în celulele de drojdii fragmente de ADN care măsoară 200-1000 Kb.
Zigot – celulă diploidă formată prin fuzionarea a doi gameţi haploizi. Din
zigot, prin diviziune, se dezvoltă embrionul şi în continuare un nou organism.

224
 BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Acordul de colaborare între Departamentul Protecţia Mediului Înconjurător al

Republicii Moldova şi Ministerul Apelor, Pădurilor şi Protecţiei Mediului al
României în domeniul mediului înconjurător şi folosirii durabile a resurselor
naturale, semnat la 18 martie 1997.
2. Acordul de colaborare între Inspectoratul Ecologic de Stat din Republica
Moldova şi Inspectoratul Ecologic de Stat şi Inspectoratul Piscicol ale regiunii
Viniţa, încheiat la 13 iunie 1996 în or. Viniţa (Ucraina).
3. Acordul între Departamentul Protecţia Mediului Înconjurător al Republicii
Moldova şi Ministerul Resurselor Naturale şi Protecţiei Mediului Înconjurător al
Republicii Belarusi privind colaborarea în domeniul mediului înconjurător,
semnat la Chişinău la 23 decembrie 1994 şi intrat în vigoare din 14 aprilie 1997.
4. Acordul între Ministerul Mediului şi Protecţiei Teritoriului al Republicii Italiene
şi Ministerul Ecologiei, Construcţiilor şi Dezvoltării Teritoriului al Republicii
Moldova privind colaborarea în domeniul protecţiei mediului şi folosirii
resurselor naturale, semnat la Chişinău la 10 iunie 2002.
5. Al Doilea Raport Naţional al Republicii Moldova cu privire la Diversitatea
Biologică, 2002.
http://bsapm.dnt.md/Text/Pagina%20web%20RaportII/RaportulII.pdf
6. An Explanatory Guide to the Cartagena Protocol on Biosafety, 2003.
http://www.iucn.org/themes/law/pdfdocuments/Biosafety%20Guide/Biosafety-
guide-prelims.pdf http://governance.wri.org/pubs_description.cfm?PubID=3880

7. Badea, E. Plantele transgenice în cultură. Bucureşti, 2000, 61 p.

8. Badea, E., Răduţoiu, S., Nicolae, I., Paicu, P. Genetica. Genetica moleculară şi
ingineria genetică. Bucureşti, Ed. Bioterra, 2000, 275 p.
9. Badea, E., Săndulescu, D. Biotehnologii vegetale. Bucureşti, Fundaţia Bioteh,
2001, 295 p.
10. Barbacaru, N. Caracteristica moleculară a genomului unor plante superioare (tomate,
porumb) cu ajutorul markerilor moleculari. //Fiziologia şi biochimia plantelor la
început de mileniu. Materialele Congresului II, Societatea de Fiziologie şi Biochimie
Vegetală din Republica Moldova. Chişinău, 2001, p. 15-23.
11. Comarov, Galina. Biotehnologia culturilor agricole. Indicaţiii metodice pentru
lucrările de laborator. Chişinău, Universitatea Agrară de Stat din Moldova, 1996,
65 p.
12. Comarov, Galina. Organisme genetic modificate. // Buletin informativ
interramural. Nr.16. Rubrica SASITŞ 68.03.09.INEI, Chişinău, 2001, 4 p.
225
13. Comarov, Galina. Realizările cercetărilor ştiinţifice în domeniul biotehnologiilor
vegetale la Universitatea Agrară de Stat din Moldova.// Inginerie genetică şi
biotehnologii moderne. Chişinău, Centrul Ed. al UASM, 2002, p. 151-155.
14. Comarov, Galina, Palii, A., Rotari, A., Zgardan, D., Climenco, N. Studiul
postacţiunii metaboliţilor endogeni asupra reacţiei morfogenetice a mutantelor de
porumb în embriocultură. // Cercet. de genetică vegetală şi animală. Vol. 5,
Bucureşti, 1998.
15. Comarov, Galina, Rotari A. Biotehnologia ca baza creării ecotehnologiilor noi în
rezolvarea problemelor dezvoltării durabile a agriculturii Moldovei. // Cercetarea
multidisciplinară regională. Al IV-lea Simpozion Internaţional. Timişoara,
România, 2000, p.24.
16. Comarov, Galina, Suprunov, Tatiana, Dorohov, D., Rotari, A. Folosirea
complexă a metodelor markerilor proteici şi a markerilor pe baza ADN-ului
pentru identificarea genotipurilor de porumb.// Lucrări ştiinţifice UASM, V. 4,
Chişinău, 1996, p. 56-59.
17. Comarov, Galina, D. Zgardan, A. Rotari, A. Palii. Rolul aminoacizilor liberi în
expresia genelor structurii endospermului asupra reacţiei morfogenetice a
embrionilor nimaturi de porumb.// Cercet. de genetică vegetală şi animală. Vol. 8,
Bucureşti, 2004, p. 97-103.
18. Convenţia dintre Guvernul Republicii Moldova şi Guvernul României privind
cooperarea în domeniul carantinei şi protecţiei plantelor, semnat la Bucureşti la
15 mai 1997 şi intrat în vigoare la 25 noiembrie 1997.
19. Convenţia privind Diversitatea Biologică, 1992.
http://www.pronatura.ro/legi/rio.html
20. Crăciun, T., Patraşcu, M. Haploidia în genetică şi ameliorarea plantelor. Editura
Ceres, Bucureşti, 1979.
21. Crăciun, T., Tomozei, L, Coleş, N., Butnaru, G. Genetica vegetală. Editura
Didactică şi Pedagogică, Bucureşti, 1991.
22. Duca, Maria, Teleuţă, A., Port, Angela. Plante modificate genetic. Beneficii şi
riscuri. F.E.P. “Tipografia Centrală”, Chişinău, 2003, 96 p.
23. Gavrilă, L. Clasic şi modern în ştiinţa eredităţii. Editura Albatros, Bucureşti,
1984.
24. H.G.R.M. cu privire la desemnarea autorităţii naţionale responsabile de legătura
cu Secretariatul Protocolului de la Cartagena privind Biosecuritatea la Convenţia
privind Diversitatea Biologică, nr. 197 din 25.02.2003, MO nr. 27-29 din
28.02.2003.
25. H.G.R.M. cu privire la Comisia Naţională pentru Securitatea Biologică, nr. 603
din 20.05.2003, Monitorul Oficial al RM nr. 91-96 din 30.05.2003.
26. H.G.R.M. privitor la aprobarea Regulamentului privind autorizarea activităţilor
legate de obţinerea, testarea, utilizarea şi comercializarea organismelor modificate
genetic: nr.1153 din 25.09.03, MO nr. 211-214 din 10.10.03.

226
27. H.G.R.M. privitor la aprobarea normelor privind etichetarea produselor
alimentare şi normelor privind etichetarea produselor chimice de menaj: nr. 996
din 20.08.2003, MO nr. 189-190 din 29.08.03.
28. H.G.R.M privitor la aprobarea Concepţiei naţionale a agriculturii ecologice,
fabricării şi comercializării produselor alimentare ecologice şi genetic
nemodificate: nr. 863 din 21.08.2000, MO nr. 109-111 din 31.08.2000.
29. Indexul bibliografic «Biotehnologii vegetale», anii 1995-2003, UASM, Chişinău,
2004.
30. Inginerie genetică şi biotehnologii moderne /Acad. de Şt. a Moldovei. Inst.de
Genetică. Soc. Şt. a Geneticienilor şi Amelioratorilor din Rep.Moldova –
Chişinău: F.E.P. “Tipografia Centrală”, 1998, 317 p.
31. Inginerie genetică şi biotehnologii moderne /Acad. de Şt. a Moldovei. Inst. de
Genetică. Soc. Şt. a Geneticienilor şi Amelioratorilor din Rep. Moldova –
Chişinău: Centrul ed. al UASM, 2002, 420 p.
32. Iuoraş, M. Markeri moleculari bazaţi pe amplificarea ADN-ului prin PCR şi
unele aplicaţii în ameliorarea plantelor / Probl.genet.teor.aplic. – 1999. – XXXI. –
(1-2), p. 79-100.
33. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mecanism in tbe synthesis of proteins.
S.Mol.Biol. 3, 1961.
34. Jacotă, A. Biotehnologiile vegetale – realizări şi perspective. // Fiziologia şi
biochimia plantelor la început de mileniu. Materialele Congresului II, Societatea
de Fiziologie şi Biochimie Vegetală din Republica Moldova. Chişinău, 2001, p.
241- 244.
35. Kravchenko O. A., Lysikov V. N, Palii A. F. Effect of gamma radiation in callus
formation and somatic embryogenesis of waxy maize. In: Maize Genetics
Cooperation Newsletter, 71, april 15, 1997, p. 42-43.
36. Larkin, P. J., Scowcroft, W. R. Somaclonal variation – a novel source of
variability from cell culture for plant impovement. Theor.Appl. Genet., 1981, 60,
197-214.
37. Legea privind Securitatea Biologică, nr.755-XV din 21 decembrie 2001
/Monitorul Oficial al Rep. Moldova, 2002 – 75, p. 3-9.
38. Legea Republicii Moldova privind Securitatea Biologică, nr. 755-XV din
21.12.2001, MO nr. 75 din 13.06.2002.
39. Leşanu, M. Principii de biotehnologie. Curs de lecţii. CE ESM, Chişinău, 2003,
134 p.
40. Levenko, B. Biotehnologhia rastenii: segodnea i zavtra. / J. Fiziologia i biochimia
culturnîh rastenii. – Kiev, 1999, 31 – 3, p.163-172.
41. Lewis, R. Agricultural Biotechnology / Human Genetics. Concepts and
Applications. – New York : McGraw Hill Higher Education, 2001, p. 361–376.
42. Maarten J. Chrispeels, David, E. Sadava – Plants, Genes, and Agriculture. Ed.
Jones and Bartlett Publishers. Boston. London, 1994, 478 p.

227
43. Milică, C. Biotehnologiile viitorului. Iaşi, Ed. Ion Ionescu de la Brad, 1999, 351
p.
44. Mitina, I. Analiza genomurilor plantelor cu utilizarea elementelor genetice
mobile. Teză de doctor în ştiinţe biologice. Chişinău, 2002, 98 p.
45. Note to Acre on the Farm Scale Evaluations by the GM Science Review Panel,
2003.
http://www.gmsciencedebate.org.uk/pdf/gmsci-fse-acre.pdf
46. Palii, A. Genetica. Chişinău, Ed. MUSEUM, 1998, 352 p.
47. Palii, A. F., Kravchenco O. A. Optimization of culture conditions for reliable
plant regenration of waxy maize. In: Abstracts of Maize and Sorghem
EUCARPIA. The 17-th conference on genetics, biotehnology and breeding of
maize and sorghum. Thessaloniki, Greece. 1996, p. 61.
48. Palii, A., Rotari, A., Zgardan, D., Comarov, Galina. Expresia genelor structurii
endospermului la nivelul metaboliţilor endogeni ai embrionilor imaturi de porumb
inoculaţi ulterior în cultura in vitro. // Lucrări ştiinţifice UASM. Vol. 9, Chişinău,
2001, p. 78-82.
49. Popa, N. Sociogenetica. – Chişinău: CE USM, 2002, 241 p.
50. Primul Raport Naţional cu privire la Diversitatea Biologică, 2001.
http://bsapm.dnt.md/Text/Pagina%20web%20Raport/Roman/Continuttot.html
51. Protocolul de la Cartagena privind Biosecuritatea la Convenţia privind
Diversitatea Biologică, 2000.
http://www.biodiv.org/biosafety/protocol.asp
52. Protocolul privind colaborarea între Ministerul Protecţiei Mediului Înconjurător al
Ucrainei şi Departamentul Protecţia Mediului Înconjurător şi Resurselor Naturale
al Republicii Moldova, încheiat la Kiev, la 19 noiembrie 1993.
53. Raicu, P. Genetica generală şi umană. Bucureşti, Humanitas, 1997, 357 p.
54. Robertson, Dominique; Scott, Shore; David, M. Miller. Manipulation and
Expression of Recombinant DNA. A Laboratorz Manual. Ed. Academic Press
1997, 204 p.
55. Rotari, A., Anţibor, I., Ojoga, O., Iliev, P., Comarov, Galina. Studierea soiurilor
de cartofi, ultilizaţi în Moldova cu scopul însănătoşirii lor după metoda
meristemei apicale. // Bulet A.Ş. a Moldovei, Ştiinţe biologie, chimice şi agricole.
Nr. 3(288), Chişinău, 2002, p. 204-209.
56. Strategia Naţională şi Planul de Acţiune în domeniul Conservării Diversităţii
Biologice, 2002.
http://bsapm.dnt.md/Text/Pagina%20web%20Strategia/Roman/Cuprinstotal. html

57. Suprafeţele mondiale cu culturi transgenice // Agricultura României, 2002 –

44(647), p. 8.
228
58. Tehnologii biologice avansate şi impactul lor în economia Moldovei. Materialele
simpozionului. Ed. AGEPI, Chişinău, 2002, 170 p.
59. Toma, O., Pârâianu, Gabriela. Biotehnologie. Metode / Procesare. Ed. ARC,
Bucureşti, 2000, 84 p.
60. Vlaic, A. Inginerie genetică. Promedia-Plus, Cluj-Napoca, 1997.
61. Watson, J. D., Oilman, M., Witkowski, J., Zoller, M. Recombinant DNA, W. H.
Freeman and Company, New York, 1992.
62. Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A., Tingey, S.V. DNA
polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.
Nucleic Acids Research, Nr.18, 1990.
63. Zgardan, D., Comarov, Galina. Expresia genelor structurii endospermului în
embriocultura formelor hibride de poumb. // Inginerie genetică şi biotehnologii
moderne. Chişinău, Centrul Ed. al UASM, 2002, p. 282-285.
64. Айала, Ф., Кайгер, Дж. Современная генетика, М.: Мир, 1988.
65. Георгиев Г. П. Гены высших организмов и их экспресия. М.: Наука, 1989.
66. Гершензон С. М. Основы современной генетики. Киев: Наукова думка,
1983.
67. Дорохов Д. Б., Клоке Э. Быстрая и экономичная технология RAPD-анализа
растительных геномов. Генетика, т.33, nr. 4, р. 443-450.
68. Комарова Г. Полиморфизм белков в селекционно-генетических исследо-
ваниях кукурузы. //Lucrări ştiinţifice UASM, V. 8. Agronomie, Chişinău, 1998.
69. Комарова Г., Ротарь А., Клименко Н. Изучение сомаклональной
изменчивости в потомстве растений-регенерантов кукурузы. //Fiziologia şi
biochimia plantelor la început de mileniu. Materialele Congresului II, Societatea
de Fiziologie şi Biochimie Vegetală din Republica Moldova. Chişinău, 2001, p.
281-289.
70. Комарова Г., Ротарь А., Караиванов Г., Палий А., Клименко Н.
Изучение сомаклональных вариантов кукурузы для их использования в
селекционном процессе. // Bulet.A.Ş. a Moldovei, Ştiinţe biologie, chimice şi
agricole. Nr. 3(288), Chişinău, 2002, p. 144-148.
71. Кочиева Е. З. Использование методов на основе полимеразной цепной реак-
ции для анализa и маркирования растительного генома. Сельскохозяйствен-
ная биология. Nr. 3, 1999, р. 3-14.
72. Муромцев Г., Бутенко Р., Тихоненко Г. и др. Основы сельскохозяйствен-
ной биотехнологии // Москва, Агропромиздат, 1990, 383 p.
73. Палий А. Ф., Кравченко О. А. Особенности культуры зародышей у
восковидной кукурузы. Тез. Докл. Республ. Конф. «Современные проблемы
генетики и селекции». Минск, 1995, р. 95.

229
74. Попа Н. Е. Инжинерия женикэ. Кишинэу, Картя Молдовеняскэ, 1989.
75. Ротарь А. И., Мику В. Е., Комарова Г. Е. Возможности использования
метода электрофореза зеина в селекции и семеноводстве кукурузы.// Сб.
Эволюция научных технологий в растениеводстве. Tом 2, Краснодар, 2004,
р. 288-295.
76. Скаукрофт У. Р. Сомаклональная изменчивость: миф о клональном
единообразии. În v. Мобильность генома растений. Москва, Аеропромиздат,
1990.
77. Созинов А. А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции.
М., 1985.
78. Шевелуха В., Калашников Е., Дегтяров С. Сельскохозяйственная
биотехнология // Москва: Высшая школа, 1998, – 351 p.
79. GM Science Review. First Report, 2003.
http://www.gmsciencedebate.org.uk/report/default.htm#first
80. GM Science Review. Second Report, 2004.
http://www.gmsciencedebate.org.uk/report/default.htm#first

230
231
 Com. 4973
Firma editorial-poligrafică “Tipografia Centrală”,
MD-2068, Chişinău, str. Florilor, 1
tel. 49-31-46, 43-03-60
Ministerul Culturii al Republicii Moldova, Direcţia
Edituri, Poligrafie şi Aprovizionare cu Cărţi

232