Sunteți pe pagina 1din 135

Lector univ. dr.

ADRIAN-GEORGE PETICIL

MICRONMULIREA
PLANTELOR HORTICOLE

-1-

CUPRINS
INTRODUCERE

UNITATEA DE NVARE NR. 1: ISTORICUL CULTURILOR DE CELULE


I ESUTURI VEGETALE

1.1

Obiectivele unitii de nvare nr. 1

1.2

nceputurile culturilor de celule

1.3

Avantajele i dezavantajele multiplicrii in vitro

13

1.4

Cercetarea n domeniul culturii de esuturi in vitro n ara noastr

16

1.5

Comentarii i rspunsuri la teste

18

Lucrare de verificare nr.1

22

Bibliografie minimal

22

1.6
1.7

UNITATEA

DE

NVARE

NR.

2:

BAZELE

TEORETICE

ALE

MICROPROPAGRII IN VITRO

23

2.1

Obiectivele unitii de nvare nr. 2

2.2
2.3

Biologia dezvoltrii plantelor (cormofite) n cazul culturilor de celule i esuturi in vitro 24


Comentarii i rspunsuri la teste
33

2.4

Lucrare de verificare nr.2

36

2.5

Bibliografie minimal

36
37

3.1

UNITATEA DE NVARE NR. 3: LABORATORUL DE CULTURI IN VITRO


Obiectivele unitii de nvare nr. 3

3.2

Alctuirea laboratorului de micropropagare

38

3.3

45

3.4

Dotrile laboratorului
Comentarii i rspunsuri la teste

3.5

Lucrare de verificare nr.3

51

3.6

Bibliografie minimal

51

23

37

50

UNITATEA DE NVARE NR. 4: ASEPSIA N CULTURILE VEGETALE IN


VITRO

52

4.1

Obiectivele unitii de nvare nr. 4

52

4.2

Msuri generale de igien i asepsie

53

4.3

Asepsizarea ncperilor, a instrumentarului i a celorlalte obiecte de laborator

54

4.4

55

4.5

Asepsizarea vaselor de cultur


Asepsizarea mediilor de cultur, apei i a altor substane

4.6

Asepsizarea materialului vegetal

56

-2-

55

4.7

Verificarea asepsizarii

57

4.8

Comentarii i rspunsuri la teste

59

4.9

Lucrare de verificare nr.4

61

4.10

Bibliografie minimal

61

UNITATEA DE NVARE NR. 5: MEDIILE DE CULTUR

62

5.1

Obiectivele unitii de nvare nr. 5

62

5.2

Generaliti

63

5.3

Compoziia mediului de cultur

64

5.4

65

5.5

Compuii anorganici i organici


Compuii fenolici, compuii antivirali i extractele vegetale

5.6

Prepararea mediilor de cultur i pH-ul

75

5.7

Problemele i infeciile care apar n mediile de cultur

78

5.8

Comentarii i rspunsuri la teste

82

5.9

Lucrare de verificare nr. 5

84

5.10

Bibliografie minimal

84

UNITATEA DE NVARE NR. 6: FAZELE PROPAGRII IN VITRO

85

6.1

Obiectivele unitii de nvare nr. 6

85

6.2

Etapa 0 / Pregtirea materialului vegetal n vederea prelevrii explantului

86

6.3

Etapa 1/ Iniierea i stabilizarea culturii

90

6.4

92

6.5

Etapa 2/ Multiplicarea
Etapa 3/ nrdcinarea

6.6

Etapa 4/ Aclimatizarea

94

6.7

Comentarii i rspunsuri la teste

96

6.8

Lucrare de verificare nr. 6

98

6.9

Bibliografie minimal

98

74

93

UNITATEA DE NVARE NR. 7: METODE DE PROPAGARE IN VITRO A


CULTURILOR DE CELULE I ESUTURI VEGETALE

99

7.1

Obiectivele unitii de nvare nr. 7

99

7.2

Organogeneza

100

7.3

Culturile de apexuri

101

7.4

Cultura de minibutai

102

7.5

Culturile de meristeme

103

7.6

Culturile de calus

105

7.7

Microaltoirea

106

-3-

7.8

Cultura de embrioni i endosperm

108

7.9

Cultura de embrioni zigotici

110

7.10

Smna sintetic

111

7.11

Cultura de antere, polen, ovare, ovule i esut nucelar

113

7.12

Cultura de protoplati

113

7.13

Comentarii i rspunsuri la teste

116

7.14

Lucrare de verificare nr. 7

118

7.15

Bibliografie minimal

118

UNITATEA DE NVARE NR. 8: MICROPROPAGAREA IN VITRO A


SPECIILOR HORTICOLE

119

8.1

Obiectivele unitii de nvare nr. 8

119

8.2

Micropropagarea in vitro la via-de-vie

120

8.3

Micropropagarea in vitro a speciilor pomicole

121

8.4

Micropropagarea in vitro a speciilor floricole

124

8.5

127

8.6

Micropropagarea in vitro a cartofului


Micoriza i culturile in vitro

8.7

Comentarii i rspunsuri la teste

131

8.8

Lucrare de verificare nr. 8

132

8.9

Bibliografie minimal

132

GLOSAR DE TERMENI

133

10

BIBLIOGRAFIE

135

-4-

128

INTRODUCERE

Romnia are un mare potenial n ceea ce privete domeniile horticole, de la viticultur la


pomicultur, legumicultur sau floricultur, i n special, n ceea ce privete producerea de
material sditor. Cum cerinele pieei moderne sunt pentru material sditor de calitate, liber de
virusuri i boli i certificat, micronmulirea - ca disciplin i afacere - este mai mult dect
necesar pentru evoluia pieei de profil.
Ne-am propus n acest manual dedicat studenilor de la Horticultur ID s trecem n revist
principalele instrumente cu care opereaz aceast disciplin, n sperana c, n viitor, una din
direciile de dezvoltare a pieei agricole va cuprinde i domeniul micronmulirii, stabilind n acest
fel primele noiuni necesare pentru a opera n domeniul biotehnologiilor. Pe parcursul capitolelor
am trecut n revist diverse aspecte legate de structura laboratoarelor, de necesarul tehnic aferent
pentru ca mai apoi s listam principalele tehnologii de producie n domeniul micronmulirii,
categoriile de culturi care se pot opera.
La fiecare capitol am ncercat s semnalm problemele deosebite care pot aprea sau
caracterul de importan i inedit, micromulirea fiind un bra al biotehnologiei, o tiin aplicat
deosebit de valoroas, care necesit ns cunotine din varii domenii adiacente, de la biochimie,
agrochime, genetic sau biologie, la fiziologie i ameliorare.
Pentru a ne ncadra ca ar membr cu drepturi depline n Comunitatea european, nu
avem doar drepturi, avem i obligaii, i una dindre acestea este aceea de a racorda serviciile
oferite la nivelul performanelor europene. Dezvoltarea segmentului de biotehnologii vegetale cu
aplicabilitate n horticultur sau agricultur, prin deschiderea de laboratoare de micronmulire,
care s ofere spre comercializare att pe piaa interna ct i pe piaa european produse de
valoare, certificate i care s corespund exigenelor crescnde ale acestui domeniu - de la
productor la consumator, susine importana acestei materii de studiu n cadrul programei
tiinifice a Facultii de Horticultur.

Autorul

-5-

UNITATEA DE NVARE NR. 1:


ISTORICUL CULTURILOR DE CELULE I ESUTURI VEGETALE

CUPRINS
1.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 1.

1.2 nceputurile culturilor de celule.

1.3 Avantajele i dezavantajele multiplicrii in vitro.

13

1.4 Cercetarea n domeniul culturii de esuturi in vitro n ara noastr.

16

1.5 Comentarii i rspunsuri la teste

18

1.6 Lucrare de verificare nr.1

22

1.7 Bibliografie minimal

22

1.1 Obiectivele Unitii de nvare nr. 1

Prin studierea acestei uniti de nvare vei fi n msur s:

Defineti locul disciplinei n arealul de specialitate.

Identifici principalele etape n dezvoltarea acestei tiine.

Listezi avantajele pe care le prezint aceast tiin i tehnic.

Plasezi cercetarea romneasc n contextul mondial al


dezvoltrii acestei tehnologii, ramur a biotehnologiilor.

-6-

1.2. nceputurile culturilor de celule.


Plantele sunt organismele care prin procesul de fotosintez realizeaz cel mai spectaculos
proces din lumea vie, acela de transformare a energiei solare n energie chimic. Ele joac un rol
hotrtor pentru existena uman, constituind aurul verde, bogia de nenlocuit a Terrei, fiind
surs de hran i energie pentru om i animale. Dac la acest rol se adaug i rolul de purificator al
atmosferei prin absorbia bioxidului de carbon i eliberarea oxigenului i rolul de materii prime
pentru unele industrii (alimentar, textil, farmaceutic), gsim justificat interesul omului pentru
perfecionarea continu a procedeelor de nmulire i cultivare a plantelor.
Secolul XX, este considerat pe bun dreptate secolul marilor progrese care au condus la
mbogirea i acumularea informaiilor legate de natur, de descifrare a mecanismelor ereditii, de
descifrare a legitilor din domeniul fenomenelor biologice i a factorilor mutageni, a modului cum
acetia pot fi manipulai pentru inducerea variabilitii pentru crarea de noi forme vegetale,
procedee de cultivare i nmulire a plantelor.
S-a consolidat concepia c celula vegetal conine n nucleul su totalitatea informaiei
genetice necesar dezvoltrii unui organism complet. Ea se supune principiului clasic al
totipotenei celulare. Regenerarea de plante pornind de la o singur celul haploid sau diploid a
stat i st la baza tehnicii nmulirii plantelor in vitro.
Cultura de esuturi vegetale s-a dezvoltat ca urmare a cercetrilor lui Gottlieb Haberlandt
care, intuind capacitatea regenerativ a celulelor plantelor superioare, a ncercat s cultive esuturi
vegetale. El public n anul 1902 lucrarea Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzelle n care este
fundamentat teoretic ideea c orice celul diploid sau haploid conine informaia genetic
ereditar imprimat n genom. La acea vreme, experienele sale nu au fost ncununate de succes
deoarece a folosit explante din celule cu un grad nalt de difereniere morfofuncional (esut
palisadic, stomate etc.) dar i a limitelor la acea dat a cunotinelor de fiziologie vegetal, a
cunotinelor n stabilirea compoziiei substratului de cultur n ce privete natura i concentraia
substanelor macro i microelemente, a proporiei n care trebuie acestea folosite, a
indispensabilitii prezenei n mediu a unor surse de C organic, vitamine i stimulatori de cretere.
Ideea lui Haberlandt a fost respin de botanitii contemporani (E. Kster, 1926), care
susineau c obinerea de plante ntregi prin multiplicare de celule somatice nu este realizabil.
Haberlandt lanseaz totui ipoteza totipotenialitii celulare, concept pe care l gsim
formulat de Schleiden i Schwann (1939) la care i aduseser o contribuie n perioada 1920 1939
White, 1939 (care a reuit s obin calus din vrfurile rdcinilor de tomate) i R. J. Cautheret,
1934 (care a obinut calusuri folosind explante de salcie, plop, ulm, tutun i morcov pe care le-a

-7-

stimulat cu auxine i le-a repicat n medii sterile), Wirchow n 1858, Bernard, 1878 i anatomistul
vegetal Goebel, citai de White n 1963.
Capacitatea unor celule eucariote de a funciona ca organisme primitive n condiiile
separrii de planta mam susinut de Haberlandt a fost exploatat prin diferite practici de nmulire
vegetativ (butire, marcotaj, altoire).
Vchting i Rechinger (1893), citai de White (1963), au iniiat experimente pentru
determinarea limitelor de divizibilitate ale materialului vegetal, fr pierderea capacitii
regenerative.
n 1957, W. D. Stewart elaboreaz prima metodologie de cultivare in vitro a esuturilor
vegetale pe medii nutritive coninnd hormoni de cretere.
Progresele din domeniul biologiei au permis abia n zilele noastre - prin tehnicile
perfecionate i cunotinele despre structura i funcionalitatea celulelor i organitelor celulare
generarea de plantule dintr-o singur celul.
Se cunosc citate n literatur (1904) experienele efectuate de Hanning care a obinut
plantule la crucifere pornind de la embrioni extrai din semine imature la Raphanus sativus,
R.landra, R.candatus i Cochlearia danica, experienele dovedind posibilitatea creterii pe medii
artificiale cu adaos de zaharoz a unor fragmente de plante.
Laibach (1925, 1929) demonstreaz utilitatea practic a tehnicii de nmulire in vitro pentru
ameliorarea plantelor. El a izolat embrionii din semine neviabile din ncruciarea lui Linum perene
cu Linum austriacum, i-a adus la maturitate i i-a cultivat pe medii nutritive. Aceast metod a
servit mai trziu la realizarea de hibrizi ce ddeau natere la semine sterile, respectiv la embrioni
avortai.
ntre 1904 i 1932 au fost efectuate numeroase ncercri de cultivare pe medii artificiale a
unor explante, dar rezultatele au dovedit c cercetrile n domeniu se aflau n impas (White, 1963).
Muli cercettori s-au aliat n aceast perioad ideii susinut de Kster (1926) potrivit creia
cultivarea esuturilor vegetale este nerezolvabil (Morel, 1948).
Totui, experienele botanitilor au continuat, n jurul anilor 1930, savanii Gautheret n
Frana i concomitent White n Statele Unite efectueaz cercetri n direcia cultivrii in vitro a
explantelor provenite din esut cambial prelevat de la arar, salcie, ulm, plop, (Gautheret, 1931) i
rdcini excizate de la plantele de tomate (White, 1934).
Odat cu descoperirea n 1934 a primului fitohormon (acidul indolil acetic) de ctre
Kgl, Haagen Smit i Erxleben a fost deschis o nou etap n succesul cultivrii in vitro a
explantelor vegetale (Moore, 1979).

-8-

n Frana, Gautheret i Nobecourt (1939), lucrnd independent, obin calus din fragmente
prelevate din rdcinile metamorfozate (tuberizate) de morcov. White (1938), Gautheret i
Nobecourt (1939) realizeaz aproape simultan cultivarea in vitro a calusului, reuind s menin n
via esuturile inoculate i proliferarea acestora, dovedind posibilitatea transferrii i nmulirii
acestor esuturi prin subcultur.
Putem considera c prin cercetrile lor, White (1938), Gautheret i Nobecourt au pus bazele
cultivrii in vitro a explantelor vegetale: organe, esuturi i celule. Totodat, ei i-au adus
contribuia i n domeniul alctuirii mediilor de cultur privind compoziia, concentraia n macro i
microelemente eseniale pentru nutriia explantelor, prezena unei surse de C i N organic, a unor
vitamine i auxine.
Culturile de calus i subcultivarea acestora au reuit i datorit descoperirii n 1934 a rolului
fiziologic al auxinei acidul 3 indolilacetic (AIA), care introdus n mediu de cultur favorizeaz
declanarea i susinerea proceselor regenerative.
n 1941, Van Querbeek i colab. demonstreaz efectul stimulator al laptelui de cocos
asupra dezvoltrii embrionilor i a formrii de calus din explante de Datura.
White i Braun, n 1942, apoi Braun singur, n 1945- reuesc cultivarea unor esuturi
tumorale caulinare pe medii aseptice. Meritele n multiplicarea i propagarea in vitro a unor plante
horticole revin lui Morel i Martin (1952, 1955). Ei au obinut material sditor devirozat pornind de
la plante infectate cultivate pe medii aseptice. Astfel, la nivelul materialului sditor au fost eradicate
virozele la cartof, orhidee, garoafe, dalii etc. (Margara, 1982).
Morel i Martin au demonstrat la dalii (1952) i la cartof (1955) c din meristemele
prelevate de la plante mame infectate se pot regenera clone sntoase. Morel (1960) la Cymbidium
stabilete tehnica de micropropagare in vitro care reprezint un prim pas n micropropagarea
industrial. El apreciaz c dintr-un singur explant ntr-un singur an se pot obine 4 milioane de
plante identice din punct de vedere genetic, libere de viroze. Cu aceast metod s-a revoluionat
tehnica nmulirii orhideelor, extins mai trziu la garoafe, crizanteme i alte specii ornamentale, la
pomii fructiferi, n viticultur i silvicultur.
O serie de ali cercettori (Gregory, 1940; Taylor, 1950; Nitsh, 1951; Sparrow i colab.,
1955; Maheshwari i Lal, 1958; Vasil, 1957, 1959 i alii) adopt o direcie deosebit de interesant,
aceea a regenerrii i diferenierii de plantule in vitro folosind componente florale, antere sau
grunciori de polen, fructe ori semine imature (Maroti, 1976).
Tehnica multiplicrii in vitro a explantelor s-a perfecionat n paralel cu rezultatele
cercetrilor din domeniul studiilor compoziiei i consistenei mediilor de cultur. Heller (1951)
experimenteaz creterea esuturilor pe mediu gelificat cu agar sau cu silicagel iar n 1955, Miller

-9-

i colab., izoleaz din sperma de heringi, chinetina. n 1957, Skoog i Miller avanseaz ipoteza
balanei hormonale,

a raportului dintre auxin i citochinin, care favorizeaz iniierea de

rdcini i mugurai dintr-o cultur de calus.


Skoog (1956) i Miller (1957) descoper importana chinetinei i aduc elemente noi privind
efectul acestui hormon, precum i aciunea raportului ntre chinetin i auxin asupra proceselor de
organogenez la explantele cultivate in vitro, deoarece manipularea acestei balane influeneaz
reuita direcionrii proceselor de difereniere morfologic la esuturile cultivate prin aceast
metod.
Astfel, sporirea cantitii de auxin determin orientarea proceselor de morfogenez spre
rizogenez n timp ce creterea proporiei de chinetin induce formarea de mugurai i lstrai, iar
la concentraii ridicate fiecare hormon administrat separat determin generare de calus i inhibarea
proceselor de organogenez.
Experienele lui Muir (1953) reprezint o premier n sensul c obine suspensii subcelulare
cu celule de Tagetes erecta i Nicotiana tabacum iar Nickell cu celule de Phaseolus vulgaris. n
1954 Muir i colab. izoleaz ca explant o celul care apoi a fost crescut pe punte de hrtie de filtru.
n 1954, Muir i colab. reuesc izolarea unei unice celule dintr-o suspensie de celule sau din
calus i obin prin diviziuni repetate un conglomerat de celule de tip calus. Doi ani mai trziu,
Nicckel (1956) descrie modul de cretere n cultur continu a unor suspensii celulare de fasole.
n deceniile cinci i ase ale secolului XX nregistrm rezultatele unor cercettori n
domeniu printre care amintim:
n 1944, Skoog iniiaz experimente pentru studierea proceselor de organogenez pe calus
de tutun, studiu care reprezint un progres n domeniul controlului evoluiei inoculilor vegetali in
vitro i un salt calitativ pentru dezvoltarea culturilor de esuturi i celule de plante. Studiile de
organogenez efectuate de Skoog n1944 pe calus de tutun reprezint un progres important n
domeniul controlrii evoluiei inoculilor vegetali in vitro.
Caplin i Steward, 1948 i Steward i Caplin, 1951, 1952, realizeaz un pas n dezvoltarea
culturii in vitro la cormofite prin adugarea n mediile de cultur a laptelui din nuc de cocos i a
auxinei de sintez 2,4 diclorfenoxiacetic cu rol stimulator asupra creterii esuturilor de morcov i
de cartof. Aceste experiene relev faptul c unii fitohormoni sau substane fitoefectoare pot aciona
sinergic.
Torrey (1957) realizeaz o cultur de celule vegetale n pictur suspendat, Jones i colab.
(1960) obin o microcultur pe o lam de microscopie. Steward i Shantz (1956) i Reinert (1956)
studiaz creterea unei suspensii celulare de Picea glauca.

- 10 -

Reinert (1958) i Steward mpreun cu colaboratorii (1958) studiaz problema


embriogenezei ntr-o suspensie provenit din rdcini de morcov. Experiena inoculrii unei celule
i formarea unei suspensii celulare se datoreaz lui Jones i colab. (1960), iar obinerea de clone
dintr-o celul unic revine lui Hildebrandt (1958).
Skoog (1944) i Skoog i Tsui (citai de Gautheret, 1959) demonstreaz pe explante
tisulare constnd din mduv de tutun o sporire a creterii masei de calus i formarea de mugurai
n condiiile aplicrii de adenin i ridicrii coninutului de fosfat n mediile de cultur.
n anul 1959 se realizeaz dintr-o singur celul o plantul (Braun). Aceast performan
repetat i prin experienele lui Vasil i Hildebrandt (1965), Chandra i Hildebrandt (1967),
confirm valabilitatea ipotezei emis la nceputul secolului de Hildebrandt, aceea a totipotenialitii
celulei vegetale i anume c dintr-o celul somatic, diploid poate fi regenerat o plantul ce i
poate continua i ncheia ciclul biologic complet la trecerea ei n cadrul natural de via.
Progresele cele mai importante n domeniul cultivrii explantelor vegetale pe medii aseptice
s-au nregistrat dup anul 1960, astfel:
Bergman, 1960, relizeaz experimentul de obinere a unei culturi de celule cu circa 90%
celule libere individualizate prin metoda de filtrare a populaiei de celule. ncorporarea celulelor
ntr-o plac de mediu de cultur agarizat a condus la fenomenul c fiecare celul izolat a generat
cte o colonie de celule vizibil cu ochiul liber iar dup separare s-au realizat clone pornind de la o
celul unic.
n anul 1960, Cocking izoleaz pe cale enzimatic protoplati din rdcini, vrful acestora
sub influena unei enzime de origine fungic celulaza duc la formarea dup un timp a unei noi
membrane celulare.
Kohlenbach (1966) izoleaz mecanic celule din mezofil foliar separate din frunzele de
Macleaya cordata pe care reuete s le cultive in vitro.
Nagata i Takebe n anul 1970 demonstreaz c proptoplatii izolai din mezofil de frunze
de tutun formeaz n timp mici colonii celulare. Ulterior, Takebe i colab. cultiv protoplati de
tutun dup metoda descris de Bergman (1960) reuind obinerea de calus din culturi de celule
generate din protoplati, prin care se regenereaz plantulele. Randamentul acestor metode la diferite
specii continu s creasc.
S-a nscut astfel ideea realizrii tehnicilor de fuziune a protoplatilor pentru obinerea de
hibrizi somatici ntre speciile la care hibridarea sexuat nu este posibil.
n 1972, Carlson i colab. obin primul hibrid somatic produs prin fuziune de protoplati de
la Nicotiana glauca x Nicotiana langsdorffii.

- 11 -

Paralel cu descoperirile teoretice n domeniul cercetrilor genetice, care fundamenteaz i


pun bazele multiplicrii in vitro se nregistreaz progrese importante n domeniul cercetrilor
aplicative, acela de cultivare a explantelor pe medii aseptice.
Printre cei care au contribuit la dezvoltarea sistemului special de cultivare in vitro a
celulelor amintim pe Steward, Mages i Smith (1958), Tulecke i Nickell (1959, 1960). Ulterior,
Byrne i Koch (1962) construiesc instalaii de mare capacitate pentru culturile de celule.
O realizare deosebit const n punerea la punct a multiplicrii exemplarelor vegetale n ritm
accelerat , lucru greu de imaginat ca fiind realizabil cu trei decenii n urm.
Multiplicarea prin subculturi succesive in vitro realizat de Murashige, 1977 i 1978 dintrun singur meristem de orhidee, care a fcut posibil obinerea a 4 milioane de exemplare, copii
fidele ale plantei donatoare, a demonstrat i eficiena economic a metodei prin care se face
economie de material biologic. Acest fapt a determinat pe practicieni s asimileze procedeele
elaborate n laboratoarele de cercetare i s standardizeze metodele pe profil industrial, crend
adevrate industrii horticole i silvice pentru obinerea prin aceast metod a materialului vegetal
pentru plantat. Clonarea in vitro n ritm intensiv a exemplarelor valoroase a uurat munca
amelioratorilor.

Test de autoevaluare
1. Avnd n vedere cele nvate n acest subcapitol i innd cont de
spaiul avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la
urmtoarele ntrebri:

a) Ce rol joac plantele n existena uman?


b) Ce proces st la baza tehnicii nmulirii in vitro?
c) Cine a pus bazele cultivrii culturilor in vitro a explantelor vegetale,
celule, esuturi i organe i n ce an?
d) n ce an i de ctre cine a fost confirmat teoria totipotenei celulare?
e) Comentai confirmarea importanei economice a micropropagrii.
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de
nvare.

- 12 -

Dup parcurgerea acestui subcapitol trebuie s reinei:

Plantele sunt organismele care transform energia solar n


energie chimic i constituie aurul verde ai Terrei.

Principiul de baz al tehnicii nmulirii plantelor in vitro este


acela al totipotenei celulare, elaborat de Haberland n 1902.

Descoperirea primului fitohormon (IBA) a deschis o nou

etap n succesul culturilor in vitro.

ncepnd cu 1960, a fost demonstrat eficiena economic a


multiplicrii in vitro, uurnd procesele de nmulire i
ameliorare a plantelor.

1.3. Avantajele i dezavantajele multiplicrii in vitro.


Avantajele multiplicrii in vitro, superioar metodelor de nmulire vegetativ clasic,
constau n rapiditatea (scurtarea timpului), obinerea de plante juvenilizate, lipsa bolilor i vigoare
mai mare.
Metoda evit variabilitatea genetic i permite obinerea de material nevirozat n final
conducnd la creterea calitii materialului vegetal.
Este permis prin aceast metod i multiplicarea speciilor care nu au semine viabile sau
care nu se pot nmuli natural pe cale vegetativ.
Culturile de explante vegetale in vitro reprezint modele, instrumente valoroase n
cercetarea modern n domeniul biologiei vegetale. Ele prezint urmtoarele avantaje:
Permit studierea aciunii fitohormonilor, a implicrii permeabilitii, absorbiei,
fotosintezei, respiraiei, metabolismului, n morfogenez, genetic i biochimie.
Sunt domenii de abordare multidisciplinar.
Pun la dispoziie mijloacele stpnirii i dirijrii creterii.
Permit ntr-o perioad scurt de timp crearea de plante adaptate la condiii vitrege de
via (rezistente la aciunea duntoare a unor ageni stresani), plante create n decurs de
cteva luni prin comprimarea evoluiei filogenetice (Gill, 1980).
Din punct de vedere istoric dezvoltarea i evoluia cunotinelor n domeniul tehnicilor de cultivare
in vitro a celulelor i esuturilor vegetale cunoate 5 etape distincte:

- 13 -

1. ntre anii 1939 1902 perioad cnd s-a lansat teoria unitii structurale fundamentale a
lumii vii (Schleiden i Schwann, 1939) celula a fost acceptat ca unitate structural de
baz a organismelor vii, fiind apoi emis postulatul conceptului de totipotenialitate
(omnipotenialitate) celular a lui Haberlandt, 1902.
2. n perioada 1902 1920, o perioad de stagnare a cercetrilor n domeniu, deoarece
primele experimente cu culturile de explante nu au condus la rezultate favorabile.
3. Etapa anilor 1920 1939 nregistreaz primele succese n domeniul creterii in vitro a
embrionilor, a rdcinilor, a obinerii de calus, esuturi care cultivate apoi pe medii
aseptice i subcultivate periodic prin repicri au condus la obinerea de material vegetal
(White, Gautheret i Nobecourt ).
4. A patra etap ntre 1939 1966 este caracterizat prin studiile efectuate de numeroi
cercettori privind comportamentul diferitelor explante cultivate pe diferite medii de
cultur, pentru cunoaterea factorilor implicai n procesele de nmulire i difereniere a
celulelor, gradul lor de autonomie funcie de substrat, condiiile de cultur, proveniena
i natura explantului.
n aceast direcie, n 1953 s-a reuit cultivarea meristemelor caulinare, aplicale (Morel
i Martin) i obinerea de plante libere de viroze folosind ca plant donatoare o plant
polivirusat, ocazie cu care s-a emis teoria (Skoog i Miller-1957), referitoare la
controlul hormonal al organogenezei (rolul balanei auxin/citochinin), obinerea de
embrioni somatici, (Steward i Reinert, 1958, 1959), primele culturi de celule (Muir,
Torrey i Jones i colab., 1954 1960), izolarea enzimatic de protoplati (1960) i
obinerea primului hibrid somatic (Carlson, 1972).
5. Perioada ncepnd din 1966 i pn n zilele noastre delimiteaz etapa modern a
culturii de celule i esuturi vegetale, caracterizat prin extinderea larg a utilizrii
explantelor pentru multiplicare. n aceast perioad, cercetrile fundamentale n biologie
cunosc o acumulare de cunotine n domeniile citologiei, citofiziologiei, biologiei
moleculare, geneticii i ameliorrii la nivel ultrastructural i molecular precum i n
biochimie, fiziologie etc.
Paralel cu cercetrile biologice fundamentale apar o serie de subramuri de biotehnologii
vegetale cum ar fi citofitotehnologiile:
nmulirea i clonarea cultivarilor valoroi;
micropropagarea i generarea de material vegetal sntos;

- 14 -

elaborarea de tehnologii de modificare a genomului unor specii cormofite;


exploatarea capacitii de biosintez a celulelor izolate n condiii de cultur
intensiv;
obinerea de embrioni somatici, producerea de semine artificiale;
clonarea rapid a unor soiuri rezultate din lucrrile de ameliorare.

Test de autoevaluare
2. Avnd n vedere cele nvate n acest subcapitol i innd cont de spaiul
avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la urmtoarele
ntrebri:
a) Comentai avantajele multiplicrii in vitro.
b) Menionai cele cinci etape distincte din evoluia micropropagrii.
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de nvare.

Dup parcurgerea acestui subcapitol trebuie s reinei:

Avantajele multiplicrii in vitro constau n scurtarea timpului


pentru obinerea unor plante sntoase, viguroase, lipsite de
virusuri i a unor specii fr semine viabile care nu se pot nmuli
natural pe care vegetativ.

Din 1966 i pn n prezent este delimitat etapa modern a culturii


de celule i esuturi in vitro, cu implicaii economice majore.

- 15 -

1.4 Cercetarea n domeniul culturii de esuturi in vitro n ara noastr.


n ara noastr, din anul 1975 au fost abordate cercetri sistematice privind problemele
nmulirii plantelor in vitro fiind amenajate laboratoare de culturi de esuturi la Institutul de
Cercetri Biologice din Bucureti, Institutul de Cercetri Silvice din Bucureti, n unitile de
cercetare agricol i horticol de la Fundulea, Vidra, Mrcineni, tefneti, n unitile de
nvmnt superior agricol din Cluj-Napoca, Bucureti, Iai, Facultatea de Biologie din Bucureti,
Facultatea de Farmacie din Bucureti i n uniti de producie cum ar fi ntreprinderea de Sere
Codlea (1988).
Ulterior au luat fiin numeroase nuclee de cercetare n domeniul culturilor de explante in
vitro, colective care s-au dezvoltat i laboratoare care s-au dotat pentru a contribui la lrgirea
cercetrilor i cunotinelor n acest domeniu.
n anul 1984 menionm apariia primei monografii cu acest profil intitulat Culturi de
celule i esuturi vegetale aplicaii n agricultur Ed.Ceres, autori Cachi C.D., Raicu P. Badea
M.E.
n anul 1999 la Iai, la Institutul Agronomic Ion Ionescu de la Brad apare tot n acest
domeniu lucrarea Biotehnologiile viitorului autor Constantin Milic.
n anul 2000 apare la Sibiu lucrarea Biotehnologie vegetal vol.I Bazele teoretice i
practice autori Dorina Cachi-Cosma i Camelia Sand.
n nvmntul superior agricol, primele cursuri n domeniul culturilor de celule i esuturi
vegetale au luat fiin la Institutul Agronomic N.Blcescu din Bucureti sub form de cursuri
postuniversitare, ntre anii 1985 1988, fiind editat i un volum intitulat Curs practic de culturi de
esuturi in vitro, cu aplicaii n legumicultur i floricultur autori Cachi C.D. i Petrescu
C.(1985). Din anul 1987 acest curs s-a introdus sub form opional la seciile de biologie i la
facultile de horticultur din ar.
Tehnicile culturilor cu explante in vitro au cptat n ultimile decenii ca urmare a
progreselor teoretice i practice din domeniu, o ampl dezvoltare i extindere n ara noastr
aprnd o serie de bioindustrii profilate pe creterea in vitro a diferitelor explante, care impunea
pregtirea n acest domeniu a unor specialiti biotehnologi. Ca urmare este nfiinat n anul 1995
la Bucureti n cadrul Universitii de tiine Agricole i Medicin Veterinar, Facultatea de
Biotehnologie cu ramuri ale biotehnologiei vegetale ce se constitue n discipline fundamentale
independente.
Micarea mondial din domeniul culturilor de explante este foarte activ.

- 16 -

n anul 1972 a luat fiin International Association for Plant Tissue Culture la care
Romnia a aderat n anul 1975. Din patru n patru ani au loc Congrese Mondiale organizate de
aceast asociaie.
La noi n ar se nfiineaz Asociaia Romn de Culturi de esuturi i Celule Vegetale.
Prima manifestare tiinific din ara noastr cu tematica culturilor de celule i esuturi
vegetale a fost oraganizat la Cluj Napoca n anul 1981 de Institutul de Cercetri de Biologie.
n 1989 tot la Institutul de Cercetri Biologice din Cluj Napoca s-a organizat al IV-lea
Simpozion Naional de Culturi de Explante.
n noiembrie 2000 se organizeaz la Universitatea Babe Bolyai Facultatea de Biologie
din Cluj Napoca al X-lea Simpozion de Culturi de esuturi i Celule Vegetale care marcheaz 25 de
ani de la iniierea primelor cercetri n domeniul culturilor de celule i esuturi n Romnia.
Test de autoevaluare
3. Avnd n vedere cele nvate n acest subcapitol i innd cont de spaiul
avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la urmtoarele

ntrebri:
a) Comentai istoricul culturilor in vitro n ara noastr.
b) Care sunt motivele dezvoltrii i extinderii n ara noastr a bio industriilor
profilate pe nmulirea in vitro.
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de nvare.

Dup parcurgerea acestui subcapitol trebuie s reinei:

C n Romnia, dup anul 1975, a nceput amenajarea laboratoarelor de


culturi de esuturi precum i cercetarea sistematic n domeniu.

n domeniul nvmntului superior agricol, primele cursuri de culturi


in vitro au fost inute la Institutul Agronomic Nicoale Blcescu din
Bucureti, ncepnd cu anul 1985.

- 17 -

1.5 Comentarii i rspunsuri la teste

ntrebarea 1
a) Plantele sunt organismele care prin procesul de fotosintez
realizeaz cel mai spectaculos proces din lumea vie, acela de
transformare a energiei solare n energie chimic. Ele joac un rol
hotrtor pentru existena uman, constituind aurul verde, bogia
de nenlocuit a Terrei, fiind surs de hran i energie pentru om i
animale. Dac la acest rol se adaug i rolul de purificator al
atmosferei prin absorbia bioxidului de carbon i eliberarea
oxigenului i rolul de materii prime pentru unele industrii
(alimentar, textil, farmaceutic), gsim justificat interesul omului
pentru perfecionarea continu a procedeelor de nmulire i
cultivare a plantelor.
b) S-a consolidat concepia c celula vegetal conine n nucleul su

totalitatea informaiei genetice necesar dezvoltrii unui organism


complet. Ea se supune principiului clasic al totipotenei celulare.
Regenerarea de plante pornind de la o singur celul haploid sau
diploid a stat i st la baza tehnicii nmulirii plantelor in vitro.
c) Putem considera c, prin cercetrile lor, White (1938), Gautheret
i Nobecourt au pus bazele cultivrii in vitro a explantelor vegetale:
organe, esuturi i celule. Totodat, ei i-au adus contribuia i n
domeniul alctuirii mediilor de cultur privind compoziia,
concentraia n macro i microelemente eseniale pentru nutriia
explantelor, prezena unei surse de C i N organic, a unor vitamine
i auxine.
d) n anul 1959 se realizeaz dintr-o singur celul o plantul
(Braun). Aceast performan repetat i prin experienele lui Vasil
i Hildebrandt (1965), Chandra i Hildebrandt (1967), confirm
valabilitatea ipotezei emis la nceputul secolului de Hildebrandt,
aceea a totipotenialitii celulei vegetale i anume, c dintr-o celul
somatic, diploid poate fi regenerat o plantul ce i poate

- 18 -

continua i ncheia ciclul biologic complet la trecerea ei n cadrul


natural de via.
e) Multiplicarea prin subculturi succesive in vitro realizat de

Murashige, 1977 i 1978 dintr-un singur meristem de orhidee, care


a fcut posibil obinerea a 4 milioane de exemplare, copii fidele
ale plantei donatoare, a demonstrat i eficiena economic a
metodei prin care se face economie de material biologic. Acest fapt

a determinat pe practicieni s asimileze procedeele elaborate n


laboratoarele de cercetare i s standardizeze metodele pe profil
industrial, crend adevrate industrii horticole i silvice pentru
obinerea prin aceast metod a materialului vegetal pentru plantat.
Clonarea in vitro n ritm intensiv a exemplarelor valoroase a uurat
munca amelioratorilor.
ntrebarea 2
a. Avantajele multiplicrii in vitro constau n rapiditatea (scurtarea
timpului) obinerii de plante juvenilizate, lipsa bolilor i vigoare
mai mare. Metoda evit variabilitatea genetic i permite obinerea
de material nevirozat n final conducnd la creterea calitii
materialului vegetal. Ea permite i multiplicarea speciilor care nu
au semine viabile sau care nu se pot nmuli natural pe cale
vegetativ.

Dintre

fitohormonilor,

avantaje:
implicrii

permite

studierea

permeabilitii,

aciunii
absorbiei,

fotosintezei, respiraiei, metabolismului, n morfogenez, genetic


i biochimie; pune la dispoziie mijloacele stpnirii i dirijrii
creterii; permite ntr-o perioad scurt de timp crearea de plante
adaptate la

condiii vitrege de via (rezistente la aciunea

duntoare a unor ageni stresani), plante create n decurs de


cteva luni prin comprimarea evoluiei filogenetice (Gill, 1980).
ntre anii 1939 1902 perioad cnd s-a lansat teoria unitii

structurale fundamentale a lumii vii (Schleiden i Schwann,


1939) celula a fost acceptat ca unitate
organismelor vii, fiind apoi emis

structural de baz a

postulatul

conceptului

de

totipotenialitate (omnipotenialitate) celular a lui Haberlandt,


1902. n perioada 1902 1920, o perioad de stagnare

- 19 -

a cercetrilor n domeniu, deoarece primele experimente cu


culturile de explante nu au condus la rezultate favorabile. Etapa
anilor 1920 1939 nregistreaz primele succese n domeniul
creterii in vitro a embrionilor, a rdcinilor, a obinerii de calus,
esuturi care cultivate apoi pe medii aseptice i subcultivate
periodic prin repicri au condus la obinerea de material vegetal
(White, Gautheret i Nobecourt). A patra etap ntre 1939
1966 este caracterizat prin studiile efectuate de numeroi
cercettori privind comportamentul diferitelor explante cultivate
pe diferite medii de cultur, pentru cunoaterea i a factorilor
implicai n procesele de nmulire i difereniere a celulelor,
gradul lor de autonomie funcie de substrat, condiiile de cultur,
proveniena i natura explantului. n aceast direcie, n 1953 s-a
reuit cultivarea meristemelor caulinare, apicale (Morel

Martin), obinerea de embrioni somatici, Steward i Reinert,


1958, 1959), primele culturi de celule (Muir, Torrey i Jones
colab., 1954 1960), izolarea enzimatic de protoplati (1960)
i obinerea primului hibrid somatic (Carlson, 1972). Perioada
ncepnd din 1966 i pn n zilele noastre delimiteaz etapa
modern a culturii de celule i esuturi vegetale, caracterizat
prin extinderea larg a utilizrii explantelor pentru multiplicare.
n aceast perioad, cercetrile fundamentale n biologie cunosc
o

acumulare

de

cunotine

domeniile

citologiei,

citofiziologiei, biologiei moleculare, geneticii i ameliorrii la


nivel ultrastructural i molecular precum i n biochimie,
fiziologie etc.
ntrebarea 3
a. n ara noastr, din anul 1975 au fost abordate cercetri
sistematice privind problemele nmulirii plantelor in vitro fiind

amenajate laboratoare de culturi de esuturi la Institutul de


Cercetri Biologice din Bucureti, Institutul de Cercetri Silvice
din Bucureti, n unitile de cercetare agricol i horticol de la
Fundulea, Vidra, Mrcineni, tefneti, n unitile de

- 20 -

nvmnt superior agricol din Cluj-Napoca, Bucureti, Iai,


Facultatea de Biologie din Bucureti, Facultatea de Farmacie din
Bucureti i n uniti de producie cum ar fi ntreprinderea de Sere
Codlea (1988).
b. Tehnicile culturilor cu explante in vitro au cptat n ultimile
decenii o ampl dezvoltare i extindere n ara noastr, ca urmare a
progreselor teoretice i practice din domeniu, aprnd o serie de
bioindustrii profilate pe creterea in vitro a diferitelor explante, care
impunea i pregtirea n acest domeniu a unor specialiti biotehnologi.

- 21 -

1.6 Lucrare de verificare nr. 1


INSTRUCIUNI
Lucrarea de verificare solicitat implic activiti care necesit cunoaterea
Unitii de nvare nr. 1.
Rspunsurile la ntrebri vor fi transmise tutorelui pentru comentarii,
corectare i evaluare. Pe prima pagin a lucrrii se vor scrie urmtoarele:
Titulatura

acestui

curs

(MICRONMULIREA

PLANTELOR

HORTICOLE), numrul lucrrii de verificare, numele i prenumele


studentei (studentului). Fiecare rspuns va trebui s fie clar exprimat i s
nu

depeasc o jumtate de pagin. Punctajul aferent este menionat

pentru fiecare ntrebare.


ntrebrile la care trebuie s rspundei sunt urmtoarele:
1. Ce rol joac plantele n existena uman? 1 p
2. Ce proces st la baza tehnicii nmulirii in vitro? 1 p
3. Cine a pus bazele cultivrii culturilor in vitro a explantelor vegetale,
celule, esuturi i organe i n ce an? 1p
4. n ce an i de ctre cine a fost confirmat teoria totipotenei celulare? 1
p
5. Comentai confirmarea importanei economice a micropropagrii.-1p
6. Comentai

avantajele multiplicrii in vitro. - 1p

7. Menionai cele cinci etape distincte din evoluia micropropagrii.- 1p


8. Comentai istoricul culturilor in vitro n ara noastr.- 1p
9. Care sunt motivele dezvoltrii i extinderii n ara noastr a bio
industriilor profilate pe nmulirea in vitro. -1p
*Un punct se acorda din oficiu.

1.7 Bibliografie minimal


1. Cachia Cosma Dorina, Petrescu Corneliu, Curs de biotehnologii, Academia Universitar
Atheneum, Bucureti, 1993
2. D. Hoza, 1997, Biotehnologie pomicol.
3. Rou, 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaii n amelioare, Ed. Ametist.
4. F. Stnic, 1999, Micronmulirea plantelor horticole i alte tehnici de cultur in vitro,
Editura Grand;

- 22 -

UNITATEA DE NVARE NR. 2:


BAZELE TEORETICE ALE MICROPROPAGRII IN VITRO

CUPRINS
2.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 2

23

2.2 Biologia dezvoltrii plantelor (cormofite) n cazul culturilor de celule i esuturi in vitro

24

2.3 Comentarii i rspunsuri la teste

33

2.4 Lucrare de verificare nr. 2

36

2.5 Bibliografie minimal

36

2.1 Obiectivele Unitii de nvare nr. 2


Prin studierea acestei uniti de nvare vei fi n msur s:

Cunoti particularitile i specificul biologic al celulelor din

perspectiva micropropagrii.

Defineti categoriile de celule implicate n micropropagare,


meristemele.

nelegi diferenierea celular. Principalele procese care au la


baz diferenierea celular.

- 23 -

2.2. Biologia dezvoltrii plantelor (cormofite) n cazul culturilor de celule i esuturi in


vitro
Creterea plantelor reprezint un proces complex morfologic, fiziologic i biochimic prin
care are loc sporirea numrului de celule prin acumularea de mas vegetativ, cnd au loc
modificri cantitative ireversibile iar n final plantele ating dimensiunile caracteristice fiecrei
specii.
Paralel cu procesul de cretere cantitativ, are loc i procesul de dezvoltare, de evoluie
individual a plantelor care parcurg o serie de etape calitative ce ncep cu germinarea i se ncheie
cu nflorirea i fructificarea. Dezvoltarea parcurs conduce la realizarea ciclului ontogenetic care
cuprinde modificri morfologice, anatomice i fiziologice ce se produc ntr-o succesiune riguroas
determinat de factorii ereditari care la rndul lor sunt influenai de factorii de mediu.
Cunoaterea aspectelor legate de biologia dezvoltrii plantelor superioare este deosebit de
important pentru nelegerea proceselor ce au loc n tehnica multiplicrii in vitro.
Procesele biologice ce au loc n timpul nmulirii, creterii i dezvoltrii plantelor parcurg
etape de acumulri prin sintez a unor compui endocelulari, compui care joac dou roluri i
anume: rol plastic (de constituie n cazul proteinelor i celulozelor) dar i rol de material genetic
(cazul ADN i ARN).
Meristemele sunt esuturi care ndeplinesc funcia de multiplicare celular, ele se divid
continuu pe tot parcursul vieii. Ele sunt celule tinere pe tot parcursul procesului de multiplicare.
La plantele adulte construirea arhitecturii corpului lor se realizeaz prin cteva tipuri de
meristeme categorisite dup criterii ca: localizare, caracteristici i origine, fiecare cu anumite
semnificaii din punct de vedere ontogenetic i anume:
meristeme histogene care genereaz esuturi;
meristeme organogene care genereaz organe i anume:

radiculare apicale; caulinare apicale; foliare

meristeme embriogene care dau natere la embrioni


La plantele superioare, organogeneza este indefinit, dar att timp ct planta sau pri din
aceasta sunt vii, procesul de multiplicare celular i formarea de masive histogene din meristeme
este continuu. ( meritos = divizibil n l. grec).
La cormofite, dup formarea oului sau zigotului, prima diviziune nseamn o polarizare care
va da natere la embrionul bipolar, una din celulele meristematice genereaz polul caulinar iar cea
de a doua polul radicular. Acest fenomen este valabil i n cazul formrii embrionilor somatici care
au origine n cte o celul somatic.

- 24 -

Dup germinaie din embrioni (zigotici sau somatici) se formeaz plantule la care n zona
hipocotil i n cotiledoane activitatea meristematic intr n declin i n continuare pe msur ce
plantula crete se transform n plante la care esuturile meristematice (embrionare sau formatoare)
se gsesc n vrfurile extreme ale rdcinilor i tulpinilor principale (care constituie axa plantei) sau
secundare.
Dup localizarea meristemelor ele pot fi:
meristeme embrionare (localizate n embrion);
meristeme apicale (localizate n vrfurile de cretere tulpini sau rdcini);
meristeme intercalare ce pot fi:
discontinui (deasupra nodurilor unor tulpini);
continui laterale: cambiu (strat libero-lemnos) i felogen (strat
generator subero-felodermic).
Dup caracterul celulelor meristematice:
meristeme primordiale (promeristeme) din care fac parte celulele embrionilor i
cele mai tinere masive meristematice care formeaz vrfurile vegetative sau
domurile meristematice.
meristeme primare (semimeristeme) derivate din meristemele primordiale.
Dup originea celulelor meristematice clasificare funcie de evoluia teoriilor emise de unii
cercettori:
-

dup Hanstein (1868 1870) meristemul radicular ar fi:

dermatogen (genereaz rizoderm);


periblem (genereaz scoar);
plerom (formeaz cilindrul central.
-

dup Haberland (1900) meristemele sunt:

protoderm (din care apar esuturile protectoare rizoderma i epiderma);


procambiu (din care se formeaz esuturile conductoare i cele mecanice);
meristem fundamental (din care apar parenchimurile corticale i medulare.
-

dup Schmidt (1924) meristemul apical al tulpinilor este format din:

tunica (ptura extern de celule care formeaz esutul protector i o parte din
scoar);
corpusul (ptura care genereaz celule ce dau natere la o parte din scoar,
cilindrul central i mduv).

- 25 -

dup Plantefol (1947 1948) care a emis teoria inelului iniial, meristemul
apical al tulpinii este constituit din:

meristem de ateptare care corespunde zonei apicale axiale i joac rol n


formarea primordiilor florale i a inflorescenelor;
inelul iniial (zona periferic) care are forma unui inel central nconjurat de
celule care periodic vor genera frunzele i scoara tulpinii;
meristemul medular ce ocup poziia central i este aezat sub meristemul de
ateptare, celulele derivate din acest meristem vor da natere parenchimului
medular.
n ara noastr, Jitaru i Toma (1980) prezint o sintez a clasificrii acestor categorii de
meristeme pe care o prezentm mai jos.
-

esuturi meristematice primordiale promeristeme care pot fi: fr celule, cu


o celul iniial, cu mai multe celule iniiale

esuturi meristematice primare semimeristeme care pot fi: apicale,


intercalare, laterale

esuturi meristematice secundare care pot fi: cambiul , felogenul

esuturi meristematice meristemoide (meristemoizi) care pot fi grupate la


nivelul esutului protector i au zone lipsite de celule cu activitate meristematic
numite cmpuri de inhibiie sau zone de blocaj.

La nivelul explantelor cultivate in vitro, grupuri cu celule cu caracter meristematic pot


proveni din celule cu caracter embrionar, preexistente n explante ce pot deveni primordii
radiculare, caulinare sau foliare. Aceste centre meristematice pot evolua anormal n meristeme
radiculare sau caulinare sau prin regresie n calus. Aceti meristemoizi prezeni la nivelul
explantelor, n cazul tehnicii in vitro pot avea efect benefic n procesele regenerative i de
morfogenez.
n cazul multiplicrii in vitro are loc neogeneza de zone sau centre meristematice din celule
dedifereniate care sunt considerate meristeme speciale ntruct acestea nu exist n structurile
organelor ci generarea lor este determinat de excizare, de condiiile speciale de cultur, i de
prezena regulatorilor de cretere n substratul de cultur.
Autonomia explantelor sau celulelor meristematice n condiiile cultivrii in vitro,
imposibilitatea dirijrii proceselor de morfogenez ntr-o anumit direcie dorit sunt dificile
ntruct natura esuturilor i celulelor din structura explantelor poate exercita influene de durat pe

- 26 -

parcursul mai multor subculturi, explantul fiind independent de planta mam, dar are totui
informaia genetic motenit de la aceasta.
Diferenierea celular
Celulele tinere difereniate dup divizarea continu sufer transformri structurale i o
specializare morfologic i fiziologic cptnd caracteristici noi, proprii celulelor adulte mari.
Progresiv, modificrile secundare ce survin ngreuneaz schimburile dintre aceste celule cu cele
nvecinate cu toate c majoritatea celulelor difereniate din corpul plantelor rmn vii, cu o intens
activitate metabolic dar i pierd capacitatea de a se divide.
Integritatea sistemului, continuitatea celulelor unui esut, comunicarea dintre celulele i
esuturile unor organe din organismul viu se menin datorit unor substane elaborate de ctre
celule, substane care pot migra la distane mari i pot asigura relaia organismului unitar cu
perceperea factorilor de mediu.
Controlul asupra diferenierii i funcionrii altor celule de ctre un grup de celule poart
denumirea de proces de inducie. Celulele asemntoare ca structur i funciune care determin n
esutul respectiv specificitatea fiziologic, faciliteaz prin interrelaiile dintre esuturi buna
funcionare a organelor i activitatea ntregii plante.
Procesul de dedifereniere este invers procesului de difereniere celular. El rar se petrece
natural, spontan. Dediferenierea este provocat de aciunea unor ocuri externe asupra celulelor
difereniate deci dediferenierea se produce ca reacie la aciunea traumatic exogen.
n cazul multiplicrii in vitro n condiiile detarii explantelor dediferenierea se produce n
sens regenerativ datorit aciunii fitohormonilor. Prin dedifereniere celulele se transform n celule
meristematice apte a se divide.
Capacitatea celulelor de a se dediferenia este inegal rspndit n corpul plantei i depinde
de ct de avansat este procesul de difereniere n morfostructura celular.
n condiiile cultivrii explantelor in vitro capacitatea regenerativ a celulelor este exploatat
la maximum. Sigur c aptitudinile regenerative ale inoculilor depind de proveniena explantului,
condiiile de cultur i de manifestarea integral a ntregii informaii genetice existent n genomul
inoculului. Succesul operaiei de regenerare de plante din diferite tipuri de explante depinde de
reuita metodelor de transformare a celulelor nemeristematice n celule meristematice obinute prin
dedifereniere.
n condiiile de cultur in vitro dediferenierea i revenirea celulelor la starea de celul
meristematic este condiie pentru instalarea i progresarea proceselor regenerative i realizarea
neoformrii unui nou organism vegetal.

- 27 -

Fazele dediferenierii sunt pe scurt urmtoarele:


1. Prima faz caracterizat prin:
amorsarea proceselor de dedifereniere
producerea dediferenierii celulelor, dobndirea caracteristicilor citologice ale
unui esut meristematic secundar cu celule aplatizate ce seamn ca aspect i
structur cu cambiul
2. A doua faz a dediferenierii const n:
dediferenierea celulelor pn la stadiu de meristem primar
generarea de promeristeme sau meristemoizi din care pot aprea centre
organogene sau embriogene
3. A treia faz de dedifereniere se caracterizeaz prin:
formarea din celulele dedifereniate a calusului neorganizat, omogen structural la
nivelul cruia se pot forma meristemoizi sau centri embriogeni
Putem considera c dediferenierea celulelor detaate de planta mam sau de unele organe,
anuleaz interdependena explantelor de organismul donor, celulele eliberate de aceast stare pot
s-i exprime n aceste condiii totipotena deinut n genom.
Deci, in vitro celulele se pot dediferenia mai rapid i mai uor ele fiind scoase de sub
interrelaiile i incidena factorilor endogeni care asigur echilibrul fiziologic al unui organism viu.
Morfogeneza: organogeneza i embriogeneza
Morfogeneza este diferenierea histologic complex a celulelor care n final duce la
formarea de organe proces numit organogenez, sau generare de embrioni proces numit
embriogenez.
Organogeneza este procesul de refacere a organelor prin activitatea meristemelor dup tipul
fitohormonilor folosii, genernd organe sau calus.
Embriogeneza este procesul n care, pornind de la zigot, celul somatic sau gamei (andro
i ginogenez) se genereaz un embrion.
Morfogeneza are la baz citodiferenierea ca exprimare a competenei celulare indus de
determinismul genetic.
n condiiile explantrii i inoculrii in vitro, capacitatea de citodifereniere a celulelor
depinde de capacitatea celulelor de a-i modifica starea lor de competen sub influena unor factori
interni i externi.

- 28 -

Dintre factorii interni amintim fitohormonii i natura esuturilor explantelor n ceea ce


privete susinerea i viteza de avansare a proceselor de morfogenez (organogenez sau
embriogenez)
Rolul mediului de cultur ce se ncadreaz n grupa factorilor externi n care amintim sursa
de energie, temperatura, lumina i regimul fotoperiodic pot exercita o influen decisiv asupra
proceselor regenerative i de morfogenez.

Organogeneza
Prin organogenez se neleg procesele de formare cretere i difereniere celular i tisular
a organelor.
n tehnica de multiplicare in vitro este vorba de apariia rdcinielor (rizogeneza), a
mugurailor i tulpinielor (caulogeneza) i a frunzulielor (filogeneza).
n rizogenez sau formarea rdcinilor, pe lng factorii endogeni n principal cel geneticun rol important l au fitohormonii, mai exact auxinele (endogene sau exogene) sau unele substane
cu aciune benefic asupra rizogenezei, substane formate n tinerele frunzulie ca rezultat al
activitii fotosintetice.
Aerarea (oxigenarea) zonei n care se produce rizogeneza, temperatura, pH-ul, rezervele
energetice endogene stimuleaz dar chiar condiioneaz rizogeneza alturi de factorul genetic (gen,
specie, soi) care au rol determinant n capacitatea rizogen a unor explante.
Caulogeneza, procesul de formare a tulpinilor, se afl deasemeni sub controlul genetic i
fitohormonal i evolueaz n funcie de condiiile de mediu i unii factori endogeni n mai mic
msur dect n cazul rizogenezei.
Caulogeneza este stimulat de un anumit raport ntre auxine i citochinine, raport care este
n favoarea citochininelor.
n cazul culturilor in vitro apariia centrilor meristematici, a mugurailor i apoi a
tulpinielor, este favorizat de prezena n mediul de cultur a chinetinei, a benziladeninei.
Polaritatea fragmentelor: este proprietatea de care trebue s se in seama atunci cnd
fragmentele vegetative se introduc n substratul rizogen sau mediul de cultur i anume apexurile
sau meristemele apicale sau axilare utilizate pentru nmulire.

Embriogeneza
Procesul de formare a embrionului sau embriogeneza a cptat o nou dimensiune dup
descoperirea embriogenezei somatice n suspensia de celule, n anul 1958 de ctre Steward i
Reinert. Embrionul ca entitate morfoanatomic distinct este un stadiu intermediar de trecere de la

- 29 -

gametofit la sporofit n ciclul biologic al unui organism, la spermatofite, n cazul embriogenezei in


vitro, neogeneza unui embrion din celule somatice poart denumirea de embriogenez
nonzigotic sau embriogeneza somatic, diferit ca origine de embriogeneza zigotic.
Zigotul, (embrion derivat din ou sau zigot) este rezultatul fecundrii gametului femel
(oosfera) de ctre gametul mascul (spermatia).
Cnd formarea embrionului se produce n lipsa fecundrii, fenomenul se numete apomixie.
n acest caz embrionul ia natere din elemente ale nucelei sau sacului embrionar sau chiar celule
ale integumentelor ovulului.
n cazul apomixiei, producerea embrionului se poate face prin:
partogenez cnd are loc la nivelul oosferei nefecundate i este: haploid
(generativ) sau diploid (somatic);
apogamie cnd geneza embrionului are loc dintr-o celul a sacului embrionar;
aposporie cnd formarea embrionului are loc dint-o celul vegetativ a nucelei
sau a integumentului;
poliembrionie formarea mai multor embrioni din acela ovul prin apogamie
ct i prin aposporie. Acest tip de embrioni se numesc embrioni adventivi iar
embriogeneza se mai numete embriogenez asexuat.
n cazul multiplicrii in vitro la nivelul explantelor, calusul celulelor n cultur n suspensii,
fenomenul de embriogenez se declaneaz printr-o serie de multiplicri celulare dintr-o celul
unic prin diviziuni succesive, se formez un embrion nezigotic asemntor cu embrionul zigotic
din punct de vedere al mrimii, structurii i comportamentului specific fiecrei specii, embrion
denumit embrion somatic fenomenul cptnd denumirea de embriogenez somatic.
Manifestarea totipotenialitii celulei vegetale n acest caz, al embriogenezei somatice, are
loc prin:
androgenez (neoformarea unui embrion, apoi a unei plante haploide dintr-un
microspor sau gruncior de polen); i
ginogenez (neoformarea unui embrion din oosfera nefecundat, embrion care
este haploid i va da natere unei plante haploide).
n inducerea genezei de embrioni din celule somatice n tehnica de multiplicare in vitro
laptele din nuc de cocos introdus n mediul de cultur, care este bogat n citochinine joac un rol
pozitiv hotrtor.
Ca i n cazul organogenezei, i n embriogeneza somatic exist embriogenez somatic
direct cnd embrionii somatici iau natere din celulele explantelor care s-au folosit la iniierea

- 30 -

culturii i embriogenez somatic indirect cnd embrionii se formeaz din celule de calus ori din
suspensii celulare care provin din calus sau protoplati.
Embriogeneza somatic are avantajul c embrionul zigotic, somatic diploid sau haploid
deine ntr-un tot echilibrat structurat morfofuncional att rdcinia, tulpinia ct i muguraul care
asigur viitoarei plante un excelent debut n via, odat cu germinaia.
Prin embriogenez somatic, ntr-un timp scurt i cu mare vitez, se pot obine un numr
mare de copii ale unui organism vegetal elit.
Plantele rezultate din embrioni somatici, identice din punct de vedere genetic cu donatorul
de explante, sunt libere de ageni patogeni, au cretere uniform, sunt robuste, au o mare
productivitate iar produsele lor sunt superioare din punct de vedere calitativ.
Embrionii somatici pot fi stocai pe o perioad lung de timp ca material biologic n bnci
de gene. Din embrionii somatici, prin multiplicarea in vitro, se pot obine produi secundari de
metabolism ce pot constitui surs de extracte cu efecte fitofarmaceutice.
Pe calea embriogenezei somatice, studiile de mutagenez pot permite selecia rapid de noi
mutani de la care se pot obine noi soiuri valoroase ce pot fi multiplicate uor i introduse n
cultur.
Embriogeneza in vitro permite producerea unui numr mare de haploizi i triploizi ntr-un
interval scurt de timp i cu randament economic ridicat.

- 31 -

Test de autoevaluare
2. Avnd n vedere cele nvate n acest subcapitol i innd cont de
spaiul avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la
urmtoarele ntrebri:
a) Comentai i analizai asemnrile i deosebirile dintre procesul de
cretere i dezvoltare a plantelor.
b) Definii i clasificai meristemele.

c) Definii procesele de difereniere i de dedifereniere celular.


d) Care sunt fazele dediferenierii ?
e) Definii organogeneza i embriogeneza i menionai de cte feluri
sunt acestea.
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de
nvare.

Dup parcurgerea acestui subcapitol trebuie s reinei:


Creterea plantelor reprezint un proces complex morfologic,
fiziologic i biochimic prin care are loc sporirea numrului de
celule prin acumularea de mas vegetativ, cnd au loc modificri
cantitative ireversibile iar n final plantele ating dimensiunile
caracteristice fiecrei specii.

Meristemele sunt esuturi care ndeplinesc funcia de multiplicare

celular, se divid tot timpul, constituind celule tinere n procesul de


multiplicare.

Clasificarea meristemelor se face dup localizare, caracteristici,


origine i funcie.

Celulele tinere diferentiate, dup faza de divizare continu, sufer


transformri structurale i o specializare morfologic i fiziologic,
cu caracteristici noi, proprii celulelor adulte, mari.

Morfogeneza este diferenierea histologic complex a celulelor


care, n final, duce la formare de organe, proces denumit
organogenez
embriogenez.

- 32 -

sau

generare

de

embrioni,

proces

numit

2.3 Comentarii i rspunsuri la teste

ntrebarea nr.2
a) Creterea plantelor reprezint un proces complex morfologic, fiziologic i
biochimic prin care are loc sporirea numrului de celule prin acumularea de mas
vegetativ, cnd au loc modificri cantitative ireversibile iar n final plantele
ating dimensiunile caracteristice fiecrei specii. Paralel cu procesul de cretere
cantitativ, are loc i procesul de dezvoltare, de evoluie individual a plantelor
care parcurg o serie de etape calitative ce ncep cu germinarea i se ncheie cu
nflorirea i fructificarea. Dezvoltarea parcurs conduce la realizarea ciclului
ontogenetic care cuprinde modificri morfologice, anatomice i fiziologice ce se
produc ntr-o succesiune riguroas determinat de factorii ereditari care la rndul
lor sunt influenai de factorii de mediu.
b) Criteriile de clasificare a meristemelor: localizare, caracteristici i origine,
fiecare cu anumite semnificaii din punct de vedere ontogenetic i anume:

meristeme histogene (care genereaz esuturi), meristeme organogene (care


genereaz organe) i anume: radiculare apicale, caulinare, apicale, foliare i
meristeme embriogene (care dau natere la embrioni)
Dup localizarea meristemelor ele pot fi: meristeme embrionare (localizate n
embrion); meristeme apicale (localizate n vrfurile de cretere tulpini sau
rdcini); meristeme intercalare ce pot fi: discontinui (deasupra nodurilor unor
tulpini); continui laterale: cambiu (strat libero-lemnos) i felogen (strat generator
subero-felodermic).
Dup caracterul celulelor meristematice: meristeme primordiale (promeristeme);
meristeme primare (semimeristeme).
Dup originea celulelor meristematice exist o clasificare n funcie de evoluia
teoriilor emise de unii cercettori: dup Hanstein (1868 1870) meristemul
radicular ar fi: dermatogen; periblem; plerom. Dup

Haberland

(1900)

meristemele sunt: protoderm, procambiu, meristem fundamental. Dup Schmidt


(1924) meristemul apical al tulpinilor este format din: tunica, corpusul.

- 33 -

Dup Plantefol (1947 1948) care a emis teoria inelului iniial, meristemul
apical al tulpinii este constituit din: meristem de ateptare care corespunde
zonei apicale axiale i joac rol n formarea primordiilor florale i a
inflorescenelor; inelul iniial (zona periferic) care are forma unui inel
central nconjurat de celule care periodic vor genera frunzele i scoara
tulpinii; meristemul medular ce ocup poziia central i este aezat sub
meristemul de ateptare, celulele derivate din acest meristem vor da natere
parenchimului medular. n ara noastr, Jitaru i Toma (1980) prezint o
sintez a clasificrii acestor categorii de meristeme: esuturi meristematice
primordiale fr celule, cu o celul iniial, cu mai multe celule iniiale.
esuturi meristematice primare semimeristeme: apicale, intercalare,
laterale. esuturi meristematice secundare pot fi: cambiul, felogenul.
esuturi meristematice meristemoide (meristemoizi) care pot fi grupate la
nivelul esutului protector i au zone lipsite de celule cu activitate
meristematic numite cmpuri de inhibiie sau zone de blocaj.
c) Controlul asupra diferenierii i funcionrii altor celule de ctre un grup
de celule poart denumirea de proces de inducie. Celulele asemntoare ca
structur i funciune care determin n esutul respectiv specificitatea
fiziologic, faciliteaz prin interrelaiile dintre esuturi buna funcionare a
organelor i activitatea intregii plante. Procesul de dedifereniere este invers
procesului de difereniere celular. El rar se petrece natural, spontan.
Dediferenierea este provocat de aciunea unor ocuri externe asupra

celulelor difereniate deci dediferenierea se produce ca reacie la aciunea


traumatic exogen. n cazul multiplicrii in vitro n condiiile detarii
explantelor dediferenierea se produce n sens regenerativ datorit aciunii
fitohormonilor. Prin dedifereniere celulele se transform n celule
meristematice apte a se divide. Capacitatea celulelor de a se dediferenia este
inegal rspndit n corpul plantei i depinde de ct de avansat este procesul
de difereniere n morfostructura celular.

- 34 -

d) Fazele dediferenierii sunt urmtoarele: prima faz caracterizat prin:


amorsarea proceselor de dedifereniere; producerea dediferenierii
celulelor,

dobndirea

caracteristicilor

citologice

ale

unui

esut

meristematic secundar cu celule aplatizate ce seamn ca aspect i


structur cu cambiul. A doua faz a dediferenierii const n:
dediferenierea celulelor pn la stadiu de meristem primar; generarea de

promeristeme sau meristemoizi din care pot aprea centre organogene


sau embriogene. A treia faz de dedifereniere se caracterizeaz prin:
formarea din celulele dedifereniate a calusului neorganizat, omogen
structural la nivelul cruia se pot forma meristemoizi sau centri
embriogeni.
e) Prin organogenez se neleg procesele de formare cretere i
difereniere celular i tisular a organelor. n tehnica de multiplicare in
vitro este vorba de apariia rdcinielor (rizogeneza), a mugurailor i
tulpinielor (caulogeneza) i a frunzulielor (filogeneza). Embriogeneza
somatic are avantajul c embrionul zigotic, somatic diploid sau haploid
dein ntr-un tot echilibrat structurat morfofuncional att rdcinia,
tulpinia ct i muguraul care asigur viitoarei plante un excelent debut
n via, odat cu germinaia.

- 35 -

2.4 Lucrare de verificare nr. 2


INSTRUCIUNI
Lucrarea de verificare solicitat, implic activiti care necesit
cunoaterea Unitii de nvare nr. 2.
Rspunsurile la ntrebri vor fi transmise tutorelui pentru comentarii,
corectare i evaluare. Pe prima pagin a lucrrii se vor scrie

urmtoarele:
Titulatura

acestui

curs

(MICRONMULIREA

PLANTELOR

HORTICOLE), numrul lucrrii de verificare, numele i prenumele


studentei (studentului).
Fiecare rspuns va trebui s fie clar exprimat i s nu depeasc o
jumtate de pagin. Punctajul aferent este menionat pentru fiecare
ntrebare.
ntrebrile la care trebuie s rspundei sunt urmtoarele:
1) Comentai i analizai asemnrile i deosebirile dintre procesul de
cretere i dezvoltare a plantelor.-1p
2) Definii i clasificai meristemele.-3p
3) Definii procesele de difereniere i de dedifereniere celular.-2p
4) Care sunt fazele dediferenierii ?-2p
5) Definii organogeneza i embriogeneza i menionai de cte feluri
sunt acestea 1p
* Un punct se acord din oficiu.

2.5 Bibliografie minimal


1. Cachia Cosma Dorina, Petrescu Corneliu, Curs de biotehnologii, Academia Universitar
Atheneum, Bucureti, 1993
2. D. Hoza, 1997, Biotehnologie pomicol.
3. A.Rou, 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaii n amelioare, Ed. Ametist.
4. F. Stnic, 1999, Micronmulirea plantelor horticole i alte tehnici de cultur in vitro,
Editura Grand;

- 36 -

UNITATEA DE NVARE NR. 3:


LABORATORUL DE CULTURI IN VITRO

CUPRINS
3.1

Obiectivele unitii de nvare nr. 3

37

3.2

Alctuirea laboratorului

38

3.3

Dotrile laboratorului

45

3.4

Comentarii i rspunsuri la teste

50

3.5

Lucrare de verificare nr. 3

51

3.6

Bibliografie minimal

51

3.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 3

Prin studierea acestei uniti de nvare vei fi n msur s:

Cunoti alctuirea laboratorului de micronmulire.


Cunoti principalele dotri tehnice necesare procesului
tehnologic care se desfoar n cadrul micronmulirii.

Deprinzi primele noiuni despre procedurile de lucru.


Ai o viziune de ansamblu a ce presupune dezvoltarea unui
laborator de micronmulire, didactic/cercetare sau industrial.

- 37 -

3.2 Alctuirea laboratorului.


Laboratoul de culturi in vitro este mprit n dou spaii strict delimitate care asigur fiecare
n parte fluxul tehnologic continuu dac este nevoie. Spaiile laboratoului de micronmulire sunt
ncperi amenajate facil pentru ntreinere i evacuare, cu pardoseal din gresie sau mozaic, cu
pereii acoperii cu faian sau vopsea de ulei pentru a se putea ntreine uor i a fi facil pentru
procesele de asepsie. Orice defeciune care s-ar produce n cadrul laboratorului, de mai lung
durat, poate provoca perturbaii grave n desfurarea lucrrilor, stagnnd fluxul operaiunilor i
ducnd la pierderi majore de material vegetal.
Un aspect important care trebuie subliniat este acela al asigurrii unei curenii perfecte n
toate compartimentele laboratorului, praful i murdria constituind surse constante de germeni,
respectiv de infecii.
Respectnd condiiile de asepsie, evitm infectarea mediului de cultur cu microorganisme,
n caz contrar, acestea se vor nmuli (mediile fiind deosebit de bogate n nutrieni i vitamine), flora
dezvoltat n recipientul de cultur devenind concurent pentru esuturile i celulele inoculate.
Infeciile microbiene i fungice avanseaz n scurt timp (2-5 zile de la inoculare) iar mediul de
cultur i modific proprietile, se altereaz, n el fiind eliminate toxine, pH-ul se modific i,
treptat, dezvoltarea explantelor este ncetinit i ulterior stopat definitiv.
n consecin, unul din aspectele majore pe care trebuie s le avem n vedere atunci cnd
dorim s iniiem culturi in vitro l constituie asigurarea unei asepsii perfecte, att a materialului
biologic ct i a recipientelor i a mediilor de cultur.
Laboratoarele de micronmulire pot fi laboratoare pentru cercetri cu profil biologic,
fiziologic, ameliorare, laboratoare de micronmulire care deservesc interese didactice, laboratoare
de micronmulire pentru afaceri la scar redus i ultima categorie, laboratoare de micronmulire
pentru afaceri la scar industrial.
Cerinele pentru realizarea acestor spaii sunt multiple i in att de sigurana procesului de
produciei ct i de securizarea operaiunilor. De obicei, laboratoarele sunt mprite n dou zone:
zona steril i zona nesteril.
Zona nesteril este spaiul destinat activitilor care se desfoar n condiii
nesterile i este reprezentat de spltor, laboratorul de preparare a mediilor de
cultur, spaiile de incubare, camera frigorific, ncperea cu autoclave etc.
Zona steril, ncpere aseptic, steril, care conine mai multe hote de lucru cu flux
laminar orizontal de aer steril ce sunt folosite pentru urmtoarele procedee de lucru:
dezinfectarea materialului vegetal, prelevare i inoculare explante in vitro i repicare
sau subcultivare.

- 38 -

Dimensionarea zonelor i ncperilor se va face innd cont de volumul de activitate pe care


laboratorul urmeaz s l aib, de amploarea personalului care va deservi laboratorul, mobilierul i
aparatura folosit. n funcie de specificul activitii, inclusiv mobilierul sau aparatura vor fi
diferite, ca n cazul culturilor de meristeme versus obinerea de material pentru aclimatizat i
plantat.
Cnd se urmrete obinerea de material de plantat devirozat, nu trebuie scpat din vedere
necesitatea amenajrii de ncperi pentru aplicarea termoterapiei, precum i a unui laborator
profilat pe testarea i certificarea calitii i a strii de sntate a plantelor generate in vitro.
Materialul de plantat rezultat, transferat din in vitro n mediul septic, dup aclimatizarea lui n
camera de cretere, urmeaz s fie plantat n ser (o construcie special n cazul n care se
urmrete pstrarea culturii n condiii de protejare fa de ageni fitopatogeni, sau o construcie
obinuit).
Faptul ca unele din activitile din laboratorul de micronmulire sunt sezoniere,
desfurndu-se n funcie de fenofazele speciilor lucrate, va trebui ca planul de afaceri s genereze
o diversificarea a activitilor, astfel nct investiia s se justifice i activitatea s fie n flux
continuu.
Ambele zone trebuie s rspund condiiilor standard de amenajare a laboratoarelor de lucru
tiinifice i s primeasc avizele de funcionare de la forurile specializate. Se vor asigura instalaii
de ap, lumin, canalizare, nclzire, gaze, toate n condiii perfecte de funcionare.

Alcatuirea zonei nesterile


Spltorul
Acesta poate fi amenajat ntr-o ncpere (de cca. 16 mp) cu canalizare n pardoseal, ciment
mozaicat sau gresie pe jos, cu panta uoar - n condiii de scurgere prin pardoseal.
Splarea sticlriei se va face n bazine de capacitate corespunztoare, funcie de volumul
inoculrilor zilnice. Dup evacuarea culturilor, mediile cu agar se colecteaz n glei i se arunc la
gunoi (agarul nfund instalaiile de canalizare); recipientele golite de mediu cu agar (precum i cele
etaneizate prin aplicare de folie de polietilen la cald), prealabil splrii, vor fi nmuiate n ap.
n consecin, n spltor - n funcie de volumul de sticlrie manipulat zilnic - trebuie s
avem n vedere amenajarea unor bazine pentru: nmuierea sticlriei, pentru splarea propriu-zis a
acesteia i, eventual, un al treilea bazin pentru limpezirea sticlriei splate.
Deasupra chiuvetei se va instala un distilator (de 510 litri) cu ap distilat (prezentnd
scurgere bazal, unde se va racorda un tub de cauciuc, cu clem) prin intermediul cruia vom avea,

- 39 -

n imediata apropiere a acesteia, o surs de ap distilat,


necesar pentru limpezirea final a sticlriei.
Chiuveta va fi prevzut cu robinete de ap cald
i rece i cu un sistem de iluminare care s asigure o
lumin corespunztoare ca intensitate, pentru crearea
condiiilor optime de verificare a gradului de curire a
obiectelor splate. n ncpere se vor monta rastele pentru
uscarea sticlriei. Pe pereii rmai liberi se pot amplasa
dulapuri, n scopul depozitrii sticlriei, a unor materiale
i a reactivilor care nu necesit condiii speciale de
pstrare.
n spltor se va proceda i la curarea
materialelor vegetale, de tipul rdcinilor, rizomilor,
bulbilor, tuberculilor etc.
n cazul n care nu avem posibilitatea s asigurm
ap cald la robinet, n apropierea chiuvetei se va instala
un boiler. n vecintatea chiuvetei trebuie s existe cutii
pentru gunoi (preferabil cu capac) i un suport pentru
perii (periile vor fi de diferite forme i mrimi), necesare
Distilator

pentru splarea sticlriei. Pentru scurgerea sticlriei, se va

avea n vedere i amenajarea unor suporturi avnd perforaii sau grtare.


Laboratorul pentru pregtirea mediilor de cultur
Este ncperea destinat preparrii mediilor de cultur, care trebuie sa fie spaioas (s
permit accesul concomitent a 3-4 persoane) i s fie corespunztor iluminat. Laboratorul va
deine instalaii de: canalizare, de ap curent (rece i cald), gaze, electricitate, pomp pentru vid.
Pardoseala va fi acoperit cu materiale uor lavabile. Dac spaiul o permite, vor fi aezate mese
att la perete ct i n centrul ncperii. Mesele de lucru vor fi faianate sau vor fi acoperite cu
material plastic ori cu folie melaminat, pentru a putea fi ntreinute uor i pentru a rezista la
reactivi.
Pe perei i sub mese se vor monta dulpioare, n scopul depozitrii n ele a sticlriei i a
substanelor. n laborator trebuie s fie instalate chiuvete cu ap rece i cald iar, n vecintatea lor,
se vor amplasa recipiente cu ap distilat i bidistilat.

- 40 -

n dreptul meselor se vor afla instalaii de gaz (aproximativ 3-4 guri de gaz repartizate pe
perei diferii), prize pentru curent de 220 V, precum i instalaie de vid (pentru operaiunile de
filtrare).
n laborator vor fi amplasate diferite aparate i anume: etuve, (din care, cel puin o etuv - de
capacitate mare va funciona n regim de 160 180C i o alta de tip bacteriologic, necesar pentru

Cntar electronic

Plit cu agitator magnetic

Cuptor microunde

incubare, la ntuneric, a inoculilor i care


va funciona la 24-38 C) ; 1-3 agitatoare
magnetice (dac se poate cu plit
electric) care vor fi necesare pentru
operaiunile de dizolvare a substanelor,
pH metru portabil

Autoclav

mai ales atunci cnd avem n vedere prepararea soluiilor stoc; n


laborator snt indispendabile i 1-2 bain marrie, de mare
capacitate, pentru prepararea mediilor cu agar (se pot face i
improvizaii, folosind, ca nlocuitori, vase de buctrie, n care se
introduce un material textil, pentru a proteja recipientele n timpul
fierberii apei), mai ales cnd nu dorim s folosim autoclavul pentru
solubilizarea agarului. De mare utilitate n laborator este un pHmetru; n laborator este indispensabil i prezena unui frigider, de
mare capacitate, cu congelator, pentru pstrarea soluiilor stoc, a
unor substane i mediile de cultur pn la folosire, dup
sterilizare. Materialul vegetal, pn n momentul prelevrii
explantelor, poate fi pstrat n camera frigorific.

- 41 -

ntr-o camer nvecinat laboratorului se vor instala balane electronice care s permit
cntrirea pn la subuniti de gram (100 10 mg), microscop optic i un stereomicroscop,
destinate examinrii materialului biologic, pre sau post inoculare.
n laborator trebuie s existe un sortiment variat i n cantiti ndestultoare de sticlrie.
Sterilizarea
ncperea care se preconizeaz a fi utilizat n scopul sterilizrii, respectiv n care va
funciona autoclavul, poate avea dimensiune variabil, n funcie de numrul autoclavelor i de tipul
i mrimea acestora. Pentru a nu se produce o strangulare a fluxului operaiunilor de inoculare este
de dorit s dispunem de dou autoclave funcionale, de mare capacitate, pentru a permite
sterilizarea concomitent a ct mai multe flacoane cu mediu.
Autoclavarea recipientelor cu medii de cultur se face la temperatura de 121C i 1,1
atmosfere, pe o durat de timp care variaz n funcie de ncrctur. Flacoanele cu medii se
depoziteaz n casolete metalice (de tip medical) sau n couri din srm, ori n tvi metalice apoi se
introduc n autoclav, cu perforaiile neobturate; celelalte tipuri de suporturi cu flacoane vor fi
nvelite n hrtie de mpachetat, perforat din loc n loc pentru a se permite accesul aburului din
autoclav, n interiorul ambalajelor. Dup autoclavare, la transportare, casoletele vor avea
perforaiile obturate.

Etuv

ncperea n care se monteaz autoclavele trebuie s


aib pardoseal din ciment, cu scurgere. Mediile, odat
sterilizate, pot fi pstrate o perioad de timp (preferabil la
ntuneric), n camer frigorific, pentru a evita degradarea
vitaminelor i a hormonilor i pentru a prentmpina
deshidratarea mediilor, prin evaporarea apei.
Apa distilat este indispensabil n laborator, att
pentru prepararea apei bidistilate ct i pentru splarea
materialului biologic sau la cltirea final a sticlriei. Bidistilatoarele, n general, sunt din sticl
special, lipsit de ioni de natriu. Bidistilatoarele de mare capacitate snt electrice.
Camera de cretere
Camera de cretere sau de incubare a culturilor este destinat pstrrii n condiii optime a
inoculilor, n vederea asigurrii bunei dezvoltri a acestora. Ea trebuie s ntruneasc condiii
maxime de septicizare, s nu fie igrasie, s nu fie demisol sau subsol, dei literatura veche
recomand, din contr, acest tip de amplasament pentru evitarea fluctuaiilor mari de temperatur.
Recent, nu se mai recomand amplasarea camerelor de cretere sub nivelul solului, deoarece

- 42 -

pot aparea probleme legate de umiditate,


microorganismele specifice zonelor calde i
umede, fr aerisire.
Amenajarea etajelor n camerele de
cretere trebuie fcut de aa manier nct
s se foloseasc la maximum spaiul
disponibil, permindu-se totodat accesul
cu uurin la recipientele cu inoculi. n
cazul n care ncperea nu poate fi
climatizat, se recomand ca distana dintre
polie s fie ceva mai mare, de cea 4050
cm. S-a constatat c rafturile de 1 m lime,
cu nlimea de 2 m i de lungime variabil,
snt cele mai practice.
Flacoanele de cultur cu inoculi
trebuie expuse la lumin, pe etajere
metalice, iluminate n regim prestabilit,
Camera de cretere

reglabil, preferabil automatizat, folosindu-se tuburi fluorescente amplasate deasupra culturilor, la o


distan de 30-40 cm. n cazul utilizrii polielor din sticl la care dedesubt, n imediata
apropiere a recipientelor se gsesc instalate tuburile de iluminare (corespunztoare raftului de jos)
aezarea flacoanelor s fie fcut pe un strat izolator, de exemplu din polistiren expandat, pentru
a nu se suprancinge, situaie n care mediul de cultur gelificat cu agar se va deshidrata i va crpa.
Regimul de temperatur al camerelor de cretere se recomand a fi la 25-27C (2C fa de
temperatura dorit) iar umiditatea de 50%, dar nu sub 50%. Fluctuaiile de temperatur, chiar i
numai cele provocate ca urmare a stingerii tuburilor fluorescente n perioada de ntuneric, produc
modificri ale volumului aerului din recipientele de cultur (prin creterea sau scderea presiunii
interioare) cu formarea unor cureni care vehiculeaz n recipiente spori i germeni, provocnd
infectarea secundar a mediilor de cultur, chiar dup o lung perioad de timp de la inoculare.
Tuburile fluorescente vor fi montate astfel nct s se evite orice posibilitate de incendiu i
s se asigure o iluminare uniform a suprafeelor. Fotoperioada optim, adecvat unei creteri
corespunztoare a celor mai multor tipuri de explante, este aceea de 16 ore lumin/8 ore ntuneric.
Recomandrile privind intensitatea optim a luminii, la suprafaa mediilor cu inoculi, variaz de la
caz la caz; de regul, se indic ca iluminarea s corespund la cea 22,6 Kluci.

- 43 -

Transferarea din in vitro n mediul septic se face


trecnd plantele printr-o etap de

ac1imatizare. O prim

acomodare a plantelor la viaa n mediul septic se face n


condiiile camerei de cretere. Plantulele eliberate de mediu
vor fi splate n ap (meninut la temperatura camerei),
apoi vor fi introduse cu rdcinile ntr-un substrat inert
(perlit, nisip, vermiculit) simplu, sau n amestec cu turb,
argil, mrani etc. cu asigurarea umiditii ridicate.
Regimul de iluminare i cel termic vor rmne, la nceput, n
limitele obinuite n care au fost cultivate plantulele in vitro, pentru ca apoi treptat, timp de cca. 3-4
sptmni, s se aduc plantulele la regimul obinuit de cultur. Uneori, literatura recomand
trecerea plantulelor pentru o prim perioad de aclimatizare n incinte cu cea i abia dup cca.
2-3 sptmni s intre n procesul standard de aclimatizare.

Alctuirea zonei sterile


Camera steril
Este ncperea n care se execut
sterilizarea,

prelevarea

inocularea

explantelor. Pereii ncperii aseptice vor fi


vopsii n ulei sau vor fi placai cu faian,
pardoseala va fi din ciment pentru a fi uor
lavabil, dar nu va avea canalizare n
podea. Camera steril este bine s fie
amenajat n apropierea laboratorului de preparare a mediilor.

Hot cu flux laminar de aer steril

n camera steril vor fi montate nie sau boxe (hote) cu flux laminar orizontal continuu, de aer
steril. Acestea au forme i dimensiuni variate iar asepsia aerului este asigurat prin filtre speciale
care rein particulele mai mari de 0,2 mm. Hotele vor fi orientate pe peretele opus uii i ferestrelor,
pentru a evita formarea curenilor de aer.
Manevrele efectuate n condiiile hotei cu flux de aer steril cer deprinderea operatorului, cu
un mod special de executare a micrilor, nefiind permis s se interpun mna, penseta sau alte
obiecte (chiar dac snt sterile), ntre curentul de aer steril i recipientul deschis; n caz contrar,

- 44 -

adeseori, procentul de infecii poate


fi mai ridicat dect n condiiile
executrii acelorai operaiuni, n
niele aseptice, improvizate.
De regul, nia sau hota trebuie
ncrcat
lucrului

naintea
numai

nceperii

cu

obiecte

sterilizate, iar operatorul se va spla


cu alcool pe mini, de fiecare dat
cnd

prsete

revine

perimetrul baleiat, scldat" de


fluxul laminar, orizontal, de aer steril. n condiiile efecturii unor inoculri obinuite, hota va fi
pus n funciune cu cca. 20 de minute nainte de nceperea operaiunilor. Hota steril va fi
prevzut cu instalaie de gaze (ori cu lmpi de spirt) i, dac este posibil, i cu instalaie de
vacuum; n spaiul propriu-zis de lucru vor fi aezate i suporturi pentru instrumente sterile i,
firete, att n ni ct i n camer, vor fi montate instalaii obinuite de iluminat i tuburi pentru
emanaie de raze ultraviolete necesare sterilizrii.
3.3. Dotrile laboratorului
Sticlria
n general, ntr-un laborator de culturi de esuturi se utilizeaz toate tipurile de recipiente
din sticl, de uz comun n laboratoarele de chimie-biologie. n laboratoare sunt necesare i pipete,
cilindrii gradai, plnii, baloane cotate (de diferite capaciti), sticle i borcane pentru reactivi (de
variate tipuri i mrimi) precum i vasele Erlenmeyer i Berzelius, de dimensiuni diverse, capsule
Petri, casolete, baghete, tuburi din sticl, sticlele de ceas, nuci filtrante, filtre Millipor, seringi,
exicatoare etc.
Ca recipiente de cultur pot fi folosite i baloanele cu fund plat ori variate vase din sticl
incolor, de forme i mrimi diferite. Pe lng recipiente din sticl, se folosesc frecvent i flacoane
sau capsule Petri, din material plastic, livrate sterilizate, ambalate fiind n pungi din polietilen.
Acest tip de recipiente nu se sterilizeaz, mediul sterilizat i cald, se toarn n recipientele sterile, n
condiii de perfect asepsie (n hota steril). n condiii de producie se folosesc dispozitive
automate de injectare (la cald) a unor cantiti fixe de mediu comparabil cu procedeele similare din
fabricile de medicamente.

- 45 -

Flacoanele cu medii de cultur, n vederea


sterilizrii, vor fi obturate cu dopuri de vat hidrofil,
nfurate cu tifon; periodic dup utilizri repetate
dopurile de vat vor fi autoclavate i apoi uscate n etuv.
Dup folosire ndelungat, dopurile de vat trebuie nlocuite,
cu altele noi.
Aparatura i dispozitivele.
La descrierea dotrii spaiilor de lucru s-a
menionat o parte din aparatura necesar, respectiv: boxa sau
incinta steril, autoclav, aparatul de distilat i bidistilat ap,
frigiderele de mare capacitate, agitatoarele magnetice (cu
plit pentru nclzirea mediilor), balanele (analitic i
tehnic),

pH-metrul,

stereomicroscopul,

12

etuvele,
lupe,

microscopul
centrifuga

i
pentru

sedimentarea biomasei n suspensiile celulare, compresorul,


o pomp de vid, dispozitivul de repartizare a mediului,
recipientele de cultur, aparatul de fotografiat.
Instrumentarul.
n tehnicile de culturi de esuturi se lucreaz cu instrumentar de tip chirurgical i anume:
pense (de diferite forme i mrimi, mai lungi dect eprubetele n care urmeaz s inoculm), ct mai
elastice, foarfeci i bisturie, anse, cuite, scalpele, lame de ras, perforatoare (de diferite dimensiuni),
care s permit explantarea unor cilindrii de esut etc. Mai sunt necesare ace, seringi, ace spatulate,
lamp de spirt etc.
Materiale diverse.
n laborator sunt necesare i alte materiale de mic valoare, nafar de sticlrie, i anume:
site cu azbest, clame, triunghiuri cu amot, trepiede, tuburi din sticl sau din cauciuc, becuri de
gaz, etc.
Vata este necesar n cantiti mari deoarece, nafar de confecionarea de dopuri, ea
servete i la splarea suprafeelor de lucru, a flacoanelor i a minilor operatorilor, cu alcool.
n laborator i gsesc utilizarea i o trus mecanic, termometre de camer, mnui din
cauciuc (de uz menajer), folie incolor din polietilen (pentru acoperirea vaselor de cultur),
elastice (pentru fixarea foliei de polietilen la gtul recipientelor), folie din aluminiu (pentru
nchiderea sau acoperirea flacoanelor cu mediu), site de metal (pentru strecurarea materialului
vegetal n operaiunea de sterilizare), tvi metalice, couri din srm, casolete metalice, suporturi

- 46 -

pentru eprubete, vase i cutii din plastic, perlit, vermiculit, sfoar, a, tifon, hrtie de filtru i de
mpachetat etc.
Substanele necesare n laborator.
n laboratorul de culturi de esuturi se folosesc nenumrate substane chimice. Astfel, pe
lng srurile anorganice i compuii organici utilizai la prepararea soluiilor nutritive, n laborator
mai snt necesari reactivi de uz comun (baze i acizi), precum i unele substane, indispensabile
pentru sterilizarea materialului vegetal, a suprafeelor de contact, sau unele preparate destinate
curirii ncperilor i a obiectelor.
a) Materiale chimice. n aceast categorie se ncadreaz detergenii sau spunurile (solide ori
lichide), soda i prafurile de curat de uz menajer alcoolul utilizat pentru dezinfectare (se
poate folosi i spirtul sanitar), acidul clorhidric tehnic, amestecul cromic (folosit n scopul curirii
veselei), bromocet, cloramin, hipoclorit etc.
ntre substanele chimice de uz comun intr i reactivii obinuii din laboratoarele de
chimie, i anume: acizi minerali (clorhidric, sulfuric, azotic) i baze (hidroxidul de potasiu, natriu,
amoniu, de puritate tehnic i cu grad ridicat de calitate), utilizai n curirea sticlriei i necesari n
prepararea unor soluii; acizi organici (acetic, citric, oxalic), alcool etilic (absolut, de 96 sau 70),
aceton, eter, cloroform (utilizai n cantiti mici), dimetilsulfoxid (DMSO), polietilenglicol (PEG),
Tween, ap de brom, clorur mercuric, hipoclorit de natriu sau de calciu, perhidrol etc.
b) Substanele necesare pentru prepararea mediilor de cultur. Pentru alegerea unui mediu de
cultur adecvat creterii anumitor tipuri de inoculi, nu trebuie s se procedeze empiric. Trebuie
analizat tipul de explant, proveniena lui i sezonul n care se recolteaz. Se alege mediul cel mai
echilibrat (vezi tabelul 1), pentru a se asigura o evoluie bun a inoculilor. Dac nu ne putem
decide, vom face experiene de tatonare, cu diferite medii.
Tipuri

de

concentraii

(dup De Possatd
Constituenii

ale

compuilor

frecvent ntlnii n mediile de cultur (n mM/1)

i colab., 1974)
Concentraie (n mM/1)
Sczut

Medie

Ridicat

NH4NO3

10

20

KNO3

10

20

KHSPO4

0,1

NaH2PO4

__

KC1

1.9

__

CaCl,

SRURI MINERALE

- 47 -

MgSO4

0,5

1,5

H3BO3

0,01

0,05

0,15

MnSO4

0,01

0,05

0,1

ZnSO4

0,001

0,02

0,04

CuSO4

0,00001

0,0001

0,0015

Na2Mo04

0,00001

0,0001

0,001

CoCl2

0,0001

0,0005

0,001

KI

0,0005

0,0025

0,005

FeSO4

0,01

0,05

0,1

Na,EDTA

0,01

0,05

0,1

A UXINE

0,0001

0,001

0,01

CITOCHININE

0,0001

0,001

0,01

Inozitol

0,1

0,3

0,6

Acid nicotinic

0,004

0,02

0,04

Piridoxin HC1

0,0006

0,003

0,006

Tiamin HC1

0,0001

0,002

0,04

Biotin

0,00004

0,0002

0,001

Acid folie

0,0005

0,001

0,002

Pantotenat de calciu

0,0002

0,001

0,005

Riboflavin

0,0001

0,001

0,01

Acid ascorbic

0,0001

0,001

0,01

L-Cistein HC1

0,01

0,06

0,12

Glicin

0,0005

0,005

0,05

Zaharoz

60

120

SUBSTANE ORGANICE

Sera de aclimatizare
n urma preocedurilor desfurate n laboratoarele de micronmulire rezult plante cu
rdcin, care urmeaza a fi trecute in vivo, i care trebuie s devin apte pentru viaa din afara
sistemului controlat al laboratorului. Pentru aceasta, laboratoarele de micropropagare sunt obligate
s dein i o ser de suprafee adaptate tipului de activitate i volumului de lucru, cu parametri
controlai, unde s poat desfura ultima etapa a micropropagrii, aclimatizarea. Meninnd
umiditatea, temperatura, lumina i aerisirea la parametri optimi pentru specia luat n discuie,

- 48 -

serele sunt ultimul pas naintea transplantrii noilor plante n containere individuale sau plci
alveolare i distribuite clientului.
Dotrile i particularitile tehnnologice ale acestei sere sunt standard, cu mese de lucru,
sistem de iluminat, sistem de irigat, sistem de cea artificial i cldur.

Test de autoevaluare
1. Avnd n vedere cele nvate n acest capitol i innd cont de spaiul

avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la urmtoarele


ntrebri:
a) Precizai care sunt zonele i alcatuirea laboratorului de culturi in vitro?
b) Care este aspectul major care trebuie respectat i luat n considerare
ntr-un laborator de cutluri in vitro?
c) Cum se realizeaz sterilizarea mediilor de cultur?
d) Care este principiul de funcionare al incintei cu aer steril?
e) Unde se realizeaz aclimatizarea explantelor i cnd?
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de nvare.
Dup parcurgerea acestui capitol trebuie s reinei:

Aspectul major care trebuie avut n vedere la iniierea unei culturi


in vitro este asigurarea unei asepsii perfecte a materialului biologic,
a recipientelor i a mediilor de cultur.

Laboratorul este alctuit din dou zone: zona nesteril sau septic i
zona steril sau aseptic.

Laboratoarele, fie c sunt de cercetare sau de producie, au aceai


alctuire, fiind diferit doar mrimea acestora.

Sterilizarea mediului de cultur i a recipientelor se face cu ajutorul


autoclavului iar cea a materialului biologic, cu substane chimice,
funcie de mai muli factori.

Hota cu flux laminar de aer steril asigur condiiile pentru


inocularea explantelor, fcnd parte din zona steril a laboratorului.

Explantele inoculate pe mediul de cultura cresc i se dezvolt n


camera de cretere, unde condiiile de vegetaie trebuie controlate
n totalitate.

Dup nrdcinare,
explantele sunt trecute n sera sau solarul de
- 49 aclimatizare pentru obinuirea cu condiiile de mediu.

3.4 Comentarii i rspunsuri la teste


ntrebarea nr.1
a) De obicei, laboratoarele sunt mprite n dou zone: zona steril i zona
nesteril. Zona nesteril este spaiul destinat activitilor care se desfoar
n condiii nesterile i este reprezentat de spltor, laboratorul de
preparare a mediilor de cultur, spaiile de incubare, camera frigorific,
ncperea cu autoclave etc. Zona steril, ncpere aseptic, steril, care

conine mai multe hote de lucru cu flux laminar orizontal de aer steril ce
sunt folosite pentru urmtoarele procedee de lucru: dezinfectarea
materialului vegetal, prelevare i inocul explante in vitro i repicare sau
subcultivare.
b) Unul din aspectele majore pe care trebuie s le avem n vedere atunci
cnd dorim s iniiem culturi in vitro l constituie asigurarea unei asepsii
perfecte, att a materialului biologic ct i a recipientelor i a mediilor de
cultur.
c)Autoclavarea recipientelor cu medii de cultur se face la temperatura de
121C, pe o durat de timp care variaz n funcie de ncrctur.
Flacoanele cu medii se depoziteaz n casolete metalice (de tip medical)
sau n couri din srm, ori n tvi metalice apoi se introduc n autoclav, cu
perforaiile neobturate; celelalte tipuri de suporturi cu flacoane vor fi
nvelite n hrtie de mpachetat, perforat din loc n loc pentru a se permite
accesul aburului din autoclav, n interiorul ambalajelor. Dup autoclavare,

la transportare, casoletele vor avea perforaiile obturate.


d) n camera steril vor fi montate nie sau boxe (hote) cu flux laminar
orizontal continuu, de aer steril = hote. Acestea au forme i dimensiuni
variate iar asepsia aerului este asigurat prin filtre speciale care rein
particulele mai mari de 0,2 mm. Hotele vor fi orientate pe peretele opus
uii i ferestrelor, pentru a evita formarea curenilor de aer.
e) n urma procedurilor desfurate n laboratoarele de micronmulire
rezult plante cu rdcin care trebuie s devin apte pentru viaa din afara
sistemului controlat al laboratorului. Pentru aceasta, laboratoarele sunt
obligate s dein i o ser de suprafee adaptate tipului de activitate i
volumului de lucru, cu parametrii controlai, unde s poat desfura
ultima etap a micropropagrii, aclimatizarea.

- 50 -

3.5 Lucrare de verificare nr. 3

INSTRUCIUNI
Lucrarea de verificare solicitat, implic activiti care necesit
cunoaterea Unitii de nvare nr. 3. Rspunsurile la ntrebri vor
fi transmise tutorelui pentru comentarii, corectare i evaluare.

Pe prima pagin a lucrrii se vor scrie urmtoarele:


Titulatura acestui curs (MICRONMULIREA PLANTELOR
HORTICOLE), numrul lucrrii de verificare, numele i
prenumele studentei (studentului).
Fiecare rspuns va trebui s fie clar exprimat i s nu depeasc o
jumtate de pagin.
ntrebrile la care trebuie s rspundei sunt urmtoarele:
a) Precizai care sunt zonele i alctuirea laboratorului de culturi in
vitro? -1 p
b) Care este aspectul major care trebuie respectat

i luat n

considerare ntr-un laborator de culturi in vitro? -2p


c) Cum se realizeaz sterilizarea mediilor de cultur? -2p
d) Care este principiul de funcionare al incintei cu aer steril?-2p
e) Unde se realizeaz aclimatizarea explantelor i cnd?-2p
* Un punct se acord din oficiu.

3.14 Bibliografie minimal


1. Cachia Cosma Dorina, Petrescu Corneliu, Curs de biotehnologii, Academia Universitar
Atheneum, Bucureti, 1993
2. D. Hoza, 1997, Biotehnologie pomicol.
3. A.Rou, 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaii n amelioare, Ed. Ametist.
4. F. Stnic, 1999, Micronmulirea plantelor horticole i alte tehnici de cultur in vitro,
Editura Grand;

- 51 -

UNITATEA DE NVARE NR. 4:


ASEPSIA N CULTURILE VEGETALE IN VITRO
CUPRINS
4.1

Obiectivele unitii de nvare nr. 4

52

4.2

Msuri generale

53

4.3

Asepsizarea ncperilor, a instrumentarului, a altor obiecte

54

4.4

Asepsizarea vaselor de cultur

55

4.5

Asepsizarea mediilor de cultur, apei, altor substane

55

4.6

Asepsizarea materialului vegetal

56

4.7

Verificarea unei bune asepsizri

57

4.8

Comentarii i rspunsuri la teste

59

4.9

Lucrare de verificare nr.4

61

4.10 Bibliografie minimal

61

4.1.Obiectivele unitii de nvare nr. 4


Prin studierea acestei uniti de nvare vei fi n msur s:

Cunoti principalele mijloace pentru asigurarea sterilizrii


culturilor in vitro.

Cunoti regulile de baza n asepsizarea materialului vegetal, a


instrumentarului i a spaiului dedicat activitailor de micro
propagare.

S identifici principalele probleme care pot surveni n urma


abaterilor de la protocolul de asepsie n cadrul activitilor de
micropropagare.

- 52 -

4.2 Msuri generale


Una din condiiile eseniale privind activitatea n cadrul unui laborator de
micropropagare i reuita activitilor care se deruleaz n cadrul acestei discipline este asepsia
pornind de la laboratoare i terminnd cu sterilizarea materialului vegetal cu care se lucreaz. n
natur, speciile horticole convieuiesc cu o seam de specii, unele nocive, altele nu, dar care se
hrnesc din aceeai surs, plant sau specia horticol, unele devenind periculoase pentru cultur i
necesitnd combatere fitotehnic, altele rmnnd inofensive. n ceea ce privete culturile in vitro,
ns, trebuie s inem seama de o serie de aspecte de igien i dezinfectare, care cura att
explantele ct i spaiul n care lucrm, tiut fiind c, urmare a compoziiei pe care o are mediul de
cultur, proliferarea agenilor patogeni se face exponenial corespunztor cu explantul in sine.
Asepsia este procesul, operaiunea de distrugere pe cale fizic sau chimic, de filtrare,
nlturare fizic, splare sau ultrasonare a micro-organismelor i a sporilor acestora. n
micropropagare se folosesc dou ci de sterilizare, cea prin distrugerea germenilor i cea care
const n eliminarea acestora.
DISTRUGEREA GERMENILOR se poate face prin diverse metode pe care un laborator
de micropropagare le poate avea la ndemn: arderea prin flambare; nclzirea cu cldur uscat
sau vapori supranclzii; iradierea cu raze gamma, microunde sau UV; ageni chimici, gen alcool
etilic, soluii clorurate, oxid sau pentaoxid de etilen care prezint dezavantajul de a fi deosebit pe
inflamabil, prezentnd risc ridicat i necesitnd manipulare n condiii de siguran, ap oxigenat
sau ap bromat.
ELIMINAREA GERMENILOR i a altor ageni duntori se poate face prin filtrarea
acestora fie prin splarea lor n curent de ap sau ap staionar cu adugarea de ageni spumani.
TIPURILE DE INFECII
Micropropagarea depinde de asigurarea asepsiei culturii i de lipsa infeciilor, acestea
ducnd fie la compromiterea total a culturilor fie la pierdere de resurse, finane i material vegetal
n scopul recuperrii ei. n micropropagare se cunosc dou tipuri de infecii, primare i secundare.
Infeciile primare i eliminarea acestora este o condiie esenial pentru reuita unei culturi
in vitro. Acestea apar imediat dup inoculare, la 2-3 zile i sunt cauzate de igien deficitar,
dezinfecie necorespunztoare a materialului vegetal, a intrumentarului i vaselor de cultur. Ele
pot fi cauzate de ciuperci i bacterii iar o cultur odat infectat, este compromis i trebuie
aruncat.
Infectiile secundare se declaneaz dup cteva sptmni de la inoculare i pericliteaz
ntreg procesul tehnologic, astfel nct este neceasar s se respecte principiile i regulile asepsiei la

- 53 -

nivelul materialului vegetal, al recipientelor de lucru i mediilor de cultur folosite, indiferent dac
sunt solide, semisolide sau lichide i suspensii, precum i respectarea asepsiei la nivelul procesului
tehnologic. Un aspect important se refer la calificarea personalului care trebuie s fie instruit i s
dein cunotine avansate de microbiologie, despre natura i evoluia germenilor (virusuri, bacterii,
alge, drojdii, mucegaiuri) precum i cile de transmitere i de reproducere a acestora.
4.3 Asepsizarea ncperilor, a instrumentarului i a altor obiecte.
Sterilizarea hotelor
Succesul activitilor n micropropagare depinde n mare parte de sterilitatea proceselor, de
asepsizarea ncperilor i a intrumentarului, de buna mentenan n condiii optime de lucru a
dispozitivelor de lucru electrice. Hotele cu flux laminar continuu sunt unul din punctele cheie n
procesul de producie, iar pstrarea lor n condiii aseptice este esenial. nainte de demararea
etapelor de lucru din camera steril, hotele se aprind i se sterilizeaza la raze ultraviolete (UV).
Dispozitivele sunt dotate din fabricaie cu lumina UV, astfel nct dupa 20 de minute de UV pornit,
hota va fi steril i pregtit pentru inocularea materialului vegetal. De reinut c lmpile UV se
ntrerup cu 20-30 de minute nainte de accesul personalului care deservete lucrul la hote din cauza
riscului de contaminare cu ozon.
Instrumentarul
Toate dispozitivele folosite n cadrul laboratoarelor de micropropagare trebuie s respecte
protocoalele de sterilizare i s fie supuse acestora altfel, succesul etapelor care se deruleaz n
camera steril nu este garantat. Sterilizarea casoletelor, sterilizarea recipientelor cu mediu steril, a
instrumentarului, a flacoanelor cu inoculi- n caz de repasare, se execut dup procedee standard de
laborator, fie la etuv sau autoclav, fie n alcool 70, fie prin fierbere n baie de ap sau electric sau
flambare.
De cele mai multe ori, procedeele de asepsizare se produc ncruciat pentru a se asigura o
deplin sterilizare a instrumentarului sau aparatelor implicate n procesele de lucru. n timpul
lucrului la hote, instrumentarul care se sterilizeaz n paralel cu celelalte operaiuni care se
desfoar poate fi fierbinte n urma sterilizrii, motiv pentru care se acord o atenie deosebit
rcirii acestuia nainte de a fi folosit i a intra n contact cu materialul vegetal.
Operatorul
Personalul calificat care lucreaz la hot este, de asemenea, surs continu de infecii pentru
materialul vegetal expus micropropagrii, dac nu chiar primul. Una dintre grijile sale este
sterilizarea perioadic a minilor atta vreme ct se afl n proces de lucru la hot, prin pulverizarea

- 54 -

constant cu alcool medicinal. De asemenea, purtarea mnuilor chirurgicale poate reprezenta un


avantaj n ceea ce privete limitarea propagrii infeciilor sau germenilor duntori.
4.4 Asepsizarea vaselor de cultur.
Vasele de cultur reprezint viitoarea cas pentru fragmentele de esuturi sau explantele
supuse procesului de micropropagare i necesit total asepsizare, astfel nct s nu permit
proliferarea niciunuia dintre factorii de infecii.
Literatura de specialitate recomand presterilizarea

vaselor de cultur, chiar cu riscul

slbirii rezistenei acestora, urmare a procesului de sterilizare sau ca urmare a emiterii unor compui
toxici ce apar n urma acestui proces.
Vasele de cultur au dopuri fie din cauciuc, plut sau alte materiale plastice care necesit
presterilizare. Trebuie s ne asigurm asupra rezistenei materialului din care sunt confecionate, s
le dezinfectm, fierbem i sterilizm. n condiiile n care se folosesc dopuri din vat acoperite de
staniol, acestea se sterilizeaz odat cu mediul de cultur.
4.5 Asepsizarea mediilor de cultur, apei, altor substane
Mediul de cultur reprezint suportul de via al explantelor pe perioada ct triesc in vitro
i trebuie s asigure condiii de hran i sntate culturilor. Sterilizarea acestuia este o etap
necesar fr de care nu se poate realiza micropropagare n condiii normale. Etapele pe care acesta
le parcurge sunt: pregtire, porionare, obturare sau acoperire i sterilizare.
Se recomand ca dopul sau capacul s nu fie nchis etan pentru a se permite circulaia
vaporilor de ap fierbini, sursa de sterilizare, de altfel, ntre recipient i mediul etuvei sau
autoclavului.
Sterilizarea mediului sau a apei distilate, a hrtiei de filtru pe care se lucreaz sau a sticlriei
se face la 1,1atmosfere presiune, 20-30 de minute i 120C. Vasele nu se vor umple cu mai mult de
din volum, pentru a nu se produce accidente odat cu modificarea presiunii de la finalul
autoclavrii, prezentnd risc de explozie. Odat autoclavat i sterilzat, mediul de cultur se va lsa
la rcit, n spaii deschise, cu aer care circul, iar recomandarea pentru folosire este dat la 24-48 de
ore de la sterilizare i rcire.
SUPRAAUTOCLAVAREA produce o alterare a calitii mediului de cultur prin deteriorarea
echilibrul ionic din mediu, ceea ce afecteaz capacitatea de solidificare a agarului i duce la
caramelizarea zaharozei.

- 55 -

Pe de alt parte, SUBAUTOCLAVAREA permite dezvoltarea coloniilor de microorganisme, ceea


ce va duce la inutilizarea lotului de mediu.
Pentru mediile lichide se poate folosi un alt tip de sterilizare, sterilizarea la rece, care se
produce prin filtrare cu nuci filtrante de sticl, porelan sau filtre Millipor.
Una din procedurile care poate aduce un plus de siguran n asepsia mediilor de cultur este
folosirea de substane sterilizante n mediul de cultur nsui, care este o practic mai puin folosit
n cadrul laboratoarelor de micropropagare, dar care poate inhiba dezvoltarea virusurilor, caz n care
folosim penicilina, streptomicina i cloramfenicol, sau a bacteriilor i ciupercilor, caz n care se
recomand a se folosi oxidul de propilen. Din pcate, se pare ca acesta provoac mutaii, inhib
sau stopeaz organogeneza, genereaz o debilitate crescut la trecerea plantelor din in vitro n in
vivo i scade capacitatea adaptativ a plantelor.

4.6 Asepsizarea materialului vegetal


Asepsizarea materialului vegetal este considerat una din primele etape din micropropagare
i este o condiie primordial a reuitei n aceast ramur a biotehnologiei. Ea se realizeaz numai
cu ageni chimici i are o sum de factori de care depinde reuita ei: specia, vrsta, fenofaza plantei
donor n momentul recoltrii, condiiile ecologice n care s-a dezvoltat, organul prelevat i poziia
sa n plant, esutul folosit, fiecare dintre acestea avnd o importan deosebit pentru stabilirea
protocolului corect de dezinfecie i asigurarea unui material vegetal curat.
Dintre toate organele plantei, indiferent de unde provine aceasta, indiferent de climatul sau
fenofaza n care se afl, organele subterane sunt cele mai populate n parazii, n simbioni, saprofii
i spori, astfel nct protocoalele de dezinfecie vor ine cont de acest aspect important. Pe de alt
parte, pentru mugurii, tulpinile, ramurile i organele cu pilozitate se ine cont de faptul c pe ele
ader sporii germenilor cu uurin, c pilozitatea mpiedic accesul dezinfectantului direct pe
suprafa, motiv pentru care trebuie distrus tensiunea superficial prin adugarea unui spumant la
detergent.
Criteriile de care se ine cont n succesul asepsizrii sunt variate i de multe ori specifice
speciei sau cultivarului folosit, dar, ca regul de baz, trebuie s evalum corect metoda de
asepsizare, s alegem conform substanele pentru sterilizare, concentraia acestora precum i durata
de timp alocat asepsizrii.
Detergenii. Privire general.
Indiferent de tipul de detergent folosit pentru dezinfectarea materialului vegetal, el trebuie s
ndeplineasc o serie de caliti care s le confere capacitate de a asigura sterilizarea explantelor.

- 56 -

Trebuie s aib aciune suficient de puternic pentru a putea distruge agenii patogeni de suprafa
i/sau interiori, nivelul lor de toxicitate s nu distrug esuturile provocnd necroze, deoarece
aceasta presupune lipsa hranei n mediul in vitro i, deci, moartea explantului. O condiie
important este ca detergentul s poat fi ndeprtat cu uurin, fr sa creeze probleme de
suprahidratare sau distrugere a esuturilor. Cu toate acestea, sterilizarea explantului este un proces
care se petrece la suprafaa explantului, motiv pentru care, n condiiile n care materialul vegetal
supus micropropagrii are esuturile profunde infectate, pot s apar infecii trzii i la a doua sau a
treia repasare, cu bacterii, fungi, micoplasme sau fungi, exponate care se regsesc i n esuturile
explantei.
Principalii dezinfectani sunt: alcool etilic n diverse concentraii (70%, 96% sau absolut), i
se recomand doar la organele cu pilozitate mare, epiderma cutinizata puternic, muguri bine nchii
i care necesit cltire rapid pentru a evita arderea explantului, apa bromat mai puin folosit,
clorura mercuric - deosebit de toxic i care se pare c prezint remanen n explante, dar
cercetrile nu sunt elocvente n acest moment, hipocloritul de sodiu sau Apa de Javel se
folosete n varii concentraii i timpi de expunere i cere cltiri abundente ulterior. Protocoalele de
dezinfecie pentru majoritatea plantelor pentru care se aplic procedeee de multiplicare in vitro au
deja stabilii detergenii, concetraiile, duratele de imersiune sau timpii de cltire. Pentru speciile
care intr n vizorul cercettorilor, stabilirea protocoalelor de dezinfecie se face prin tatonri
repetate pn la atingerea scopului dorit.
4.7 Verificarea unei bune asepsizri
n vederea evitrii accidentelor cauzate de infecii, este obligatorie verificarea periodic a hotelor cu
flux laminar de aer n ceea ce privete asepsizarea aerului din interiorul hotei. Acest lucru se face cu
aparate care msoar gradul de impurificare a aerului. n funcie de aceste rezultate, se stabilete
momentul de schimbare a filtrelor.
n aceeai ordine de idei, se verific i gradul de asepsizare din camera de cretere i din camera
steril prin mijloace fizice, chimice si biologice.
Fizice-manometre, termometre cu sau fr sistem de nregistrare grafic
Chimice-substane sub form de pulberi cu punct de fuziune cunoscut, benzi de hrtie
impregnate cu diverse substane (testul Bowie & Dick), lichide aezate n tuburi care la o
anumit temperatur i schimb culoarea. Dintre pulberi, sulful cu punct de topire 118C,
acidul picric la 130C.

- 57 -

Biologice cu Bacillus stearothermophylus comercializat sub form de Sterotest 120 (fiole,


coninut limpede, culoare violet), care este un indicator pentru controlul sterilizrii cu
autoclav la 120C pe o durat de 30 de minute, fiind puse n incubator la 56C. Meninerea
aspectului, culorii i transparenei, arat o sterilizare corect, virajul la galben i o uoar
opalescen arat o sterilizare sub parametrii de eficien.

Test de autoevaluare
1. Avnd n vedere cele nvate n acest capitol i innd cont de spaiul
avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la
urmtoarele ntrebri:
a) Ce este asepsia?
b) Enumerai cteva metode de dezinfecie.
c) Care sunt condiiile n care se execut sterilizarea mediului, a apei

distilate i a hrtiei de filtru?


d) Comentai rspunsul diferitelor organe ale plantei la dezinfecie?
e)Menionai

care

sunt

principalii

dezinfectani

folosii

micropropagare.
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de
nvare.

Dup parcurgerea acestui capitol trebuie s reinei:

Principalele tehnici pe care le avei la dispoziie pentru


asigurarea asepsizrii laboratorului, instrumentarului , caselor de
cultur i materialului vegetal;

Principiile asepsizrii n micropropagare i substanele folosite


n acest scop;

Tipurile de infecii care pot surveni n micropropagare i cauzele


care le genereaz.

- 58 -

4.8 Comentarii i rspunsuri la teste

ntrebarea nr.1
a) Asepsia este procesul, operaiunea de distrugere pe cale fizic
sau chimic, de filtrare, nlturare fizic, splare sau ultrasonare a
micro-organismelor i a sporilor acestora. n micropropagare se

folosesc dou ci de sterilizare, cea prin distrugerea germenilor i


cea care const n eliminarea acestora.
b) n micropropagare se cunosc dou tipuri de infecii, primare i
secundare. Infeciile primare si eliminarea acestora este o condiie
esenial pentru reuita unei culturi in vitro. Acestea apar imediat
dup inoculare, la 2-3 zile i sunt cauzate de igien deficitar,
dezinfecie

necorespunztoare

materialului

vegetal,

intrumentarului i vaselor de cultur. Ele pot fi cauzate de ciuperci


i bacterii iar o cultur odat infectat, este compromis i trebuie
aruncat. Infeciile secundare se declaneaz dup cteva sptmni
de la inoculare i pericliteaz ntreg procesul tehnologic, astfel nct
este necesar s se respecte principiile i regulile asepsiei la nivelul
materialului vegetal, al recipientelor de lucru i mediilor de cultur
folosite, indiferent dac sunt solide, semisolide sau lichide i
suspensii, precum i respectarea asepsiei la nivelul procesului

tehnologic. Un aspect important se refer la calificarea personalului


care trebuie s fie instruit i s dein cunotine avansate de
microbiologie, despre natura i evoluia germenilor (virusuri,
bacterii, alge, drojdii, mucegaiuri) precum i cile de transmitere i
de reproducere a acestora.
c) Sterilizarea mediului sau a apei distilate, a hrtiei de filtru pe
care se lucreaz sau a sticlriei se face la 1,1 atm presiune, 20-30 de
minute i 120C. Vasele nu se vor umple cu mai mult de din
volum, pentru a nu se produce accidente odat cu modificarea
presiunii de la finalul autoclavrii, prezentnd risc de explozie.

- 59 -

Odat autoclavat i sterilizat, mediul de cultur se va lsa la rcit, n


spaii deschise, cu aer care circul, iar recomandarea pentru folosire
este dat la 24-48 de ore de la sterilizare i rcire.
d) Dintre toate organele plantei, indiferent de unde provine aceasta,
indiferent de climatul sau fenofaza n care se afl, organele
subterane sunt cele mai populate n parazii, n simbioni, saprofii
i spori, astfel nct protocoalele de dezinfecie vor ine cont de
acest aspect important. Pe de alt parte, pentru mugurii, tulpinile,
ramurile i organele cu pilozitate se ine cont de faptul c pe ele
ader sporii germenilor cu uurin, c pilozitatea mpiedic accesul
dezinfectantului direct pe suprafa, motiv pentru care trebuie

distrus tensiunea superficial prin adaugarea unui spumant la


detergent.
e) Principalii dezinfectani sunt: alcool etilic n diverse concentraii
(70%, 96% sau absolut), i se recomand doar la organele cu
pilozitate mare, epiderma cutinizat puternic, muguri bine nchii
i care necesit cltire rapid pentru a evita arderea explantului, apa
bromat mai puin folosit, clorura mercuric - deosebit de toxic

i care se pare c prezint remanen n explante, dar cercetrile nu


sunt elocvente n acest moment, hipocloritul de sodiu sau Apa de
Javel se folosete n varii concentraii i timpi de expunere i cere
cltiri abundente ulterior. Protocoalele de dezinfecie pentru
majoritatea plantelor pentru care se aplic procedee de multiplicare
in vitro au deja stabilii detergenii, concetraiile, duratele de
imersiune sau timpii de cltire. Pentru speciile care intr n vizorul
cercettorilor, stabilirea protocoalelor de dezinfecie se face prin
tatonari repetate pn la atingerea scopului dorit.

- 60 -

4.9 Lucrare de verificare nr. 4

INSTRUCIUNI
Lucrarea de verificare solicitat, implic activiti care necesit
cunoaterea Unitii de nvare nr. 4. Rspunsurile la ntrebri vor fi

transmise tutorelui pentru comentarii, corectare i evaluare.


Pe prima pagin a lucrrii se vor scrie urmtoarele:
Titulatura

acestui

curs

(MICRONMULIREA

PLANTELOR

HORTICOLE), numrul lucrrii de verificare, numele i prenumele


studentei (studentului).
Fiecare rspuns va trebui s fie clar exprimat i s nu depeasc o
jumtate de pagin.
ntrebrile la care trebuie s rspundei sunt urmtoarele:
1. Ce este asepsia? -1p
2. Enumerai cteva metode de dezinfecie. -2p
3. Care sunt condiiile n care se execut sterilizarea mediului, a apei
distilate i a hrtiei de filtru? -2p
4. Comentai rspunsul diferitelor organe ale plantei la dezinfecie? -2p
5.

Menionai

care

sunt

principalii

dezinfectani

folosii

micropropagare. -2p
* Un punct se acord din oficiu.

4.10 Bibliografie minimal


1. Cachia Cosma Dorina, Petrescu Corneliu, Curs de biotehnologii, Academia Universitar
Atheneum, Bucureti, 1993
2. D. Hoza, 1997, Biotehnologie pomicol.
3. A.Rou, 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaii n amelioare, Ed. Ametist.
4. F. Stnic, 1999, Micronmulirea plantelor horticole i alte tehnici de cultur in vitro,
Editura Grand;

- 61 -

UNITATEA DE NVARE NR. 5:


MEDIILE DE CULTUR

CUPRINS
5.1

Obiectivele unitii de nvare nr. 5

62

5.2

Generaliti

63

5.3

Compoziia mediului de cultur

64

5.4

Compuii anorganici i organici

65

5.5

Compuii fenolici, compuii antivirali i extractele vegetale

74

5.6

Prepararea mediilor de cultur i pH-ul

75

5.7

Probleme i infeciile care apar n mediile de cultur

78

5.8

Comentarii i rspunsuri la teste

82

5.9

Lucrare de verificare nr. 5

84

5.10 Bibliografie minimal

84

5.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 5


Prin studierea acestei uniti de nvare vei fi n msur s:

Cunoti configuraia standard a unui mediu de cultur.


tii etapele care trebuie parcurse pentru a realiza un mediu, n
funcie de specie i tipul de cultur ce urmeaz a fi executate.

Cunoti principalii factori de risc pe care i presupune lucrul cu


mediile de cultur.

- 62 -

5.2. Generaliti
Momentul de mare rscruce n realizarea mediilor de cultur a fost anul 1962, cnd T.
Murashige i F. Skoog au elaborat i publicat reeta de mediu de cultur care le poart numele i
astzi prescurtat MS. Dei elaborat pentru esuturi de tutun, MS a devenit astzi mediul de baz n
culturile in vitro, mediul de iniiere fiind folosit pentru o varietate larg de specii.
Mediul de cultur este un suport fizico-chimic pentru susinerea vieii la explante n
condiiile recipientelor de cultur i are nevoie de o serie de atribute pe care s le ndeplineasc
pentru a putea fi asociat unui protocol de micropropagare a unei specii.
Principala condiie pe care trebuie s o ndeplineasc un mediu de cultur este aceea de a
putea s hrneasc corect i suficient explanta aflat n diverse stadii de micropropagare (de la
iniiere la nrdcinare) i s i asigure condiii optime de dezvoltare n ceea ce privete necesitile
ei fiziologice (pH, presiune osmotic, umiditate, echilibru ionic). Din punct de vedere al
caracteristicilor administrative, mediile de cultur trebuie s fie uor de preparat, s aib o reet
care se poate reproduce i s prezinte stabilitate dup ncheierea procesului de pregtire, s fie stabil
i s nu manifeste modificri fizico-chimice de substan sau stare, infecii sau alte dezechilibre. De
asemenea, orice laborator de micropropagare va aprecia un cost mic per unitatea de mediu, ceea ce
presupune substane constituente necostisitoare i accesibile.
La nivel mondial se recunosc ca fiind cele mai folosite o serie de reete de mediu, dar nu
sunt nici pe departe singurele, existnd i specii care au medii de cultura dedicate. Dintre cele mai
cunoscute medii de cultur, retinem: B5 (Gamborg i colab. 1968), N6 (Chu, 1978), Nitsch&Nitsch
(NN, 1969), Quoirin&Lepoivre (QL, 1977), DKW (Driver&Kuniyuki, 1984) i WPM (Lloyd &
McCown, 1980) - ultimele fiind recomandate n special pentru speciile lemnoase i pomicole,
compoziia lor variind n limite relativ mici, cu atenie asupra variaiei cantitilor compuilor
anorganici (macroelementele, microelementele, chelatul de fier), variaiile necontrolate putnd
afecta echilibrul ionic care pune n pericol rspunsul corect fiziologic al plantei n respectivul mediu
de cultur.
Mediile de cultur pot fi de trei feluri dup constituia lor: lichide, solide i semisolide i
presupun anumite criterii dup care se evalueaz necesitatea folosirii unui anumit mediu pentru o
lucrare. Se ine seama de tipul de explant, de modul de cultivare al plantei donor, de proveniena
acestuia din mediu exterior sau spaiu de cultur protejat, stadiul de dezvoltare a explantului, de
specie i de soi, mrimea, sezonul de recoltare (important mai ales pentru culturile din muguri)
precum i de scopul culturii.

- 63 -

Majoritatea speciilor cunoscute astzi i care au fost testate, au un mediu de cultur la care
au reacionat pozitiv i care este listat n literatura de specialitate, la acestea adugndu-se speciile
care nu au nc un mediu de cultur viabil, care s produc culturi stabile genetic i speciile la care,
n urma testrilor, s-a ajuns la concluzia c sunt recalcitrante la micropropagare i nu se poate lista
ca metod de nmulire pentru ele aceast tehnic.
Un rol important n stabilirea mediilor de cultur pentru plantele horticole n vederea
uurrii muncii de reproducere, multiplicare i ridicarea standardelor de comercializare a acestora
att cantitativ (populaia planetei cere mult hran zilnic, care trebuie produs rapid), dar i calitativ
(gusturile consumatorului s-au rafinat, cernd variaie mare) l au fiziologii, specialiti n nutriia
plantelor, care pot evalua constant necesarul de hran al unui explant i dozarea substanelor
constitutive ale mediului de cultur, astfel nct procesul de multiplicare in vitro s se desfoare n
bune condiii.
5.3. Compoziia mediului de cultur
Compoziia mediului de cultur este diferit de la o specie la alta, iar de la nceputurile
micronmulirii pn astzi au fost elaborate multe reete, odat cu acumularea informaiilor despre
specia n discuie, cu evoluia fiziologiei i a biologiei moleculare, domeniul nefiind nici pe departe
nchis cercetrii.
Modificrile care apar la nivel molecular ntr-o plant care se afl n stare de caren sau
exces n ceea ce privete nutriia sunt relativ conoscute la aceast dat, recomandarea n
micropropagare fiind aceea de a asigura un echilibru ntre elementele componente ale elementelor
din mediul de cultur, altfel cultura este supus eecului.
Odat desprit de planta mam, explantul va avea nevoie de condiii de mediu speciale
pentru evoluie, de asepsie total, de mediu complet steril i de hran adecvat, adic acea soluie
nutritiv complex format din ap, sruri minerale (macroelemente i microelemente) - substane
anorganice i substane organice (glucide, vitamine, fitohormoni, agar etc).
APA
Toate organismele au n componena lor sau au nevoie de ap, iar acest fapt fiziologic se
regsete i n cadrul micropropagrii in vitro a plantelor. Ea intr n componena mediului de
cultur sau a procedeelor de sterilizare i autoclavare a recipientelor, dar este ntlnit i n
recipientele de cultur, numai c aici are un circuit nchis. Nu este recomandat ca eprubetele cu
explante s dobndeasc condens, deoarece acesta poate ridica riscurile de infecii, iar acest aspect
se poate controla odata cu reglarea temperaturii n camera de cretere. n cazul n care recipientele
de cultur nu sunt nchise etan, aceast ap rezultat din condens se poate evapora i poate s

- 64 -

contribuie i la dezechilibrarea hidric e explantelor, pierderea turgescenei celulare, situaie n care


explantele i modific metabolismul i pot s apar modificri de stare fiziologic i biologic.
Apa ntlnit n micropropagare este apa bidistilat sau distilat, ideal pentru realizarea
mediului de cultur, nerecomandndu-se folosirea apei pure sau ultrapure, deoarece aceasta este o
ap moart, fr via, fr proprieti fizico-chimice necesare procedurilor i proceselor din
micropropagare.
Sterilizarea explantelor n alcool produce deshidratarea major a esuturilor mai ales n cazul
frunzelor neacoperite de pruina sau strat ceros, recomandrile pentru timpul de submersie fiind
foarte reduse n acest caz sau chiar nlocuirea alcoolului cu hipoclorit de Ca sau Na.
5.4. Compuii anorganici i organici
COMPUII ANORGANICI
Se cunosc ase elemente indispensabile creterii plantelor: N, P, K, Ca, Mg, i S.
Cele mai folosite sruri sunt fosfaii, azotaii, clorurile i sulfaii de Ca, K, Mg, Mn, Al, Fe, Mo, Zn,
Cu, Na. Fiecare etap a micropropagrii cere un anumit element n mod suplimentar iar absorbia
acestora se va face sub form de ioni, necesar de reinut fiind c rolul fiziologic al fiecrui element
din mediul de cultur variaz n funcie de concentraie, natura explantelor i specificul culturii.
Cantitatea de substan folosit n eleborarea mediilor a mprit aceste elemente n
MACROELEMENTE - C, O, H, N, P, S, K, Ca, Mg i MICROELEMENTE - Fe, Mn, Zn, Al,
B, Cu, Mo, Na, Co, I. Proporiile n care acestea se folosesc n mediile de cultura se aleg conform
cu scopul urmrit, fie folosind reetele deja consacrate, fie prin tatonri personale, n funcie de
scopul urmrit.
Rolul elementelor n compoziia mediului este dat, cum am spus, de concentraia n care se
folosete elementul, de forma chimic n care se gsete precum i de tot ceea ce ine de partea
vegetal, adic subiectul micropropagrii.
Dintre rolurile importante pe care le au macroelementele, enunm cteva:
Omiterea N, S sau P n cazul culturilor de liber secundar la morcov provoac moartea
inoculilor n cca. 2 luni de la inoculare, observndu-se c exist o sensibilitate mare a
celulelor la S i P, elemente care trebuie dozate foarte atent n compoziia mediului de
cultur.
Lipsa cationului de K - carena, duce la ncetinirea creterii culturilor.
Carena de N care persist poate provoca dereglri n metabolismul glucidelor i proteinelor,
iar prezena acestei carene se poate observa prin creterea concentraiei de pigmeni
antociani n vacuole.

- 65 -

Mrirea concentraiei cationului de K duce la mrirea ratei creterii culturilor de tutun i vi


de vie slbatic.
Carenele de Ca i Mg genereaz tulburri vegetative culturilor - cea de Mg provocnd
modificri n masa foliar- pn la moartea celulelor.
Absena NH4NO3 pentru culturile de Lactuca sativa genereaz doar calus, fr s se
produc diferenierea mugurailor.
esuturile senescente sau ameliorate cer medii cu continut de Ca suplimentar, complementar
cu K.
N are rol important n embriogeneza somatic i produce fenomenul de vitrificare n funcie
de forma n care se afl (amoniacal sau nitric).

Compozitia mediilor listate conform


SRM
UNIVERSITY,
BIOTECHNOLOGY

SCHOOL

OF

- 66 -

BIOENGINEERING,

DEPARTMENT

OF

Rolul microelementelor n mediul de cultur este dat de faptul c intr n compoziia unor sisteme
enzimatice catalogate vitale pentru metabolismul vegetal. Aadar, sunt indispensabile i importante,
lipsa lor din mediile de cultur provoac, pn la a treia repasare, decesul culturii.
Fe intervine n metabolizarea intranuclear, sinteza ARN i sinteza proteic; necesit a fi
administrat sub forme chelatizate, deoarece este greu de asimilat.
Lipsa Zn modific sinteza auxinei.
Mn particip la proteosinteza i formarea ARN-ului n celulele rdcinilor de mazre i are
rol important n cazul rizogenezei la tomate dar trebuie avut n vedere raportul Mg/Mn
deoarece se pot produce perturbaii grave la nivel celular.
B are rol n procesele de diviziune i cretere celular.
Al este catalizator n multe reacii chimice i nu s-au raportat fenomene de caren evident
n caz de lips.
Cercetrile din acest moment pot recomanda anumite medii de cultur pentru diverse specii,
nefiind nicidecum restrictiv, imaginaia i perseverena fiind ultimele bariere n ceea ce privete
elaborarea mediilor de cultur pentru speciile horticole.
WHITE (1943) recomandat pentru culturile de esuturi tumorale.
HELER (1953) recomandat pentru multe culturi, mai puin tutun.
KNUDSON (1925) recomandat pentru orhidee i ferigi.
MURASHIGE-SKOOG (1962) recomandat pentru culturi de calus la tutun i culturi de
celule la majoritatea speciilor fiind numit mediu universal.
GAMBORG (1968) recomandat n germinarea n condiii aseptice a seminelor.

COMPUII ORGANICI
n 1934, WHITE a reuit s afirme n lumea biotehnologiilor c zaharoza i extractul
neautolizat de drojdie care conine glicin/aminoacizi i tiamina/vitamine aduc superioritate
nutriional mediilor de cultur, producnd reacii pozitive de cretere explantelor i cam tot la
aceeai dat a fost descoperit principiul de aciune al AUXINELOR. n 1938, ROBBINS i
SCHMIDT au adugat reetelor de mediu piridoxina, adic vitamina B6 (precursor al unor enzime)
i acidul nicotinic. i acesta a fost nceputul unei noi ere n elaborarea mediilor de cultur i a
importanei compuilor organici.
Cele mai importante surse organice care intr n componena acestor medii i pe care le
folosim la aceast dat sunt: zharoza/glucoza, aminoacizi, vitamine, extract de drojdie,
fitohormonii/substanele reglatoare de cretere, cazeina, sucuri naturale i agarul, regsite n mediu

- 67 -

n funcie de tipul celulelor cultivate sau de tipul explantului, de scopul culturii i de rezerva proprie
de hormoni ai explantului.
CARBONUL ORGANIC
Mediul de cultur conine adaos de carbon glucidic, ceea ce asigur substrat respirator
pentru culturi (prin degradarea glucidelor se obine energia necesar proceselor vitale, multiplicrii,
creterii i diferenierii celulare). Trebuie reinut c, dei plantulele sunt verzi i posed clorofil,
sau calusul este activ, aceste materiale vegetale nu sunt total autotrofe i pentru a fi inute n via
avem nevoie de surse de carbon organic, care s ajute procesul de fotosintez, proces care nu se
desfaoar integral sau s suplineasc proasta funcionare a cloroplastelor.
Formele n care avem posibilitatea de a suplini lipsa de sintez a substanelor energetice sunt
a) GLUCIDELE; b) ALCOOLII i c) ACIZII ORGANICI.
Dintre glucide, Zaharoza prezint eficien maxim n procesele metabolice la nivelul
culturilor in vitro (alte surse fiind

glucoza, fructoza, maltoza, rafinoza i amidonul) ntr-o

concentraie optim de 2%. Excesul de zaharoz poate duce la plasmolizarea celulelor urmare a
presiunii osmotice create.
Culturile vegetale evolueaz optim la o concentraie a zaharozei de 2-3% (3% glucoz doar
pentru culturi de meristeme la unele specii lemnoase) cu variaii ntre 1,2% - 8% (pentru cartof). De
asemenea, se recomand ca la autoclavare s se respecte strict temperatura de sterilizare deoarece
uneori se poate produce fenomenul de caramelizare, de alterare a zaharozei.
Dintre alcooli, GLICEROLUL poate fi folosit ca surs energetic, potennd efectul
glucidelor, dovedit pn n acest moment ca fiind sigurul cu eficien, dar mult mai slab ca
performan dect zaharoza. MONOALCOOLII - ca metanol, etanol, propanol sau butanol- nu pot
fi utilizai, fiind toxici chiar i la diluii mari.
AZOTUL ORGANIC
esuturile vegetale sunt autotrofe fa de azot, prelundu-l din substanele anorganice, ceea
ce nu limiteaz ns folosirea acestuia n mediile de cultur. n 1939, WHITE a dovedit c
GLICINA mbuntete creterea rdcinilor la tomate, de asemenea c UREEA i unele BAZE
AZOTATE pot fi surse eficiente de azot organic. Dei atenioneaz asupra faptului c sursele de
azot organic n culturi pot fi toxice, n 1981, BIONDI i THORPE recomand folosirea
aminoacizilor n mediile de cultur atunci cnd se urmrete formarea de calus.
VITAMINELE
Avantajele vitaminelor n cultura explantelor s-au descoperit ntmpltor n anii 1922-1940
cnd, dup WHITE, orice mediu de cultur trebuie s conin vitamine. Acestea la aceasta dat
erau considerate indispensabile vieii plantelor. Dintre acestea, amintim cteva:

- 68 -

VITAMINA B1 (TIAMINA)
Valoare biologica important.
Stimuleaz creterea celulelor i a esuturilor.
VITAMINA B6 (PIRIDOXINA)
Precursor al enzimelor, considerat indispensabil.
VITAMINA H (BIOTINA)
Utilizat nc din 1946 (Morel).
Exercit efect stimulator asupra culturilor de celule.
ACIDUL FOLIC
Efect stimulant asupra esuturilor tumorale dar i efect toxic urmare a descompunerii n acid
p-aminobenzoic (factor de cretere, ns).
ACIDUL NICOTINIC
Utilizat nc din 1938 i considerat indispensabil.
VITAMINA C (ACIDUL ASCORBIC)
Aciune antioxidanta i folosit pentru diminuarea aciunii fenolice a unor specii
recalcitrante la micropropagare i care elimin fenoli.
INOZITOL (glucid/vitamin)
Obligatoriu n mediul de cultur dar nu se cunoate clar rolul fiziologic pe care l exercit
asupra culturilor.

FITOHORMONII/FITOREGULATORI
Fitohormonii stimulelaz, inhib sau modific calitativ i cantitativ creterea i dezvoltarea
explantelor i sunt folosii n concentraii foarte mici, de ordinul mM sau M. De la nceput trebuie
s se fac diferena ntre fitohormoni i fitoregulatori.
FITOHORMONII produc modificri la nivelul proceselor de morfogenez, organogenez,
embriogenez, cu urmri n dezvoltarea celular, tisular, organic, diferenierea celular sau la
nivelul ntregii plante.
FITOREGULATORII sunt regulatori chimici, organici, compui de sintez care imit
efectele hormonilor naturali, devenind indispensabili n biotehnologiile vegetale.
INFLUENA FITOHORMONILOR care poate fi tradus n echivalena cu rspunsul
imediat sau ntrziat al plantei, depinde de starea fiziologic a centrilor receptori (celule, esuturi,
organe), stadiul de dezvoltare al organelor plantei, natura i nivelul semnalului, de interaciile
acestuia cu ali fithormoni, condiiile de mediu .a.m.d.

- 69 -

Multiplicarea i creterea celular care sunt catalogate ca fiind fenomene complexe pot
produce reacii particulare, urmare a interaciunii dintre fitohormonii explantei i fitoregulatorii
administrai n mediul de cultur, acesta fiind motivul pentru care reetele de mediu variaz n
concentraii de hormoni de la specie la specie, n funcie de bagajul endogen al acesteia.
O scurt trecere n revist a pailor fcui de evoluia fitohormonilor vegetali ne arat c
DARWIN, n 1880, intuiete existena fitohormonilor, pentru ca peste un secol, nc s nu se
cunoasc pe deplin mecanismele de interaciune dintre fitohormoni i toate procesele pe care le
implic. Frits Warmolt WENT (1928) identific auxina A n urina uman, descoperire care permite
lansarea unei noi tiine: fitotehnologia. Anii 30 aduc descoperirea aciunii giberelinelor, acidului
abscisic i etilenei, pentru ca SKOOG (1955-1956) s izoleze din sperma de heringi chinetina (6
furfurilaminopurina); n anii 1956, STEWARD lanseaz citochininele native din laptele de cocos.
n acest moment se cunosc cinci mari categorii de fitohormoni: AUXINE, CITOCHININE,
GIBERELINE, ACIDUL ABSCISIC i ETILENA.
AUXINELE
n plante, auxinele se gsesc fie libere (AIA) fie legate, sub multiple forme sau combinaii
ale AIA cu acid aspartic, glutamic sau acid ascorbic.
Tipuri de auxine cunoscute:
AIA (auxina nativa), AIB (acidul 3-indolilbutiric - nu se gsete n toate speciile vegetale), ANA
(acidul 1-naftilacetic), 2,4-D (acidul 2,4-diclorfenoxiacetic), 4ACFA SAU ACPA (acidul 4clorfenoxiacetic), ANOA (acidul 2-naftoxiacetic), 2,4,5-T (acidul 2,4,5-triclorfenoxiacetic),
DICAMBA (acidul 3,6-dicloro-2-metoxibenzoic), PICLORAM (acidul 4 amino-3,5,6-tricloro-2piridincarboxilic), AMCA (acidul 2-metic-4-clorfenoxiacetic).
ACTIUNEA FIZIOLOGIC A AUXINELOR
1. Creterea n lungime a celulelor (mrirea plasticitii pereilor celulari);
2. Permeabilizarea membranelor plasmatice;
3. Influene pozitive asupra sintezei ARN ribozomal;
4. Stimuleaz diviziunea celular (alturi de citochinine);
5. Influeneaz sinteza de etilen;
6. Influeneaz creterea celulelor n tropisme;
7. Implicate n fenomenul de dominan apical, caulinar;
8. Aciune inhibitoare asupra cderii frunzelor i fructelor;
9. Aciune rizogenstimularea butailor n nmulirea vegetativ;
10. Inhib formarea embrionilor somatici.

- 70 -

Folosite n concentraii mici, auxinele dezvolt o aciune benefic asupra creterii celulei
vegetale, pe cnd n concentraii mai mari dezvolt o aciune inhibitoare sau chiar toxic, cazul
dicamba sau 2,4-D, caz n care auxinele de sinteza devin erbicide. Dintre auxinele de sinteza, cele
mai cunoscute i folosite sunt ANA i 2,4-D, fiind, de altfel, i cele mai stabile.
Viteza de degradare i capacitatea de aciune a auxinelor exogene depinde de muli factori:
tipul esutului, natura i concentraia auxinei, fenofaza plantei, organul supus tratamentului i
multe altele, studiile artnd c rdcinile sunt mai receptive la concentraii sczute de auxine, pe
cnd tulpinile, frunzele i fructele (n formare) cer concentraii mai ridicate de auxine.
CITOCHININELE
Hormoni care acioneaz asupra proceselor de diviziune celular, citochininele fac posibil
diviziunea celular, n absena lor, celulele nu se divid deloc. Le gsim n cantiti relativ mari n
organele de reproducere, semine i fructe. n 1955, la 3 luni de la izolarea citochininei, se
sintetizeaz benziladenina/benzilanimopurina/BA/BAP, care va deveni cea mai eficient i
utilizat dintre citochinine. Citochininele native se regsesc n multe extracte vegetale (drojdie de
bere, germeni de porumb, lapte din nuc de cocos). Biosinteza citochininelor se realizeaz n
rdcini i embrioni, n meristeme i se folosesc, de regul, n diluii mari, suportnd bine
autoclavarea.
Tipuri de citochinine:
K sau KIN(CHINETINA sau KINETINA), Z (ZEATINA), BA sau BAP (BENZILADENINA
sau BENZILAMINOPURINA), 2iP (IZOPENTENILADENINA), TDZ (TIDIAZURON).
Ecuaia cunoscut astzi a balaei hormonale n micropropagare este dat de relaia:
AUXINE + CITOCHININE = BALANA HORMONAL
Modificarea balanei hormonale n favoarea uneia sau alteia dintre substane produce urmtoarele
stri de fapt:
Concentraii sporite de auxine poteneaz rizogeneza.
Concentraiile sporite de citochinine poteneaz formarea de muguri i generarea de tulpinie.
Concentraii sporite din ambele poteneaz morfogeneza i procesele de calusare.
ACTIUNEA FIZIOLOGIC A CITOCHININELOR
1. Impulsioneaz diviziunea celular;
2. Stimuleaz formarea de mugurai i tulpinie, n funcie de concentraie i balan;
3. Stimuleaz proteosinteza (au fost gsite citochinine legate de ARN transfer);
4. Rol n prevenia senescenei;

- 71 -

5. Efect antagonic auxinelor, anihilnd dominana apical a mugurelui terminal;


6. Susine capacitatea de supravieuire a inoculilor;
7. Favorizeaz i susine multiplicarea celular;
GIBERELINELE
Giberelinele au fost descoperite n 1926 de KUROSAWA i izolate abia n 1935, cea mai
activ giberelin fiind la acest moment acidul giberelic (AG3). Au o importan mai mic dect
auxinele i citochninele n procesele metabolice, dar au aciune similar cu auxinele, neexercitnd
vreo influen asupra proceselor de elongaie celular (ca auxinele).
Seminele conin cea mai mare cantitate de gibereline, cele imature fiind cele mai bogate n
fitohormoni. Folosirea giberelinelor n culturile in vitro se face cnd se urmrete favorizarea
alungirii meristemelor caulinare, apicale i cnd se fac culturi de meristeme la specii precum tomate
sau cartof. Dei nu s-a demonstrat c absena giberelinelor n mediul de cultur poate provoca
deservicii, totui, absena giberelinelor n mediul de cultur poate genera un fenomen de cretere
globuloas.
ACTIUNEA FIZIOLOGIC A GIBERELINELOR
1. Produc alungirea internodiilor tulpinilor i a rahisului inflorescenelor;
2. Ajut la nlturarea fenomenului de nanism;
3. Rol n reglarea nivelului endogen de auxin;
4. Suprimarea latenei la nivelul seminelor, mugurilor sau organelor de rezerv;
5. Aciune complex n antez;
6. Rol n formarea fructelor partenocarpice;
7. Rol n germinarea seminelor;
8. AG3 nu exercit vreo aciune asupra rizogenezei.
ETILENA
Fitohormon recent recunoscut, identificat ns din 1901 de NELJUBOV, etilena este o
hidrocarbur nesaturat gazoas ce a fost greu de identificat n celule deoarece fructele verzi au un
coninut mic de etilen (mai mult etilen gsim n fructele n coacere). Auxinele naturale
stimuleaz biogeneza de etilena iar la nivelul culturilor in vitro etilena intensific activitatea
auxinelor endogene sau exogene.
Mai puin utilizat n culturile in vitro deoarece este gazoas, etilena se folosete sub form
de acid 2-cloroetilfosfonic (ACEP). Etilena este ns prezent i n recipientele de cultur i
explantele care sufer de fenomenul de vitrificare (hiperhidrie) au o productie de etilen care duce
la lignificarea vaselor lemnoase i rigidizarea peretilor celulari parenchimatici.
ACIUNEA FIZIOLOGIC A ETILENEI (cercetrile continu pe acest subiect)

- 72 -

1. Control asupra creterii permeabilitii membranelor plasmatice;


2. Stimuleaza cderea frunzelor, coacerea i cderea fructelor;
3. Influeneaz deschiderea florilor, ofilirea i decolorarea;
4. Induce senescena esuturilor;
5. Intervine n transportul auxinei;
6. Celulele supuse traumelor produc i eman etilen;
7. Stimuleaz rizogeneza adventiv;
8. Inhib creterea n lungime a rdcinilor;
9. Influeneaz geotropismul rdcinilor;
10. Stimuleaz creterea izodiametric a celulelor.
ACIDUL ABSCISIC (ABA)
Rar utilizat, are rol de inhibare a creterii, i prezint, totui, un rol important n viaa
cormofitelor;
ACIUNEA FIZIOLOGIC A ACIDULUI ABSCISIC
1. Produce inhibiie asupra creterii i dezvoltrii embrionilor, mugurilor i meristemelor;
2. Implicat n procese de laten a organelor de rezerv, mugurilor i seminelor;
3. n concentraii sczute, AAB inhib efectele AIA i ale giberelinei;
4. BIOSINTEZA AAB se afl n frunze (n toate etapele dezvoltrii plantei);
5. Utilizat n mic msur n culturile de esuturi.
SUGGESTED AMOUNTS AND KINDS OF VITAMINS, HORMONES AND
SUPPLEMENTS USED WITH THE MINERAL SALT MEDIA
MS (15)
mg
L
Inositol Nicotinic Acid 100
Pyridoxine HCI Thiamine 0.5
0.5
HCI Glycine
0.1
IAAa
2.0
NAAb
1-30
Kinetin
2,4-Dc
0.04-10
p-CPAd
Compound

ER (28)
mg
L
0.5
0.5
0.5
2.0
1.0
0.02

B5 (29)
mg
L
100
1.0
1.0
10.0
0.1
0.1-l.O

SH (26)
mg
L
1000
5.0
0.5
5.0
0.5
2.0

a Indoleacetic acid.
b Naphthaleneacetic acid.
c 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid.
d p-chlorophenoxyacetic acid.
IN VITRO, Vol. 12, No, 7, 1976, PLANT TISSUE CULTURE MEDIA /O. L. GAMBORG, T. MURASHIGE, T.
A. THORPE, AND I. K.VASIL

- 73 -

5.5. Compuii fenolici, compuii antivirali i extractele vegetale


Compuii fenolici sunt compui toxici, eliberai n special de speciile lemnoase, n mod
special n condiii de stres, i care prin aciunea lor antagonic substanelor de cretere, inhib
reaciile metabolice, oprind creterea i potennd fenomenul de dorman indus de AAB,
senescena i necroza, ceea ce duce la periclitarea culturii.
Eliminarea lor n mediul de cultur se face att de ctre celulele agresate ct i de ctre
explantul n general, de celulele din profunzimea sa. ntreg procesul se poate sintetiza sub forma:
Fenolii se elimin oxideaz brunifcarea mediului necrozarea celulelor moartea
inoculilor.
PREVENIA se realizeaz prin cteva tehnici recomandate, dar i aici, cercetrile continu
1. Operarea a 2-3 culturi succesive, repasri i mediu nou;
2. Precultivarea meristemelor pe medii de cultura lichide, timp de 3 zile, la 15C,
lumin continu la 500 lucsi, i apoi trecere pe mediu solid;
3. Adugarea n mediul de cultur a unor substane antioxidante: cisteina, HCl, acid
ascorbic, acid citric, DDT(ditiotreitol);
4. Adugarea n mediul de cultur de crbune vegetal;
5. Pstrarea n ntuneric a explantelor inoculate pentru o perioad scurt de timp.
Optarea pentru una sau alta din soluiile de mai sus ine de specia n discuie i de
coninutul su n fenoli i compui toxici, de gradul de interaciune al plantei la procedeele de
micropropagare i de mediul folosit.
Extractele vegetale
Extractul de drojdie de bere, hidrolizatul de cazeina, sucul de portocale, sucul de tomate,
laptele din nuca de cocos, extractul de mal, extractul de endosperm imatur de porumb etc. sunt
doar cteva dintre substanele auxiliare care se folosesc n mai mic sau mai mare msur n
culturile in vitro. Se utilizeaz de regul n concentraii scazute (de 0,1-1 g.l). Exist reacii
necunoscute ale acestora n mediul de cultur urmare a necunoaterii complete a compoziiei
chimice, astfel nct recomandrile sunt nc limitate, dar cercetrile continu, stimulate de
coninutul de vitamine, aminoacizi i minerale pe care aceste substane le au i care pot aduce un
beneficiu de nutriie explantelor in vitro.
Compuii antivirali
Folosirea lor are drept scop obinerea de culturi libere de viroze. Dintre aceti compui
amintim ribavirina, DHT (2,4-dioxohexahydro - 1,2,5-triazina) care prezint, ns, fitotoxicitate iar
eficacitatea este condiionat de tipul de virus, specia virusat i chiar de cultivar (BOXUX 1995).

- 74 -

n acest sens, folosirea compuilor virali n compoziia mediului de cultur n scopul limitrii
reaciilor oxidative este o procedura puin ntlnit n practica curent, cercetrile efectuate pn
acum au vizat specii ca Cymbidium, Prunus sp. sau Malus sp..
Agarul
Produs natural, polizaharid obinut din alga roie Gelidium amansii care triete n
Oceanul Indian i Marea Chinei, agarul aduce un procent suplimentar de elemente chimice (Ca i
Mn), influennd potenialul osmotic i difuzia nutrienilor i este cel mai cunoscut agent gelificator
utilizat n prepararea mediilor de cultur. l gsim comercializat sub diverse forme, solzi, fibre sau
pulbere. Se folosete n concentraii variabile, n funcie de reeta de mediu folosit, ntre 0,6-1%
(Street, 1977)
Crbunele activ
Are diverse recomandri de la autorii de specialitate i l vom gsi n mediul de cultur al
speciilor lemnoase recalcitrante la micropropagare, folosit pentru reducerea emisiei de fenoli sau n
mediul de nrdcinare, n cazul unor culturi de apexuri i antere sau n cazul culturilor de conifere.
Concentraiile n care este folosit variaz de la 2-5%.
5.6. Prepararea mediilor de cultur i pH-ul
Pentru evitarea erorilor de cntrire sau msurare, mai ales n cazul substanelor care intr n
componena mediilor de cultur n concentraii de ordinul M sau mM, se utilizeaz soluii stoc
corespunztoare fiecrei mari grupe de substane.
Dintre acestea, enumerm: soluie stoc de macroelemente, soluie stoc de microelemente;
soluie stoc de chelat de fier, soluie stoc de vitamine; soluie stoc de aminoacizi i soluie stoc de
hormoni.
n condiiile n care concentraia normal se notaz cu X, soluiile stoc pot avea concentraii
de 10 ori mai mari (10X), 100 de ori mai mari (100X) sau 1000X. Cu ct cantitatea de substan
dintr-o soluie este mai mic, de ordinul gram/l, cu att soluia stoc va fi mai concentrat. Dac n
mediul de cultur Murashige&Skoog, KNO3 are concentraia de 1.900 mg/l, soluia stoc de
macroelemente pentru mediul MS de 10X va avea o concentraie KNO3 de 19.000 mg/l.
Soluiile stoc sunt specifice pentru fiecare mediu de cultur iar soluia stoc de
macroelemente are, de regul, concentraia de 10X, cea de microelemente de 1.000X iar vitaminele
100 X. Pentru calculul volumului de soluie stoc se folosete urmtoarea formul:
Y ml soluie stoc = Volumul de mediu (ml)

Concentraia cerut

C soluiei stoc (g/l)

- 75 -

n funcie de specificul laboratorului i diferitele tipuri de medii pe care le preparm, acestea


pot avea concentraii NORMALE de sruri notate cu X, pot fi dublu concentrate notate cu 2X, sau
pot avea concentraia de sruri redus la jumtate, caz n care se noteaz cu X/2. Pentru uurarea
muncii n laborator, pentru fiecare tip de mediu de cultur se ntocmete o schem de preparare a
mediului de cultur n care se calculeaz la nceput toate componentele mediului, urmnd ca la
fiecare preparare s se urmreasc doar tipul soluiei stoc i cantitatea final din aceasta.
Pentru uurarea preparrii soluiilor stoc, n condiiile n care n laborator se folosesc mai
multe medii de cultur i exist implicit mai multe soluii stoc (macro, micro, vitamine), se prepar
i o soluie mam a unei anumite substane, din care se vor lua cantitile necesare pentru soluia
stoc propriu zis. Soluia mam se realizeaz prin cntrirea pentru fiecare sare a unei cantiti
constante (de regula 100g pentru macroelemente i 10 g pentru microelemente) care se dizolv ntrun volum cunoscut de soluie ( de regula 1 l), ajungndu-se la concentraii de 100 g/l, respectiv
10g/l. Pentru a prepara soluia stoc propriu zis de 1000X, 100X sau 10X, se dilueaz un anumit
volum din fiecare soluie mam n funcie de srurile care intr n compoziia soluiei stoc
respective.
Formula folosit pentru calculul soluiei mam este:
Z ml soluie mam = Volumul soluiei (mg/l)

Concentraia soluiei stoc

C soluiei mam (g/l)


Prin folosirea celor dou tipuri de soluii, se uureaz munca de preparare a mediului de
cultur i se evit pe ct posibil erorile care pot aprea. n practica curent se pot folosi i medii de
cultur gata preparate, care se pot achiziiona de la firme de profil, dar care au ns costuri
substanial ridicate.
La prepararea soluiilor stoc pot aprea precipitai insolubili care au drept cauz adugarea
incorect n soluii a srurilor de Ca. Alturi de soluiile stoc de macro i micro elemente, un
compus de baz al mediului de cultur este Chelatul de fier.

- 76 -

SCHEMA DE PREPARARE A MEDIULUI


DE CULTUR
Substrat (sigla)..preparat n datapentru faza
..
speciaml
de
substrat
necesarirecipiente.
ml/recipientpH msuratpH dorit.pH corectat
cu

COMPONENTE
CONC.
DORIT

CONC.
SOL.
STOC.

ml(g)
Cant.
pt 100 Totala
ml
ml(g)

Sruri minerale
MACRO
MICRO
CHELAT DE FIER
Vitamine/aminoacizi
AMESTECINOZITOL
Altele
Gibereline
GA-3
ALTELE
Auxine
ANA; AIA; IBA
ALTELE
Citochinine
BENZILADENIN
(BAP)
ALTELE
Diverse

Zaharuri
ZAHAROZ
ALTELE
Subst gelifiante
AGAR
ALTELE
Pentru a fi accesibil plantelor, Fe trebuie s fie legat de un agent de chelatare, care n cazul
culturilor in vitro este Na2EDTA, sarea disodic a acidului etilen-diamiono-tetra-acetic

- 77 -

(C10H14N2O8Na2.2H2O). Ca sursa de Fe, se folosete sulfatul feros cu 7 molecule de H2O,


FeSO4.2H2O. Raportul dintre sulfatul feros i agentul de chelatare trebuie s fie de 1:2.
O alt component de baz sunt vitaminele, ale cror soluii stoc au concentraii cuprinse
ntre 100 - 1.000X. Diveri autori de medii de cultur au propus reete proprii care nsoesc mediul
respectiv.
Substanele care determin sensul evoluiei explantelor i anume, cele fitoregulatoare, se
gsesc i ele sub form de soluii stoc n diferite concentraii care se dilueaz n momentul folosirii
pn la concentraia dorit. Solvenii folosii se regsesc de cele mai multe ori alturi de reetele de
preparare a soluiilor care n final, n mediul de cultur, au concentraii cuprinse ntre 0,1 10mg/l.
Ph-ul i precipitarea mediilor de cultur
Mediul de cultur necesit un pH prietenos dezvoltrii vieii i derulrii proceselor
metabolice modificate din interiorul vaselor de cultur. Determinarea pH-ului mediului de cultur
se face nainte de a se adauga substanele solide, prin msurarea cu pH-metrul calibrat
corespunztor. De obicei, valorile pe care mediul de cultur le are se ncadreaz ntre 5,5 5,8,
excepie fcnd recomandrile speciale pentru alte valori cum ar fi organogeneza care cere un pH
de 7 pentru inducerea mai bun a mugurilor adventivi - i lucrrile de cercetare. Pentru reglarea
pH-ului, se folosete fie NaOH 0,1 N i se adaug picturi de substan n mediul aflat pe o plit cu
agitator magnetic pn se atinge valoarea dorit, fie HCl

n condiiile n care din anumite

considerente pH-ul are valori prea mari i trebuie redus.


Exist situaia n care mediul precipit urmare a ionilor bivaleni de Fe care precipit i
oxideaz n Fe trivalent, precipitat sub forma de ion fosfat feric. Apare turbiditatea i pH-ul scade
cu 0,2 0,5 unitati. Coreciile se fac cu citrat de Na (variaia este limitata la 0.15 uniti pH), dar
pe acest subiect, cercetrile continu.
Importana unui pH corect stabilit este dat de faptul c el influeneaz gradul de
solidificare a mediului i gradul de absorbie a elementelor nutritive i/sau hormoni.
Odat ce pH-ul a fost corectat i adus la valorile necesare, se adaug restul de substane,
agarul i zaharoza i se nclzete pn acestea se dizolv complet. Tehnologia de preparare se
evideniaz n cadrul lucrrilor practice.
5.7. Probleme care apar n mediile de cultur
Folosirea substanelor termolabile n compoziia mediului de cultur, a cror sterilizare nu
se poate face prin autoclavare, este posibil prin adugarea acestora n mediu ulterior autoclavrii,
cnd temperatura mediului ajunge la o valoare de 35-37C.

- 78 -

n cadrul procesului de producere a mediului de cultur pot surveni o serie de probleme care
pot periclita att lotul de mediu necesar inoculrii sau altei faze din micropropagare, ct i ntreaga
cultur ulterioar.
Precipitatele insolubile
Nerespectarea ordinii la amestecare a unor compui duce la formarea fosfailor insolubili.
Frecvent, srurile cu calciu se dizolv i se folosesc pentru prepararea unor soluii stoc
separate de cele de macroelemente i se adaug doar n momentul preparrii mediului. Formarea de
precipitat n mediu cu pH-ul n jur de 5,6 la adugarea compuilor cu calciul i fosforul. Pentru
reducerea riscului precipitrii se mai recomand s se foloseasc soluii stoc de macroelemente mai
diluate (10X).
Infeciile
Infeciile sunt cele mai periculoase evenimente care pot s apar i, n funcie de momentul
apariei lor, putem identifica cel puin cauza primar care a dus la acest eveniment n scopul
reglementrii problemelor.
Sursele infeciilor pot fi soluii stoc nvechite, vase de cultur nesplate i nedezinfectate
corespunztor, autoclavare necorespunztoare, lipsa cureniei n camera de preparare a mediului
amd.
CATEGORII DE INFECII / PROBLEME DIN MEDIILE DE CULTUR:
1. origine micotic: fructificaii de diferite culori (negru Aspergillus sp., verde-albastru
Penicillium sp.)
2. origine bacterian: n mediu i la suprafaa lui, n zona de contact cu planta, se formeaz
un halou translucid, de culoare alb glbuie;
3. brunificarea mediului: provocat de oxidarea fenolilor emii de plant sau a altor substane
toxice eliminate de specie;
4. vitrificarea/sticlozitatea: proces ce se produce n recipientele de cultur, relativ
controversat i nc n studiu;
5. deshidratarea mediului: arat o umiditate necorespunztoare n recipientul de cultur.
Nesolidificarea mediului dup rcire este o alt problem care poate aprea n procesul de
producie. Din cauzele care ar putea genera aceast problem enumerm: prea puin agar (sub 56g/l), un pH prea mic (sub 5,5) sau o temperatur de autoclavare prea mare.

- 79 -

Test de autoevaluare
1. Avnd n vedere cele nvate n acest capitol i innd cont de spaiul
avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la urmtoarele
ntrebri:
a) Ce este mediul de cultur?
b) Enumerai cteva dintre cele mai cunoscute medii de cultur.
c) Compoziia mediului de cultur.
d) Enumerai compuii anorganici din mediul de cultur.
e) Enumetai compuii organici care intr n compoziia mediului de
cultur.
f) Care este rolul fitohormonilor i a fitoregulatorilor n micropropagare?
g) Care este aciunea fiziologic a auxinelor, citochininelor si
giberelinelor?
h) Care este rolul soluiilor stoc n prepararea mediilor de cultur?
i) Care sunt limitele de pH recomandate pentru mediile de cultur?
j) Care sunt categoriile de infecii i alte probleme care pot aprea n
mediile de cultur i cum se manifest ele?
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de nvare.

- 80 -

Dup parcurgerea acestui capitol trebuie s reinei:

Cel mai utilizat mediu de cultur la nivel mondial este obinut


n 1962 de ctre T. Murashige i F. Schoog, i are iniialele
MS.

Dup constituie, mediile de cultur pot s fie lichide, solide i

semisolide. Componenta care le difereniaz este agarul,


folosit ca agent de solificare.

n componena mediilor de cultur intr sruri minerale,


glucide, vitamine, fitohormoni, ap. Fiecare element chimic i
substan din mediul de cultur are un rol bine definit n
evoluia ulterioar a explantului.

Direcia de evoluie a explantului este dat de raportul dintre


fitohormoni (auxine/citochinine/gibereline)

Mediile de cultur pot fi achiziionate de la firme specializate


sau pot fi preparate n propriul laborator, caz n care, pentru
evitarea erorilor de msurare i cntrire, se recomand
utilizarea soluiilor stoc.

pH-ul mediului de cultur este recomandat s se situeze ntre


valorile 5,5 5,8, analiza acestuia fiind fcut nainte de
adugarea sursei de carbon i agentului de solidificare (acolo

unde este cazul).

Ca n orice activitate, pot aprea i probleme la prepararea


mediilor de cultur, una dintre acestea fiind infeciile.

- 81 -

5.8. Comentarii i rspunsuri la teste


ntrebarea nr. 1
a) Mediul de cultur este un suport pentru susinerea vieii la explante n
condiiile recipientelor de cultur i are nevoie de o serie de atribute pe
care s le ndeplineasc pentru a putea fi asociat unui protocol de
micropropagare sau unei specii
b) Dintre cele mai cunoscute medii de cultur, retinem: B5 (Gamborg i

colab.

1968),

N6

(Chu,

1978),

Nitsch&Nitsch

(NN,

1969),

Quoirin&Lepoivre (QL, 1977), DKW (Driver&Kuniyuki, 1984) i WPM


(Lloyd & McCown, 1980) - ultimele fiind recomandate n special pentru
speciile lemnoase i pomicole, compoziia lor variind n limite relativ mici.
c) Odat desprit de planta mam, explantul va avea nevoie de condiii de
mediu speciale pentru evoluie, de asepsie total, de mediu complet steril i
de hran adecvat, adic acea soluie nutritiv complex format din ap,
sruri minerale (macroelemente i microelemente) - substane anorganice
i substane organice (glucide, vitamine, fitohormoni, agar etc).
d) Cantitatea de substan folosit n eleborarea mediilor a mprit aceste
elemente n MACROELEMENTE - C, O, H, N, P, S, K, Ca, Mg i
MICROELEMENTE - Fe, Mn, Zn, Al, B, Cu, Mo, Na, Co, I. Proporiile
n care acestea se folosesc n mediile de cultur se aleg conform cu scopul
urmrit, fie folosind reetele deja consacrate, fie prin tatonri personale.
e) Cele mai importante surse organice care intr n componena acestor
medii i pe care le folosim sunt: zharoza/glucoza, aminoacizi, vitamine,
extract de drojdie, fitohormonii/substanele reglatoare de cretere, cazeina,
sucuri naturale i agarul, regsite n mediu n funcie de tipul celulelor
cultivate sau de tipul explantului, de scopul culturii i de rezerva proprie de
hormoni ai explantului.
f) FITOHORMONII produc modificri la nivelul proceselor de
morfogenez, organogenez, embriogenez, cu urmri n dezvoltarea

celular, tisular, organic, diferenierea celular sau la nivelul ntregii


plante. FITOREGULATORII sunt regulatori chimici, organici, compui de
sintez care imit efectele hormonilor naturali, devenind indispensabili
n biotehnologiile vegetale.

- 82 -

g) ACTIUNEA FIZIOLOGIC A AUXINELOR: creterea n lungime a


celulelor; permeabilizarea membranelor plasmatice; influene pozitive asupra
sintezei ARN ribozomal; stimuleaz diviziunea celular; influeneaz sinteza
de etilen; influeneaz creterea celulelor n tropisme; implicate n fenomenul
de dominan apical, caulinar; aciune inhibitoare asupra cderii frunzelor i
fructelor; aciune rizogenstimularea butailor n nmulirea vegetativ;
inhib formarea embrionilor somatici. ACIUNEA FIZIOLOGIC A

GIBERELINELOR: produc alungirea internodiilor tulpinilor i a rahisului


inflorescenelor; ajut la nlturarea fenomenului de nanism; rol n reglarea
nivelului endogen de auxin; suprimarea latenei la nivelul seminelor,
mugurilor sau organelor de rezerv; aciune complex n antez; rol n
formarea fructelor partenocarpice; rol n germinarea seminelor; AG3 nu
exercit vreo aciune asupra rizogenezei. ACIUNEA FIZIOLOGIC A
CITOCHININELOR: impulsioneaz diviziunea celular; stimuleaz formarea
de mugurai i tulpinie, n funcie de concentraie i balan; stimuleaz
proteosinteza (au fost gsite citochinine legate de ARN transfer); rol n
prevenia senescenei; efect antagonic auxinelor, anihilnd dominana apical a
mugurelui terminal; susine capacitatea de supravieuire a inoculilor;
favorizeaz i susine multiplicarea celular;
h) Pentru evitarea erorilor de cntrire sau msurare, mai ales n cazul
substanelor care intr n componena mediilor de cultur n concentraii de
ordinul mol sau mmol, se utilizeaz soluii stoc corespunztoare fiecrei mari

grupe de substane.
i) De obicei, valorile pe care mediul de cultur le ia se ncadreaz ntre 5,5
5,8, excepie fcnd recomandrile speciale pentru alte valori cum ar fi
organogeneza care cere un pH de 7 pentru inducerea mai bun a mugurilor
adventivi - i lucrrile de cercetare.
j) Categoriile de infecii sau probleme care apar n mediile de cultur sunt:
origine micotic: fructificaii de diferite culori (Aspergillus sp.,Penicillium):
origine bacterian: n mediu i la suprafaa lui, n zona de contact cu planta;
brunificarea mediului: provocat de oxidarea fenolilor sau a altor substane
toxice eliminate de specie; vitrificarea/sticlozitatea; deshidratarea mediului.

- 83 -

5.9. Lucrare de verificare nr. 5


INSTRUCIUNI
Lucrarea de verificare solicitat, implic activiti care necesit cunoaterea
Unitii de nvare nr. 5. Rspunsurile la ntrebri vor fi transmise
tutorelui pentru comentarii, corectare i evaluare. Pe prima pagin a lucrrii
se vor scrie urmtoarele: Titulatura acestui curs (MICRONMULIREA
PLANTELOR HORTICOLE), numrul lucrrii de verificare, numele i

prenumele studentei (studentului). Fiecare rspuns va trebui s fie clar


exprimat i s nu depeasc o jumtate de pagin.
ntrebrile la care trebuie s rspundei sunt urmtoarele:
Ce este mediul de cultur?
1) Enumerai cteva dintre cele mai cunoscute medii de cultur.-1p
2) Compoziia mediului de cultur.-1p
3) Enumerai compuii anorganici din mediul de cultur.-1p
4) Enumerai compuii organici care intr n compoziia mediului de
cultur. -1p
5) Care este rolul fitohormonilor i al fitoregulatorilor n micropropagare?1p
6) Care este aciunea fiziologic a auxinelor, citochininelor si
giberelinelor?-1p
7) Care este rolul soluiilor stoc n prepararea mediilor de cultur?-1p
8) Care sunt limitele de pH recomandate pentru mediile de cultur? -1p

9) Care sunt categoriile de infecii i alte probleme care pot aprea n


mediile de cultur i cum se manifest ele?-1p
* Un punct se acord din oficiu.

5.10 Bibliografie minimal


1. Cachia Cosma Dorina, Petrescu Corneliu, Curs de biotehnologii, Academia Universitar
Atheneum, Bucureti, 1993
2. D. Hoza, 1997, Biotehnologie pomicol.
3. A.Rou, 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaii n amelioare, Ed. Ametist.
4. F. Stnic, 1999, Micronmulirea plantelor horticole i alte tehnici de cultur in vitro,
Editura Grand;

- 84 -

UNITATEA DE NVARE NR. 6:


FAZELE PROPAGRII IN VITRO
CUPRINS
6.1

Obiectivele unitii de nvare nr. 6

85

6.2

Etapa 0: Pregtirea materialului vegetal n vederea prelevrii explantului

86

6.3

Etapa 1: Iniierea i stabilizarea culturii

90

6.4

Etapa 2: Multiplicarea

92

6.5

Etapa 3: nrdcinarea

93

6.6

Etapa 4: Aclimatizarea

94

6.7

Comentarii i rspunsuri la teste

96

6.8

Lucrare de verificare nr. 6

98

6.9

Bibliografie minimal

98

6.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 6


Prin studierea acestei uniti de nvare vei fi n msur s:

Cunoti etapele multiplicrii in vitro.

Deprinzi tehnicile i metodele de lucru pentru fiecare etap n


parte.

Fii avertizat asupra rigorilor i limitrilor dar i a riscurilor pe


care le presupune fiecare etap n parte.

Recomanzi cele mai bune procedee de lucru pentru fiecare


etap n parte pentru asigurarea reuitei procedurilor.

- 85 -

6.2. Etapa 0: Pregtirea materialului vegetal n vederea prelevrii explantului


Etapele micropropagrii au fost sistematizate n 5 faze, dup ali autori 4, dar toi au czut
de acord asupra coninutului acestora. Acestea sunt: pregtirea materialului vegetal, iniierea i
stabilizarea culturii, multiplicarea culturii, nrdcinarea i aclimatizarea. nainte de orice activitate
de laborator, se execut o etap pregtitoare, o etapa documentar, care se dovedete a fi crucial
pentru desfurarea cu succes a ntregului proces.

Se va consulta

literatura

de

specialitate, se vor face cercetri asupra materialului care se supune procesului de micropropagare,
se rspunde la o serie de ntrebri referitoare la tipul de cultur dorit, natura, mrimea i numrul de
inoculi, natura i proveniena explantului, gradul de dezvoltare a plantei mam, fenofaza, condiiile
de cretere, mediul de cultur ales i compoziia acestuia precum i variaiile la care va fi supus. Se
execut o serie de activiti standard de laborator privind necesarul de lucru, tipul de instrumentar

- 86 -

necesar procedurii ce urmeaz a se desfura n etape repetitive. n urma documentrii i a stabilirii


protocolului de lucru, se statueaz regimul culturii, factorii reglabili ca temperatura, umiditatea i
lumina fotoperioad, precum i particularitile tehnice ale ntregului proces.
MORFOLOGIA EXPLANTULUI
Pregtirea materialului vegetal pentru prelevare i inoculare presupune analiza morfologiei
lui, confirmarea faptului c explantul este viu, c nu este necrozat, c nu sufer modificri de esut
sau esuturi mecanice distruse. De asemenea, ideal este s prezinte zone cu esut meristematic
bogat.
n scopul realizrii unei fie tehnice complete, se vor nota:
Originea explantelor, specia, varietatea, clona sau linia;
Determinarea ecologic a provenienei plantei donor: cmp deschis, sere, solarii, camere de
cretere, depozite sau culturi primare;
Expoziia pe planta donor a segmentului folosit;
Studiile efectuate n scurta istorie a acestei tinere ramuri a biotehnologiilor sunt n msur s ofere
deja direcii clare n ceea ce privete evaluarea explantelor:
Se recomand ca explantele s fie recoltate din poriunile tinere ale plantei donor.
Se consider c plantele din spaiile nchise au anse de infestare mai mic.
Se consider c exist o corelare ntre localizarea explantului pe planta mam i
contaminarea cu germeni duntori (distana fa de sistemul radicular), tiindu-se c
zonele cele mai expuse agenilor patogeni sunt rdcinile. De asemenea, cea mai ridicat
capacitate regenerativ tim la aceast dat c o au cotiledoanele, hipocotilele i muguraii.

Variabilitatea de reacie
n funcie de biotipurile unei specii, de soiurile alese sau de varieti precum i n funcie de
de originea sa biologic (morfologic, funcional sau de fenofaz i sezon), explantul poate
manifesta o mare variabilitate de reacie n micropropagare, aceasta provenind din considerente
morfo funcionale ca:
Zona de prelevare: vrful, mijlocul sau baza ramurii;
Ramur umbrit sau nu, solarizat sau nu;
La plante lemnoase: zonele mai apropiate de polul radicular sunt cele mai bine
aprovizionate cu ap, hran i hormoni;
Prezena meristemelor: vrfuri, rdcini, noduri, bractee, inflorescene, apexuri.
De asemenea, atunci cnd se preleveaz segmente de plante sau organe ce vor fi supuse
micropropagrii, se va ine cont i se menioneaz ca aspect important privind condiionarea

- 87 -

fiziologic a segmentului i condiiile ecologice, acestea avnd un rol important n aspectul


variabilitii.
Totipotena celular
Principiul care st la baza micropropagrii se numete totipotena celular i reprezint
capacitatea fiecrei celule vegetale de a se reproduce identic n forma iniial a celulei care a
generat-o, principiu care d posibilitatea multiplicrii plantelor din varii tipuri de segmente, organe
sau esuturi. Teoretic, toate celulele vii ale plantei sunt totipotente dar aceasta vine i cu preul unei
variabiliti genetice uluitoare.
Sintetiznd principiiile care stau la baza micropropagrii, putem spune c natura esuturilor
componente reprezint suma variabilitilor structurale i funcionale uriae pe care le posed planta
i care se manifest prin principiul totipotenei celulare. Acesta permite manifestarea regenerrii la
nivelul inoculilor i, n final, diferenierea celular.
Vrsta plantei donor sau a organului din care se preleveaz
Reprezint un aspect important n faza de documentare i pregtire a materialului de
inoculat iar riscul prelevrii din plante btrne este prezent sub forma infeciilor i virozelor mult
mai agresive. n condiiile n care avem de-a-face cu o plant donor btrn, exist procedee care
ajut la prelevarea de organe din planta respectiv, stimulnd metabolismul:
Tratamente termice;
Stimularea drajonrii (juvenilizarea);
Regulatori de cretere;
Regim special de iluminare;
Culturi de plant mam n regim de termoterapie;
Momentul recoltrii
Este crucial i limitat, chiar la o unic fenofaz. Recoltarea de material destinat
micropropagrii se poate face:
n cursul germinaiei seminelor;
ntr-un anumit moment din formarea celulelor generative la nivelul inflorescenei;
Punctual, la un moment dat n timpul creterii frunzelor, fructelor sau seminelor;
n perioada de laten a mugurilor;
Recolatarea explantelor ar trebui s se fac conform recomandrilor manualelor de
specialitate, cu respectarea condiiilor menionate pentru specia, genul, familia sau cultivarul
respectiv, n funcie de sezon, existnd o serie de factori care intervin i modific starea biologic i
echilibrul fiziologic al explantului.

- 88 -

Plantele lemnoase din climat temperat pun probleme mari n ceea ce privete perioada de
recoltare a materialului vegetal pentru inoculare, reuita acestei operaiuni depinznd de sezon,
momentul recoltrii i condiiile pedoclimatice.
Mrimea explantului
Dimensiunea explantului la recoltare se cere a fi minim, la limit, dar s se asigure totipotena
celular. Ea este standardizat pentru fiecare specie sau soi, n funcie de natura explantului,
fenofaza plantei donor sau a organului din care se preleveaz.
Prelevarea explantului n bune condiii i ndeplinind parametri de calitate se face i n baza
unor cunotine temeinice de anatomie vegetal precum i urmare a cunoaterii amplasrii
esuturilor care se vor preleva, a structurii botanice a speciei.
La nivel industrial, acolo unde volumul de activitate este foarte mare, se prefer s se
lucreze cu apexuri i meristeme apicale datorit faptului c aceste dou categorii prezint rata cea
mai mare de propagare, cu cele mai mari creteri sau cele mai mici anse de infectare datorit
prezenei meristemelor. Un explant de dimensiuni mari nseamn i pericolul de infecie mai mare
dar i o deshidratarea accentuat, n ciuda avantajului c promite o regenerare mai rapid n mediul
de cultur.
Pe de alt parte, atunci cnd se preleveaz explantul, se ine cont de faptul c o suprafa de
contact mai mare cu mediul de cultur nseamn o mai bun asigurare a schimburilor gazoase, o
mai bun absorbie a hranei i a apei.
STERILIZAREA MATERIALULUI VEGETAL
Este principala activitate a etapei 0 din micropropagare i reprezint cheia unei inoculri
corecte i evoluiei satisfctoare a unei culturi, fiind realizat cu scopul de a elibera esutul ce
urmeaz a fi micropropagat de agenii patogeni. Succesul asepsizrii depinde de foarte muli factori,
dintre care amintim:
selectarea corect a metodei de asepsizare, n funcie de explant, de tipul de esut cu care se
lucreaz i toate celelalte aspecte listate n capitolul anterior;
substanele alese pentru sterilizare, innd cont c sunt esuturi fragile, foarte tinere sau, din
contr, lemnoase, greu de sterilizat; se folosesc ageni chimici, n diferite concentraii n
funcie de natura explantului, de tipul lui.
concentraia acestora n raport cu timpul de expunere la substana activa i cltirile
ulterioare;
durata de timp alocat asepsizrii.

- 89 -

De asemenea, se va ine cont de FACTORII care influeneaz tipul de asepsizare i care au


fost discutai pn acum: specia; condiiile ecologice; organul; esutul; poziia n plant; vrsta i
fenofaza plantei n momentul recoltrii esutului vegetal ce urmeaz a intr n laborator.
Sterilizarea materialului vegetal trebuie s fie suficient de puternic pentru a elimina
bacterile sau microorganismele pe care le posed explantul, nivelul de toxicitatea nu trebuie s
distrug ns esuturile explantului sau s produc necroze, deoarece asigurarea hranei va fi
ntrerupt n aceste cazuri i decesul explantului este garantat. ndeprtarea dezinfectantului trebuie
s se fac cu uurin, s poat fi curat complet de pe esut, asigurnd astfel o rat mare de succes
la iniierea culturii. n condiiile n care procesul de sterilizare nu a fost efectuat corespunztor se
poate ntmpla situaia ca la a doua sau a treia repasare s apar infecii. Considerate latente, ele
sunt generate de micoplasme, de fungi aflai n esuturile profunde ale organelor, de bacterii sau
chiar virusuri i aduc pagube mari lotului micropropagat.
Tipuri de dezinfectani agreai i testai deja n laboratoarele de micropropagare sunt
alcoolul, hipoclorit sodiu, hipoclorit de calciu, apa oxigenat, apa bromat, azotat de argint, clorura
mercuric i antibioticele. Ele se folosesc n funcie de recomandrile literaturii de specialitate i
scopul propus.
Sterilizarea materialului biologic se face la hot, n mediu complet steril, conform
procedurilor stabilite inial. ndeprtarea agentului sterilzant se va face tot la hot, alturi de toate
celelalte operaiuni. Se reine c pstrarea materialului, a explantului, n stare submersa mai mult
timp dect este recomandat de literatura de specialitate produce prin anaerobioz necrozarea
esuturilor i moartea materialului vegetal.
6.3. Etapa1: Iniierea i stabilizarea culturii
Inocularea presupune introducerea explantului sterilizat, aseptic, n medii de cultur sterile
preparate anterior i presupune dou subfaze: sterilizarea materialului i inocularea materialului.
Procedurile i tehnicile de lucru necesare parcurgerii acestei etape sunt standardizate internaional i
specifice n acelai timp fiecrui laborator n parte, n funcie de regimul de lucru al laboratorului,
de volum i de ncadrarea sa ca didactic sau tiinific. Se va ine cont de protocolul de lucru la hot
i protocolul de lucru n spaile aseptice, de procedurile care trebuiesc urmrite atunci cnd
operatorul se afl n lucru la hot, asigurndu-se c flxul operaiunilor se desfaoar constant,
ritmic, ordonat, fr sincope.

- 90 -

ETAPE
Manipularea explantului se face cu grij, cu instrumentar sterilizat i RCIT n prealabil.
Indiferent de cultura urmarit sau de mediul folosit (ne referim la cel solid acum), la inocularea in
vitro a explantelor se va respecta polaritatea: polul caulinar plasndu-se n afara mediului. Plasnd
explantul orizontal sau uor oblic (la inoculi meristematici apicali sau axilari- se va cuta a se
pune n contact mediul cu suprafaa secionat) suprafaa de contact va fi mai mare i se va asigura
astfel o rat de absorbie a hranei mai bun. Explantul se introduce uor n mediul de cultur, ct s
prezinte stabilitate i s nu se rstoarne la urmtoarele manipulri efectuate n decursul procedurii.
Recipientele se etaneizeaz, se eticheteaz i se trimit n camera de cretere.
STABILIZAREA
Literatura de specialitate cunoate deja detalii amnunite privind culturile in vitro la o serie
ntreag de specii horticole sau dendrologice, tatonrile i experienele dezvoltate artnd care
perioad de incubare i cretere variaz n funcie de tipul culturii, specia i natura explantului
folosit, condiiile din camera de cretere i protocolul folosit.
n aceast etap a micropropagrii, explantul se afl n spaiul camerei de cretere, cu factori
de mediu controlai i i acomodeaz procesele metabolice conform compoziiei mediului de
cultur n care a fost inoculat.
Creterile survenite n aceast etap se raporteaz la mediul de cultur folosit i la
tipul de cultur iniiat, fiind urmrite calitatea materialului vegetal, starea de turgescen, starea de
sntate precum i gradul de evoluie. Creterile sunt gestionate i influenate de balana hormonal,
astfel nct, pentru culturile de calus, spre exemplu, se vor folosi auxine i citochinine n
concentraii mai ridicate, pentru lstarii adventivi, procent mai ridicat de citochinine, pentru lstarii
laterali, citochinine n cantitate mai mic sau deloc, n funcie de natura explantului.
n acelai timp, aceasta este perioada n care infeciile apar n condiiile unei dezinfecii
necorespunztoare sau a unui mediu de lucru septic. Indiferent de tipul de cultur iniiat, se
estimeaz c avem o stabilizare a culturilor n primele 14 zile de la inoculare, dup aceast dat,
infeciile care survin sunt puse pe seama infeciilor latente, a virusurilor n mod special. Categoriile
de infecii i alte probleme ce pot s apar n mediul de cultur sunt:
infecii de origine micotic, origine bacterian
brunificarea mediului
vitrificarea/sticlozitatea;
deshidratarea mediului
Etapa de stabilizare a culturiii in vitro presupune i evidenierea tuturor factorilor de mediu
care intervin, a modificrilor de stare in vivo sau ex vivo fa de arealul de cultur i se recomand a

- 91 -

se efectua notri zilnice n ceea ce privete evenimentele care survin asupra culturii n sine, n
scopul evidenierii succesului sau eecului iniierii i validitii protocolului de lucru atunci cnd
vorbim de un laborator de cercetare.
PARTICULARITI
n studile efectuate asupra plantelor s-a evideniat c explantele generate din plante
ierboase genereaz primele manifestri vegetative la 14 zile maxim de la inoculare, fa de
explantele provenind de la plantele lemnoase care manifest vegetativ la 40-60 de zile.

6.4. Etapa 2: Multiplicarea


Denumit i subcultivare sau repicare, reprezint transferul sau pasarea inoculilor pe medii
proaspete sau alte medii, cu compoziie diferit (prezint n reeta de cultur hormoni), prin
realizarea de subculturi. Este considerat o operaiune indispensabil n toate ramurile
biotehnologiei.
n general, schema de evoluie a explantelor n funcie de cultur i tipul de mediu este:
Meristemele apicale i apexurile caulinare tulpinie cu rdcinue vitroplantule (similar
nmulire vegetativ butai);
Nod, internod i alte segmente de organe mugurai tulpinie;
n industria micropropagrii se folosete termenul de coeficient de multiplicare i reprezint
raportul dintre numrul lstarilor pui la multiplicare i numrul final al lstarilor obinui pn la
finalul etapei i este strns legat de tipul mediului de cultur i de condiiile de mediu.
Subculturile se realizeaz prin: desprirea culturii generale, transformarea tulpinielor n
noi inoculi prin microsecionare sau separarea glomerulelor cum se produce la orhidee.
Multiplicare clonal presupune detaarea materialului biologic din cultura iniial i
multiplicarea lui de cte ori este nevoie, pe medii cu aport de citochinine.
Culturile de calus se repic periodic, fragmentate, pe medii proaspete cu adaus de auxine.
La culturile de rdcini multiplicarea se opereaz periodic, obligatoriu prin tieri n masa
radicular i transferarea apexurilor pe medii lichide, n caz contrar, cultura moare.
Un eveniment nedorit care poate aparea in aceasta etapa a culturilor in vitor este senescenta
culturii, mbtrnirea i epuizarea ei. Are diverse cauze printre care amintim carene provenite din
hrnirea neadecvat a celulelor din mediul de cultur, epuizarea proprietilor mediilor de cultur
sau chiar toxicizarea mediului de cultur.

- 92 -

Unul din criteriile care poate aduce un aport considerabil de reuita culturii in vitro este
momentul optim de repasare. MOMENTUL multiplicrii se va alege n funcie de scopul culturii,
de natura i tipul culturii i de particularitile de reacie a explantelor aflate n recipientele de
cultur, literatura recomandnd pentru cteva specii timpii optimi pentru a se determina acest
moment. Pentru a recunoate o cultur care necesit repasare, trebuie s fim ateni i s urmrim
modificrile de stare survenite n cultur:
calusul devine brun, cenuiu sau se usuc;
frunzuliele bazale se nglbenesc;
crete gradul de vscozitate al suspensiilor celulare.
6.5. Etapa 3: nrdcinarea
Reprezint etapa de pregtire a materialului vegetal pentru trecerea in vivo, n spaii
protejate nti i apoi n cmp prin stimularea apariiei sistemului radicular. Plantele rezultate din
tehnicile de multiplicare in vitro au rdcinuele glabre, fr periori absorbani, ceea ce va face
dificil urmtoarea etap, aclimatizarea. Scopul acestei etape este de a forma rdcini ct mai
sntoase i multe, pentru a permite creterea rezistenei plantei la aclimatizare.
Mediul de nrdcinare folosit are auxine n concentraii mari i gibereline, adaos de crbune
vegetal i zaharoz n concentraie redus. Acest mediu permite limitarea lstririi axilare,
stimularea alungirii lstarilor i, cel mai important, inducerea rizogenezei i formarea rdcinilor.
Aspectul cel mai important este cel al caracterului rdcinilor, care fiind foarte slab
dezvoltate pun probleme mari de adaptabilitate. i, odat ce planta este scoas din mediul su de
cultur, procesele metabolice se modific, iar administrarea hranei plantei va trece n atribuiile
sistemul radicular.
Din aceste considerente se urmrete cuplarea etapei de nrdcinare cu aclimatizare, mai
ales la speciile recunoscute ca fiind tolerante la nrdcinare (portaltoii de mr, GF 677 sau gutuiul
Colt). PROBELEMELE ce pot s apar la nrdcinare sunt generate de mediul cu auxine care
poate produce inhibiia plantelor i regresul evoluiei acestora. Ca metod de limitare a inhibiiei, se
tempereaz aceast tendin printr-un tratament inductiv cu auxine cencentrate i abia apoi se trece
la introducerea n mediul de nrdcinare.

6.6. Etapa 4: Aclimatizarea


Considerat una din cele mai dificile sau critice etape din micropropagare, aclimatizarea
este ultima faz a micropropagrii i const n pregtirea plantelor pentru mediul ex vivo.

- 93 -

Ca procedur, manualele de specialitate recomand plasarea lstarilor nrdcinai n


substraturi, depozitarea lor n spaii cu umidiate ridicat i factori de mediu strict controlai (n
special temperatura), fortificarea lor i creterea n cmp pentru cteva luni pentru ca, n final, s se
ajung la livrarea materialului sditor.
Etapa este critic i dureaz aproximativ dou sptmni i poate prezenta cazuri de eec n
aclimatizare, mai ales urmare a nesplrii corespunzatoare a agarului de pe rdcini, substan care,
odat rmas pe rdcini, va constitui principala surs de infecii i bacterioze. Acestea vor debilita
tnara plant, pn la eliminare. De asemenea, ghivecele i containerele n care se mut noile plante
vor trebui sterilizate, pentru a limita posibilitile de infectare. n aceste condiii, se fac tratamente
cu fungicide, se folosete ceaa artificial pentru a ridica umiditatea mediului iar substratul care se
folosete pentru ghivece necesit i el caliti multiple: s fie uor, poros, s rein apa, s permit
distribuia rdcinilor rapid, s nu se taseze amd.
Exist situaii ntlnite la unele specii, cnd plantele scoase din faza de nrdcinare intr n
repaus, caz n care se face tratament cu gibereline 200 ppm, pentru scoaterea acestora din repaus.
Concluzionnd, pentru aceast etap se reine c problema major este deshidratarea
plantelor i uscarea lor, problem care se gestioneaz n condiii de spaii controlate, cu instalaii
necesare modificrii condiiilor climatice.

- 94 -

Test de autoevaluare
1. Avnd n vedere cele nvate n acest capitol i innd cont de spaiul
avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la urmtoarele
ntrebri:
a) Care sunt etapele micronmulirii?
b) Care sunt factorii ce influeneaz sterilizarea materialului vegetal?
c) Enumerai tipurile de dezinfectani agreai n micropropagare?
d) Detaliai etapa 1: iniierea culturii in vitro.
e) Detaliai etapa de multiplicare in vitro.
f) Detaliai etapa de nrdcinare a explantelor.
g) Detaliai etapa de aclimatizare a plantelor.
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de
nvare.

Dup parcurgerea acestui capitol trebuie s reinei:

Etapele micropropagrii sunt: pregtirea materialului vegetal,


iniierea culturii, multiplicarea, nrdcinarea i aclimatizarea.

Toate etapele sunt la fel de importante n tehnologia de obinere a


plantelor in vitro.

naintea oricrei faze se va face o documentare complet i


complex, care va ine cont de toi factorii care influeneaz

evoluia ulterioar a culturii in vitro.

Pentru faza de iniiere, se folosesc de regul, medii de cultur fr


hormoni, notate de cele mai multe ori cu sigla mediului urmat de
semnul (-) [ex: MS (-)].

Faza de multiplicare presupune folosirea mediilor de cultur cu


hormoni de cretere, notate de cele mai multe ori cu (+) dup
sigla mediului de cultur.

Faza de nrdcinare presupune folosirea unui mediu de cultur


care conine hormoni de nrdcinare, de regul auxine.

Faza de aclimatizare presupune existena unor incinte speciale cu


posibilitatea meninerii i corectrii tuturor factorilor de vegetaie.

- 95 -

6.7. Comentarii i rspunsuri la teste


Intrebarea 1
a) Etapele micropropagrii au fost sistematizate n 5 faze, dup ali autori
4, dar toi au czut de acord asupra coninutului acestora. Acestea sunt:
pregtirea

materialului

vegetal,

iniierea

stabilizarea

culturii,

multiplicarea culturii, nrdcinarea i aclimatizarea


b) Se va ine cont de FACTORII care influeneaz tipul de asepsizare i

care au fost discutai pn acum: specia; condiiile ecologice; organul;


esutul; poziia n plant; vrsta i fenofaza plantei n momentul recoltrii
esutului vegetal ce urmeaz a intra l laborator.
c) Tipuri de dezinfectani agreai i testai deja n laboratoarele de
micropropagare sunt alcoolul, hipoclorit sodiu, hipoclorit de calciu, apa
oxigenat, apa bromat, azotat de argint, clorura mercuric i
antibioticele. Ele se folosesc n funcie de recomandrile literaturii de

specialitate i scopul propus.


d) Inocularea presupune introducerea explantului sterilizat, aseptic, n
medii de cultur sterile preparate anterior i presupune dou subfaze:
sterilizarea materialului i inocularea materialului. Procedurile i tehnicile
de lucru necesare parcurgerii acestei etape sunt standardizate internaional
i specifice n acelai timp fiecrui laborator n parte, n funcie de
regimul de lucru al laboratorului, de volum i de ncadrarea sa ca didactic
sau tiinific.
e) Denumit i subcultivare sau repicare, reprezint transferul sau pasarea
inoculilor pe medii proaspete sau alte medii, cu compoziie diferit
(prezint n reeta de cultur hormoni), prin realizarea de subculturi. Este
considerat o operaiune indispensabil n toate ramurile biotehnologiei.
Schema de evoluie a explantelor n funcie de cultura i tipul de mediu
este: Meristemele apicale i apexurile caulinare tulpinie cu
rdcinue vitroplantule (similar nmulire vegetativ butai);

Nod, internod i alte segmente de organe mugurai tulpinie;

- 96 -

f) Reprezint etapa de pregtire a materialului vegetal pentru trecerea in


vivo, n spaii protejate nti i apoi n cmp prin stimularea apariiei
sistemului radicular. Plantele rezultate din tehnicile de multiplicare in
vitro au rdcinuele glabre, fr periori absorbani, ceea ce va face
dificil urmtoarea etap, aclimatizarea. Scopul acestei etape este de a
forma rdcini ct mai sntoase i multe, pentru a permite creterea
rezistenei plantei la aclimatizare.

g) Considerat una din cele mai dificile sau critice etape din
micropropagare, aclimatizarea

este ultima faz a micropropagrii i

const n pregtirea plantelor pentru mediul ex vivo.


Ca procedur, manualele de specialitate recomand plasarea lstarilor
nrdcinai n substraturi, depozitarea lor n spaii cu umidiate ridicat i
factori de mediu strict controlai (n special temperatura), fortificarea lor
i creterea n cmp pentru cteva luni pentru ca, n final, s se ajung la
livrarea materialului sditor.

6.8. Lucrare de verificare nr. 6

- 97 -

INSTRUCIUNI
Lucrarea de verificare solicitat, implic activiti care necesit
cunoaterea Unitii de nvare nr. 6. Rspunsurile la ntrebri vor fi
transmise tutorelui pentru comentarii, corectare i evaluare. Pe prima
pagin a lucrrii se vor scrie urmtoarele:
Titulatura

acestui

curs

(MICRONMULIREA

PLANTELOR

HORTICOLE), numrul lucrrii de verificare, numele i prenumele

studentei (studentului). Fiecare rspuns va trebui s fie clar exprimat i


s nu depeasc o jumtate de pagin.
ntrebrile la care trebuie s rspundei sunt urmtoarele:
1) Care sunt etapele micronmulirii?-0,5p
2) Care sunt factorii ce influeneaz sterilizarea materialului vegetal?0,5p
3) Detaliai etapa 1: iniierea culturii in vitro.-2p
4) Detaliai etapa de multiplicare in vitro.-2p
5) Detaliai etapa de nrdcinare a explantelor.-2p
6) Detaliai etapa de aclimatizare a plantelor.-2p
* Un punct se acord din oficiu.

6.9. Bibliografie minimal


1. Cachia Cosma Dorina, Petrescu Corneliu, Curs de biotehnologii, Academia Universitar
Atheneum, Bucureti, 1993
2. D. Hoza, 1997, Biotehnologie pomicol.
3. A.Rou, 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaii n amelioare, Ed. Ametist.
4. F. Stnic, 1999, Micronmulirea plantelor horticole i alte tehnici de cultur in vitro,
Editura Grand;

- 98 -

UNITATEA DE NVARE NR. 7:


METODE DE PROPAGARE IN VITRO A CULTURILOR DE CELULE I ESUTURI
VEGETALE

CUPRINS
7.1

Obiectivele unitii de nvare nr. 7

99

7.2

Organogeneza

100

7.3

Culturile de apexuri

101

7.4

Culturile de minibutai

102

7.5

Culturile de meristeme

103

7.6

Culturile de calus

105

7.7

Microaltoirea

106

7.8

Cultura de embrioni i endosperm

108

7.9.

Cultura embrioni zigotici

110

7.10

Smna sintetic

111

7.11. Cultura de antere, polen, ovare, ovule i esut nucelar

113

7.12. Cultura de protoplati

113

7.13. Comentarii i rspunsuri le teste

116

7.14

Lucrare de verificare nr.7

118

7.15

Bibliografie minimal

118

7.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 7


Prin studierea acestei uniti de nvare vei fi n msur s:

Cunoti principalele tipuri de culturi de celule i s aplici


corespunzator tehnologia de laborator;

Cunoti tipurile de reacii ale speciilor horticole ce rspund


pozivitv la micropropagare i s aplici tipul de cultur
corespunztor speciei.

- 99 -

7.2

Organogeneza
Organogeneza reprezint capacitatea esuturilor vegetale de a forma organe de novo, bazat

pe nuirea celulelor somatice specializate de a dediferenia i a se rentoarce la stadiul de celule


meristematice, capabile de diviziune activ i cu generare de primordii de organe, lstari, frunze,
flori sau pri florale.
Ea se mparte n:
Organogeneza direct/adventiv sau cultura de muguri adventivi;
Primordiile se dezvolt direct din meristemoizii derivai direct din explantul iniial.
Organogeneza indirect, sau regenerarea plantelor prin intermedul calusului;
Celulele explantului iniial se divid i genereaz esut calusal, n care apar meristemoizii,
din care, ulterior dau rdcini adventive.
n practica micropropagrii, un loc aparte l au meristemoizii, celule cu caracteristici
meristematice rezultate n urma diviziunii celulare repetate, cu plasticitate morfogenetic mare,
fapt ce le confer posibilitatea de a forma diferite primordii de organe n condiiile unor factori
climatici diferiti i pe diferite medii de cultur.
Schematic, evoluia plantei prin dediferenierea meristemoizilor se poate lista:
Explant iniial meristemoid primordii de organe
(organogenez direct)
Explant iniial calus meristemoid primordii de organe
(organogenez indirect)
ORGANOGENEZA DIRECT
Folosete diverse organe din plantele selecionate, de la frunze la peiol, hipocotil sau
epicotil, n funcie de ce anume ofer specia, oferind avantajul economic al folosirii oricrui tip de
poriune vegetal.
Literatura de specialitate lanseaz ipoteza a trei faze n cadrul organogenezei directe, i
anume: dediferenierea celular, diviziunea celular i dediferenierea primordiilor i formarea cu
definitivare a organelor. n ciuda avantajelor economice, organogeneza are nc nite limitri care
in de instabilitatea culturii. Dei se recomand a se folosi material deja multiplicat in vitro pentru
iniierea acestui tip de cultur, totui, riscul apariiei anomaliilor genetice este mare.
Factorii care influeneaz cultura sunt de mai multe categorii:
Faza de vegetaie n care se afl planta donatoare i mrimea ei, plantele tinere, din primii
ani de via fiind cele mai recomandate;

- 100 -

Dimensiunea explantului se recomand a fi ct mai mare pentru ca rata de supravieuire n


etapele micropropagrii s fie ct mai bun;
Din perspectiva procedurii, pH-ul mediului de cultur trebuie s se situeze n jurul valorii de
7 (fa de celelalte culturi, unde se recomand a fi n jurul valorii 5,5), compoziia mediului
este, de asemenea, important, lumina prin lipsa ei pare c favorizeaz organogeneza (se
recomand tratamente cu ntuneric imediat dup inoculare timp de 7-10 zile)
Metod folosit n micropropagare, necunoscut pe deplin, organogeneza direct nu se
folosete la scar larg datorit mutaiilor genetice ce pot surveni n cadrul procesului i care ar
pune n pericol lotul de plante realizate astfel.
ORGANOGENEZA INDIRECT
Metod de micropropagare care, prin culturi succesive de calus, formeaz meristemoizi i
care, la rndul lor, evolund, formez plante noi. Capacitatea de regenerare a calusului este mare
dup 2 sau 3 subcultivri, n condiiile n care se pstrez anumite condiii de iluminare lumin de
intensitate slab.
Factorii care influeneaz organogeneza indirect sunt n primul rnd cei genetici, care in de
specie i chiar de soi dar i de capacitatea de calusare, dei aceasta este o nsuire a tuturor speciilor.
Plantele manifest eterogenitate mare n privina reaciei de calusare i exist specii care caluseaz
slab, mai bine sau foarte bine. Condiiile biologice n care se afl planta, starea de sntate, starea
fiziologic, vrsta, tipul explantului, sunt, de asemenea, criterii definitorii pentru organogenez.
Prezena auxinei 2.4D n mediul de cultur, a fitohormonilor, este o condiie esenial a formrii
unei culturi n organogeneza indirect.
Tehnic incomplet cunoscut, organogeneza indirect a dat rezultate bune la unele specii ca
Malus pumila, Prunus amigdalus, Actinidia sp., sau Prunus insititia.
7.3. Culturile de apexuri
Considerat cea mai rspndit cultur in vitro, este prima dintre culturile aplicabile la toate
speciile, soiurile i cultivarurile, cu excepia plantelor reticente la acest procedeu. Asociat cu
termoterapia, cultura de apexuri este un procedeu bun pentru realizarea de culturi libere de virusuri
att la portaltoi ct i la soiuri, avnd la baz prezena meristemelor apicale. Dup cum se tie,
meristemele prezint cea mai mic rat de infectare cu ageni patogeni. Explicaia privind aceast
reacie nu este pe deplin i satisfctor oferit de oamenii de tiin, dar una din ipotezele care
explic aceasta devirozare este asocierea la cultura de apexuri prin meninerea ramurilor sau a
plantelor donor n temperaturi pn n pragul biologic de suportabilitate (37-39C), reducndu-se

- 101 -

astfel

riscul

transmiterii

virusurilor.

Certificarea materialului sditor ns este o


condiie esenial pentru a fi siguri c
materialul biologic transmis este liber de
virusuri i sntos.
Meristem apical de Hypericum uralum
Credit: Encyclopdia Britannica, Inc.

Cultura folosete ca material vegetal APEXUL, vrful de cretere al unui lstar, segment ntlnit
att la plantele ierboase ct i la lemnoase. De asemenea, se mai pot folosi segmente uninodale,
minibutai de un nod, de dimensiuni mici de civa milimetri, poriuni de lstari obinui prin
secionarea de o parte i de alta a unui nod i eliminarea frunzei aferente.
Controlul hormonal al dominanei apicale presupune participarea tuturor hormonilor - un rol
important avndu-l auxinele biosintetizate n mugurii apicali care, datorit concentraiei mrite din
apropierea mugurilor laterali, au efect inhibitor asupra creterii acestora.
Apexurile au cretere nedeterminat n mediul in vitro astfel nct, cu ajutorul hormonilor i
a balanei hormonale care se va modifica n favoarea auxinelor, neogeneza de lstari ne va da
posibilitatea s avem cu ajutorul acestei tehnici proliferare nelimitat.
7.4. Cultura de minibutai
Culturile de minibutai sunt derivate din culturile de apexuri i sunt specifice i recomandate
speciilor, soiurilor sau cultivarurilor care prezint dominan apical pronunat i au internodii
lungi.
Cu dimensiuni de 1 nod i descrii anterior n cultura de apexuri, butaii prelevai de la
explant se pot aeza n recipientele de cultur i orizontal, iniiindu-se n acest sens o cultur de gen
marcotaj sau microbutire.
Poziionarea explantului orizontal nltur dominana apical i permite creterea mugurilor
n condiiile defolierii prealabile, ceea ce permite avansarea mai multor creteri noi, lstari, toate n
schimbul unei singure creteri apicale. Odat ajuni la o lungine acceptabil, de 5/6 cm, acetia pot
fi trecui n faza de nrdcinare. Metoda se mai numete i marcotaj in vitro.

- 102 -

7.5. Culturile de meristeme


Meristemele sunt esuturi tinere, cu o activitate celular intens n plant, formate din celule
nespecializate funcional, care au diviziune continu i care asigur creterea n lungime i grosime.
Sunt dispuse de obicei terminal, att n partea hipogee ct i n partea epigee a plantelor.
n funcie de poziia lor n plant, meristemele se mpart n mai multe categorii:
Tipuri de meristeme
A. Dup tipul structurii pe care o genereaz
1. PRIMARE (caracter embrionar):
Terminale - vrful rdcinilor i tulpinilor, n muguri; de mare importan la pomii
fructiferi;
Laterale cambiu, strat generator libero-lemnos;
Intercalare - la baza internodiilor de la monocotiledonate;
Foliare n frunzele aflate n curs de dezvoltare (rol major n organogenez);
Adventive n rdcini i parte aerian.
2. SECUNDARE (influeneaz creterea n grosime)
Cambiu i felogen;
3. SPECIALE (localizate la nivelul explantelor cultivate in vitro):
Promeristemul faza timpurie de formare a meristemului cu importan n embriogeneza
somatic;
Meristemoidul aglomerare meristematic nestructurat care poate da natere la diferite
organe;
Embrioidul grup de celule meristematice care genereaz embrioni somatici.
B. Dupa zona n care se gsesc meristemele:
1. RADICULARE
Structura mai simpl;
Funcii limitate;
Categorii: apicale, laterale, adventive.
2. CAULINARE
Mult mai complexe funcional i morfologic;
Culturile de meristeme sunt importante n micropropagare i sunt cutate de productori,
urmare a unor particulariti deosebite ale celulelor meristematice. Vorbim despre perei subiri,
nemodificai, de un nucleu mare i de o mare cantitate de citoplasm i mitocondri, ceea ce permite
o evoluie favorabil n cadrul culturii.

- 103 -

Cultura de meristeme permite o rapid multiplicare a plantelor horticole i o stare bun de


sntate. Plantele generate in vitro provenind din culturi de meristeme care la prelevare au avut
alturat doar dou primordii de frunze sunt, teoretic, libere de virusuri, urmare a metabolismului
accentuat al celulelor meristematice. Pe lang eliminarea virozelor, cultura de meristeme permite i
eradicarea unui numr mare de fungi, micoplasme sau bacterii care pot scpa protocoalelor clasice
de dezinfecie.
Teoriile privind aciunea antiviral a acestui tip de cultur sunt mai multe, dar nu au reuit
s elucideze pe deplin mecanismul prin care, totui, cultura de meristeme asigur cea mai bun rat
de sterilizare i eliminare a virusurilor din plante: competiie ntre celulele gazd i parazit sau
faptul c celulele agresate sunt capabile s elimine virusurile, avnd o rat mai mare de multiplicare
dect a parazitului sau a virusului.
Tehnologia de prelevare i inoculare
Un rol important n prelevarea unui material de lucru optim pentru culturile in vitro l are
epoca de recoltare i se va ine cont de faptul c se recomand evitarea perioadelor de dorman sau
de laten la speciile vizate. Materialul selecionat,
meristemul, se preleveaz din materialul vegetal
sterilizat sub lupa binocular i se inoculeaz n

Meristem apical
Primordii de frunze

recipientele cu mediul de cultur realizat la un pH de


5.5-5.8 i o concentraie de macroelemente aflat la

Meristem excizat
pentru inoculare

jumtate.
Recomandarea pentru unele specii este ca s se in
meristemele timp de 3-7 zile la ntuneric, n scopul limitrii procesului oxidativ, proces deteriorativ
care pune n pericol evoluia culturii.
n camera de cretere, temperatura va varia n funcie de specie: ntre 22C, 25C sau i mai mult,
n cazul viei-de-vie; intensitatea luminoas se va stabili ntre 2.400 - 10.000 lucsi, coniferele cernd
o intensitate luminoas mai mare.
Succesul unei culturi de meristeme depinde de numeroi factori ca: dimensiunea
explantului (0,1 mm la cartof pn la 0,3mm), de localizarea mugurelui, n sensul n care mugurii
poziionai n vrful lstarilor vor avea o rat mai bun de evoluie dect cei cei de la baz care sunt
mai btrni, sezonul de prelevare. La speciile pomicole se va ine seama de satisfacerea nevoii de
frig i de tipul de dezinfecie folosit.
Avantajele culturii de meristeme:
1. Permite nmulirea clonal a materialului biologic valoros, care trebuie conservat, salvat
sau pstrat;

- 104 -

2. Eliminarea bolilor i duntorilor, a visururilor i a altor ageni patogeni;


3. Material nou, juvenilizat, cu capacitate mare de multiplicare;
4. Poate produce material mult, de calitate, care s fie stocat n bncile de gene.

7.6. Cultura de calus


Calusul este o mas neorganizat de celule, mai mult sau mai puin difereniate cu o
capacitate variabil de proliferare, care apare n urma unei rniri mecanice suferit de plant ca
form de aprare i regenerare celular. n culturile de esuturi, calusul este foarte des ntlnit i este
o cultur de baz, el putnd constitui un scop n sine sau o eroare i atunci este un dezavantaj.
Cultura de calus este nc n studiu i tiina urmeaz s rspund la o serie de ntrebri ce
in de evoluia culturilor de calus, a stabilitii genetice a plantelor obinute din culturile de calus,
motiv pentru care, dei este prima cultur ncercat a biotehnologiilor horticole in vitro, ea are nc
multe necunoscute.
Creterea calusului se consider a fi nedefinit, nu se oprete din producere vreodat,
deoarece calusul poate fi nmulit i subcultivat periodic pe un mediu nou, cu o periodicitate de 5-6
sptmni pentru ca celulele s nu i piard viabilitatea.
Generaliti pentru iniierea culturii:
Cultura de calus este parte integrant i faz intermediar a organogenezei indirecte;
Necesit un pH optim: 5.6 6.0 (7 la culturile de Actinidia sp. ) nainte de autoclavare;
Cere o balan controlat ntre concentraiile de auxine i citochinine, de regul auxinele sau
citochininele n exces favorizeaz formarea calusului;
Se recomand utilizarea auxinelor i citochininelor numai n mediu (2.4 D sau ANA);
Sursele de carbon (zaharoz, glucoz, maltoz, galactoz) pot induce modificri la nivelul
diferenierii, precum i n creterea i morfologia calusurilor.
Cultura de calus are trei etape:
1. Inducerea formrii calusului sau faza de inducie.
Pentru inducia calusului, prima etap a culturii de calus, se va
folosi material vegetal de orice tip - rdcini, tulpini, frunze,
flori sau esuturi, dup cum recomand literatura de
specialitate sau dup necesitile cercetrii. Pentru juvenilizare,
se vor folosi cotiledoane, puiet sau embrioni imaturi.
Reacia explantului la cultura de calus este variabil n funcie de tipul morfologic al explantului,
putnd varia capacitatea proliferativ, textura, culoarea sau morfologia celulelor componente.

- 105 -

Pentru a forma calusul, acesta se stimuleaz prin hormonii specifici, auxine, citochinine sau
o combinaie de auxine i citochinine, reet care variaz n funcie de specie. n faza de inducere de
calus, esuturile parenchimatice care reprezint masa calusului intr ntr-un proces de
dedifereniere celular. Trebuie menionat c esuturile meristematice nu au nevoie de procese de
dedifereniere, fiind capabile de diviziune rapid i formarea de calus direct. n aceast faz,
celulele evolueaz n diferite organe: lstari, rdcini sau embrioni somatici.
2. Proliferarea calusului sau faza de diviziune.
Procesul de nmulire al calusului, faza a doua, este direct gestiona de balana hormonilor care se
regsesc n mediul de cultur. Procesul n urma cruia calusul se divide nu este pe deplin cunoscut,
dar se presupune c se formeaz n urma interaciunii hormonilor eliberai de celulele rnite. n
aceast etap, celulele din alctuirea calusului devin meristematice, se divid activ, rapid i scad n
volum.
3. Regenerarea organic sau faza de difereniere.
Este o faz controversat a culturii de calus, urmare a evoluiilor care se petrec n cultura de celule
de calus. n acest moment, rata creterii calusului scade, ajungndu-se la un echilibru ntre creterea
n volum i diviziune.
Faptul c generarea de organe are la baza principiul totipotenei celulare, ne permite astzi
s multiplicm de ordinul unu/zeci de mii plantele, cteva grame de calus putnd genera mii de
neoplantule.
Cu toate acestea, culturile de calus au instabilitate genetic i fiziologic mare, ceea ce
limiteaz cultivarea n scopul conservrii germoplasmei sau pentru multiplicare clonal
(variabilitatea somaclonal este ns intens studiat n acest moment n ameliorare iar
comportamentul celulelor n culturile de calus va da, ntr-un final, rspunsurile necesare).

7.7. Microaltoirea
Ca tehnic a micropropagrii, microaltoirea este recent aprut, urmare a descoperirii
incompatibilitii dintre portaltoi i altoi la multe specii de interes horticol. Ea genereaz plante
mam libere de virusuri i alte boli care ulterior pot fi utilizate ca surs de ramuri altoi pentru
altoirea tradiional. Primul pom liber de virusuri obinut prin microaltoire a fost generat n 1970,
prin microaltoirea la Citrus (Murashige i colab.)
Ca tehnic a micropropagrii, microaltoirea are aplicabilitate pentru diverse scopuri:
1. multiplicarea unor specii care rspund dificil la cultura de meristeme (cire, cais);
2. aproape exclusiv pentru producerea de pomi liberi de virusuri la speciile: piersic, mr,
cais, cire, prun.

- 106 -

Tehnica microaltoirii presupune altoirea in vitro, n condiii ASEPTICE a unui apex


meristematic pe un portaltoi obinut din semine sau din minibutai cultivai tot in vitro prin una din
tehnicile sau metodele de micropropagare care permit acest lucru.
1. OBINEREA PORTALTOIULUI
Portaltoiul se poate obine din semine, din minibutai sau meristeme apicale i laterale,
toate prin tehnici i proceduri de multiplicare in vitro. Un aspect important trebuie acordat ieirii din
dormans, n cazul seminelor, fie prin stratificare, tratamente cu citochinine, gibereline, sau frig. Se
nltur endocarpul cu meninerea tegumentelor seminale, se verific viabilitatea, seminele se
sterilizeaz n etanol 70% timp de 1 min, hipoclorit de sodiu 0.7% clor activ i Tween 20 cu 0.3%,
20 minute i se efectueaz cltiri cu ap distilat steril pentru ndeprtarea agenilor de sterilizare
n totalitate. Urmeaz inoculare pe mediu MS (-) pentru germinare i plasarea lor n camera de
cretere n condiii controlate de temperatur la 20C i ntuneric.
2. PREGTIREA ALTOIULUI
Altoiul care urmeaza a fi inoculat, altoit pe portaltoi, se poate extrage dintr-un apex
meristematic de la lstari crescui n vitro, sau de la ramuri sau lstari obinui in vivo, caz n care se
introduce protocolul de sterilizare.
3. ALTOIREA PROPRIU ZIS
Se nltur cotiledoanele de la portaltoii obinui in vitro, portaltoiul se secioneaz
transversal iar apexul meristematic al altoiului se detaeaz i se plaseaz pe zona inciziei. Noua
cultur se trece ntr-o eprubet steril, pe mediu de cultur steril LICHID, ntr-o atmosfer saturat
de umiditate, pentru a asigura limitarea atacului bolilor criptogamice i pentru a favoriza calusarea.
4. ACLIMATIZAREA
Atunci cnd altoiul atinge dimensiuni de 1.5-2 cm lungime se va trece n faza de
aclimatizare, trecndu-se gradual in vivo, printr-o umiditate relativ a aerului ridicat i controlat.
AVANTAJE acestei tehnici:
Plantele altoite sunt produse ntr-un timp relativ scurt;
Condiiile de cretere (mediul de cultur i camerele de cretere) sunt controlate
eficient;
Util n devirozarea materialului genetic virozat, pentru cazurile n care specia nu
suport termoterapia din cauza riscului de apariie a mutaiilor genetice sau la
speciile care se nmulesc greu in vitro;
Aplicabil speciilor care se nmulesc uor in vitro, dar care nu nrdcineaz;
Avantaj pentru cercetarea tiinific privind compatibilitaile ntre altoi i portaltoi.
DEZAVANTAJELE acestei tehnici:

- 107 -

Este considerat o tehnic pretenioas i preioas, necesitnd un personal nalt calificat.


7.8. Cultura de embrioni i endosperm
Cultura de embrioni sau de segmente embrionare prezint utilitate n cadrul micropropagrii
putnd fi aplicat speciilor care manifest latena seminelor sau n cazul n care avem specii ale
cror semine nu germineaz, chiar puse n condiii favorizante de lumin, temperatur i umiditate.
EMBRIOGENEZA SOMATICA
Embriogeneza este procesul de formare a embrionului fie dintr-un zigot, fie dintr-o celul
somatic - vegetativ sau generativ i se bazeaz pe capacitatea regenerativ a fiecrei celule
vegetale, urmare a principiului totipotenei celulare i a faptului c nu numai embrionul zigotic
genereaza embrion, ci fiecare celul vegetal, chiar haploid fiind. Embriogeneza somatic este
proprietatea general a celulelor cormofite.
Aceasta tehnic a fost lansat ncepnd cu 1958, de Steward i Reinert prin studii pe Daucus
carota i suspensii de celule i a fost completat n 1979 de Thomas i colab., pe studii la
Umbelifere. n acest moment au fost puse n eviden peste 135 de specii cu capacitate
embriogenar, din 81 de genuri i 32 de familii.
Embriogeneza somatic se ntlnete la nivelul calusului, n culturile de celule derivate din
calus sau din culturile de protoplati, la nivelul epidermei, la explante din fragmente de tulpini,
segmente uninodale precum i la fragmente de pistil, hipocotile sau cotiledoane.
EMBRIOGENEZA SOMATIC DIRECT
n cadrul ei, embrionii iau natere din celulele aparinnd esuturilor plantelor care au servit
la iniierea culturii. Embrioni somatici se gsesc att n celule nucelare (Citrus sp.), celule
epidermice, hipocotil (Daucus carota) sau n celulele somatice.
Problema important la cultura de embrioni este MOMENTUL OPTIM pentru recoltarea
izolarea i inocularea embrionilor. Se cunoate deja c la unele specii, pentru cultura de embrioni,
se recomand extragerea timpurie a embrionilor de sub influena plantei mam mpreun cu esutul
nutritiv la hibrizii interspecifici i la soiurile timpurii de piersic.
MEDIUL DE CULTUR folosit n cazul culturii de embrioni necesit atenie n ceea ce
privete regulatorii de cretere, acetia avnd o importan vital n culturile de embrioni somatici.
Lipsa AUXINELOR mpiedic formarea embrionilor somatici n faza de maturare, ns, prezena
auxinelor n mediul de cultur perturb maturarea acestora, recomandndu-se reducerea sau
eliminarea complet a auxinelor din mediu. Pentru unele specii, este important prezena n mediu a
unui raport corect auxine/citochinine (2,4-D). Natura i concentraia glucidelor este alt element vital
al culturii de embrioni, mrirea concentraiei de zaharoz putnd preveni GERMINAIA

- 108 -

PRECOCE a embrionilor somatici. De asemenea, temperatura, lumina i compoziia aerului din


vasele de cultur influeneaz embriogeneza somatic.
Procedura embriogenezei somatice, listat sintetic:
1. Sterilizarea materialului donor;
2. Excizarea embrionului imatur;
3. Inoculare pe mediu;
4. Diferenierea embrionilor somatici n diferite stadii de dezvoltare (globular, cordiform,
torpil, cotiledonar) i suprapunerea diferitelor stadii de evoluie.
Suprapunerea stadiilor de dezvoltare face aproape imposibil automatizarea culturilor, ceea
ce aduce costuri mari de manoper i ridic preul produsului final.
EMBRIOGENEZA SOMATIC INDIRECT
nseamn regenerarea embrionilor somatici din calus i este limitat sau condiionat de
capacitatea de regenerare a fiecrei specii, care este variabil, unele specii regenernd numai
organe, altele numai embrioni somatici i altele ambele categorii. Felul explantului aduce i el un
plus de variabilitate n ceea ce privete aceast capacitate. Vrsta explantului i a plantei donor i
numrul de multiplicri care se opereaz dau, de asemenea, dimensiunea calitii procesului.
Procedura embriogenezei somatice indirecte, listata sintetic:
1. Iniierea culturii de calus;
2. Multiplicarea calusului i identificarea calusului EMBRIOGEN (acesta ridic probleme la
nivel global, deoarece nu sunt nc date certe despre criteriile de identificare i proceduri);
3. Inducia pe un mediu nou de cultur;
4. Formarea embrionilor somatici.
Embriogeneza somatic ca proces n micropropagare, prezint nite condiionri de care se
ine cont n cadrul elaborrii protocoalelor de lucru, a reetelor mediilor de cultur i n stabilirea
condiiilor mediului ambiant n camerele de cretere:

Auxinele n concentraie mare nseamn inducia embrionilor somatici;

Acidul abscisic stimuleaz formarea embrionilor n culturile de calus i celule n suspensie;

Giberelinele i etilena inhib procesele de inducie;

esuturile juvenile favorizeaz ansele formrii embrionilor somatici;

Temperatura ridicat stimuleaz formarea embrionilor somatici;

Laptele de cocos, foarte bogat n citochinine, are un rol important n inducia procesului de
embriogeneza somatic.

- 109 -

Din aceast perspectiv, embriogeneza somatic are i limitri pe care evoluia tiinific
sigur le va depi:

Materialul genetic este relativ instabil n procesele embriogenezei;

Exist riscul apariie de mutaii;

Nerecomandat pentru multiplicarea clonal, urmare a instabilitii genetice manifestate;

Nu se poate aplica tuturor speciilor urmare a faptului c nu toate speciile formeaz


embrioni somatici;

Culturile repetate duc la deprecierea calusului;

Apariia fenomenului de dormans.

Importana embriogenezei somatice:

Embrionul, ca material nmulitor, este structurat morfofuncional (rdcini, tulpini,


mugura);

Viteza uluitoare de propagare, ceea ce permite la o singur inoculare producerea unui numr
foarte mare de plante;

Plantele derivate din embriogenez somatic sunt identic genetice cu donorul;

Creterea plantelor este uniform;

Plantele sunt robuste;

Embrionii pot fi stocai pentru o lung perioad de timp n bnci de gene;

Prezint material important de studiu pentru mutagenez.

7.9. Cultura embrionilor zigotici


Cultura embrionilor zigotici presupune separarea embrionilor zigorici de esutul ovular,
cultivarea acestora n condiii aseptice, pe medii de cultur speciale care poteneaz dezvoltarea
ovulului, n condiii speciale, care asigur creterea i diferenierea embrionar normal. Aprut ca
o necesitate n pomicultur, n scopul obinerii de timpurietate la unele soiuri de drupacee, este o
metod mult utilizat n acest moment n acest domeniu al horticulturii, n scopul elaborrii de noi
soiuri
n mod cauzal,
PROBLEMA este avortarea embrionilor ntlnit n ameliorarea plantelor.
CAUZA o reprezint dereglarile fiziologice din procesul de cretere al seminei i fructului.
REZOLVAREA o aduce embriocultura = cultura de embrioni zigotici.
Ce ofer EMBRIOCULTURA?
Reprezint extragerea embrioniului abia format cu o poriune de esut nucelar sau cultivarea
ovulului fecundat, depindu-se astfel barierele incompatibilitii.

- 110 -

Cu aplicabiliatate n POMICULTUR, embriocultura permite cultivarea unor embrioni


imaturi provenii de la ncrucirile soiurilor extratimpurii i timpurii de smburoase, pentru ca n
VITICULTUR s rezolve imposibilitatea obinerii unor descendeni hibrizi cnd genitorul matern
este un soi apiren n care embrionul avorteaz n mod natural.
Iniierea culturii depinde sau este influenat de mrimea cotiledoanelor i variaz de la
specie la specie, astfel: cire 28/35 de zile de la nflorire, sau dup ntrirea smburelui; viin
29/41 de zile; piersic 81/97 de zile.
MEDIUL DE CULTUR folosit n embriocultur are formula cu att mai complex cu ct
stadiul de dezvoltare al embrionului n momentul prelevrii este mai incipient i se recomand chiar
i folosirea de extracte naturale de endosperm.
Spre deosebire de alte culturi, unde fragilitatea esuturilor impune protocoale rafinate i
dificile de sterilizare n scopul conservrii esuturilor, aici, STERILIZAREA se poate realiza la
concentraii mai mari, deoarece endocarpul i tegumentul permit acest lucru.
Embriogeneza poate folosi embrioni maturi, provenii de la speciile la care smna ajunge
la maturitate i se folosete n scopul obinerii timpurietii la plante, micorndu-se durata
protocolului ameliorativ sau embrioni imaturi, provenii de la speciile care nu ajung s menin
embrionii i este destinat nlturrii intersterilitii sau pentru valorificarea unor genotipuri
valoroase.
Embriogeneza este o cultur realtiv uoar datorit simplificrii dezinfectrii, a mediului de
cultur, spre deosebire de cultura embrionilor imaturi, unde dificultatea apare pe masur ce acetia
sunt mai tineri, ridicndu-se preteniile de cultivare iar rata aclimatizrii plantelor rezultate este
destul de mic.
7.10. Smna sintetic
Creat n folosul embriogenezei somatice, prin generarea unui endosperm artificial care s
protejeze i s hrneasc embrionul, conceptul de smn sintetic a aprut relativ recent i a fost
dezvoltat n scopul conservrii produselor micropropagrii, tiut fiind c plantele produse in vitro
menin o sensibilitate iniial la angajarea n mediul exterior, in vivo. Astfel, smna sintetic are
un nveli de protecie care protejeaz lstarii, butaii i embrionii mpotriva deshidratrii, n primul
rnd, dar i al infeciilor.
Deoarece embrionii somatici i pierd repede valabilitatea, se folosesc gelurile de
ncapsulare cu substane chimice nutritive, regulatori osmotici i pesticide sau se intervine la nivel
tehnologic prin semnarea embrionilor n flux lichid cu ajutorul tehnologiilor puse la punct pentru
culturile in vivo.

- 111 -

Speciile au pretenii diferite fa de nutriie, motiv pentru care nu se pot elabora reete
standardizate pentru alctuirea mediului nutritiv al semiei sintetice, endospermului artificial,
aceasta constituind una din principalele inconveniente ale tehnicii.
AVANTAJE ale seminei sintetice:
1. Permite folosirea i producerea de semine la speciile care nu produc de obicei semine;
2. nlocuiesc seminele hibride;
3. Folosirea unor genotipuri speciale;
4. Importan maxim n ameliorare;
Dintre dezavantaje, amintim:
1. Se deshidrateaz repede i necesit sisteme de nveliuri care s le pstreze umiditatea
relativ;
2. Embrionul este meninut n stare de repaus cu ajutorul unor substane chimice;
3. Semnatul presupune scoaterea embrionului din repaus;
4. Procent variabil spre mic de plante viabile obinute;
5. Pesticizarea seminei trebuie limitat, deoarece la dezvoltarea embrionului, acestea
mpiedic micorizarea.
6. Alginatul de calciu are permeabilitate mare pentru elemente solubile;
7. Rdcinile lstarilor cresc mai lent;
8. Capsulele sunt lipicioase i se manipuleaz greu la semnare.
Procedura de realizare se bazeaz pe aa numita tehnic de ncapsulare, n condiiile
realizrii unei semine ct mai uniforme pentru uurarea mecanizrii. n acest sens, ncapsularea
butailor nu este nc posibil din cauza limitrilor tehnologice. Etape:
Incapsularea embrionilor n alginat de sodiu 2-4%;
Scufundarea embrionilor n alginat de sodiu 2-4%;
mbierea individual n clorura de calciu 50 M, cu pH 7;
La max 30 de minute distan, capsulele se ntresc i pot fi manipulate;
Se pstreaz n condiii de refrigerare, la 3-6 C, n condiii aseptice.
ncapsularea organelor este o extensie a seminei sintetice, putnd fi ncapsulai bulbi
provenii din culturi in vitro, minibutai i rozete de frunze de la diverse specii: kiwi, zmeur, mr,
crin etc. Prin ncapsularea acestuia, materialul vegetal se poate pstra cu cheltuieli mai reduse,
promind economie de spaiu ct i de for de munc.
Tehnica este n explorare, permite deja standardizare, dar are nc de rspuns la ntrebri
privind compoziia subtratului n care se afl i testarea n continuare a speciilor pentru a vedea care
se preteaz la aceast procedur cu cele mai bune rezultate.

- 112 -

7.11. Cultura de antere, polen, ovare, ovule i esut nucelar


O serie de ali cercettori (Gregory, 1940; Taylor, 1950; Nitsh, 1951; Sparrow i
colab., 1955; Maheshwari i Lal, 1958; Vasil, 1957, 1959 i alii) adopt o direcie deosebit de
interesant, aceea a regenerrii i diferenierii de plantule in vitro folosind componente florale,
antere sau grunciori de polen, fructe ori semine imature (Maroti, 1976).
Culturile acestea sunt culturi moderne, aprute odat cu stabilizarea tehnologiei de
micropropagare. Tehnologia pentru cultura de polen i antere este relativ simpl, anterele se
recolteaz i se desprind cnd florile se afl n faza de boboc, se sterilizeaz i se inoculeaz pe
mediu de cultur solid sau lichid.
n cazul culturilor de polen se recomand transferarea periodic a anterelor pe mediu
proaspt pentru a coloniza ct mai multe vase de cultur.
Cultura de ovar, ovuli i esut nucelar este folosit n cazul incompatibilitilor dintre soiuri
sau specii, n condiiile n care mare parte din incompatibiliti provin din disfuncii ale polenului
sau organelor sexuale.
Inocularea OVARELOR se face nainte sau dup polenizare n funcie de compatibilitatea
existent, putndu-se realiza i fecundarea in vitro. Cultura de ovar i ovuli nu este aplicabil direct
n micronmulire, nefiind o tehnic pus la punct ca protocol.
7.12. Cultura de protoplati
Cultura de protoplati este o tehnic de micropropagare relativ recent, cu aplicabilitate
direct n pomicultur, care permite, teoretic, producerea de hibrizi ntre specii i soiuri de orice fel.
Ca procedur, ea presupune unirea n condiii specifice a dou celule crora li se dezagreg
enzimatic (sau mecanic) structura peretelui celular, obinndu-se astfel hibrizi somatici.
Cultura de protoplati se bazeaz pe ingineria genetic, iar interveniile la nivelul celulei fac
posibile transferul de gene, selecia de plante rezistente la agenii patogeni i boli. Ca tehnic,
explantele se trateaz enzimatic pentru a li se distruge peretele celular, proces care se petrece pe
baza presiunii osmotice, pentru ca mai apoi, prin fuziunea protoplatilor s se poat obine noi
celule.
Practic, tehnologia nu este nc pus la punct, avnd nc mai multe limitri, dintre care
enumerm apariia calusului himeric n locul hibrizilor, instabilitatea genetic i selectivitatea
aleatorie.
Dei permite, ca avantaj, obinerea de hibrizi ntre speciile incompatibile natural sau hibrizi
ntre speciile care nu nfloresc sau care nu au timp s i matureze organele, lipsa tehnologiilor de

- 113 -

selecie a plantelor, descendenii instabili genetic, sterili sau chiar cu mutaii fizice, calusul himeric
enunat mai sus i neasigurarea transmiterii caracterelor necesare in, deocamdat, aceast tehnic,
n rezerv.

- 114 -

Test de autoevaluare
1. Avnd n vedere cele nvate n acest capitol i innd cont de spaiul
avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la urmtoarele
ntrebri:
a) Ce reprezint organogeneza?
b) Ce reprezint culturile de apexuri?
c) Definii cultura de minibutai.

d) Detaliai mecanismele prin care culturile de meristeme produc plante


libere de virusuri.
e) Detaliai etapele culturii de calus.
f) Care sunt scopurile microaltoirii?
g) Care este utilitatea culturii de embrion i endosperm?
h) Ce presupune cultura embrionilor zigotici?
i) Definii conceptul de smn sintetic.
j) Detaliai cultura de antere, oavare, ovul, polen i esut nucelar.
k) Definii cultura de protoplati.
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de
nvare.

Dup parcurgerea acestui capitol trebuie s reinei:

Organogeneza reprezint capacitatea esuturilor vegetale


capabile de a dediferenia i poate fi indirect sau direct. St la
baza tehnicilor de nmulire dintre care enumerm pe cele mai
importante: cultura de apexuri, cultura de minibutai, cultura de
meristeme (cea mai important n devirozarea plantelor),
cultura de calus, microaltoirea, cultura de embrioni i
endosperm, cultura de embironi zigotici, smna sintetic,
cultura de antere, ovare, polen, ovule i esut nucelar i cultura
de protoplati.

- 115 -

7.13. Comentarii i rspunsuri la teste


ntrebarea 1
a) Organogeneza reprezint capacitatea esuturilor vegetale de a forma
organe de novo, bazat pe nuirea celulelor somatice specializate de a
dediferenia i a se rentoarce la stadiul de celule meristematice, capabile
de diviziune activ cu generare de primordii de organe, lstari, frunze,
flori sau pri floarale.
b) Cultura folosete ca material vegetal APEXUL, vrful de cretere al
unui lstar, segment ntlnit att la plantele ierboase ct i la lemnoase. De
asemenea, se mai pot folosi segmente uninodale, minibutai de un nod, de
dimensiuni mici de civa milimetri, poriuni de lstari obinui prin
secionarea de o parte i de alta a unui nod i eliminarea frunzei aferente.
c) Culturile de minibutai sunt derivate din culturile de apexuri i sunt

specifice i recomandate speciilor, soiurilor sau cultivarurilor care


prezint dominan apical pronunat i au internodii lungi.
d) Teoriile privind aciunea antiviral a acestui tip de cultur sunt mai
multe, dar nu au reuit s elucideze pe deplin mecanismul prin care,
totui, cultura de meristeme asigur cea mai bun rat de sterilizare i
eliminare a virusurilor din plante: competiie ntre celulele gazd i parazit
sau faptul c celulele agresate sunt capabile s elimine virusurile, avnd o
rat mai mare de multiplicare dect a parazitului sau a virusului.
e) Etapele culturii de calus sunt inducerea formrii calusului sau faza de
inducie; proliferarea calusului sau faza de diviziune; regenerarea organic
sau faza de difereniere.
f) Ca tehnic a micropropagrii, microaltoirea are aplicabilitate pentru
diverse scopuri: multiplicarea unor specii care rspund dificil la cultura de
meristeme (cire, cais); aproape exclusiv pentru producerea de pomi liberi
de virusuri la speciile: piersic, mr, cais, cire, prun. Tehnica microaltoirii

presupune altoirea in vitro, n condiii ASEPTICE a unui apex


meristematic pe un portaltoi obinut din semine sau din minibutai
cultivai tot in vitro prin una din tehnicile sau metodele de micropropagare
care permit acest lucru.

- 116 -

ntrebarea 1
g) Cultura de embrioni sau de segmente embrionare prezint utilitate n cadrul
micropropagrii putnd fi aplicat speciilor care manifest latena seminelor sau n
cazul n care avem specii ale cror semine nu germineaz, chiar puse n condiii
favorizante de lumin temperatur i umiditate.
h) Cultura embrionilor zigotici presupune separarea embrionilor zigorici de esutul
ovular, cultivarea acestora n condiii aseptice, pe medii de cultur speciale care
poteneaz dezvoltarea ovulului, n condiii speciale care asigur creterea i

diferenierea embrionar normal.


i) Smna sintetic are un nveli de protecie care protejeaz lstarii, butaii i
embrionii mpotriva deshidratrii, n primul rnd, dar i al infeciilor.
j) Tehnologia pentru cultura de polen i antere este relativ simpl, anterele se
recolteaz i se desprind cnd florile se afl n faza de boboc, se sterilizeaz i se
inoculeaz pe mediu de cultur solid sau lichid. n cazul culturilor de polen se
recomand transferarea periodic a anterelor pe mediu proaspt pentru a coloniza
ct mai multe vase de cultur. Cultura de ovar, ovuli i esut nucelar este folosit n
cazul incompatibilitilor dintre soiuri sau specii, n condiiile n care mare parte
din incompatibiliti provin din disfuncii ale polenului sau organelor sexuale.
k) Cultura de protoplati este o tehnic de micropropagare relativ recent, cu
aplicabilitate direct n pomicultur, care permite, teoretic, producerea de hibrizi
ntre specii i soiuri de orice fel. Ea presupune unirea n condiii specifice a dou
celule crora li se dezagreg enzimatic (sau mecanic) structura peretelui celular,
obinndu-se astfel hibrizi somatici.

- 117 -

7.14 Lucrare de verificare nr. 7


INSTRUCIUNI
Lucrarea de verificare solicitat, implic activiti care necesit
cunoaterea Unitii de nvare nr. 7. Rspunsurile la ntrebri vor fi
transmise tutorelui pentru comentarii, corectare i evaluare. Pe prima
pagin a lucrrii se vor scrie urmtoarele:
Titulatura

acestui

curs

(MICRONMULIREA

PLANTELOR

HORTICOLE), numrul lucrrii de verificare, numele i prenumele


studentei (studentului). Fiecare rspuns va trebui s fie clar exprimat i s
nu depeasc o jumtate de pagin.
ntrebrile la care trebuie s rspundei sunt urmtoarele:
1) Ce reprezint organogeneza?-1p
2) Ce reprezint culturile de apexuri?-1p
3) Definii cultura de minibutai.-1p
4) Detaliai mecanismele prin care culturile de meristeme produc plante
libere de virusuri.-1p
5) Detaliai etapele culturii de calus.-0,5 p
6) Care sunt scopurile microaltoirii?-1p
7) Care este utilitatea culturii de embrion i endosperm?-0,5 p
8) Ce presupune cultura embrionilor zigotici?-1p
9) Definii conceptul de smn sintetic.-0,5p
10) Detaliai cultura de antere, oavare, ovul, polen i esut nucelar.-1p
11) Definii cultura de protoplati.-0,5p
* Un punct se acord din oficiu.

7.11 Bibliografie minimal


1. Cachia Cosma Dorina, Petrescu Corneliu, Curs de biotehnologii, Academia Universitar
Atheneum, Bucureti, 1993
2. D. Hoza, 1997, Biotehnologie pomicol.
3. A.Rou, 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaii n amelioare, Ed. Ametist.
4. F. Stnic, 1999, Micronmulirea plantelor horticole i alte tehnici de cultur in vitro,
Editura Grand;

- 118 -

UNITATEA DE NVARE NR. 8:


MICROPROPAGAREA IN VITRO A SPECIILOR HORTICOLE

CUPRINS
8.1

Obiectivele unitii de nvare nr. 8

119

8.2

Micropropagarea in vitro a viei-de-vie

120

8.3

Micropropagarea in vitro a speciilor pomicole

121

8.4

Micropropagarea in vitro a speciilor dendro floricole

124

8.5

Micropropagarea in vitro a cartofului

127

8.6

Micoriza si culturile in vitro

128

8.7

Comentarii i rspunsuri la teste

131

8.8

Lucrare de verificare nr.8

132

8.9.

Bibliografie selectiv

132

8.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 8


Prin studierea acestei uniti de nvare vei fi n msur s:

Cunoti cteva din principalele specii horticole care se preteaz


activitilor de micropropagare i s i nsuseti principalele
tehnici de micronmulire a acestor specii.

- 119 -

8.2 Micropropagarea in vitro a viei-de-vie


Literatura de specialitate afirm c la via-de-vie factorul definitoriu l constituie soiul, ca
factor biotic principal (Stamp & colab, 1982, Bdiescu i colab, 1981, Brezeanu i colab. 1982,
Vioiu 2001). Pentru via-de-vie aflat n faza de nrdcinare se recomand un fotoperiodism de 16
ore, ntlnit n toate laboratoarele de cercetare din lume, reducerea acestei perioade antrennd i o
diminuare a ratei de nrdcinare, direct proporional cu scderea cheltuielilor cu energia electric.
n ara noastr exist cercetri efectuate pe micropropagarea la via-de-vie elaborate de Vioiu i
listate n lucrarea de doctorat Tehnologia devirozrii soiuriulor de vi-de-vie roditoare i de
portaltoi prin clonare in vitro 2001.

Potentialul organogen al genului Vitis


GENOTIP

V. vinifera

EXPLANT

Apex

MEDIU

DE REGULATORI

CULTURA

CRESTERE

Mille&Murashige

(3-4)BAP(80) AdS

DE REFERINTE

Harris

meristematic (1976)

Stevenson

Riesling,

Meristem

Murashige&Skoog (2)BAP

Mirancea

Cabernet,

fragmentat

(1962)

colab.(1982)

Meristem

Murashige&Skoog (2) BAP

Mirancea

ntreg

(1962)

colab. (1982)

Apex

Chee

i
i

Feteasc
Riesling

Vitis spp.

Pool (1,1)BAP+(0,09)ANA

meristematic (1982)

Chee i Pool
(1983)
i

V. berlandieri x Apex

Murashige&Skoog (2,25)BAP

Novak

V. riparia

meristenatic

(1962)

Jukova (1983)

V. vinifera

Apex

Stevenson

meristematic Monette (1983)

i (0,023)IBA+(2)BAP+(60)

Monette (1886)

AdS

n ultimii ani s-au dezvoltat tehnici noi care se apropie de embriogeneza somatic n cazul
micropropagrii viei-de-vie. n 1980, Barlass i Skene pun la punct protocolul de multiplicare in
vitro la via-de-vie pornind de la cultivarea pe medii aseptice a fragmentelor de apexuri de cca.
1mm, prelevate din vrful tulpinilor. n 60 de zile de la inoculare au fost generai lstari de 3 cm
care, subcultivai ca butai de 1 ochi, n 10-14 zile au condus la obinerea de cca. 8.000 de plante de
vi-de-vie ntr-un timp total de 3-4 luni. (Bhakwani i Razdan, 1983).

- 120 -

Pornind de la concluzia exprimat n 1983 de Chee i Pool, conform creia, comparnd


speciile V.vinifera, V. Riparia, V. Cinerea, V. Labrusca V. Argentifolia, a rezultat c soiurile speciei
V. vinifera au o capacitate regenerativ net superioar (75%) dect celelalte specii (5-50%), se poate
afirma c folosirea micropropagrii la via-de-vie reprezint o tehnic sigur pentru aceast specie,
care poate permite obinerea rapid de plante devirozate.

8.3 Micropropagarea in vitro a speciilor pomicole


Micropropagarea speciilor pomicole cunoate o real expansiune n cadrul biotehnologiilor,
odat cu rezultatele bune avute de cercettori privind nmulirea fie a speciilor care nrdcineaz
greu, fie a speciilor cu deficiene de polenizare, fie a speciilor care prezint variaie genetic mare i
nu pot fi stabilizate prin metode vegetative de multiplicare.
Efortul cercetrilor s-a ndreptat ctre elaborarea unor medii de cultur care s permit
sporirea ratei de multiplicare a speciei respective precum i stabilitatea clonala, aceasta fiind un
deziderat important n micropropagarea speciilor pomicole folosite ca portaltoi.
Majoritatea mediilor de cultur pentru speciile pomicole sunt solide, urmare a folosirii
agarului ca agent de solidificare, existnd ncercri de folosire a mediului lichid la genul Prunus
pentu faza de multiplicare i nrdcinare ct i la Juglans nigra n scopul lungirii lstarilor
(Heile-Sudholt i colab, 1986).
Medile de cultur sunt pe att mai spectaculoase i permit variaii mari n cercetare, cu ct
conin auxine n diferite concentraii, tiut fiind c rolul acestora n multiplicarea in vitro este
crucial. Dintre fazele micropropagrii, nrdcinarea pune cele mai mari probleme, reetele
ncercate pentru speciile pomicole de interes fiind foarte variate i coninnd stimulatori ai
rizogenezei n varii concentraii.
Putem comenta cteva din cercetrile autohtone privind nmulirea speciilor pomicole
valoroase, cercetri conduse la Institutul de Cercetare i Producie pentru Pomicultur PitetiMrcineni (Teodorescu R., 2005)
Mr
nrdcinare in vitro a portaltoiului de mr D1R57T120 cu rezisten la rapn (Venturia
inaequalis) i finare (Podosphera leucotricha) n 1985;
- culturi in vitro pentru soiurile Pionier, Generos i Ladyspur n 1991;
- lipsa auxinelor n mediu i o concentratie de 2mg/l BAP la portaltoiul MM106 aduce cele mai
bune rezultate culturii n 1983;
- IBA 0,5mg/l favorizeaz nrdcinarea in vitro a MM106, M26 si M9, ntr-un procent mai mare
de 75%;

- 121 -

- cele mai multe cercetri se fac n acest moment pentru nrdcinarea in vitro a microbutailor.
Prun
-

raportul auxine/citokinine se stabilizeaz i produce o rat de multiplicare de 3

microlstari/explant (Ana Spath) i 14 microbutai /explant (Centenar) 1983 i 1985


Cire i viin
- se stabilesc mediile de cultur pentru o serie de portaltoi de cire i viin precum i soiuri;
- se produc culturi in vitro pentru soiurile Bing, Sam, Cerna, Stella (cire) i Chantenmorelle, Nana,
Meteor (viin)
Pr
- se stabilesc mediile de cultur pentru soiurile de portaltoi Alami, Harbuzeti, Cu miez rou i
PC.56; PC.56 a avut i o reacie pozitiv n faza de nrdcinare n mediu suplimentat cu cea
artificial 1987;
Gutui
- microlstarii de la portaltoiul BA.29 au fost nrdcinai pe mediu de cultur fr fitoregulatori,
dup un tratament prealabil cu acid indolilbutiric 10,1 mg/l 1996.
Kiwi
Prima livad din Romnia a fost plantat n 1993 iar de atunci au fost efectuate o serie de
experimente pentru a stabili condiiile optime de cretere. n 1993 a fost nceput la Facultatea de
Horticultur din Bucureti un program de nmulire la kiwi, folosind mai mult de 1000 de plante
hibride obinute de la firma Vitroplant din Cesena, Italia. Cu o experien de peste 30 de ani n
domeniu, Vitroplant din Cesena, Italia, folosete micronmulirea pe scar industrial la Actinidia
arguta, att pentru obinerea de portaltoi ct i pentru obinerea n ameliorare a seminelor.
Actinidia arguta este o specie care se preteaz foarte bine la nmulirea in vitro spre
deosebire de mslin, de exemplu, la care stabilitatea genetic nu este inc sigur. Studiile recente au
scos n eviden prezena unei proteine extrase din fructul de kiwi, numit kiwellin, care manifest
proprieti puternice antialergice. Pentru depirea problemelor aprute n nmulirea clasic a
Actinidiei, dup introducerea n cultur n Europa, o serie de autori au pus la punct diferite tehnici
de micronmulire in vitro.
Obinerea unor rezultate pozitive a fost posibil datorit stabilirii procedurii de sterilizare a
materialului iniial. Astfel, utilizarea n calitate de sterilizant a hipocloridului de sodiu (0,6 - 1,5 %)
timp de 15-30 minute n prezena detergentului Tween 20 de 1% a contribuit esenial la diminuarea
riscului de contaminri. O alt posibilitate de a steriliza fragmentele detaate de la planta -mam
este folosirea diacidului n diferite concentraii i timp de expunere. Astfel, meninerea n diacid de
0,1% timp de 7 minute pentru Actinidia, s-a dovedit a fi optim. Numeroi cercettori au testat un

- 122 -

ir de medii nutritive n scopul optimizrii lor pentru declanarea procesului de morfogenez. Cel
mai des utilizat substrat este mediul Murashige-Skoog (MS). Rugini, E., 2003 recomand de a
utiliza acest mediu n stare semisolid cu adaos de 20mg/l zaharoz, regulatori de cretere ca zeatin
- 4,6 M i IAA- 0,3 M sau 4,6 M - zeatin, 2,9M GA3 i 2,2 M BA. Deseori, n relaie cu
scopul propus, se recurge la reducerea cantitativ a mediului nutritiv pn la 75% ori 50%. Un alt
mediu utilizat n special pentru cultivarea explantelor provenite din frunze i peiol de la Actinidia
este mediul Gamborg B5. Caracteristic pentru el este coninutul mai redus de N, microelemente ca
Fe, Mn, Zn n comparaie cu MS, pe cnd coninutul de K este mai ridicat, ceea ce conduce la
reglarea sporit a permeabilitii membranelor celulare. n mediul Hildebrandt o importan
deosebit i se atribuie azotailor, fosfailor, sulfailor i clorurii de K, Ca, Mg i Na. Pentru
cultivarea Actinidiei n condiii in vitro au fost utilizate i alte medii ca: Standardi, Pieric, WPM,
LQ, Nitsh, Chengs K(h).
Pentru dediferenierea esuturilor n vederea producerii calusului a fost folosit o mare
diversitate de metode i substane. Astfel, Muleo R. i colab. (1990) a indus formarea calusului din
frunz cu 1,0 mg/l de 2,4 D la ntuneric. Ali autori au recurs la folosirea 4PU n doze de 0,1 mg/l.
Acest produs s-a dovedit i un bun stimulator al diferenierii de muguri i lstari pe calusul format.
Formarea calusului din peiol a fost vizibil n cazul adaosului n substratul nutritiv MS a
hormonilor BA (2,2 M) i ANA (0,27 M). O alt variant de inducere a calusului la Actinidia pe
mediul MS din poriuni de tulpin a folosit fitohormonii BAP (0,5-2 ppm) i IAA (0,05 ppm) sau
BAP + zeatin. Combinaiile auxinelor 2,4 D i IAA i a citochininelor BAP i kinetin au fost
testate cu succes pe explantele derivate din tulpin, peiol, frunze i rdcini. ANA (0,0 2 mg/l) i
zeatina (0,1 mg/l) adugate la mediul Standardi (1983) avnd ca explante limbul foliar i peiolul au
dat dovad de un nalt potenial calusogenetic. Majoritatea surselor de specialitate ce analizeaz
influena citochininelor asupra proceselor de organogenez fie direct sau indirect denot faptul c
hormonul folosit cel mai frecvent pentru obinerea calusului de Actinidia este zeatina n doze de 0,5
1,0 mg/l.
n faza de proliferare, diferii autori recomand utilizarea diferitor medii de cultur cu o
combinaie de fitohormoni variabila. O nalt rat de proliferare a lstarilor a fost atestat de
Lionakis S. i Zirari A., (1991), utiliznd mediu lichid suplimentat cu 8,9 M BA i 0,3 M IBA.
Marino G. i Battistini, S. (1990), au demonstrat c BAP cauzeaz hiperhidricitatea frunzelor, efect
ce nu a fost depistat n cazul zeatinei, care a condus nemijlocit la sporirea ratei de proliferare. De
asemenea, o proliferare activ a fost obinut de Pais M. 1987 pe (MS) mediu dup o perioad de
subcultur de patru sptmni cu 0,5 mg/l acid ascorbic, ca antioxidant i 2,3 zeatin, 0,3 IAA.
Segmente de lstari obinui pe acest mediu au fost transferai pe un mediu identic, modificndu-se

- 123 -

coninutul hormonal i anume utilizarea a 5 mg/l de DTT i excluderea acidului ascorbic. Acest
mediu numit H2 a condus la o proliferare activ dup cinci sptmni de cultur.
De cele mai multe ori, obinerea rizogenezei a fost posibil datorit tratrii directe a bazei
lstarilor obinui in vitro cu IBA i apoi transferul lor n sol bine aerat. Diferite concentraii de
auxine au fost utilizate n acest scop cu succes: suplinirea mediului MS cu 2,5 M de IBA timp de 1
lun sau tratarea cu 4,9 M de IBA timp de 20 secunde. Morini S. (1986) a constatat faptul c IBA
n mediul nutritiv, n concentraie 2,5; 4,9; 9,8 M influeneaz direct numrul rdcinilor formate
la Actinidia. Pentru formarea rdcinilor la neoplantulele obinute, autorul recomand utilizarea
variantei cu 2,5 M i plantarea ulterioar a lor n perlit steril. Aclimatizarea plantulelor trebuie
efectuat treptat, reducnd umiditatea n camera de cultivare de la 100% la 80% timp de 30 zile cu
meninerea fotoperioadei de 16 ore zi/8 ore ntuneric.
Sotiropoulos T.E i colab. (2006) au studiat reacia speciei Actinidia deliciosa la prezena n
mediul de cultur a metioninei i a borului (B). Prezena B n substratul nutritiv poate afecta
procesul de organogenez in vitro. Odat cu mrirea concentraiei B are loc creterea ratei de
proliferare a mugurilor.
La specia Actinidia deliciosa var.deliciosa, Harada (1975), folosind 2,4 D sau ANA (0,1-10
mg/l) n cultura de rdcin i tulpin, a obinut embrioizii pn la stadiul globular, cu pierderea pe
mai departe a capacitii de dezvoltare i dedifereniere.
Dezvoltarea metodelor de micropropagare la kiwi constituie o parte considerabil a
programelor de studiere a acestei culturi, care implic tehnici de ameliorare in vitro deoarece
micropropagarea clonal ofera uniformitatea genetic a materialului vegetativ la aceast specie.

8.4 Micropropagarea in vitro a speciilor floricole


Culturile de flori, arbori i arbuti au mare importan i din aceast cauz necesitatea
culturilor intensive este evident. Desigur, majoritatea permit nmulirea pe cale vegetativ, tehnic
standardizat pentru realizarea materialului vegetal, dar care aduce cu ea i inconvenientul major al
propagrii virusurilor sau altor boli precum i o durata mare de producie.
n scopul limitrii propagrii bolilor la speciile floricole se poate folosi cu succes cultura de
meristeme, care permite nmulirea acestora i producerea unui material liber de viroze. n ciuda
faptului c, asociat cu termoterapia, cultura de meristeme elimin multe virusuri, totui, nc nu a
fost descoperit antidotul virusului marmorat al garoafelor, spre exemplu.
Garoafa
Plat decorativ deosebit de apreciat la nivel mondial, este o cultur foarte rentabil n
spaii protejate dar nmulit vegetativ, nu limiteaz transmiterea bolilor de la o plant la alta.

- 124 -

Prima multiplicare in vitro la garoafe a fost fcut n 1957 de Quak, iar aceasta a permis ca astzi s
avem culturi de plante ornamentale fr virusuri. Cele mai bune rezultate la culturile in vitro pe
garoafe s-au obinut cu ajutorul culturilor de meristeme iar studiile au artat c dimensiunea
meristemului joac un rol hotrtor. Pamfil (1984) afirm c dimensiunea de 0,2 mm la meristem
aduce o eficien maxim a devirozrii, procentul acesteia fiind direct proporional i cu gradul de
contaminare al plantei i mrimea meristemului. n plus, cea mai bun evoluie n cultur au avut-o
meristemele apicale (54,44%) fa de cele axilare. Murashige i Shabde (1977) folosesc mediul de
cultur MS modificat, 1mg/l AIA dnd rezultatele cele mai bune alturi de chinetin i tot ei
menioneaz c pentru multiplicarea in vitro a garoafelor, un mare rol l are mediul de cultur, n
mod special macroelementele, hormonii i glucidele.
De asemenea, pentru cultura in vitro a garoafelor se poate practica microbutairea,
obinndu-se 80.000 plante dintr-un singur meristem, ntr-un an, avnd n vedere poziionarea
acestora pe neoplantula iniial (82,78% minibutai de vrf, 51,11% minibutai bazali) i se ofer
astfel o bun stabilitate genetic materialului obinut (Pamfil, 1984).

Crizantema
Cunoatem n acest moment trei metode de nmulire vegetativ in vitro: cultura de
meristeme, care vine i cu avantajul devirozrii plantei, cultura de fragmente uninodale, i cultura
din frunze sau fragmente florale (boboci, elemente florale, peduncul).
Mediul de cultur recomandat pentru cultura crizantemei este pe baza de microelemente
Heller iar condiiile optime n care se dezvolt cultura sunt stabilite la 16 ore lumin/24 ore,
intensitate luminoas de 2.600 lucsi i o temperatur situat la aproximativ 24C.

Saintpaulia Ionatha
Prima ncercare reuit n multiplicarea a Saintpaulia s-a petrecut n 1937, cnd cercettorii
Naylor i Johnson au obinut plante noi din cultivarea pe hrtie de filtru umectat a unor fragmente
de frunze, pentru ca mai trziu, n 1972, s fie generate primele neoplantule in vitro. Mediul de
cultur folosit a coninut o balan echilibrat a hormonilor cu aport de ANA 1mg/l si BA de 1mg/l.
Cercettorii romni de la Centrul de Cercetri Biologice Cluj-Napoca au obinut plante de
Saintpaulia in vitro folosind fragmente de limb foliar sau peiol, acesta din urm avnd ns o rat
lent de multiplicare. Cea mai bun variant de multiplicare pentru Saintpaulia este recomandat de
Cachia Cosma, Petrescu (1993) i const n prelevarea i cultivarea in vitro a unor fragmente de
dimensiune cca. 1 cm din lamina frunzei sau din boboci care, ulterior, se microbutesc. Etapa de

- 125 -

nrdcinare este uor trecut de aceast specie i se recomand substrat anorganic, nisip cu perlit i
mbuntit sptmnal cu soluie ANA pentru accelerarea rizogenezei.

Freesia
O alt specie deosebit de apreciat este freesia, floare des ntlnit pe piaa de consum i
care vine pe sezonul rece, cnd avem puine plante n vegetaie i sortimentul este redus n climat
temperat continental. Din pcate, nmulirea vegetativ la freesia este deficitar, planta producnd
aproximativ 5-6 tuberobulbi, ceea ce asigur o rat de multiplicare foarte mic. Astfel, cercetrile
ndreptate ctre multiplicarea in vitro sunt pe deplin justificate. n 1974 i 1976 se reuete
producerea pe neoplantule de freesie folosind cultura de calus din meristem, tulpin, bulbi i flori,
iar devirozarea plantei a fost posibil prin culturi de meristeme n 1968. Cercetrile efectuate de
Cachia i Lazar (1983, 1984) au pornit de la datele oferite de Pierik i Bajaj (1975) i, folosind
balana hormonal drastic modificat, lipsa hidrolizatului de cazein, agar i zaharoza n minus, au
reuit producerea de noi plante de freesia, observndu-se c bobocii terminali de pe apexurile
inflorescenelor i cei subapicali au o capacitate regenerativ diferit n funcie de poziia acestora
n inflorescen i de natura regulatorilor de cretere folosii. n plus, se recomand ca inoculii
(bobocii sau butonii florali) s fie meninui la ntuneric pentru o perioad de cca 8 sptmni,
pentru ca apoi s fie trecui la lumin continu sau regim 16 ore lumin/24 ore.

Trandafirul
Anual, n Frana, se obin prin multiplicare in vitro ntre 200.000-400.000 plante de
trandafir pornind de la un singur mugure, putnd fi folosite ca plante cultivate pe rdcini proprii
sau pot s furnizeze muguri altoi pentru nmulirea vegetativ clasic. Primele cercetri tatonri
privind nmulirea la trandafiri au fost fcute n 1967 de ctre Hill, n 1968 obinndu-se rezultate
satisfctoare de ctre Iacobs i colab. iar Davies i Wilkowska reliefeaz c un factor decisiv n
multiplicarea in vitro la trandafiri este sensibilitatea soiului care genereaz rspunsuri complet
diferite la modificarea concentraiei de citochinine i auxine.
Este metoda cea mai nou i mai modern de producere a materialului sditor pe rdcini
proprii, pornind de la un mic grup de celule meristematice care se gsesc n vrfurile de cretere ai
mugurilor.
Principiul acestei metode const n extirparea unor esuturi meristematice de dimensiuni
reduse (0,3 mm) luate din vrfurile de cretere i cultivarea lor pe medii artificiale i n condiii de
laborator controlate, n aa fel ca s se obin n final o plant mic cu lstari i rdcini.

- 126 -

n momentul de fa, pe plan mondial, exist sute de laboratoare care se ocup de nmulirea
in vitro a plantelor, printre care trandafirii ocup un loc de frunte. Se apreciaz c se obin anual
peste 25 de mii. de plante prin aceast metod.
n ara noastr s-au fcut cercetri numeroase, mai ales la Institutul de Pomicultur din
Piteti-Mrcineni, prin care s-a reuit elaborarea unei tehnici de nmulire care are ca finalitate
practic obinerea n timp scurt a unor cantiti mari de plante identice din punct de vedere genetic
cu planta mam.
Cercetrile romneti afirm c exist cteva elemente fundamentale de care trebuie s se
in cont la cultura in vitro a trandafirului: sursa de explante (planta donor s fie sntoas,
viguroas i autentic), epoca de prelevare a explantelor, natura explantelor (mugurii subcutanai
dnd cele mai bune rezultate iar mugurii apicali, de cele mai multe ori fiind floriferi) i
specificitatea soiului. Mediul de cultur folosit pentru iniierea culturilor este unul fr auxine sau
cu o cantitate mic (0,004-0,1 mg/; ANA), cantitile mari de auxine genernd cantiti
considerabile de calus la baza explantelor. BAP este un factor limitativ n iniierea culturilor iar
nrdcinarea plantelor se face bine n condiiile n care srurile au fost reduse la jumtate iar acidul
naftilacetic este n concentraie de 0,05-0,1 mg/l (Coman, 1983). Aclimatizarea n condiii normale
aduce ns pierderi la cultura de rosa, dar ca soluie, se poate trece i n mediu anorganic de
turb/mrani cu perlit i stimulare cu Radistim, soluia propus aducnd un procent satisfctor la
aclimatizare 85-92% (Coman, 1983).

8.5 Micropropagarea in vitro a cartofului


Una din speciile serios afecatete de virusuri i care se rspndesc cu mare uurin urmare a
metodelor vegetative de multiplicare este cartoful, specie horticol de mare nsemntate pentru
alimentaia mondiala uman i animal. Astfel, cercetrile n micropropagare privind nmulirea
cartofului au aprut nc din 1954, cnd Norris a realizat primele culturi de meristeme la cartof iar
cercetrile ulterioare au artat ca procentul de plante devirozate scade direct proporional cu
descreterea mrimii explantului meristematic, viabilitatea pe care o prezint inoculul micornduse odat cu diminuarea mrimii acestuia. Prima devirozare complet la cartof a fost obinut n
1973 de Mac Donald dei din 1950 s-a demonstrat c virusul care provoac rsucirea frunzelor la
cartof poate fi inactivat n tubercul, prin tratamente termice cu cldur.
Evoluia micropropagrii la acest specie a trecut i printr-o faz de cercetare care
recomand asocierea mai multor forme de tratamente, termoterapie sau adugarea n substratul de
cultur a unor compui chimici inhibitori virali, antimetabolii. Din pcate, aceasta din urm soluie
nu i-a dovedit eficiena.

- 127 -

Pentru a reui procedura de multiplicare in vitro a cartofului i devirozarea acestuia, trebuie


luate n calcul cteva aspecte: condiiile de cultur, de la compoziia mediului la factorii de mediu,
tipurile de subcultivri, proveniena materialului biologic, soiul i cultivarul, tipul de explant,
dimensiunea acestuia i momentul recoltrii (foarte important dup unele cercetri), condiiile de
total asepsizare i aclimatizarea plantelor, toate acestea fiind, n aceeai msur i piedici n
stabilizarea unei culturi in vitro la cartof. Din pcate, cercetrile nu au reuit s stabilizeze 100%
reuita multiplicrii in vitro la cartof, unele linii din PVX i PVS - dou virusuri care afecteaz
aceast specie, persistnd latent i dup 10 sptmni de tratament cu termoterapie. Rezultatele au
artat c prelungirea termoterapiei peste 6-8 sptmni nu se justific, fiind ineficient. (StaceSmith, 1970).
Multiplicarea in vitro a cartofului se poate face i prin culturi de microbutai, studii n acest
sens fcndu-se i n centrele de cercetare din Romnia folosindu-se procedeele de micropropagare
de la garoafe (Rudelle, 1982).
n faza de aclimatizare, noile plante de cartof se planteaz direct n spaiile acoperite, pe
parapei, n perlit, i se in acoperite cu polietilen timp de 5 sptmni n scopul forrii dezvoltrii
sistemului radicular.
8.6. Micoriza i culturile in vitro
Micoriza reprezint legtura care se stabilete ntre rdcinile plantelor i microorganisme
cu avantaje reciproce pentru cei doi parteneri din perspectiv nutriional. Sunt deja cunoscute
exemplele nodozitilor de la speciile leguminoase, unde cel mai edificator exemplu l reprezint
bacteriile fixatoare de azot.
n micropropagare se obin plante care nu au micoriz, dar metoda prezint avantajul de a
produce plante libere de virusuri, rapid, astfel nct ideea de a introduce micoriza i n cadrul
micropropagrii a devenit pe deplin justificat, cercetrile n direcia acesta dezvoltandu-se odat cu
micronmulirea.
Dei pare simpl ideea micorizrii rdcinilor neoplantulelor, exist nite bariere care
trebuie trecute: cultivarea in vitro a micorizei, selecionarea plantei gazd i condiiile asocierii
celor doi parteneri, primele cercetri n acest sens datnd din 1921. n plus, micoriza este de 3
feluri:
ECTOMICORIZA: sunt rdcini de dimensiuni mici, scurte, acoperite n totalitate de hifele
ciupercii, ca o psl care penetreaz parenchimul rdcinilor. Rolul lor este de a mri zona
de contact dintre rdcin i substrat.

- 128 -

ENDOMICORIZA: sunt vezicule sau ngrori care apar la suprafaa rdcinii, ciuperca
gsindu-se localizat n parenchimul cortical iar celulele care sunt colonizate de
endomicoriz au un comportament foarte activ. ntlnite la peste 80% din plantele de
cultur.
ECTOMICORIZELE: mai puin rspndite la speciile pomicole, dar le regsim la castan,
alun.
Tehnica microrizrii se reduce la obinerea plantelor care urmeaz a fi micorizate, aduse pn n
faza de nrdcinare, la selecionarea ciupercii care se pune pe mediu de multiplicare i a treia faz,
micorizarea propriu zis, care presupune trecerea micropantulelor nrdcinate pe un substrat de
turb i perlit care a fost n prelabil mbuntit cu agentul de micorizare, adic ciuperca.
S-a descoperit ca micorizele au rol important n absorbia azotului i fosforului (la mr s-a
observat o mrire a ratei absorbiei cu 50-80%), c asigur o reacie mai bun a plantelor la soluia
calcaroas a solului sau apei, inhibnd manifestrile de cloroz, iar unele micorize chiar elimin
auxine, stimulnd n acest fel procesul de nrdcinare a butailor, toate acestea fiind numai
avantaje pe care le poate oferi micoriza n procesul de multiplicare in vitro.

- 129 -

Test de autoevaluare
1. Avnd n vedere cele nvate n acest capitol i innd cont de
spaiul avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la
urmtoarele ntrebri:
a) Care este principalul factor biotic care intervine n cultura in vitro la
via-de-vie?
b) Care este baza tiinific de la care se poate susine afirmaia ca
micropropagarea este o tehnic recomandat pentru nmulire la viade-vie?
c) Care dintre fitoregulatori deine un rol crucial n multiplicarea in
vitro la speciile pomicole?
d) Care este cea mai dificil faz a micropropagrii speciilor pomicole?
e) Care sunt primele cercetri ntreprinse pe cultura la garoafe?
f) Care este elementul care joac un rol hotttor n culturile in vitro la

garoafe?
g) Care este cea mai bun metod de micropropagare recomandat de
cercetatorii romni pentru micropropagarea Saintpaulia?
h) Care sunt factorii limitativi n cultura in vitro la trandafir?
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de
nvare.

Dup parcurgerea acestui capitol trebuie s reinei:

Micropropagarea speciilor horticole este un domeniu de


viitor i existena unei populaii n continu multiplicare
necesit un aport substanial de hran.

Stabilitatea

genetic

este

un

punct

important

al

micropropagrii.

Nu toate speciile horticole se preteaz acestei tehnici, dar

rolul microbiologiei este de a gsi soluii pentru nmulirea


rapid i n condiii de stabilitate genetic a ct mai multor
specii horticole valoroase.

- 130 -

8.7. Comentarii i rspunsuri la teste


ntrebarea 1
a) Literatura de specialitate afirm ca la via-de-vie, factorul definitoriu l
constituie soiul, ca factor biotic principal (Stamp & colab, 1982,
Baditescu si colab, 1981, Brezeanu si colab. 1982, visoiu 2001).
b) Pornind de la concluzia exprimat n 1983 de Chee i Pool, conform
creia, comparnd speciile V vinifera, V. Riparia, V. Cinerea, V.
Labrusca V. Argentifolia, a rezultat c soiurile speciei V vinifera au o
capacitate regenerativ net superioar (75%) dect celelalte specii (550%), se poate afirma c folosirea micropropagrii la via-de-vie
reprezint o tehnic sigur pentru aceast specie, care poate permite
obinerea rapid de plante devirozate.
c) Medile de cultur sunt pe att mai spectaculoase i permit variaii mari
n cercetare, cu ct conin auxine n diferite concentraii, rolul acestora n

multiplicarea in vitro fiind crucial.


d) Dintre fazele micropropagrii, nrdcinarea pune cele mai mari
probleme, reetele ncercate pentru speciile pomicole de interes fiind
foarte variate i coninnd stimulatori ai rizogenezei n varii concentraii.
e) Prima multiplicare in vitro la garoafe a fost fcut n 1957 de Quak, iar
aceasta a permis ca astzi s avem culturi de plante ornamentale fr
virusuri.
f) Cele mai bune rezultate la culturile in vitro pe garoafe s-au obinut cu
ajutorul culturilor de meristeme iar studiile au artat c dimensiunea
meristemului joac un rol hotrtor.
g) Cea mai bun variant de multiplicare pentru Saintpaulia este
recomandat de Cachia Cosma, Petrescu (1993) i const n prelevarea i
cultivarea in vitro a unor fragmente de dimensiune cca. 1 cm din lamina
frunzei sau din boboci care, ulterior, se microbutesc.
h) BAP este un factor limitativ n iniierea culturilor iar nrdcinarea

plantelor se face bine n condiiile n care srurile au fost reduse la


jumtate iar acidul naftilacetic este n concentraie de 0,05-0,1 mg/l
(Coman, 1983).

- 131 -

8.8 Lucrare de verificare nr. 8


INSTRUCIUNI
Lucrarea de verificare solicitat, implic activiti care necesit
cunoaterea Unitii de nvare nr. 8. Rspunsurile la ntrebri vor fi
transmise tutorelui pentru comentarii, corectare i evaluare. Pe prima
pagin a lucrrii se vor scrie urmtoarele: Titulatura acestui curs
(MICRONMULIREA

PLANTELOR

HORTICOLE),

numrul

lucrrii de verificare, numele i prenumele studentei (studentului).


Fiecare rspuns va trebui s fie clar exprimat i s nu depeasc o
jumtate de pagin.
1) Care este principalul factor biotic care intervine n cultura in vitro la
via-de-vie? -1p
2) Care este baza tiinific de la care se poate susine afirmaia ca
micropropagarea este o tehnic recomandat pentru nmulire la viade-vie? -1,5p
3) Care dintre fitoregulatori deine un rol crucial n multiplicarea in
vitro la speciile pomicole?-1p
4) Care este cea mai dificil faz a micropropagrii speciilor
pomicole?-1p
5) Care sunt primele cercetri ntreprinse pe cultura la garoafe?-1p
6) Care este elementul care joac un rol hotttor n culturile in vitro la
garoafe?- 1,5p

7) Care este cea mai bun metod de micropropagare recomandat de


cercetatorii romni?-1p
8) Care sunt factorii limitativi n cultura in vitro la trandafir?-1p
* Un punct se acord din oficiu.
8.9 Bibliografie minimal
1. Cachia Cosma Dorina, Petrescu Corneliu, Curs de biotehnologii, Academia Universitar
Atheneum, Bucureti, 1993
2. D. Hoza, 1997, Biotehnologie pomicol.
3. A.Rou, 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaii n amelioare, Ed. Ametist.
4. F. Stnic, 1999, Micronmulirea plantelor horticole i alte tehnici de cultur in vitro,
Editura Grand;

- 132 -

MIC GLOSAR
Agar: agent de solidificare, natural, extras din alge marine.
Autoclav: Main capabil s sterilizeze sub presiunea aburilor.
Calus: formaiuni de celule nedifereniate.
Clona: un grup de plante propagate din pri vegetative, derivate din culturi repetate provenite dintrun singur individ. Clonele sunt considerate uniform genetice.
Contaminare: infectare cu un organism nedorit ntr-un mediu controlat.
Cultur de celule: cultivarea celulelor sau evoluia lor in vitro, incluzand i cultura unei singure
celule.
Cultur de embrioni: cultur in vitro a unor embrioni maturi sau imaturi.
Cultur: Creterea unei plante in vitro, intr-un mediu steril.
Culturi de esut: cultura in vitro a celulelor, esuturilor, organelor i plantelor n condiii aseptic
total.
Embrioni somatici: structuri de tip embrion, non-zigotice, formate din celule somatice.
Explant: parte sau segment excizat dintr-o plant care se folosete n cadrul culturilor in vitro.
Ex vitro: spaiul n care sunt scoase plantele generate in vitro i transplantate de obicei n sol sau
ghivece cu substrat.
Hormon: Compui naturali (sau de sintez) care se gsesc n plant i influeneaz creterea i
dezvoltarea plantelor.
Hot cu flux laminar: Spaiu nchis de lucru unde aerul este sterilizat i controlat de filtre HEPA
In vitro: care creste n sticl.
In vivo: care crete natural.
Inocul/explant: poriune de organism (lstar, frunz, calus etc) folosit n iniierea micropropagrii.
nmulire adventiv: dezvoltarea organelor precum mugurii, frunzele, radacinile, lastarii somatici i
embrioni din lastari i esut din rdcin sau esut calus.

- 133 -

Mediu de cultur: soluie nutritiv sau substrat de cultur folosit n culturile de celule, cu reeta
specific.
Meristem: grup de celule nedifereniate care sunt situate n vrful lstarilor, mugurilor, rdcinilor
care se divid activ i genereaz esuturi i organe.
Micropropagare: multiplicarea plantelor pornind de la pri vegetative prin intermediul mediului de
cultur.
Nedifereniat: celule care nu au difereniat.
Propagare clonal: multiplicare asexuat a plantelor dintr-un singur individ sau explant.
Subcultivare: divizarea i transferarea unei culturi sau unei poriuni din explant pe un mediu nou de
cultur cu aceeai sau cu reet diferit.
Tehnici aseptice: proceduri folosite in scopul prevenirii infeciilor cu microorganisme de gen: fungi,
bacterii, virui, micoplasma, care pot afecta culturile de celule esut sau organe.
Totipoten: capacitatea celuleor plantelor de a regenera ntreaga plant n condiii de cultivare pe
medii de cultur potrivite.
Zigotul: embrion derivat din ou sau zigot, este rezultatul fecundrii gametului femel (oosfera) de
ctre gametul mascul (spermatia).

- 134 -

BIBLIOGRAFIE

1. A. Rou, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaii n amelioare, Ed. Ametist,


1999
2. Alan Doyle & J. Bryan Griffiths, Cell and tissue culture: laboratory procedures in
biotechnology, John Wiley & Sons Ltd, 1998 .
3. Cachita-Cosma Dorina, C. Deliu, L. Rakosy-Tican, A. Ardelean, Tratat de
biotehnologie vegetala, vol 1. Editura Dacia, Cluj Napoca, 2004.
4. Cachia Cosma Dorina, Petrescu Corneliu, Curs de biotehnologii, Academia
Universitar Atheneum, Bucureti, 1993.
5. Department of Horticulture Auburn University, Plant Propagation, 2005.
6. Dodds H.J., Roberts L., Experiments in Plant Tissue Culture, CAMBRIDGE
UNIVERSITY PRESS, 1985.
7. F. Stnic, Micronmulirea plantelor horticole i alte tehnici de cultur in vitro,
Editura Grand, 1999.
8. Gail M. Lang, The green world, Horticulture, Chelsea House, An imprint of Infobase
Publishing, 2007.
9. Gamborg O.L., Murashige T., Thorpe T.A., Vasil I.K., Plant tissue culture media, In
vitro, 1976.
10. Gamborg, O.L. si Wetter, L.R., Plant tissue culture, National Research Council,
1975.
11. Hoza Dorel, Biotehnologie pomicola, 1997.
12. Le Bui Van, Introduction to plant biotechnology, University of Science, Vietnam,
2009.
13. Lorraine Mineo, Plant Tissue Culture Techniques, Department of Biology Lafayette
Easton, Pennsylvania 1990.
14. Plant biotechnology practical manual for biotech, UCLA, 2002.
15. Rhitu Rai,

Genetics and plant Breeding, Introduction to Plant Biotechnology,

National Research Centre on Plant Biotechnology Lal Bhadur Shastri Building New
Delhi, 2007.

- 135 -