Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
ADRIAN-GEORGE PETICIL
MICRONMULIREA
PLANTELOR HORTICOLE
-1-
CUPRINS
INTRODUCERE
1.1
1.2
1.3
13
1.4
16
1.5
18
22
Bibliografie minimal
22
1.6
1.7
UNITATEA
DE
NVARE
NR.
2:
BAZELE
TEORETICE
ALE
MICROPROPAGRII IN VITRO
23
2.1
2.2
2.3
2.4
36
2.5
Bibliografie minimal
36
37
3.1
3.2
38
3.3
45
3.4
Dotrile laboratorului
Comentarii i rspunsuri la teste
3.5
51
3.6
Bibliografie minimal
51
23
37
50
52
4.1
52
4.2
53
4.3
54
4.4
55
4.5
4.6
56
-2-
55
4.7
Verificarea asepsizarii
57
4.8
59
4.9
61
4.10
Bibliografie minimal
61
62
5.1
62
5.2
Generaliti
63
5.3
64
5.4
65
5.5
5.6
75
5.7
78
5.8
82
5.9
84
5.10
Bibliografie minimal
84
85
6.1
85
6.2
86
6.3
90
6.4
92
6.5
Etapa 2/ Multiplicarea
Etapa 3/ nrdcinarea
6.6
Etapa 4/ Aclimatizarea
94
6.7
96
6.8
98
6.9
Bibliografie minimal
98
74
93
99
7.1
99
7.2
Organogeneza
100
7.3
Culturile de apexuri
101
7.4
Cultura de minibutai
102
7.5
Culturile de meristeme
103
7.6
Culturile de calus
105
7.7
Microaltoirea
106
-3-
7.8
108
7.9
110
7.10
Smna sintetic
111
7.11
113
7.12
Cultura de protoplati
113
7.13
116
7.14
118
7.15
Bibliografie minimal
118
119
8.1
119
8.2
120
8.3
121
8.4
124
8.5
127
8.6
8.7
131
8.8
132
8.9
Bibliografie minimal
132
GLOSAR DE TERMENI
133
10
BIBLIOGRAFIE
135
-4-
128
INTRODUCERE
Autorul
-5-
CUPRINS
1.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 1.
13
16
18
22
22
-6-
-7-
stimulat cu auxine i le-a repicat n medii sterile), Wirchow n 1858, Bernard, 1878 i anatomistul
vegetal Goebel, citai de White n 1963.
Capacitatea unor celule eucariote de a funciona ca organisme primitive n condiiile
separrii de planta mam susinut de Haberlandt a fost exploatat prin diferite practici de nmulire
vegetativ (butire, marcotaj, altoire).
Vchting i Rechinger (1893), citai de White (1963), au iniiat experimente pentru
determinarea limitelor de divizibilitate ale materialului vegetal, fr pierderea capacitii
regenerative.
n 1957, W. D. Stewart elaboreaz prima metodologie de cultivare in vitro a esuturilor
vegetale pe medii nutritive coninnd hormoni de cretere.
Progresele din domeniul biologiei au permis abia n zilele noastre - prin tehnicile
perfecionate i cunotinele despre structura i funcionalitatea celulelor i organitelor celulare
generarea de plantule dintr-o singur celul.
Se cunosc citate n literatur (1904) experienele efectuate de Hanning care a obinut
plantule la crucifere pornind de la embrioni extrai din semine imature la Raphanus sativus,
R.landra, R.candatus i Cochlearia danica, experienele dovedind posibilitatea creterii pe medii
artificiale cu adaos de zaharoz a unor fragmente de plante.
Laibach (1925, 1929) demonstreaz utilitatea practic a tehnicii de nmulire in vitro pentru
ameliorarea plantelor. El a izolat embrionii din semine neviabile din ncruciarea lui Linum perene
cu Linum austriacum, i-a adus la maturitate i i-a cultivat pe medii nutritive. Aceast metod a
servit mai trziu la realizarea de hibrizi ce ddeau natere la semine sterile, respectiv la embrioni
avortai.
ntre 1904 i 1932 au fost efectuate numeroase ncercri de cultivare pe medii artificiale a
unor explante, dar rezultatele au dovedit c cercetrile n domeniu se aflau n impas (White, 1963).
Muli cercettori s-au aliat n aceast perioad ideii susinut de Kster (1926) potrivit creia
cultivarea esuturilor vegetale este nerezolvabil (Morel, 1948).
Totui, experienele botanitilor au continuat, n jurul anilor 1930, savanii Gautheret n
Frana i concomitent White n Statele Unite efectueaz cercetri n direcia cultivrii in vitro a
explantelor provenite din esut cambial prelevat de la arar, salcie, ulm, plop, (Gautheret, 1931) i
rdcini excizate de la plantele de tomate (White, 1934).
Odat cu descoperirea n 1934 a primului fitohormon (acidul indolil acetic) de ctre
Kgl, Haagen Smit i Erxleben a fost deschis o nou etap n succesul cultivrii in vitro a
explantelor vegetale (Moore, 1979).
-8-
n Frana, Gautheret i Nobecourt (1939), lucrnd independent, obin calus din fragmente
prelevate din rdcinile metamorfozate (tuberizate) de morcov. White (1938), Gautheret i
Nobecourt (1939) realizeaz aproape simultan cultivarea in vitro a calusului, reuind s menin n
via esuturile inoculate i proliferarea acestora, dovedind posibilitatea transferrii i nmulirii
acestor esuturi prin subcultur.
Putem considera c prin cercetrile lor, White (1938), Gautheret i Nobecourt au pus bazele
cultivrii in vitro a explantelor vegetale: organe, esuturi i celule. Totodat, ei i-au adus
contribuia i n domeniul alctuirii mediilor de cultur privind compoziia, concentraia n macro i
microelemente eseniale pentru nutriia explantelor, prezena unei surse de C i N organic, a unor
vitamine i auxine.
Culturile de calus i subcultivarea acestora au reuit i datorit descoperirii n 1934 a rolului
fiziologic al auxinei acidul 3 indolilacetic (AIA), care introdus n mediu de cultur favorizeaz
declanarea i susinerea proceselor regenerative.
n 1941, Van Querbeek i colab. demonstreaz efectul stimulator al laptelui de cocos
asupra dezvoltrii embrionilor i a formrii de calus din explante de Datura.
White i Braun, n 1942, apoi Braun singur, n 1945- reuesc cultivarea unor esuturi
tumorale caulinare pe medii aseptice. Meritele n multiplicarea i propagarea in vitro a unor plante
horticole revin lui Morel i Martin (1952, 1955). Ei au obinut material sditor devirozat pornind de
la plante infectate cultivate pe medii aseptice. Astfel, la nivelul materialului sditor au fost eradicate
virozele la cartof, orhidee, garoafe, dalii etc. (Margara, 1982).
Morel i Martin au demonstrat la dalii (1952) i la cartof (1955) c din meristemele
prelevate de la plante mame infectate se pot regenera clone sntoase. Morel (1960) la Cymbidium
stabilete tehnica de micropropagare in vitro care reprezint un prim pas n micropropagarea
industrial. El apreciaz c dintr-un singur explant ntr-un singur an se pot obine 4 milioane de
plante identice din punct de vedere genetic, libere de viroze. Cu aceast metod s-a revoluionat
tehnica nmulirii orhideelor, extins mai trziu la garoafe, crizanteme i alte specii ornamentale, la
pomii fructiferi, n viticultur i silvicultur.
O serie de ali cercettori (Gregory, 1940; Taylor, 1950; Nitsh, 1951; Sparrow i colab.,
1955; Maheshwari i Lal, 1958; Vasil, 1957, 1959 i alii) adopt o direcie deosebit de interesant,
aceea a regenerrii i diferenierii de plantule in vitro folosind componente florale, antere sau
grunciori de polen, fructe ori semine imature (Maroti, 1976).
Tehnica multiplicrii in vitro a explantelor s-a perfecionat n paralel cu rezultatele
cercetrilor din domeniul studiilor compoziiei i consistenei mediilor de cultur. Heller (1951)
experimenteaz creterea esuturilor pe mediu gelificat cu agar sau cu silicagel iar n 1955, Miller
-9-
i colab., izoleaz din sperma de heringi, chinetina. n 1957, Skoog i Miller avanseaz ipoteza
balanei hormonale,
- 10 -
- 11 -
Test de autoevaluare
1. Avnd n vedere cele nvate n acest subcapitol i innd cont de
spaiul avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la
urmtoarele ntrebri:
- 12 -
- 13 -
1. ntre anii 1939 1902 perioad cnd s-a lansat teoria unitii structurale fundamentale a
lumii vii (Schleiden i Schwann, 1939) celula a fost acceptat ca unitate structural de
baz a organismelor vii, fiind apoi emis postulatul conceptului de totipotenialitate
(omnipotenialitate) celular a lui Haberlandt, 1902.
2. n perioada 1902 1920, o perioad de stagnare a cercetrilor n domeniu, deoarece
primele experimente cu culturile de explante nu au condus la rezultate favorabile.
3. Etapa anilor 1920 1939 nregistreaz primele succese n domeniul creterii in vitro a
embrionilor, a rdcinilor, a obinerii de calus, esuturi care cultivate apoi pe medii
aseptice i subcultivate periodic prin repicri au condus la obinerea de material vegetal
(White, Gautheret i Nobecourt ).
4. A patra etap ntre 1939 1966 este caracterizat prin studiile efectuate de numeroi
cercettori privind comportamentul diferitelor explante cultivate pe diferite medii de
cultur, pentru cunoaterea factorilor implicai n procesele de nmulire i difereniere a
celulelor, gradul lor de autonomie funcie de substrat, condiiile de cultur, proveniena
i natura explantului.
n aceast direcie, n 1953 s-a reuit cultivarea meristemelor caulinare, aplicale (Morel
i Martin) i obinerea de plante libere de viroze folosind ca plant donatoare o plant
polivirusat, ocazie cu care s-a emis teoria (Skoog i Miller-1957), referitoare la
controlul hormonal al organogenezei (rolul balanei auxin/citochinin), obinerea de
embrioni somatici, (Steward i Reinert, 1958, 1959), primele culturi de celule (Muir,
Torrey i Jones i colab., 1954 1960), izolarea enzimatic de protoplati (1960) i
obinerea primului hibrid somatic (Carlson, 1972).
5. Perioada ncepnd din 1966 i pn n zilele noastre delimiteaz etapa modern a
culturii de celule i esuturi vegetale, caracterizat prin extinderea larg a utilizrii
explantelor pentru multiplicare. n aceast perioad, cercetrile fundamentale n biologie
cunosc o acumulare de cunotine n domeniile citologiei, citofiziologiei, biologiei
moleculare, geneticii i ameliorrii la nivel ultrastructural i molecular precum i n
biochimie, fiziologie etc.
Paralel cu cercetrile biologice fundamentale apar o serie de subramuri de biotehnologii
vegetale cum ar fi citofitotehnologiile:
nmulirea i clonarea cultivarilor valoroi;
micropropagarea i generarea de material vegetal sntos;
- 14 -
Test de autoevaluare
2. Avnd n vedere cele nvate n acest subcapitol i innd cont de spaiul
avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la urmtoarele
ntrebri:
a) Comentai avantajele multiplicrii in vitro.
b) Menionai cele cinci etape distincte din evoluia micropropagrii.
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de nvare.
- 15 -
- 16 -
n anul 1972 a luat fiin International Association for Plant Tissue Culture la care
Romnia a aderat n anul 1975. Din patru n patru ani au loc Congrese Mondiale organizate de
aceast asociaie.
La noi n ar se nfiineaz Asociaia Romn de Culturi de esuturi i Celule Vegetale.
Prima manifestare tiinific din ara noastr cu tematica culturilor de celule i esuturi
vegetale a fost oraganizat la Cluj Napoca n anul 1981 de Institutul de Cercetri de Biologie.
n 1989 tot la Institutul de Cercetri Biologice din Cluj Napoca s-a organizat al IV-lea
Simpozion Naional de Culturi de Explante.
n noiembrie 2000 se organizeaz la Universitatea Babe Bolyai Facultatea de Biologie
din Cluj Napoca al X-lea Simpozion de Culturi de esuturi i Celule Vegetale care marcheaz 25 de
ani de la iniierea primelor cercetri n domeniul culturilor de celule i esuturi n Romnia.
Test de autoevaluare
3. Avnd n vedere cele nvate n acest subcapitol i innd cont de spaiul
avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la urmtoarele
ntrebri:
a) Comentai istoricul culturilor in vitro n ara noastr.
b) Care sunt motivele dezvoltrii i extinderii n ara noastr a bio industriilor
profilate pe nmulirea in vitro.
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de nvare.
- 17 -
ntrebarea 1
a) Plantele sunt organismele care prin procesul de fotosintez
realizeaz cel mai spectaculos proces din lumea vie, acela de
transformare a energiei solare n energie chimic. Ele joac un rol
hotrtor pentru existena uman, constituind aurul verde, bogia
de nenlocuit a Terrei, fiind surs de hran i energie pentru om i
animale. Dac la acest rol se adaug i rolul de purificator al
atmosferei prin absorbia bioxidului de carbon i eliberarea
oxigenului i rolul de materii prime pentru unele industrii
(alimentar, textil, farmaceutic), gsim justificat interesul omului
pentru perfecionarea continu a procedeelor de nmulire i
cultivare a plantelor.
b) S-a consolidat concepia c celula vegetal conine n nucleul su
- 18 -
Dintre
fitohormonilor,
avantaje:
implicrii
permite
studierea
permeabilitii,
aciunii
absorbiei,
structural de baz a
postulatul
conceptului
de
- 19 -
acumulare
de
cunotine
domeniile
citologiei,
- 20 -
- 21 -
acestui
curs
(MICRONMULIREA
PLANTELOR
- 22 -
CUPRINS
2.1 Obiectivele unitii de nvare nr. 2
23
2.2 Biologia dezvoltrii plantelor (cormofite) n cazul culturilor de celule i esuturi in vitro
24
33
36
36
perspectiva micropropagrii.
- 23 -
- 24 -
Dup germinaie din embrioni (zigotici sau somatici) se formeaz plantule la care n zona
hipocotil i n cotiledoane activitatea meristematic intr n declin i n continuare pe msur ce
plantula crete se transform n plante la care esuturile meristematice (embrionare sau formatoare)
se gsesc n vrfurile extreme ale rdcinilor i tulpinilor principale (care constituie axa plantei) sau
secundare.
Dup localizarea meristemelor ele pot fi:
meristeme embrionare (localizate n embrion);
meristeme apicale (localizate n vrfurile de cretere tulpini sau rdcini);
meristeme intercalare ce pot fi:
discontinui (deasupra nodurilor unor tulpini);
continui laterale: cambiu (strat libero-lemnos) i felogen (strat
generator subero-felodermic).
Dup caracterul celulelor meristematice:
meristeme primordiale (promeristeme) din care fac parte celulele embrionilor i
cele mai tinere masive meristematice care formeaz vrfurile vegetative sau
domurile meristematice.
meristeme primare (semimeristeme) derivate din meristemele primordiale.
Dup originea celulelor meristematice clasificare funcie de evoluia teoriilor emise de unii
cercettori:
-
tunica (ptura extern de celule care formeaz esutul protector i o parte din
scoar);
corpusul (ptura care genereaz celule ce dau natere la o parte din scoar,
cilindrul central i mduv).
- 25 -
dup Plantefol (1947 1948) care a emis teoria inelului iniial, meristemul
apical al tulpinii este constituit din:
- 26 -
parcursul mai multor subculturi, explantul fiind independent de planta mam, dar are totui
informaia genetic motenit de la aceasta.
Diferenierea celular
Celulele tinere difereniate dup divizarea continu sufer transformri structurale i o
specializare morfologic i fiziologic cptnd caracteristici noi, proprii celulelor adulte mari.
Progresiv, modificrile secundare ce survin ngreuneaz schimburile dintre aceste celule cu cele
nvecinate cu toate c majoritatea celulelor difereniate din corpul plantelor rmn vii, cu o intens
activitate metabolic dar i pierd capacitatea de a se divide.
Integritatea sistemului, continuitatea celulelor unui esut, comunicarea dintre celulele i
esuturile unor organe din organismul viu se menin datorit unor substane elaborate de ctre
celule, substane care pot migra la distane mari i pot asigura relaia organismului unitar cu
perceperea factorilor de mediu.
Controlul asupra diferenierii i funcionrii altor celule de ctre un grup de celule poart
denumirea de proces de inducie. Celulele asemntoare ca structur i funciune care determin n
esutul respectiv specificitatea fiziologic, faciliteaz prin interrelaiile dintre esuturi buna
funcionare a organelor i activitatea ntregii plante.
Procesul de dedifereniere este invers procesului de difereniere celular. El rar se petrece
natural, spontan. Dediferenierea este provocat de aciunea unor ocuri externe asupra celulelor
difereniate deci dediferenierea se produce ca reacie la aciunea traumatic exogen.
n cazul multiplicrii in vitro n condiiile detarii explantelor dediferenierea se produce n
sens regenerativ datorit aciunii fitohormonilor. Prin dedifereniere celulele se transform n celule
meristematice apte a se divide.
Capacitatea celulelor de a se dediferenia este inegal rspndit n corpul plantei i depinde
de ct de avansat este procesul de difereniere n morfostructura celular.
n condiiile cultivrii explantelor in vitro capacitatea regenerativ a celulelor este exploatat
la maximum. Sigur c aptitudinile regenerative ale inoculilor depind de proveniena explantului,
condiiile de cultur i de manifestarea integral a ntregii informaii genetice existent n genomul
inoculului. Succesul operaiei de regenerare de plante din diferite tipuri de explante depinde de
reuita metodelor de transformare a celulelor nemeristematice n celule meristematice obinute prin
dedifereniere.
n condiiile de cultur in vitro dediferenierea i revenirea celulelor la starea de celul
meristematic este condiie pentru instalarea i progresarea proceselor regenerative i realizarea
neoformrii unui nou organism vegetal.
- 27 -
- 28 -
Organogeneza
Prin organogenez se neleg procesele de formare cretere i difereniere celular i tisular
a organelor.
n tehnica de multiplicare in vitro este vorba de apariia rdcinielor (rizogeneza), a
mugurailor i tulpinielor (caulogeneza) i a frunzulielor (filogeneza).
n rizogenez sau formarea rdcinilor, pe lng factorii endogeni n principal cel geneticun rol important l au fitohormonii, mai exact auxinele (endogene sau exogene) sau unele substane
cu aciune benefic asupra rizogenezei, substane formate n tinerele frunzulie ca rezultat al
activitii fotosintetice.
Aerarea (oxigenarea) zonei n care se produce rizogeneza, temperatura, pH-ul, rezervele
energetice endogene stimuleaz dar chiar condiioneaz rizogeneza alturi de factorul genetic (gen,
specie, soi) care au rol determinant n capacitatea rizogen a unor explante.
Caulogeneza, procesul de formare a tulpinilor, se afl deasemeni sub controlul genetic i
fitohormonal i evolueaz n funcie de condiiile de mediu i unii factori endogeni n mai mic
msur dect n cazul rizogenezei.
Caulogeneza este stimulat de un anumit raport ntre auxine i citochinine, raport care este
n favoarea citochininelor.
n cazul culturilor in vitro apariia centrilor meristematici, a mugurailor i apoi a
tulpinielor, este favorizat de prezena n mediul de cultur a chinetinei, a benziladeninei.
Polaritatea fragmentelor: este proprietatea de care trebue s se in seama atunci cnd
fragmentele vegetative se introduc n substratul rizogen sau mediul de cultur i anume apexurile
sau meristemele apicale sau axilare utilizate pentru nmulire.
Embriogeneza
Procesul de formare a embrionului sau embriogeneza a cptat o nou dimensiune dup
descoperirea embriogenezei somatice n suspensia de celule, n anul 1958 de ctre Steward i
Reinert. Embrionul ca entitate morfoanatomic distinct este un stadiu intermediar de trecere de la
- 29 -
- 30 -
culturii i embriogenez somatic indirect cnd embrionii se formeaz din celule de calus ori din
suspensii celulare care provin din calus sau protoplati.
Embriogeneza somatic are avantajul c embrionul zigotic, somatic diploid sau haploid
deine ntr-un tot echilibrat structurat morfofuncional att rdcinia, tulpinia ct i muguraul care
asigur viitoarei plante un excelent debut n via, odat cu germinaia.
Prin embriogenez somatic, ntr-un timp scurt i cu mare vitez, se pot obine un numr
mare de copii ale unui organism vegetal elit.
Plantele rezultate din embrioni somatici, identice din punct de vedere genetic cu donatorul
de explante, sunt libere de ageni patogeni, au cretere uniform, sunt robuste, au o mare
productivitate iar produsele lor sunt superioare din punct de vedere calitativ.
Embrionii somatici pot fi stocai pe o perioad lung de timp ca material biologic n bnci
de gene. Din embrionii somatici, prin multiplicarea in vitro, se pot obine produi secundari de
metabolism ce pot constitui surs de extracte cu efecte fitofarmaceutice.
Pe calea embriogenezei somatice, studiile de mutagenez pot permite selecia rapid de noi
mutani de la care se pot obine noi soiuri valoroase ce pot fi multiplicate uor i introduse n
cultur.
Embriogeneza in vitro permite producerea unui numr mare de haploizi i triploizi ntr-un
interval scurt de timp i cu randament economic ridicat.
- 31 -
Test de autoevaluare
2. Avnd n vedere cele nvate n acest subcapitol i innd cont de
spaiul avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la
urmtoarele ntrebri:
a) Comentai i analizai asemnrile i deosebirile dintre procesul de
cretere i dezvoltare a plantelor.
b) Definii i clasificai meristemele.
- 32 -
sau
generare
de
embrioni,
proces
numit
ntrebarea nr.2
a) Creterea plantelor reprezint un proces complex morfologic, fiziologic i
biochimic prin care are loc sporirea numrului de celule prin acumularea de mas
vegetativ, cnd au loc modificri cantitative ireversibile iar n final plantele
ating dimensiunile caracteristice fiecrei specii. Paralel cu procesul de cretere
cantitativ, are loc i procesul de dezvoltare, de evoluie individual a plantelor
care parcurg o serie de etape calitative ce ncep cu germinarea i se ncheie cu
nflorirea i fructificarea. Dezvoltarea parcurs conduce la realizarea ciclului
ontogenetic care cuprinde modificri morfologice, anatomice i fiziologice ce se
produc ntr-o succesiune riguroas determinat de factorii ereditari care la rndul
lor sunt influenai de factorii de mediu.
b) Criteriile de clasificare a meristemelor: localizare, caracteristici i origine,
fiecare cu anumite semnificaii din punct de vedere ontogenetic i anume:
Haberland
(1900)
- 33 -
Dup Plantefol (1947 1948) care a emis teoria inelului iniial, meristemul
apical al tulpinii este constituit din: meristem de ateptare care corespunde
zonei apicale axiale i joac rol n formarea primordiilor florale i a
inflorescenelor; inelul iniial (zona periferic) care are forma unui inel
central nconjurat de celule care periodic vor genera frunzele i scoara
tulpinii; meristemul medular ce ocup poziia central i este aezat sub
meristemul de ateptare, celulele derivate din acest meristem vor da natere
parenchimului medular. n ara noastr, Jitaru i Toma (1980) prezint o
sintez a clasificrii acestor categorii de meristeme: esuturi meristematice
primordiale fr celule, cu o celul iniial, cu mai multe celule iniiale.
esuturi meristematice primare semimeristeme: apicale, intercalare,
laterale. esuturi meristematice secundare pot fi: cambiul, felogenul.
esuturi meristematice meristemoide (meristemoizi) care pot fi grupate la
nivelul esutului protector i au zone lipsite de celule cu activitate
meristematic numite cmpuri de inhibiie sau zone de blocaj.
c) Controlul asupra diferenierii i funcionrii altor celule de ctre un grup
de celule poart denumirea de proces de inducie. Celulele asemntoare ca
structur i funciune care determin n esutul respectiv specificitatea
fiziologic, faciliteaz prin interrelaiile dintre esuturi buna funcionare a
organelor i activitatea intregii plante. Procesul de dedifereniere este invers
procesului de difereniere celular. El rar se petrece natural, spontan.
Dediferenierea este provocat de aciunea unor ocuri externe asupra
- 34 -
dobndirea
caracteristicilor
citologice
ale
unui
esut
- 35 -
urmtoarele:
Titulatura
acestui
curs
(MICRONMULIREA
PLANTELOR
- 36 -
CUPRINS
3.1
37
3.2
Alctuirea laboratorului
38
3.3
Dotrile laboratorului
45
3.4
50
3.5
51
3.6
Bibliografie minimal
51
- 37 -
- 38 -
- 39 -
- 40 -
n dreptul meselor se vor afla instalaii de gaz (aproximativ 3-4 guri de gaz repartizate pe
perei diferii), prize pentru curent de 220 V, precum i instalaie de vid (pentru operaiunile de
filtrare).
n laborator vor fi amplasate diferite aparate i anume: etuve, (din care, cel puin o etuv - de
capacitate mare va funciona n regim de 160 180C i o alta de tip bacteriologic, necesar pentru
Cntar electronic
Cuptor microunde
Autoclav
- 41 -
ntr-o camer nvecinat laboratorului se vor instala balane electronice care s permit
cntrirea pn la subuniti de gram (100 10 mg), microscop optic i un stereomicroscop,
destinate examinrii materialului biologic, pre sau post inoculare.
n laborator trebuie s existe un sortiment variat i n cantiti ndestultoare de sticlrie.
Sterilizarea
ncperea care se preconizeaz a fi utilizat n scopul sterilizrii, respectiv n care va
funciona autoclavul, poate avea dimensiune variabil, n funcie de numrul autoclavelor i de tipul
i mrimea acestora. Pentru a nu se produce o strangulare a fluxului operaiunilor de inoculare este
de dorit s dispunem de dou autoclave funcionale, de mare capacitate, pentru a permite
sterilizarea concomitent a ct mai multe flacoane cu mediu.
Autoclavarea recipientelor cu medii de cultur se face la temperatura de 121C i 1,1
atmosfere, pe o durat de timp care variaz n funcie de ncrctur. Flacoanele cu medii se
depoziteaz n casolete metalice (de tip medical) sau n couri din srm, ori n tvi metalice apoi se
introduc n autoclav, cu perforaiile neobturate; celelalte tipuri de suporturi cu flacoane vor fi
nvelite n hrtie de mpachetat, perforat din loc n loc pentru a se permite accesul aburului din
autoclav, n interiorul ambalajelor. Dup autoclavare, la transportare, casoletele vor avea
perforaiile obturate.
Etuv
- 42 -
- 43 -
ac1imatizare. O prim
prelevarea
inocularea
n camera steril vor fi montate nie sau boxe (hote) cu flux laminar orizontal continuu, de aer
steril. Acestea au forme i dimensiuni variate iar asepsia aerului este asigurat prin filtre speciale
care rein particulele mai mari de 0,2 mm. Hotele vor fi orientate pe peretele opus uii i ferestrelor,
pentru a evita formarea curenilor de aer.
Manevrele efectuate n condiiile hotei cu flux de aer steril cer deprinderea operatorului, cu
un mod special de executare a micrilor, nefiind permis s se interpun mna, penseta sau alte
obiecte (chiar dac snt sterile), ntre curentul de aer steril i recipientul deschis; n caz contrar,
- 44 -
naintea
numai
nceperii
cu
obiecte
prsete
revine
- 45 -
pH-metrul,
stereomicroscopul,
12
etuvele,
lupe,
microscopul
centrifuga
i
pentru
- 46 -
pentru eprubete, vase i cutii din plastic, perlit, vermiculit, sfoar, a, tifon, hrtie de filtru i de
mpachetat etc.
Substanele necesare n laborator.
n laboratorul de culturi de esuturi se folosesc nenumrate substane chimice. Astfel, pe
lng srurile anorganice i compuii organici utilizai la prepararea soluiilor nutritive, n laborator
mai snt necesari reactivi de uz comun (baze i acizi), precum i unele substane, indispensabile
pentru sterilizarea materialului vegetal, a suprafeelor de contact, sau unele preparate destinate
curirii ncperilor i a obiectelor.
a) Materiale chimice. n aceast categorie se ncadreaz detergenii sau spunurile (solide ori
lichide), soda i prafurile de curat de uz menajer alcoolul utilizat pentru dezinfectare (se
poate folosi i spirtul sanitar), acidul clorhidric tehnic, amestecul cromic (folosit n scopul curirii
veselei), bromocet, cloramin, hipoclorit etc.
ntre substanele chimice de uz comun intr i reactivii obinuii din laboratoarele de
chimie, i anume: acizi minerali (clorhidric, sulfuric, azotic) i baze (hidroxidul de potasiu, natriu,
amoniu, de puritate tehnic i cu grad ridicat de calitate), utilizai n curirea sticlriei i necesari n
prepararea unor soluii; acizi organici (acetic, citric, oxalic), alcool etilic (absolut, de 96 sau 70),
aceton, eter, cloroform (utilizai n cantiti mici), dimetilsulfoxid (DMSO), polietilenglicol (PEG),
Tween, ap de brom, clorur mercuric, hipoclorit de natriu sau de calciu, perhidrol etc.
b) Substanele necesare pentru prepararea mediilor de cultur. Pentru alegerea unui mediu de
cultur adecvat creterii anumitor tipuri de inoculi, nu trebuie s se procedeze empiric. Trebuie
analizat tipul de explant, proveniena lui i sezonul n care se recolteaz. Se alege mediul cel mai
echilibrat (vezi tabelul 1), pentru a se asigura o evoluie bun a inoculilor. Dac nu ne putem
decide, vom face experiene de tatonare, cu diferite medii.
Tipuri
de
concentraii
(dup De Possatd
Constituenii
ale
compuilor
i colab., 1974)
Concentraie (n mM/1)
Sczut
Medie
Ridicat
NH4NO3
10
20
KNO3
10
20
KHSPO4
0,1
NaH2PO4
__
KC1
1.9
__
CaCl,
SRURI MINERALE
- 47 -
MgSO4
0,5
1,5
H3BO3
0,01
0,05
0,15
MnSO4
0,01
0,05
0,1
ZnSO4
0,001
0,02
0,04
CuSO4
0,00001
0,0001
0,0015
Na2Mo04
0,00001
0,0001
0,001
CoCl2
0,0001
0,0005
0,001
KI
0,0005
0,0025
0,005
FeSO4
0,01
0,05
0,1
Na,EDTA
0,01
0,05
0,1
A UXINE
0,0001
0,001
0,01
CITOCHININE
0,0001
0,001
0,01
Inozitol
0,1
0,3
0,6
Acid nicotinic
0,004
0,02
0,04
Piridoxin HC1
0,0006
0,003
0,006
Tiamin HC1
0,0001
0,002
0,04
Biotin
0,00004
0,0002
0,001
Acid folie
0,0005
0,001
0,002
Pantotenat de calciu
0,0002
0,001
0,005
Riboflavin
0,0001
0,001
0,01
Acid ascorbic
0,0001
0,001
0,01
L-Cistein HC1
0,01
0,06
0,12
Glicin
0,0005
0,005
0,05
Zaharoz
60
120
SUBSTANE ORGANICE
Sera de aclimatizare
n urma preocedurilor desfurate n laboratoarele de micronmulire rezult plante cu
rdcin, care urmeaza a fi trecute in vivo, i care trebuie s devin apte pentru viaa din afara
sistemului controlat al laboratorului. Pentru aceasta, laboratoarele de micropropagare sunt obligate
s dein i o ser de suprafee adaptate tipului de activitate i volumului de lucru, cu parametri
controlai, unde s poat desfura ultima etapa a micropropagrii, aclimatizarea. Meninnd
umiditatea, temperatura, lumina i aerisirea la parametri optimi pentru specia luat n discuie,
- 48 -
serele sunt ultimul pas naintea transplantrii noilor plante n containere individuale sau plci
alveolare i distribuite clientului.
Dotrile i particularitile tehnnologice ale acestei sere sunt standard, cu mese de lucru,
sistem de iluminat, sistem de irigat, sistem de cea artificial i cldur.
Test de autoevaluare
1. Avnd n vedere cele nvate n acest capitol i innd cont de spaiul
Laboratorul este alctuit din dou zone: zona nesteril sau septic i
zona steril sau aseptic.
Dup nrdcinare,
explantele sunt trecute n sera sau solarul de
- 49 aclimatizare pentru obinuirea cu condiiile de mediu.
conine mai multe hote de lucru cu flux laminar orizontal de aer steril ce
sunt folosite pentru urmtoarele procedee de lucru: dezinfectarea
materialului vegetal, prelevare i inocul explante in vitro i repicare sau
subcultivare.
b) Unul din aspectele majore pe care trebuie s le avem n vedere atunci
cnd dorim s iniiem culturi in vitro l constituie asigurarea unei asepsii
perfecte, att a materialului biologic ct i a recipientelor i a mediilor de
cultur.
c)Autoclavarea recipientelor cu medii de cultur se face la temperatura de
121C, pe o durat de timp care variaz n funcie de ncrctur.
Flacoanele cu medii se depoziteaz n casolete metalice (de tip medical)
sau n couri din srm, ori n tvi metalice apoi se introduc n autoclav, cu
perforaiile neobturate; celelalte tipuri de suporturi cu flacoane vor fi
nvelite n hrtie de mpachetat, perforat din loc n loc pentru a se permite
accesul aburului din autoclav, n interiorul ambalajelor. Dup autoclavare,
- 50 -
INSTRUCIUNI
Lucrarea de verificare solicitat, implic activiti care necesit
cunoaterea Unitii de nvare nr. 3. Rspunsurile la ntrebri vor
fi transmise tutorelui pentru comentarii, corectare i evaluare.
i luat n
- 51 -
52
4.2
Msuri generale
53
4.3
54
4.4
55
4.5
55
4.6
56
4.7
57
4.8
59
4.9
61
61
- 52 -
- 53 -
nivelul materialului vegetal, al recipientelor de lucru i mediilor de cultur folosite, indiferent dac
sunt solide, semisolide sau lichide i suspensii, precum i respectarea asepsiei la nivelul procesului
tehnologic. Un aspect important se refer la calificarea personalului care trebuie s fie instruit i s
dein cunotine avansate de microbiologie, despre natura i evoluia germenilor (virusuri, bacterii,
alge, drojdii, mucegaiuri) precum i cile de transmitere i de reproducere a acestora.
4.3 Asepsizarea ncperilor, a instrumentarului i a altor obiecte.
Sterilizarea hotelor
Succesul activitilor n micropropagare depinde n mare parte de sterilitatea proceselor, de
asepsizarea ncperilor i a intrumentarului, de buna mentenan n condiii optime de lucru a
dispozitivelor de lucru electrice. Hotele cu flux laminar continuu sunt unul din punctele cheie n
procesul de producie, iar pstrarea lor n condiii aseptice este esenial. nainte de demararea
etapelor de lucru din camera steril, hotele se aprind i se sterilizeaza la raze ultraviolete (UV).
Dispozitivele sunt dotate din fabricaie cu lumina UV, astfel nct dupa 20 de minute de UV pornit,
hota va fi steril i pregtit pentru inocularea materialului vegetal. De reinut c lmpile UV se
ntrerup cu 20-30 de minute nainte de accesul personalului care deservete lucrul la hote din cauza
riscului de contaminare cu ozon.
Instrumentarul
Toate dispozitivele folosite n cadrul laboratoarelor de micropropagare trebuie s respecte
protocoalele de sterilizare i s fie supuse acestora altfel, succesul etapelor care se deruleaz n
camera steril nu este garantat. Sterilizarea casoletelor, sterilizarea recipientelor cu mediu steril, a
instrumentarului, a flacoanelor cu inoculi- n caz de repasare, se execut dup procedee standard de
laborator, fie la etuv sau autoclav, fie n alcool 70, fie prin fierbere n baie de ap sau electric sau
flambare.
De cele mai multe ori, procedeele de asepsizare se produc ncruciat pentru a se asigura o
deplin sterilizare a instrumentarului sau aparatelor implicate n procesele de lucru. n timpul
lucrului la hote, instrumentarul care se sterilizeaz n paralel cu celelalte operaiuni care se
desfoar poate fi fierbinte n urma sterilizrii, motiv pentru care se acord o atenie deosebit
rcirii acestuia nainte de a fi folosit i a intra n contact cu materialul vegetal.
Operatorul
Personalul calificat care lucreaz la hot este, de asemenea, surs continu de infecii pentru
materialul vegetal expus micropropagrii, dac nu chiar primul. Una dintre grijile sale este
sterilizarea perioadic a minilor atta vreme ct se afl n proces de lucru la hot, prin pulverizarea
- 54 -
slbirii rezistenei acestora, urmare a procesului de sterilizare sau ca urmare a emiterii unor compui
toxici ce apar n urma acestui proces.
Vasele de cultur au dopuri fie din cauciuc, plut sau alte materiale plastice care necesit
presterilizare. Trebuie s ne asigurm asupra rezistenei materialului din care sunt confecionate, s
le dezinfectm, fierbem i sterilizm. n condiiile n care se folosesc dopuri din vat acoperite de
staniol, acestea se sterilizeaz odat cu mediul de cultur.
4.5 Asepsizarea mediilor de cultur, apei, altor substane
Mediul de cultur reprezint suportul de via al explantelor pe perioada ct triesc in vitro
i trebuie s asigure condiii de hran i sntate culturilor. Sterilizarea acestuia este o etap
necesar fr de care nu se poate realiza micropropagare n condiii normale. Etapele pe care acesta
le parcurge sunt: pregtire, porionare, obturare sau acoperire i sterilizare.
Se recomand ca dopul sau capacul s nu fie nchis etan pentru a se permite circulaia
vaporilor de ap fierbini, sursa de sterilizare, de altfel, ntre recipient i mediul etuvei sau
autoclavului.
Sterilizarea mediului sau a apei distilate, a hrtiei de filtru pe care se lucreaz sau a sticlriei
se face la 1,1atmosfere presiune, 20-30 de minute i 120C. Vasele nu se vor umple cu mai mult de
din volum, pentru a nu se produce accidente odat cu modificarea presiunii de la finalul
autoclavrii, prezentnd risc de explozie. Odat autoclavat i sterilzat, mediul de cultur se va lsa
la rcit, n spaii deschise, cu aer care circul, iar recomandarea pentru folosire este dat la 24-48 de
ore de la sterilizare i rcire.
SUPRAAUTOCLAVAREA produce o alterare a calitii mediului de cultur prin deteriorarea
echilibrul ionic din mediu, ceea ce afecteaz capacitatea de solidificare a agarului i duce la
caramelizarea zaharozei.
- 55 -
- 56 -
Trebuie s aib aciune suficient de puternic pentru a putea distruge agenii patogeni de suprafa
i/sau interiori, nivelul lor de toxicitate s nu distrug esuturile provocnd necroze, deoarece
aceasta presupune lipsa hranei n mediul in vitro i, deci, moartea explantului. O condiie
important este ca detergentul s poat fi ndeprtat cu uurin, fr sa creeze probleme de
suprahidratare sau distrugere a esuturilor. Cu toate acestea, sterilizarea explantului este un proces
care se petrece la suprafaa explantului, motiv pentru care, n condiiile n care materialul vegetal
supus micropropagrii are esuturile profunde infectate, pot s apar infecii trzii i la a doua sau a
treia repasare, cu bacterii, fungi, micoplasme sau fungi, exponate care se regsesc i n esuturile
explantei.
Principalii dezinfectani sunt: alcool etilic n diverse concentraii (70%, 96% sau absolut), i
se recomand doar la organele cu pilozitate mare, epiderma cutinizata puternic, muguri bine nchii
i care necesit cltire rapid pentru a evita arderea explantului, apa bromat mai puin folosit,
clorura mercuric - deosebit de toxic i care se pare c prezint remanen n explante, dar
cercetrile nu sunt elocvente n acest moment, hipocloritul de sodiu sau Apa de Javel se
folosete n varii concentraii i timpi de expunere i cere cltiri abundente ulterior. Protocoalele de
dezinfecie pentru majoritatea plantelor pentru care se aplic procedeee de multiplicare in vitro au
deja stabilii detergenii, concetraiile, duratele de imersiune sau timpii de cltire. Pentru speciile
care intr n vizorul cercettorilor, stabilirea protocoalelor de dezinfecie se face prin tatonri
repetate pn la atingerea scopului dorit.
4.7 Verificarea unei bune asepsizri
n vederea evitrii accidentelor cauzate de infecii, este obligatorie verificarea periodic a hotelor cu
flux laminar de aer n ceea ce privete asepsizarea aerului din interiorul hotei. Acest lucru se face cu
aparate care msoar gradul de impurificare a aerului. n funcie de aceste rezultate, se stabilete
momentul de schimbare a filtrelor.
n aceeai ordine de idei, se verific i gradul de asepsizare din camera de cretere i din camera
steril prin mijloace fizice, chimice si biologice.
Fizice-manometre, termometre cu sau fr sistem de nregistrare grafic
Chimice-substane sub form de pulberi cu punct de fuziune cunoscut, benzi de hrtie
impregnate cu diverse substane (testul Bowie & Dick), lichide aezate n tuburi care la o
anumit temperatur i schimb culoarea. Dintre pulberi, sulful cu punct de topire 118C,
acidul picric la 130C.
- 57 -
Test de autoevaluare
1. Avnd n vedere cele nvate n acest capitol i innd cont de spaiul
avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la
urmtoarele ntrebri:
a) Ce este asepsia?
b) Enumerai cteva metode de dezinfecie.
c) Care sunt condiiile n care se execut sterilizarea mediului, a apei
care
sunt
principalii
dezinfectani
folosii
micropropagare.
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de
nvare.
- 58 -
ntrebarea nr.1
a) Asepsia este procesul, operaiunea de distrugere pe cale fizic
sau chimic, de filtrare, nlturare fizic, splare sau ultrasonare a
micro-organismelor i a sporilor acestora. n micropropagare se
necorespunztoare
materialului
vegetal,
- 59 -
- 60 -
INSTRUCIUNI
Lucrarea de verificare solicitat, implic activiti care necesit
cunoaterea Unitii de nvare nr. 4. Rspunsurile la ntrebri vor fi
acestui
curs
(MICRONMULIREA
PLANTELOR
Menionai
care
sunt
principalii
dezinfectani
folosii
micropropagare. -2p
* Un punct se acord din oficiu.
- 61 -
CUPRINS
5.1
62
5.2
Generaliti
63
5.3
64
5.4
65
5.5
74
5.6
75
5.7
78
5.8
82
5.9
84
84
- 62 -
5.2. Generaliti
Momentul de mare rscruce n realizarea mediilor de cultur a fost anul 1962, cnd T.
Murashige i F. Skoog au elaborat i publicat reeta de mediu de cultur care le poart numele i
astzi prescurtat MS. Dei elaborat pentru esuturi de tutun, MS a devenit astzi mediul de baz n
culturile in vitro, mediul de iniiere fiind folosit pentru o varietate larg de specii.
Mediul de cultur este un suport fizico-chimic pentru susinerea vieii la explante n
condiiile recipientelor de cultur i are nevoie de o serie de atribute pe care s le ndeplineasc
pentru a putea fi asociat unui protocol de micropropagare a unei specii.
Principala condiie pe care trebuie s o ndeplineasc un mediu de cultur este aceea de a
putea s hrneasc corect i suficient explanta aflat n diverse stadii de micropropagare (de la
iniiere la nrdcinare) i s i asigure condiii optime de dezvoltare n ceea ce privete necesitile
ei fiziologice (pH, presiune osmotic, umiditate, echilibru ionic). Din punct de vedere al
caracteristicilor administrative, mediile de cultur trebuie s fie uor de preparat, s aib o reet
care se poate reproduce i s prezinte stabilitate dup ncheierea procesului de pregtire, s fie stabil
i s nu manifeste modificri fizico-chimice de substan sau stare, infecii sau alte dezechilibre. De
asemenea, orice laborator de micropropagare va aprecia un cost mic per unitatea de mediu, ceea ce
presupune substane constituente necostisitoare i accesibile.
La nivel mondial se recunosc ca fiind cele mai folosite o serie de reete de mediu, dar nu
sunt nici pe departe singurele, existnd i specii care au medii de cultura dedicate. Dintre cele mai
cunoscute medii de cultur, retinem: B5 (Gamborg i colab. 1968), N6 (Chu, 1978), Nitsch&Nitsch
(NN, 1969), Quoirin&Lepoivre (QL, 1977), DKW (Driver&Kuniyuki, 1984) i WPM (Lloyd &
McCown, 1980) - ultimele fiind recomandate n special pentru speciile lemnoase i pomicole,
compoziia lor variind n limite relativ mici, cu atenie asupra variaiei cantitilor compuilor
anorganici (macroelementele, microelementele, chelatul de fier), variaiile necontrolate putnd
afecta echilibrul ionic care pune n pericol rspunsul corect fiziologic al plantei n respectivul mediu
de cultur.
Mediile de cultur pot fi de trei feluri dup constituia lor: lichide, solide i semisolide i
presupun anumite criterii dup care se evalueaz necesitatea folosirii unui anumit mediu pentru o
lucrare. Se ine seama de tipul de explant, de modul de cultivare al plantei donor, de proveniena
acestuia din mediu exterior sau spaiu de cultur protejat, stadiul de dezvoltare a explantului, de
specie i de soi, mrimea, sezonul de recoltare (important mai ales pentru culturile din muguri)
precum i de scopul culturii.
- 63 -
Majoritatea speciilor cunoscute astzi i care au fost testate, au un mediu de cultur la care
au reacionat pozitiv i care este listat n literatura de specialitate, la acestea adugndu-se speciile
care nu au nc un mediu de cultur viabil, care s produc culturi stabile genetic i speciile la care,
n urma testrilor, s-a ajuns la concluzia c sunt recalcitrante la micropropagare i nu se poate lista
ca metod de nmulire pentru ele aceast tehnic.
Un rol important n stabilirea mediilor de cultur pentru plantele horticole n vederea
uurrii muncii de reproducere, multiplicare i ridicarea standardelor de comercializare a acestora
att cantitativ (populaia planetei cere mult hran zilnic, care trebuie produs rapid), dar i calitativ
(gusturile consumatorului s-au rafinat, cernd variaie mare) l au fiziologii, specialiti n nutriia
plantelor, care pot evalua constant necesarul de hran al unui explant i dozarea substanelor
constitutive ale mediului de cultur, astfel nct procesul de multiplicare in vitro s se desfoare n
bune condiii.
5.3. Compoziia mediului de cultur
Compoziia mediului de cultur este diferit de la o specie la alta, iar de la nceputurile
micronmulirii pn astzi au fost elaborate multe reete, odat cu acumularea informaiilor despre
specia n discuie, cu evoluia fiziologiei i a biologiei moleculare, domeniul nefiind nici pe departe
nchis cercetrii.
Modificrile care apar la nivel molecular ntr-o plant care se afl n stare de caren sau
exces n ceea ce privete nutriia sunt relativ conoscute la aceast dat, recomandarea n
micropropagare fiind aceea de a asigura un echilibru ntre elementele componente ale elementelor
din mediul de cultur, altfel cultura este supus eecului.
Odat desprit de planta mam, explantul va avea nevoie de condiii de mediu speciale
pentru evoluie, de asepsie total, de mediu complet steril i de hran adecvat, adic acea soluie
nutritiv complex format din ap, sruri minerale (macroelemente i microelemente) - substane
anorganice i substane organice (glucide, vitamine, fitohormoni, agar etc).
APA
Toate organismele au n componena lor sau au nevoie de ap, iar acest fapt fiziologic se
regsete i n cadrul micropropagrii in vitro a plantelor. Ea intr n componena mediului de
cultur sau a procedeelor de sterilizare i autoclavare a recipientelor, dar este ntlnit i n
recipientele de cultur, numai c aici are un circuit nchis. Nu este recomandat ca eprubetele cu
explante s dobndeasc condens, deoarece acesta poate ridica riscurile de infecii, iar acest aspect
se poate controla odata cu reglarea temperaturii n camera de cretere. n cazul n care recipientele
de cultur nu sunt nchise etan, aceast ap rezultat din condens se poate evapora i poate s
- 64 -
- 65 -
SCHOOL
OF
- 66 -
BIOENGINEERING,
DEPARTMENT
OF
Rolul microelementelor n mediul de cultur este dat de faptul c intr n compoziia unor sisteme
enzimatice catalogate vitale pentru metabolismul vegetal. Aadar, sunt indispensabile i importante,
lipsa lor din mediile de cultur provoac, pn la a treia repasare, decesul culturii.
Fe intervine n metabolizarea intranuclear, sinteza ARN i sinteza proteic; necesit a fi
administrat sub forme chelatizate, deoarece este greu de asimilat.
Lipsa Zn modific sinteza auxinei.
Mn particip la proteosinteza i formarea ARN-ului n celulele rdcinilor de mazre i are
rol important n cazul rizogenezei la tomate dar trebuie avut n vedere raportul Mg/Mn
deoarece se pot produce perturbaii grave la nivel celular.
B are rol n procesele de diviziune i cretere celular.
Al este catalizator n multe reacii chimice i nu s-au raportat fenomene de caren evident
n caz de lips.
Cercetrile din acest moment pot recomanda anumite medii de cultur pentru diverse specii,
nefiind nicidecum restrictiv, imaginaia i perseverena fiind ultimele bariere n ceea ce privete
elaborarea mediilor de cultur pentru speciile horticole.
WHITE (1943) recomandat pentru culturile de esuturi tumorale.
HELER (1953) recomandat pentru multe culturi, mai puin tutun.
KNUDSON (1925) recomandat pentru orhidee i ferigi.
MURASHIGE-SKOOG (1962) recomandat pentru culturi de calus la tutun i culturi de
celule la majoritatea speciilor fiind numit mediu universal.
GAMBORG (1968) recomandat n germinarea n condiii aseptice a seminelor.
COMPUII ORGANICI
n 1934, WHITE a reuit s afirme n lumea biotehnologiilor c zaharoza i extractul
neautolizat de drojdie care conine glicin/aminoacizi i tiamina/vitamine aduc superioritate
nutriional mediilor de cultur, producnd reacii pozitive de cretere explantelor i cam tot la
aceeai dat a fost descoperit principiul de aciune al AUXINELOR. n 1938, ROBBINS i
SCHMIDT au adugat reetelor de mediu piridoxina, adic vitamina B6 (precursor al unor enzime)
i acidul nicotinic. i acesta a fost nceputul unei noi ere n elaborarea mediilor de cultur i a
importanei compuilor organici.
Cele mai importante surse organice care intr n componena acestor medii i pe care le
folosim la aceast dat sunt: zharoza/glucoza, aminoacizi, vitamine, extract de drojdie,
fitohormonii/substanele reglatoare de cretere, cazeina, sucuri naturale i agarul, regsite n mediu
- 67 -
n funcie de tipul celulelor cultivate sau de tipul explantului, de scopul culturii i de rezerva proprie
de hormoni ai explantului.
CARBONUL ORGANIC
Mediul de cultur conine adaos de carbon glucidic, ceea ce asigur substrat respirator
pentru culturi (prin degradarea glucidelor se obine energia necesar proceselor vitale, multiplicrii,
creterii i diferenierii celulare). Trebuie reinut c, dei plantulele sunt verzi i posed clorofil,
sau calusul este activ, aceste materiale vegetale nu sunt total autotrofe i pentru a fi inute n via
avem nevoie de surse de carbon organic, care s ajute procesul de fotosintez, proces care nu se
desfaoar integral sau s suplineasc proasta funcionare a cloroplastelor.
Formele n care avem posibilitatea de a suplini lipsa de sintez a substanelor energetice sunt
a) GLUCIDELE; b) ALCOOLII i c) ACIZII ORGANICI.
Dintre glucide, Zaharoza prezint eficien maxim n procesele metabolice la nivelul
culturilor in vitro (alte surse fiind
concentraie optim de 2%. Excesul de zaharoz poate duce la plasmolizarea celulelor urmare a
presiunii osmotice create.
Culturile vegetale evolueaz optim la o concentraie a zaharozei de 2-3% (3% glucoz doar
pentru culturi de meristeme la unele specii lemnoase) cu variaii ntre 1,2% - 8% (pentru cartof). De
asemenea, se recomand ca la autoclavare s se respecte strict temperatura de sterilizare deoarece
uneori se poate produce fenomenul de caramelizare, de alterare a zaharozei.
Dintre alcooli, GLICEROLUL poate fi folosit ca surs energetic, potennd efectul
glucidelor, dovedit pn n acest moment ca fiind sigurul cu eficien, dar mult mai slab ca
performan dect zaharoza. MONOALCOOLII - ca metanol, etanol, propanol sau butanol- nu pot
fi utilizai, fiind toxici chiar i la diluii mari.
AZOTUL ORGANIC
esuturile vegetale sunt autotrofe fa de azot, prelundu-l din substanele anorganice, ceea
ce nu limiteaz ns folosirea acestuia n mediile de cultur. n 1939, WHITE a dovedit c
GLICINA mbuntete creterea rdcinilor la tomate, de asemenea c UREEA i unele BAZE
AZOTATE pot fi surse eficiente de azot organic. Dei atenioneaz asupra faptului c sursele de
azot organic n culturi pot fi toxice, n 1981, BIONDI i THORPE recomand folosirea
aminoacizilor n mediile de cultur atunci cnd se urmrete formarea de calus.
VITAMINELE
Avantajele vitaminelor n cultura explantelor s-au descoperit ntmpltor n anii 1922-1940
cnd, dup WHITE, orice mediu de cultur trebuie s conin vitamine. Acestea la aceasta dat
erau considerate indispensabile vieii plantelor. Dintre acestea, amintim cteva:
- 68 -
VITAMINA B1 (TIAMINA)
Valoare biologica important.
Stimuleaz creterea celulelor i a esuturilor.
VITAMINA B6 (PIRIDOXINA)
Precursor al enzimelor, considerat indispensabil.
VITAMINA H (BIOTINA)
Utilizat nc din 1946 (Morel).
Exercit efect stimulator asupra culturilor de celule.
ACIDUL FOLIC
Efect stimulant asupra esuturilor tumorale dar i efect toxic urmare a descompunerii n acid
p-aminobenzoic (factor de cretere, ns).
ACIDUL NICOTINIC
Utilizat nc din 1938 i considerat indispensabil.
VITAMINA C (ACIDUL ASCORBIC)
Aciune antioxidanta i folosit pentru diminuarea aciunii fenolice a unor specii
recalcitrante la micropropagare i care elimin fenoli.
INOZITOL (glucid/vitamin)
Obligatoriu n mediul de cultur dar nu se cunoate clar rolul fiziologic pe care l exercit
asupra culturilor.
FITOHORMONII/FITOREGULATORI
Fitohormonii stimulelaz, inhib sau modific calitativ i cantitativ creterea i dezvoltarea
explantelor i sunt folosii n concentraii foarte mici, de ordinul mM sau M. De la nceput trebuie
s se fac diferena ntre fitohormoni i fitoregulatori.
FITOHORMONII produc modificri la nivelul proceselor de morfogenez, organogenez,
embriogenez, cu urmri n dezvoltarea celular, tisular, organic, diferenierea celular sau la
nivelul ntregii plante.
FITOREGULATORII sunt regulatori chimici, organici, compui de sintez care imit
efectele hormonilor naturali, devenind indispensabili n biotehnologiile vegetale.
INFLUENA FITOHORMONILOR care poate fi tradus n echivalena cu rspunsul
imediat sau ntrziat al plantei, depinde de starea fiziologic a centrilor receptori (celule, esuturi,
organe), stadiul de dezvoltare al organelor plantei, natura i nivelul semnalului, de interaciile
acestuia cu ali fithormoni, condiiile de mediu .a.m.d.
- 69 -
Multiplicarea i creterea celular care sunt catalogate ca fiind fenomene complexe pot
produce reacii particulare, urmare a interaciunii dintre fitohormonii explantei i fitoregulatorii
administrai n mediul de cultur, acesta fiind motivul pentru care reetele de mediu variaz n
concentraii de hormoni de la specie la specie, n funcie de bagajul endogen al acesteia.
O scurt trecere n revist a pailor fcui de evoluia fitohormonilor vegetali ne arat c
DARWIN, n 1880, intuiete existena fitohormonilor, pentru ca peste un secol, nc s nu se
cunoasc pe deplin mecanismele de interaciune dintre fitohormoni i toate procesele pe care le
implic. Frits Warmolt WENT (1928) identific auxina A n urina uman, descoperire care permite
lansarea unei noi tiine: fitotehnologia. Anii 30 aduc descoperirea aciunii giberelinelor, acidului
abscisic i etilenei, pentru ca SKOOG (1955-1956) s izoleze din sperma de heringi chinetina (6
furfurilaminopurina); n anii 1956, STEWARD lanseaz citochininele native din laptele de cocos.
n acest moment se cunosc cinci mari categorii de fitohormoni: AUXINE, CITOCHININE,
GIBERELINE, ACIDUL ABSCISIC i ETILENA.
AUXINELE
n plante, auxinele se gsesc fie libere (AIA) fie legate, sub multiple forme sau combinaii
ale AIA cu acid aspartic, glutamic sau acid ascorbic.
Tipuri de auxine cunoscute:
AIA (auxina nativa), AIB (acidul 3-indolilbutiric - nu se gsete n toate speciile vegetale), ANA
(acidul 1-naftilacetic), 2,4-D (acidul 2,4-diclorfenoxiacetic), 4ACFA SAU ACPA (acidul 4clorfenoxiacetic), ANOA (acidul 2-naftoxiacetic), 2,4,5-T (acidul 2,4,5-triclorfenoxiacetic),
DICAMBA (acidul 3,6-dicloro-2-metoxibenzoic), PICLORAM (acidul 4 amino-3,5,6-tricloro-2piridincarboxilic), AMCA (acidul 2-metic-4-clorfenoxiacetic).
ACTIUNEA FIZIOLOGIC A AUXINELOR
1. Creterea n lungime a celulelor (mrirea plasticitii pereilor celulari);
2. Permeabilizarea membranelor plasmatice;
3. Influene pozitive asupra sintezei ARN ribozomal;
4. Stimuleaz diviziunea celular (alturi de citochinine);
5. Influeneaz sinteza de etilen;
6. Influeneaz creterea celulelor n tropisme;
7. Implicate n fenomenul de dominan apical, caulinar;
8. Aciune inhibitoare asupra cderii frunzelor i fructelor;
9. Aciune rizogenstimularea butailor n nmulirea vegetativ;
10. Inhib formarea embrionilor somatici.
- 70 -
Folosite n concentraii mici, auxinele dezvolt o aciune benefic asupra creterii celulei
vegetale, pe cnd n concentraii mai mari dezvolt o aciune inhibitoare sau chiar toxic, cazul
dicamba sau 2,4-D, caz n care auxinele de sinteza devin erbicide. Dintre auxinele de sinteza, cele
mai cunoscute i folosite sunt ANA i 2,4-D, fiind, de altfel, i cele mai stabile.
Viteza de degradare i capacitatea de aciune a auxinelor exogene depinde de muli factori:
tipul esutului, natura i concentraia auxinei, fenofaza plantei, organul supus tratamentului i
multe altele, studiile artnd c rdcinile sunt mai receptive la concentraii sczute de auxine, pe
cnd tulpinile, frunzele i fructele (n formare) cer concentraii mai ridicate de auxine.
CITOCHININELE
Hormoni care acioneaz asupra proceselor de diviziune celular, citochininele fac posibil
diviziunea celular, n absena lor, celulele nu se divid deloc. Le gsim n cantiti relativ mari n
organele de reproducere, semine i fructe. n 1955, la 3 luni de la izolarea citochininei, se
sintetizeaz benziladenina/benzilanimopurina/BA/BAP, care va deveni cea mai eficient i
utilizat dintre citochinine. Citochininele native se regsesc n multe extracte vegetale (drojdie de
bere, germeni de porumb, lapte din nuc de cocos). Biosinteza citochininelor se realizeaz n
rdcini i embrioni, n meristeme i se folosesc, de regul, n diluii mari, suportnd bine
autoclavarea.
Tipuri de citochinine:
K sau KIN(CHINETINA sau KINETINA), Z (ZEATINA), BA sau BAP (BENZILADENINA
sau BENZILAMINOPURINA), 2iP (IZOPENTENILADENINA), TDZ (TIDIAZURON).
Ecuaia cunoscut astzi a balaei hormonale n micropropagare este dat de relaia:
AUXINE + CITOCHININE = BALANA HORMONAL
Modificarea balanei hormonale n favoarea uneia sau alteia dintre substane produce urmtoarele
stri de fapt:
Concentraii sporite de auxine poteneaz rizogeneza.
Concentraiile sporite de citochinine poteneaz formarea de muguri i generarea de tulpinie.
Concentraii sporite din ambele poteneaz morfogeneza i procesele de calusare.
ACTIUNEA FIZIOLOGIC A CITOCHININELOR
1. Impulsioneaz diviziunea celular;
2. Stimuleaz formarea de mugurai i tulpinie, n funcie de concentraie i balan;
3. Stimuleaz proteosinteza (au fost gsite citochinine legate de ARN transfer);
4. Rol n prevenia senescenei;
- 71 -
- 72 -
ER (28)
mg
L
0.5
0.5
0.5
2.0
1.0
0.02
B5 (29)
mg
L
100
1.0
1.0
10.0
0.1
0.1-l.O
SH (26)
mg
L
1000
5.0
0.5
5.0
0.5
2.0
a Indoleacetic acid.
b Naphthaleneacetic acid.
c 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid.
d p-chlorophenoxyacetic acid.
IN VITRO, Vol. 12, No, 7, 1976, PLANT TISSUE CULTURE MEDIA /O. L. GAMBORG, T. MURASHIGE, T.
A. THORPE, AND I. K.VASIL
- 73 -
- 74 -
n acest sens, folosirea compuilor virali n compoziia mediului de cultur n scopul limitrii
reaciilor oxidative este o procedura puin ntlnit n practica curent, cercetrile efectuate pn
acum au vizat specii ca Cymbidium, Prunus sp. sau Malus sp..
Agarul
Produs natural, polizaharid obinut din alga roie Gelidium amansii care triete n
Oceanul Indian i Marea Chinei, agarul aduce un procent suplimentar de elemente chimice (Ca i
Mn), influennd potenialul osmotic i difuzia nutrienilor i este cel mai cunoscut agent gelificator
utilizat n prepararea mediilor de cultur. l gsim comercializat sub diverse forme, solzi, fibre sau
pulbere. Se folosete n concentraii variabile, n funcie de reeta de mediu folosit, ntre 0,6-1%
(Street, 1977)
Crbunele activ
Are diverse recomandri de la autorii de specialitate i l vom gsi n mediul de cultur al
speciilor lemnoase recalcitrante la micropropagare, folosit pentru reducerea emisiei de fenoli sau n
mediul de nrdcinare, n cazul unor culturi de apexuri i antere sau n cazul culturilor de conifere.
Concentraiile n care este folosit variaz de la 2-5%.
5.6. Prepararea mediilor de cultur i pH-ul
Pentru evitarea erorilor de cntrire sau msurare, mai ales n cazul substanelor care intr n
componena mediilor de cultur n concentraii de ordinul M sau mM, se utilizeaz soluii stoc
corespunztoare fiecrei mari grupe de substane.
Dintre acestea, enumerm: soluie stoc de macroelemente, soluie stoc de microelemente;
soluie stoc de chelat de fier, soluie stoc de vitamine; soluie stoc de aminoacizi i soluie stoc de
hormoni.
n condiiile n care concentraia normal se notaz cu X, soluiile stoc pot avea concentraii
de 10 ori mai mari (10X), 100 de ori mai mari (100X) sau 1000X. Cu ct cantitatea de substan
dintr-o soluie este mai mic, de ordinul gram/l, cu att soluia stoc va fi mai concentrat. Dac n
mediul de cultur Murashige&Skoog, KNO3 are concentraia de 1.900 mg/l, soluia stoc de
macroelemente pentru mediul MS de 10X va avea o concentraie KNO3 de 19.000 mg/l.
Soluiile stoc sunt specifice pentru fiecare mediu de cultur iar soluia stoc de
macroelemente are, de regul, concentraia de 10X, cea de microelemente de 1.000X iar vitaminele
100 X. Pentru calculul volumului de soluie stoc se folosete urmtoarea formul:
Y ml soluie stoc = Volumul de mediu (ml)
Concentraia cerut
- 75 -
- 76 -
COMPONENTE
CONC.
DORIT
CONC.
SOL.
STOC.
ml(g)
Cant.
pt 100 Totala
ml
ml(g)
Sruri minerale
MACRO
MICRO
CHELAT DE FIER
Vitamine/aminoacizi
AMESTECINOZITOL
Altele
Gibereline
GA-3
ALTELE
Auxine
ANA; AIA; IBA
ALTELE
Citochinine
BENZILADENIN
(BAP)
ALTELE
Diverse
Zaharuri
ZAHAROZ
ALTELE
Subst gelifiante
AGAR
ALTELE
Pentru a fi accesibil plantelor, Fe trebuie s fie legat de un agent de chelatare, care n cazul
culturilor in vitro este Na2EDTA, sarea disodic a acidului etilen-diamiono-tetra-acetic
- 77 -
- 78 -
n cadrul procesului de producere a mediului de cultur pot surveni o serie de probleme care
pot periclita att lotul de mediu necesar inoculrii sau altei faze din micropropagare, ct i ntreaga
cultur ulterioar.
Precipitatele insolubile
Nerespectarea ordinii la amestecare a unor compui duce la formarea fosfailor insolubili.
Frecvent, srurile cu calciu se dizolv i se folosesc pentru prepararea unor soluii stoc
separate de cele de macroelemente i se adaug doar n momentul preparrii mediului. Formarea de
precipitat n mediu cu pH-ul n jur de 5,6 la adugarea compuilor cu calciul i fosforul. Pentru
reducerea riscului precipitrii se mai recomand s se foloseasc soluii stoc de macroelemente mai
diluate (10X).
Infeciile
Infeciile sunt cele mai periculoase evenimente care pot s apar i, n funcie de momentul
apariei lor, putem identifica cel puin cauza primar care a dus la acest eveniment n scopul
reglementrii problemelor.
Sursele infeciilor pot fi soluii stoc nvechite, vase de cultur nesplate i nedezinfectate
corespunztor, autoclavare necorespunztoare, lipsa cureniei n camera de preparare a mediului
amd.
CATEGORII DE INFECII / PROBLEME DIN MEDIILE DE CULTUR:
1. origine micotic: fructificaii de diferite culori (negru Aspergillus sp., verde-albastru
Penicillium sp.)
2. origine bacterian: n mediu i la suprafaa lui, n zona de contact cu planta, se formeaz
un halou translucid, de culoare alb glbuie;
3. brunificarea mediului: provocat de oxidarea fenolilor emii de plant sau a altor substane
toxice eliminate de specie;
4. vitrificarea/sticlozitatea: proces ce se produce n recipientele de cultur, relativ
controversat i nc n studiu;
5. deshidratarea mediului: arat o umiditate necorespunztoare n recipientul de cultur.
Nesolidificarea mediului dup rcire este o alt problem care poate aprea n procesul de
producie. Din cauzele care ar putea genera aceast problem enumerm: prea puin agar (sub 56g/l), un pH prea mic (sub 5,5) sau o temperatur de autoclavare prea mare.
- 79 -
Test de autoevaluare
1. Avnd n vedere cele nvate n acest capitol i innd cont de spaiul
avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la urmtoarele
ntrebri:
a) Ce este mediul de cultur?
b) Enumerai cteva dintre cele mai cunoscute medii de cultur.
c) Compoziia mediului de cultur.
d) Enumerai compuii anorganici din mediul de cultur.
e) Enumetai compuii organici care intr n compoziia mediului de
cultur.
f) Care este rolul fitohormonilor i a fitoregulatorilor n micropropagare?
g) Care este aciunea fiziologic a auxinelor, citochininelor si
giberelinelor?
h) Care este rolul soluiilor stoc n prepararea mediilor de cultur?
i) Care sunt limitele de pH recomandate pentru mediile de cultur?
j) Care sunt categoriile de infecii i alte probleme care pot aprea n
mediile de cultur i cum se manifest ele?
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de nvare.
- 80 -
- 81 -
colab.
1968),
N6
(Chu,
1978),
Nitsch&Nitsch
(NN,
1969),
- 82 -
grupe de substane.
i) De obicei, valorile pe care mediul de cultur le ia se ncadreaz ntre 5,5
5,8, excepie fcnd recomandrile speciale pentru alte valori cum ar fi
organogeneza care cere un pH de 7 pentru inducerea mai bun a mugurilor
adventivi - i lucrrile de cercetare.
j) Categoriile de infecii sau probleme care apar n mediile de cultur sunt:
origine micotic: fructificaii de diferite culori (Aspergillus sp.,Penicillium):
origine bacterian: n mediu i la suprafaa lui, n zona de contact cu planta;
brunificarea mediului: provocat de oxidarea fenolilor sau a altor substane
toxice eliminate de specie; vitrificarea/sticlozitatea; deshidratarea mediului.
- 83 -
- 84 -
85
6.2
86
6.3
90
6.4
Etapa 2: Multiplicarea
92
6.5
Etapa 3: nrdcinarea
93
6.6
Etapa 4: Aclimatizarea
94
6.7
96
6.8
98
6.9
Bibliografie minimal
98
- 85 -
Se va consulta
literatura
de
specialitate, se vor face cercetri asupra materialului care se supune procesului de micropropagare,
se rspunde la o serie de ntrebri referitoare la tipul de cultur dorit, natura, mrimea i numrul de
inoculi, natura i proveniena explantului, gradul de dezvoltare a plantei mam, fenofaza, condiiile
de cretere, mediul de cultur ales i compoziia acestuia precum i variaiile la care va fi supus. Se
execut o serie de activiti standard de laborator privind necesarul de lucru, tipul de instrumentar
- 86 -
Variabilitatea de reacie
n funcie de biotipurile unei specii, de soiurile alese sau de varieti precum i n funcie de
de originea sa biologic (morfologic, funcional sau de fenofaz i sezon), explantul poate
manifesta o mare variabilitate de reacie n micropropagare, aceasta provenind din considerente
morfo funcionale ca:
Zona de prelevare: vrful, mijlocul sau baza ramurii;
Ramur umbrit sau nu, solarizat sau nu;
La plante lemnoase: zonele mai apropiate de polul radicular sunt cele mai bine
aprovizionate cu ap, hran i hormoni;
Prezena meristemelor: vrfuri, rdcini, noduri, bractee, inflorescene, apexuri.
De asemenea, atunci cnd se preleveaz segmente de plante sau organe ce vor fi supuse
micropropagrii, se va ine cont i se menioneaz ca aspect important privind condiionarea
- 87 -
- 88 -
Plantele lemnoase din climat temperat pun probleme mari n ceea ce privete perioada de
recoltare a materialului vegetal pentru inoculare, reuita acestei operaiuni depinznd de sezon,
momentul recoltrii i condiiile pedoclimatice.
Mrimea explantului
Dimensiunea explantului la recoltare se cere a fi minim, la limit, dar s se asigure totipotena
celular. Ea este standardizat pentru fiecare specie sau soi, n funcie de natura explantului,
fenofaza plantei donor sau a organului din care se preleveaz.
Prelevarea explantului n bune condiii i ndeplinind parametri de calitate se face i n baza
unor cunotine temeinice de anatomie vegetal precum i urmare a cunoaterii amplasrii
esuturilor care se vor preleva, a structurii botanice a speciei.
La nivel industrial, acolo unde volumul de activitate este foarte mare, se prefer s se
lucreze cu apexuri i meristeme apicale datorit faptului c aceste dou categorii prezint rata cea
mai mare de propagare, cu cele mai mari creteri sau cele mai mici anse de infectare datorit
prezenei meristemelor. Un explant de dimensiuni mari nseamn i pericolul de infecie mai mare
dar i o deshidratarea accentuat, n ciuda avantajului c promite o regenerare mai rapid n mediul
de cultur.
Pe de alt parte, atunci cnd se preleveaz explantul, se ine cont de faptul c o suprafa de
contact mai mare cu mediul de cultur nseamn o mai bun asigurare a schimburilor gazoase, o
mai bun absorbie a hranei i a apei.
STERILIZAREA MATERIALULUI VEGETAL
Este principala activitate a etapei 0 din micropropagare i reprezint cheia unei inoculri
corecte i evoluiei satisfctoare a unei culturi, fiind realizat cu scopul de a elibera esutul ce
urmeaz a fi micropropagat de agenii patogeni. Succesul asepsizrii depinde de foarte muli factori,
dintre care amintim:
selectarea corect a metodei de asepsizare, n funcie de explant, de tipul de esut cu care se
lucreaz i toate celelalte aspecte listate n capitolul anterior;
substanele alese pentru sterilizare, innd cont c sunt esuturi fragile, foarte tinere sau, din
contr, lemnoase, greu de sterilizat; se folosesc ageni chimici, n diferite concentraii n
funcie de natura explantului, de tipul lui.
concentraia acestora n raport cu timpul de expunere la substana activa i cltirile
ulterioare;
durata de timp alocat asepsizrii.
- 89 -
- 90 -
ETAPE
Manipularea explantului se face cu grij, cu instrumentar sterilizat i RCIT n prealabil.
Indiferent de cultura urmarit sau de mediul folosit (ne referim la cel solid acum), la inocularea in
vitro a explantelor se va respecta polaritatea: polul caulinar plasndu-se n afara mediului. Plasnd
explantul orizontal sau uor oblic (la inoculi meristematici apicali sau axilari- se va cuta a se
pune n contact mediul cu suprafaa secionat) suprafaa de contact va fi mai mare i se va asigura
astfel o rat de absorbie a hranei mai bun. Explantul se introduce uor n mediul de cultur, ct s
prezinte stabilitate i s nu se rstoarne la urmtoarele manipulri efectuate n decursul procedurii.
Recipientele se etaneizeaz, se eticheteaz i se trimit n camera de cretere.
STABILIZAREA
Literatura de specialitate cunoate deja detalii amnunite privind culturile in vitro la o serie
ntreag de specii horticole sau dendrologice, tatonrile i experienele dezvoltate artnd care
perioad de incubare i cretere variaz n funcie de tipul culturii, specia i natura explantului
folosit, condiiile din camera de cretere i protocolul folosit.
n aceast etap a micropropagrii, explantul se afl n spaiul camerei de cretere, cu factori
de mediu controlai i i acomodeaz procesele metabolice conform compoziiei mediului de
cultur n care a fost inoculat.
Creterile survenite n aceast etap se raporteaz la mediul de cultur folosit i la
tipul de cultur iniiat, fiind urmrite calitatea materialului vegetal, starea de turgescen, starea de
sntate precum i gradul de evoluie. Creterile sunt gestionate i influenate de balana hormonal,
astfel nct, pentru culturile de calus, spre exemplu, se vor folosi auxine i citochinine n
concentraii mai ridicate, pentru lstarii adventivi, procent mai ridicat de citochinine, pentru lstarii
laterali, citochinine n cantitate mai mic sau deloc, n funcie de natura explantului.
n acelai timp, aceasta este perioada n care infeciile apar n condiiile unei dezinfecii
necorespunztoare sau a unui mediu de lucru septic. Indiferent de tipul de cultur iniiat, se
estimeaz c avem o stabilizare a culturilor n primele 14 zile de la inoculare, dup aceast dat,
infeciile care survin sunt puse pe seama infeciilor latente, a virusurilor n mod special. Categoriile
de infecii i alte probleme ce pot s apar n mediul de cultur sunt:
infecii de origine micotic, origine bacterian
brunificarea mediului
vitrificarea/sticlozitatea;
deshidratarea mediului
Etapa de stabilizare a culturiii in vitro presupune i evidenierea tuturor factorilor de mediu
care intervin, a modificrilor de stare in vivo sau ex vivo fa de arealul de cultur i se recomand a
- 91 -
se efectua notri zilnice n ceea ce privete evenimentele care survin asupra culturii n sine, n
scopul evidenierii succesului sau eecului iniierii i validitii protocolului de lucru atunci cnd
vorbim de un laborator de cercetare.
PARTICULARITI
n studile efectuate asupra plantelor s-a evideniat c explantele generate din plante
ierboase genereaz primele manifestri vegetative la 14 zile maxim de la inoculare, fa de
explantele provenind de la plantele lemnoase care manifest vegetativ la 40-60 de zile.
- 92 -
Unul din criteriile care poate aduce un aport considerabil de reuita culturii in vitro este
momentul optim de repasare. MOMENTUL multiplicrii se va alege n funcie de scopul culturii,
de natura i tipul culturii i de particularitile de reacie a explantelor aflate n recipientele de
cultur, literatura recomandnd pentru cteva specii timpii optimi pentru a se determina acest
moment. Pentru a recunoate o cultur care necesit repasare, trebuie s fim ateni i s urmrim
modificrile de stare survenite n cultur:
calusul devine brun, cenuiu sau se usuc;
frunzuliele bazale se nglbenesc;
crete gradul de vscozitate al suspensiilor celulare.
6.5. Etapa 3: nrdcinarea
Reprezint etapa de pregtire a materialului vegetal pentru trecerea in vivo, n spaii
protejate nti i apoi n cmp prin stimularea apariiei sistemului radicular. Plantele rezultate din
tehnicile de multiplicare in vitro au rdcinuele glabre, fr periori absorbani, ceea ce va face
dificil urmtoarea etap, aclimatizarea. Scopul acestei etape este de a forma rdcini ct mai
sntoase i multe, pentru a permite creterea rezistenei plantei la aclimatizare.
Mediul de nrdcinare folosit are auxine n concentraii mari i gibereline, adaos de crbune
vegetal i zaharoz n concentraie redus. Acest mediu permite limitarea lstririi axilare,
stimularea alungirii lstarilor i, cel mai important, inducerea rizogenezei i formarea rdcinilor.
Aspectul cel mai important este cel al caracterului rdcinilor, care fiind foarte slab
dezvoltate pun probleme mari de adaptabilitate. i, odat ce planta este scoas din mediul su de
cultur, procesele metabolice se modific, iar administrarea hranei plantei va trece n atribuiile
sistemul radicular.
Din aceste considerente se urmrete cuplarea etapei de nrdcinare cu aclimatizare, mai
ales la speciile recunoscute ca fiind tolerante la nrdcinare (portaltoii de mr, GF 677 sau gutuiul
Colt). PROBELEMELE ce pot s apar la nrdcinare sunt generate de mediul cu auxine care
poate produce inhibiia plantelor i regresul evoluiei acestora. Ca metod de limitare a inhibiiei, se
tempereaz aceast tendin printr-un tratament inductiv cu auxine cencentrate i abia apoi se trece
la introducerea n mediul de nrdcinare.
- 93 -
- 94 -
Test de autoevaluare
1. Avnd n vedere cele nvate n acest capitol i innd cont de spaiul
avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la urmtoarele
ntrebri:
a) Care sunt etapele micronmulirii?
b) Care sunt factorii ce influeneaz sterilizarea materialului vegetal?
c) Enumerai tipurile de dezinfectani agreai n micropropagare?
d) Detaliai etapa 1: iniierea culturii in vitro.
e) Detaliai etapa de multiplicare in vitro.
f) Detaliai etapa de nrdcinare a explantelor.
g) Detaliai etapa de aclimatizare a plantelor.
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de
nvare.
- 95 -
materialului
vegetal,
iniierea
stabilizarea
culturii,
- 96 -
g) Considerat una din cele mai dificile sau critice etape din
micropropagare, aclimatizarea
- 97 -
INSTRUCIUNI
Lucrarea de verificare solicitat, implic activiti care necesit
cunoaterea Unitii de nvare nr. 6. Rspunsurile la ntrebri vor fi
transmise tutorelui pentru comentarii, corectare i evaluare. Pe prima
pagin a lucrrii se vor scrie urmtoarele:
Titulatura
acestui
curs
(MICRONMULIREA
PLANTELOR
- 98 -
CUPRINS
7.1
99
7.2
Organogeneza
100
7.3
Culturile de apexuri
101
7.4
Culturile de minibutai
102
7.5
Culturile de meristeme
103
7.6
Culturile de calus
105
7.7
Microaltoirea
106
7.8
108
7.9.
110
7.10
Smna sintetic
111
113
113
116
7.14
118
7.15
Bibliografie minimal
118
- 99 -
7.2
Organogeneza
Organogeneza reprezint capacitatea esuturilor vegetale de a forma organe de novo, bazat
- 100 -
- 101 -
astfel
riscul
transmiterii
virusurilor.
Cultura folosete ca material vegetal APEXUL, vrful de cretere al unui lstar, segment ntlnit
att la plantele ierboase ct i la lemnoase. De asemenea, se mai pot folosi segmente uninodale,
minibutai de un nod, de dimensiuni mici de civa milimetri, poriuni de lstari obinui prin
secionarea de o parte i de alta a unui nod i eliminarea frunzei aferente.
Controlul hormonal al dominanei apicale presupune participarea tuturor hormonilor - un rol
important avndu-l auxinele biosintetizate n mugurii apicali care, datorit concentraiei mrite din
apropierea mugurilor laterali, au efect inhibitor asupra creterii acestora.
Apexurile au cretere nedeterminat n mediul in vitro astfel nct, cu ajutorul hormonilor i
a balanei hormonale care se va modifica n favoarea auxinelor, neogeneza de lstari ne va da
posibilitatea s avem cu ajutorul acestei tehnici proliferare nelimitat.
7.4. Cultura de minibutai
Culturile de minibutai sunt derivate din culturile de apexuri i sunt specifice i recomandate
speciilor, soiurilor sau cultivarurilor care prezint dominan apical pronunat i au internodii
lungi.
Cu dimensiuni de 1 nod i descrii anterior n cultura de apexuri, butaii prelevai de la
explant se pot aeza n recipientele de cultur i orizontal, iniiindu-se n acest sens o cultur de gen
marcotaj sau microbutire.
Poziionarea explantului orizontal nltur dominana apical i permite creterea mugurilor
n condiiile defolierii prealabile, ceea ce permite avansarea mai multor creteri noi, lstari, toate n
schimbul unei singure creteri apicale. Odat ajuni la o lungine acceptabil, de 5/6 cm, acetia pot
fi trecui n faza de nrdcinare. Metoda se mai numete i marcotaj in vitro.
- 102 -
- 103 -
Meristem apical
Primordii de frunze
Meristem excizat
pentru inoculare
jumtate.
Recomandarea pentru unele specii este ca s se in
meristemele timp de 3-7 zile la ntuneric, n scopul limitrii procesului oxidativ, proces deteriorativ
care pune n pericol evoluia culturii.
n camera de cretere, temperatura va varia n funcie de specie: ntre 22C, 25C sau i mai mult,
n cazul viei-de-vie; intensitatea luminoas se va stabili ntre 2.400 - 10.000 lucsi, coniferele cernd
o intensitate luminoas mai mare.
Succesul unei culturi de meristeme depinde de numeroi factori ca: dimensiunea
explantului (0,1 mm la cartof pn la 0,3mm), de localizarea mugurelui, n sensul n care mugurii
poziionai n vrful lstarilor vor avea o rat mai bun de evoluie dect cei cei de la baz care sunt
mai btrni, sezonul de prelevare. La speciile pomicole se va ine seama de satisfacerea nevoii de
frig i de tipul de dezinfecie folosit.
Avantajele culturii de meristeme:
1. Permite nmulirea clonal a materialului biologic valoros, care trebuie conservat, salvat
sau pstrat;
- 104 -
- 105 -
Pentru a forma calusul, acesta se stimuleaz prin hormonii specifici, auxine, citochinine sau
o combinaie de auxine i citochinine, reet care variaz n funcie de specie. n faza de inducere de
calus, esuturile parenchimatice care reprezint masa calusului intr ntr-un proces de
dedifereniere celular. Trebuie menionat c esuturile meristematice nu au nevoie de procese de
dedifereniere, fiind capabile de diviziune rapid i formarea de calus direct. n aceast faz,
celulele evolueaz n diferite organe: lstari, rdcini sau embrioni somatici.
2. Proliferarea calusului sau faza de diviziune.
Procesul de nmulire al calusului, faza a doua, este direct gestiona de balana hormonilor care se
regsesc n mediul de cultur. Procesul n urma cruia calusul se divide nu este pe deplin cunoscut,
dar se presupune c se formeaz n urma interaciunii hormonilor eliberai de celulele rnite. n
aceast etap, celulele din alctuirea calusului devin meristematice, se divid activ, rapid i scad n
volum.
3. Regenerarea organic sau faza de difereniere.
Este o faz controversat a culturii de calus, urmare a evoluiilor care se petrec n cultura de celule
de calus. n acest moment, rata creterii calusului scade, ajungndu-se la un echilibru ntre creterea
n volum i diviziune.
Faptul c generarea de organe are la baza principiul totipotenei celulare, ne permite astzi
s multiplicm de ordinul unu/zeci de mii plantele, cteva grame de calus putnd genera mii de
neoplantule.
Cu toate acestea, culturile de calus au instabilitate genetic i fiziologic mare, ceea ce
limiteaz cultivarea n scopul conservrii germoplasmei sau pentru multiplicare clonal
(variabilitatea somaclonal este ns intens studiat n acest moment n ameliorare iar
comportamentul celulelor n culturile de calus va da, ntr-un final, rspunsurile necesare).
7.7. Microaltoirea
Ca tehnic a micropropagrii, microaltoirea este recent aprut, urmare a descoperirii
incompatibilitii dintre portaltoi i altoi la multe specii de interes horticol. Ea genereaz plante
mam libere de virusuri i alte boli care ulterior pot fi utilizate ca surs de ramuri altoi pentru
altoirea tradiional. Primul pom liber de virusuri obinut prin microaltoire a fost generat n 1970,
prin microaltoirea la Citrus (Murashige i colab.)
Ca tehnic a micropropagrii, microaltoirea are aplicabilitate pentru diverse scopuri:
1. multiplicarea unor specii care rspund dificil la cultura de meristeme (cire, cais);
2. aproape exclusiv pentru producerea de pomi liberi de virusuri la speciile: piersic, mr,
cais, cire, prun.
- 106 -
- 107 -
- 108 -
Laptele de cocos, foarte bogat n citochinine, are un rol important n inducia procesului de
embriogeneza somatic.
- 109 -
Din aceast perspectiv, embriogeneza somatic are i limitri pe care evoluia tiinific
sigur le va depi:
Viteza uluitoare de propagare, ceea ce permite la o singur inoculare producerea unui numr
foarte mare de plante;
- 110 -
- 111 -
Speciile au pretenii diferite fa de nutriie, motiv pentru care nu se pot elabora reete
standardizate pentru alctuirea mediului nutritiv al semiei sintetice, endospermului artificial,
aceasta constituind una din principalele inconveniente ale tehnicii.
AVANTAJE ale seminei sintetice:
1. Permite folosirea i producerea de semine la speciile care nu produc de obicei semine;
2. nlocuiesc seminele hibride;
3. Folosirea unor genotipuri speciale;
4. Importan maxim n ameliorare;
Dintre dezavantaje, amintim:
1. Se deshidrateaz repede i necesit sisteme de nveliuri care s le pstreze umiditatea
relativ;
2. Embrionul este meninut n stare de repaus cu ajutorul unor substane chimice;
3. Semnatul presupune scoaterea embrionului din repaus;
4. Procent variabil spre mic de plante viabile obinute;
5. Pesticizarea seminei trebuie limitat, deoarece la dezvoltarea embrionului, acestea
mpiedic micorizarea.
6. Alginatul de calciu are permeabilitate mare pentru elemente solubile;
7. Rdcinile lstarilor cresc mai lent;
8. Capsulele sunt lipicioase i se manipuleaz greu la semnare.
Procedura de realizare se bazeaz pe aa numita tehnic de ncapsulare, n condiiile
realizrii unei semine ct mai uniforme pentru uurarea mecanizrii. n acest sens, ncapsularea
butailor nu este nc posibil din cauza limitrilor tehnologice. Etape:
Incapsularea embrionilor n alginat de sodiu 2-4%;
Scufundarea embrionilor n alginat de sodiu 2-4%;
mbierea individual n clorura de calciu 50 M, cu pH 7;
La max 30 de minute distan, capsulele se ntresc i pot fi manipulate;
Se pstreaz n condiii de refrigerare, la 3-6 C, n condiii aseptice.
ncapsularea organelor este o extensie a seminei sintetice, putnd fi ncapsulai bulbi
provenii din culturi in vitro, minibutai i rozete de frunze de la diverse specii: kiwi, zmeur, mr,
crin etc. Prin ncapsularea acestuia, materialul vegetal se poate pstra cu cheltuieli mai reduse,
promind economie de spaiu ct i de for de munc.
Tehnica este n explorare, permite deja standardizare, dar are nc de rspuns la ntrebri
privind compoziia subtratului n care se afl i testarea n continuare a speciilor pentru a vedea care
se preteaz la aceast procedur cu cele mai bune rezultate.
- 112 -
- 113 -
selecie a plantelor, descendenii instabili genetic, sterili sau chiar cu mutaii fizice, calusul himeric
enunat mai sus i neasigurarea transmiterii caracterelor necesare in, deocamdat, aceast tehnic,
n rezerv.
- 114 -
Test de autoevaluare
1. Avnd n vedere cele nvate n acest capitol i innd cont de spaiul
avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la urmtoarele
ntrebri:
a) Ce reprezint organogeneza?
b) Ce reprezint culturile de apexuri?
c) Definii cultura de minibutai.
- 115 -
- 116 -
ntrebarea 1
g) Cultura de embrioni sau de segmente embrionare prezint utilitate n cadrul
micropropagrii putnd fi aplicat speciilor care manifest latena seminelor sau n
cazul n care avem specii ale cror semine nu germineaz, chiar puse n condiii
favorizante de lumin temperatur i umiditate.
h) Cultura embrionilor zigotici presupune separarea embrionilor zigorici de esutul
ovular, cultivarea acestora n condiii aseptice, pe medii de cultur speciale care
poteneaz dezvoltarea ovulului, n condiii speciale care asigur creterea i
- 117 -
acestui
curs
(MICRONMULIREA
PLANTELOR
- 118 -
CUPRINS
8.1
119
8.2
120
8.3
121
8.4
124
8.5
127
8.6
128
8.7
131
8.8
132
8.9.
Bibliografie selectiv
132
- 119 -
V. vinifera
EXPLANT
Apex
MEDIU
DE REGULATORI
CULTURA
CRESTERE
Mille&Murashige
(3-4)BAP(80) AdS
DE REFERINTE
Harris
meristematic (1976)
Stevenson
Riesling,
Meristem
Murashige&Skoog (2)BAP
Mirancea
Cabernet,
fragmentat
(1962)
colab.(1982)
Meristem
Mirancea
ntreg
(1962)
colab. (1982)
Apex
Chee
i
i
Feteasc
Riesling
Vitis spp.
Pool (1,1)BAP+(0,09)ANA
meristematic (1982)
Chee i Pool
(1983)
i
V. berlandieri x Apex
Murashige&Skoog (2,25)BAP
Novak
V. riparia
meristenatic
(1962)
Jukova (1983)
V. vinifera
Apex
Stevenson
i (0,023)IBA+(2)BAP+(60)
Monette (1886)
AdS
n ultimii ani s-au dezvoltat tehnici noi care se apropie de embriogeneza somatic n cazul
micropropagrii viei-de-vie. n 1980, Barlass i Skene pun la punct protocolul de multiplicare in
vitro la via-de-vie pornind de la cultivarea pe medii aseptice a fragmentelor de apexuri de cca.
1mm, prelevate din vrful tulpinilor. n 60 de zile de la inoculare au fost generai lstari de 3 cm
care, subcultivai ca butai de 1 ochi, n 10-14 zile au condus la obinerea de cca. 8.000 de plante de
vi-de-vie ntr-un timp total de 3-4 luni. (Bhakwani i Razdan, 1983).
- 120 -
- 121 -
- cele mai multe cercetri se fac n acest moment pentru nrdcinarea in vitro a microbutailor.
Prun
-
- 122 -
ir de medii nutritive n scopul optimizrii lor pentru declanarea procesului de morfogenez. Cel
mai des utilizat substrat este mediul Murashige-Skoog (MS). Rugini, E., 2003 recomand de a
utiliza acest mediu n stare semisolid cu adaos de 20mg/l zaharoz, regulatori de cretere ca zeatin
- 4,6 M i IAA- 0,3 M sau 4,6 M - zeatin, 2,9M GA3 i 2,2 M BA. Deseori, n relaie cu
scopul propus, se recurge la reducerea cantitativ a mediului nutritiv pn la 75% ori 50%. Un alt
mediu utilizat n special pentru cultivarea explantelor provenite din frunze i peiol de la Actinidia
este mediul Gamborg B5. Caracteristic pentru el este coninutul mai redus de N, microelemente ca
Fe, Mn, Zn n comparaie cu MS, pe cnd coninutul de K este mai ridicat, ceea ce conduce la
reglarea sporit a permeabilitii membranelor celulare. n mediul Hildebrandt o importan
deosebit i se atribuie azotailor, fosfailor, sulfailor i clorurii de K, Ca, Mg i Na. Pentru
cultivarea Actinidiei n condiii in vitro au fost utilizate i alte medii ca: Standardi, Pieric, WPM,
LQ, Nitsh, Chengs K(h).
Pentru dediferenierea esuturilor n vederea producerii calusului a fost folosit o mare
diversitate de metode i substane. Astfel, Muleo R. i colab. (1990) a indus formarea calusului din
frunz cu 1,0 mg/l de 2,4 D la ntuneric. Ali autori au recurs la folosirea 4PU n doze de 0,1 mg/l.
Acest produs s-a dovedit i un bun stimulator al diferenierii de muguri i lstari pe calusul format.
Formarea calusului din peiol a fost vizibil n cazul adaosului n substratul nutritiv MS a
hormonilor BA (2,2 M) i ANA (0,27 M). O alt variant de inducere a calusului la Actinidia pe
mediul MS din poriuni de tulpin a folosit fitohormonii BAP (0,5-2 ppm) i IAA (0,05 ppm) sau
BAP + zeatin. Combinaiile auxinelor 2,4 D i IAA i a citochininelor BAP i kinetin au fost
testate cu succes pe explantele derivate din tulpin, peiol, frunze i rdcini. ANA (0,0 2 mg/l) i
zeatina (0,1 mg/l) adugate la mediul Standardi (1983) avnd ca explante limbul foliar i peiolul au
dat dovad de un nalt potenial calusogenetic. Majoritatea surselor de specialitate ce analizeaz
influena citochininelor asupra proceselor de organogenez fie direct sau indirect denot faptul c
hormonul folosit cel mai frecvent pentru obinerea calusului de Actinidia este zeatina n doze de 0,5
1,0 mg/l.
n faza de proliferare, diferii autori recomand utilizarea diferitor medii de cultur cu o
combinaie de fitohormoni variabila. O nalt rat de proliferare a lstarilor a fost atestat de
Lionakis S. i Zirari A., (1991), utiliznd mediu lichid suplimentat cu 8,9 M BA i 0,3 M IBA.
Marino G. i Battistini, S. (1990), au demonstrat c BAP cauzeaz hiperhidricitatea frunzelor, efect
ce nu a fost depistat n cazul zeatinei, care a condus nemijlocit la sporirea ratei de proliferare. De
asemenea, o proliferare activ a fost obinut de Pais M. 1987 pe (MS) mediu dup o perioad de
subcultur de patru sptmni cu 0,5 mg/l acid ascorbic, ca antioxidant i 2,3 zeatin, 0,3 IAA.
Segmente de lstari obinui pe acest mediu au fost transferai pe un mediu identic, modificndu-se
- 123 -
coninutul hormonal i anume utilizarea a 5 mg/l de DTT i excluderea acidului ascorbic. Acest
mediu numit H2 a condus la o proliferare activ dup cinci sptmni de cultur.
De cele mai multe ori, obinerea rizogenezei a fost posibil datorit tratrii directe a bazei
lstarilor obinui in vitro cu IBA i apoi transferul lor n sol bine aerat. Diferite concentraii de
auxine au fost utilizate n acest scop cu succes: suplinirea mediului MS cu 2,5 M de IBA timp de 1
lun sau tratarea cu 4,9 M de IBA timp de 20 secunde. Morini S. (1986) a constatat faptul c IBA
n mediul nutritiv, n concentraie 2,5; 4,9; 9,8 M influeneaz direct numrul rdcinilor formate
la Actinidia. Pentru formarea rdcinilor la neoplantulele obinute, autorul recomand utilizarea
variantei cu 2,5 M i plantarea ulterioar a lor n perlit steril. Aclimatizarea plantulelor trebuie
efectuat treptat, reducnd umiditatea n camera de cultivare de la 100% la 80% timp de 30 zile cu
meninerea fotoperioadei de 16 ore zi/8 ore ntuneric.
Sotiropoulos T.E i colab. (2006) au studiat reacia speciei Actinidia deliciosa la prezena n
mediul de cultur a metioninei i a borului (B). Prezena B n substratul nutritiv poate afecta
procesul de organogenez in vitro. Odat cu mrirea concentraiei B are loc creterea ratei de
proliferare a mugurilor.
La specia Actinidia deliciosa var.deliciosa, Harada (1975), folosind 2,4 D sau ANA (0,1-10
mg/l) n cultura de rdcin i tulpin, a obinut embrioizii pn la stadiul globular, cu pierderea pe
mai departe a capacitii de dezvoltare i dedifereniere.
Dezvoltarea metodelor de micropropagare la kiwi constituie o parte considerabil a
programelor de studiere a acestei culturi, care implic tehnici de ameliorare in vitro deoarece
micropropagarea clonal ofera uniformitatea genetic a materialului vegetativ la aceast specie.
- 124 -
Prima multiplicare in vitro la garoafe a fost fcut n 1957 de Quak, iar aceasta a permis ca astzi s
avem culturi de plante ornamentale fr virusuri. Cele mai bune rezultate la culturile in vitro pe
garoafe s-au obinut cu ajutorul culturilor de meristeme iar studiile au artat c dimensiunea
meristemului joac un rol hotrtor. Pamfil (1984) afirm c dimensiunea de 0,2 mm la meristem
aduce o eficien maxim a devirozrii, procentul acesteia fiind direct proporional i cu gradul de
contaminare al plantei i mrimea meristemului. n plus, cea mai bun evoluie n cultur au avut-o
meristemele apicale (54,44%) fa de cele axilare. Murashige i Shabde (1977) folosesc mediul de
cultur MS modificat, 1mg/l AIA dnd rezultatele cele mai bune alturi de chinetin i tot ei
menioneaz c pentru multiplicarea in vitro a garoafelor, un mare rol l are mediul de cultur, n
mod special macroelementele, hormonii i glucidele.
De asemenea, pentru cultura in vitro a garoafelor se poate practica microbutairea,
obinndu-se 80.000 plante dintr-un singur meristem, ntr-un an, avnd n vedere poziionarea
acestora pe neoplantula iniial (82,78% minibutai de vrf, 51,11% minibutai bazali) i se ofer
astfel o bun stabilitate genetic materialului obinut (Pamfil, 1984).
Crizantema
Cunoatem n acest moment trei metode de nmulire vegetativ in vitro: cultura de
meristeme, care vine i cu avantajul devirozrii plantei, cultura de fragmente uninodale, i cultura
din frunze sau fragmente florale (boboci, elemente florale, peduncul).
Mediul de cultur recomandat pentru cultura crizantemei este pe baza de microelemente
Heller iar condiiile optime n care se dezvolt cultura sunt stabilite la 16 ore lumin/24 ore,
intensitate luminoas de 2.600 lucsi i o temperatur situat la aproximativ 24C.
Saintpaulia Ionatha
Prima ncercare reuit n multiplicarea a Saintpaulia s-a petrecut n 1937, cnd cercettorii
Naylor i Johnson au obinut plante noi din cultivarea pe hrtie de filtru umectat a unor fragmente
de frunze, pentru ca mai trziu, n 1972, s fie generate primele neoplantule in vitro. Mediul de
cultur folosit a coninut o balan echilibrat a hormonilor cu aport de ANA 1mg/l si BA de 1mg/l.
Cercettorii romni de la Centrul de Cercetri Biologice Cluj-Napoca au obinut plante de
Saintpaulia in vitro folosind fragmente de limb foliar sau peiol, acesta din urm avnd ns o rat
lent de multiplicare. Cea mai bun variant de multiplicare pentru Saintpaulia este recomandat de
Cachia Cosma, Petrescu (1993) i const n prelevarea i cultivarea in vitro a unor fragmente de
dimensiune cca. 1 cm din lamina frunzei sau din boboci care, ulterior, se microbutesc. Etapa de
- 125 -
nrdcinare este uor trecut de aceast specie i se recomand substrat anorganic, nisip cu perlit i
mbuntit sptmnal cu soluie ANA pentru accelerarea rizogenezei.
Freesia
O alt specie deosebit de apreciat este freesia, floare des ntlnit pe piaa de consum i
care vine pe sezonul rece, cnd avem puine plante n vegetaie i sortimentul este redus n climat
temperat continental. Din pcate, nmulirea vegetativ la freesia este deficitar, planta producnd
aproximativ 5-6 tuberobulbi, ceea ce asigur o rat de multiplicare foarte mic. Astfel, cercetrile
ndreptate ctre multiplicarea in vitro sunt pe deplin justificate. n 1974 i 1976 se reuete
producerea pe neoplantule de freesie folosind cultura de calus din meristem, tulpin, bulbi i flori,
iar devirozarea plantei a fost posibil prin culturi de meristeme n 1968. Cercetrile efectuate de
Cachia i Lazar (1983, 1984) au pornit de la datele oferite de Pierik i Bajaj (1975) i, folosind
balana hormonal drastic modificat, lipsa hidrolizatului de cazein, agar i zaharoza n minus, au
reuit producerea de noi plante de freesia, observndu-se c bobocii terminali de pe apexurile
inflorescenelor i cei subapicali au o capacitate regenerativ diferit n funcie de poziia acestora
n inflorescen i de natura regulatorilor de cretere folosii. n plus, se recomand ca inoculii
(bobocii sau butonii florali) s fie meninui la ntuneric pentru o perioad de cca 8 sptmni,
pentru ca apoi s fie trecui la lumin continu sau regim 16 ore lumin/24 ore.
Trandafirul
Anual, n Frana, se obin prin multiplicare in vitro ntre 200.000-400.000 plante de
trandafir pornind de la un singur mugure, putnd fi folosite ca plante cultivate pe rdcini proprii
sau pot s furnizeze muguri altoi pentru nmulirea vegetativ clasic. Primele cercetri tatonri
privind nmulirea la trandafiri au fost fcute n 1967 de ctre Hill, n 1968 obinndu-se rezultate
satisfctoare de ctre Iacobs i colab. iar Davies i Wilkowska reliefeaz c un factor decisiv n
multiplicarea in vitro la trandafiri este sensibilitatea soiului care genereaz rspunsuri complet
diferite la modificarea concentraiei de citochinine i auxine.
Este metoda cea mai nou i mai modern de producere a materialului sditor pe rdcini
proprii, pornind de la un mic grup de celule meristematice care se gsesc n vrfurile de cretere ai
mugurilor.
Principiul acestei metode const n extirparea unor esuturi meristematice de dimensiuni
reduse (0,3 mm) luate din vrfurile de cretere i cultivarea lor pe medii artificiale i n condiii de
laborator controlate, n aa fel ca s se obin n final o plant mic cu lstari i rdcini.
- 126 -
n momentul de fa, pe plan mondial, exist sute de laboratoare care se ocup de nmulirea
in vitro a plantelor, printre care trandafirii ocup un loc de frunte. Se apreciaz c se obin anual
peste 25 de mii. de plante prin aceast metod.
n ara noastr s-au fcut cercetri numeroase, mai ales la Institutul de Pomicultur din
Piteti-Mrcineni, prin care s-a reuit elaborarea unei tehnici de nmulire care are ca finalitate
practic obinerea n timp scurt a unor cantiti mari de plante identice din punct de vedere genetic
cu planta mam.
Cercetrile romneti afirm c exist cteva elemente fundamentale de care trebuie s se
in cont la cultura in vitro a trandafirului: sursa de explante (planta donor s fie sntoas,
viguroas i autentic), epoca de prelevare a explantelor, natura explantelor (mugurii subcutanai
dnd cele mai bune rezultate iar mugurii apicali, de cele mai multe ori fiind floriferi) i
specificitatea soiului. Mediul de cultur folosit pentru iniierea culturilor este unul fr auxine sau
cu o cantitate mic (0,004-0,1 mg/; ANA), cantitile mari de auxine genernd cantiti
considerabile de calus la baza explantelor. BAP este un factor limitativ n iniierea culturilor iar
nrdcinarea plantelor se face bine n condiiile n care srurile au fost reduse la jumtate iar acidul
naftilacetic este n concentraie de 0,05-0,1 mg/l (Coman, 1983). Aclimatizarea n condiii normale
aduce ns pierderi la cultura de rosa, dar ca soluie, se poate trece i n mediu anorganic de
turb/mrani cu perlit i stimulare cu Radistim, soluia propus aducnd un procent satisfctor la
aclimatizare 85-92% (Coman, 1983).
- 127 -
- 128 -
ENDOMICORIZA: sunt vezicule sau ngrori care apar la suprafaa rdcinii, ciuperca
gsindu-se localizat n parenchimul cortical iar celulele care sunt colonizate de
endomicoriz au un comportament foarte activ. ntlnite la peste 80% din plantele de
cultur.
ECTOMICORIZELE: mai puin rspndite la speciile pomicole, dar le regsim la castan,
alun.
Tehnica microrizrii se reduce la obinerea plantelor care urmeaz a fi micorizate, aduse pn n
faza de nrdcinare, la selecionarea ciupercii care se pune pe mediu de multiplicare i a treia faz,
micorizarea propriu zis, care presupune trecerea micropantulelor nrdcinate pe un substrat de
turb i perlit care a fost n prelabil mbuntit cu agentul de micorizare, adic ciuperca.
S-a descoperit ca micorizele au rol important n absorbia azotului i fosforului (la mr s-a
observat o mrire a ratei absorbiei cu 50-80%), c asigur o reacie mai bun a plantelor la soluia
calcaroas a solului sau apei, inhibnd manifestrile de cloroz, iar unele micorize chiar elimin
auxine, stimulnd n acest fel procesul de nrdcinare a butailor, toate acestea fiind numai
avantaje pe care le poate oferi micoriza n procesul de multiplicare in vitro.
- 129 -
Test de autoevaluare
1. Avnd n vedere cele nvate n acest capitol i innd cont de
spaiul avut la dispoziie, v rugm s comentai sau s rspundei la
urmtoarele ntrebri:
a) Care este principalul factor biotic care intervine n cultura in vitro la
via-de-vie?
b) Care este baza tiinific de la care se poate susine afirmaia ca
micropropagarea este o tehnic recomandat pentru nmulire la viade-vie?
c) Care dintre fitoregulatori deine un rol crucial n multiplicarea in
vitro la speciile pomicole?
d) Care este cea mai dificil faz a micropropagrii speciilor pomicole?
e) Care sunt primele cercetri ntreprinse pe cultura la garoafe?
f) Care este elementul care joac un rol hotttor n culturile in vitro la
garoafe?
g) Care este cea mai bun metod de micropropagare recomandat de
cercetatorii romni pentru micropropagarea Saintpaulia?
h) Care sunt factorii limitativi n cultura in vitro la trandafir?
Comentarii la aceste ntrebri vei gsi la sfritul unitii de
nvare.
Stabilitatea
genetic
este
un
punct
important
al
micropropagrii.
- 130 -
- 131 -
PLANTELOR
HORTICOLE),
numrul
- 132 -
MIC GLOSAR
Agar: agent de solidificare, natural, extras din alge marine.
Autoclav: Main capabil s sterilizeze sub presiunea aburilor.
Calus: formaiuni de celule nedifereniate.
Clona: un grup de plante propagate din pri vegetative, derivate din culturi repetate provenite dintrun singur individ. Clonele sunt considerate uniform genetice.
Contaminare: infectare cu un organism nedorit ntr-un mediu controlat.
Cultur de celule: cultivarea celulelor sau evoluia lor in vitro, incluzand i cultura unei singure
celule.
Cultur de embrioni: cultur in vitro a unor embrioni maturi sau imaturi.
Cultur: Creterea unei plante in vitro, intr-un mediu steril.
Culturi de esut: cultura in vitro a celulelor, esuturilor, organelor i plantelor n condiii aseptic
total.
Embrioni somatici: structuri de tip embrion, non-zigotice, formate din celule somatice.
Explant: parte sau segment excizat dintr-o plant care se folosete n cadrul culturilor in vitro.
Ex vitro: spaiul n care sunt scoase plantele generate in vitro i transplantate de obicei n sol sau
ghivece cu substrat.
Hormon: Compui naturali (sau de sintez) care se gsesc n plant i influeneaz creterea i
dezvoltarea plantelor.
Hot cu flux laminar: Spaiu nchis de lucru unde aerul este sterilizat i controlat de filtre HEPA
In vitro: care creste n sticl.
In vivo: care crete natural.
Inocul/explant: poriune de organism (lstar, frunz, calus etc) folosit n iniierea micropropagrii.
nmulire adventiv: dezvoltarea organelor precum mugurii, frunzele, radacinile, lastarii somatici i
embrioni din lastari i esut din rdcin sau esut calus.
- 133 -
Mediu de cultur: soluie nutritiv sau substrat de cultur folosit n culturile de celule, cu reeta
specific.
Meristem: grup de celule nedifereniate care sunt situate n vrful lstarilor, mugurilor, rdcinilor
care se divid activ i genereaz esuturi i organe.
Micropropagare: multiplicarea plantelor pornind de la pri vegetative prin intermediul mediului de
cultur.
Nedifereniat: celule care nu au difereniat.
Propagare clonal: multiplicare asexuat a plantelor dintr-un singur individ sau explant.
Subcultivare: divizarea i transferarea unei culturi sau unei poriuni din explant pe un mediu nou de
cultur cu aceeai sau cu reet diferit.
Tehnici aseptice: proceduri folosite in scopul prevenirii infeciilor cu microorganisme de gen: fungi,
bacterii, virui, micoplasma, care pot afecta culturile de celule esut sau organe.
Totipoten: capacitatea celuleor plantelor de a regenera ntreaga plant n condiii de cultivare pe
medii de cultur potrivite.
Zigotul: embrion derivat din ou sau zigot, este rezultatul fecundrii gametului femel (oosfera) de
ctre gametul mascul (spermatia).
- 134 -
BIBLIOGRAFIE
National Research Centre on Plant Biotechnology Lal Bhadur Shastri Building New
Delhi, 2007.
- 135 -