ADRIAN-GEORGE PETICILĂ

MICROÎNMULŢIREA
PLANTELOR HORTICOLE

2015

1
 CUPRINS
INTRODUCERE 5
Cap. I. ISTORICUL CULTURILOR DE CELULE ŞI
6
ŢESUTURI VEGETALE
1.1 Începuturile culturilor de celule 7
1.2 Avantajele şi dezavantajele multiplicării in vitro 13
1.3 Cercetarea în domeniul culturii de ţesuturi in vitro în
16
ţara noastră
Cap II. BAZELE TEORETICE ALE
23
MICROPROPAGĂRII IN VITRO
2.1 Noțiuni esențiale de biologie celulară 24
2.2 Particularitățile morfologice și funcționale ale celulei
vegetale și implicațiile acestora în tehnicile de 24
multiplicare a celulelor și țesuturilor in vitro.
2.3 Biologia dezvoltării plantelor (cormofite) în cazul
24
culturilor de celule şi ţesuturi in vitro.
Cap. III. LABORATORUL DE CULTURI IN VITRO 37
3.1 Alcătuirea laboratorului de micropropagare 37
3.2 Dotările laboratorului 38
Cap. IV. ASEPSIA ÎN CULTURILE VEGETALE IN
52
VITRO
4.1 Măsuri generale de igienă şi asepsie 53
4.2 Asepsizarea încăperilor, a instrumentarului şi a
54
celorlalte obiecte de laborator
4.3 Asepsizarea vaselor de cultură 55

2
4.4 Asepsizarea mediilor de cultură, apei şi a altor substanţe 55
4.5 Asepsizarea materialului vegetal 56
4.6 Verificarea asepsizării 57
Cap. V. MEDIILE DE CULTURĂ 62
5.1 Generalităţi 63
5.2 Compoziţia mediului de cultură 64
5.3 Compuşii anorganici şi organici 65
5.4 Compuşii fenolici, compuşii antivirali şi extractele
74
vegetale
5.5 Prepararea mediilor de cultură şi pH-ul 75
5.6 Problemele şi infecţiile mediilor de cultură 78
Cap. VI. FAZELE PROPAGĂRII IN VITRO 85
6.1 Etapa 0 - Pregătirea materialului vegetal în vederea
86
prelevării explantului
6.2 Etapa 1 - Iniţierea şi stabilizarea culturii 90
6.3 Etapa 2 - Multiplicarea 92
6.4 Etapa 3 - Înrădăcinarea 93
6.5 Etapa 4 - Aclimatizarea 94
Cap. VII. METODE DE PROPAGARE IN VITRO A
CULTURILOR DE CELULE ŞI ŢESUTURI 99
VEGETALE
7.1 Organogeneza 100
7.2 Culturile de apexuri 101
7.3 Cultura de minibutaşi 102
7.4 Culturile de meristeme 103
7.5 Cultura de calus 105

3
7.6 Microaltoirea 106
7.7 Cultura de embrioni şi endosperm 108
7.8 Cultura de embrioni zigotici 110
7.9 Sămânţa sintetică 111
7.10 Cultura de antere, polen, ovare, ovule şi ţesut nucelar 113
7.11 Cultura de protoplaşti 113
Cap. VIII. MICROPROPAGAREA IN VITRO A
119
SPECIILOR HORTICOLE
8.2 Micropropagarea in vitro la vița-de-vie 120
8.3 Micropropagarea in vitro a speciilor pomicole 121
8.4 Micropropagarea in vitro a speciilor floricole 124
8.5 Micropropagarea in vitro a cartofului 127
8.6 Micoriza și culturile in vitro 128

GLOSAR DE TERMENI
BIBLIOGRAFIE

4
INTRODUCERE
România are un mare potenţial în ceea ce priveşte domeniile
horticole, de la viticultură la pomicultură, legumicultură sau floricultură şi
în special, în ceea ce priveşte producerea de material săditor. Cum cerinţele
pieţei moderne sunt pentru material săditor de calitate, liber de virusuri şi
boli şi certificat, microînmulțirea - ca disciplină şi afacere - este mai mult
decât necesară pentru evoluția pieţei de profil.
Ne-am propus în acest manual dedicat studenţilor de la Facultatea
Horticultură să trecem în revistă principalele instrumente cu care operează
această disciplină, în speranța că în viitor, una din direcțiile de dezvoltare a
pieţei agricole va cuprinde şi domeniul microînmulțirii, stabilind în acest fel
primele noțiuni necesare pentru a opera în domeniul biotehnologiilor. Pe
parcursul capitolelor am trecut în revistă diverse aspecte legate de structura
laboratoarelor, necesarul tehnic aferent pentru ca mai apoi să listam
principalele tehnologii de producție în domeniul microînmulţirii, categoriile
de culturi care se pot opera.
La fiecare capitol am încercat să semnalăm problemele deosebite
care pot apărea sau caracterul de importanţă și inedit, microîmulţirea fiind
un braţ al biotehnologiei, o ştiinţă aplicată deosebit de valoroasă care
necesită însă cunoştinţe din varii domenii adiacente, de la biochimie,
agrochime, genetică sau biologie, la fiziologie şi ameliorare.
Pentru a ne încadra ca ţară membră cu drepturi depline în
Comunitatea Europeană, nu avem doar drepturi, avem şi obligaţii, şi una
dintre acestea este aceea de a racorda serviciile oferite la nivelul
performanțelor europene. Dezvoltarea segmentului de biotehnologii
vegetale cu aplicabilitate în horticultură sau agricultură, prin deschiderea

5
de laboratoare de microînmulțire care să ofere spre comercializare atât pe
piaţa internă cât şi pe piaţa europeană produse de valoare, certificate şi
care să corespundă exigenţelor crescânde ale acestui domeniu - de la
producător la consumator, susţine importanţa acestei materii de studiu în
cadrul programei ştiinţifice a Facultăţii de Horticultură.

Rădăcini de Drosera pygmaea, multiplicată in vitro.

Autorul
București, august 2015

6
 Cap. I. ISTORICUL CULTURILOR DE CELULE ŞI ŢESUTURI
VEGETALE
1.1. Începuturile culturilor de celule.
Plantele sunt organismele care prin procesul de fotosinteză realizează
cel mai spectaculos proces din lumea vie, acela de transformare a energiei
solare în energie chimică. Ele joacă un rol hotărâtor pentru existenţa umană,
constituind „aurul verde‖, bogăţia de neînlocuit a Terrei, fiind sursă de hrană
şi energie pentru om şi animale. Dacă la acest rol se adaugă şi rolul de
purificator al atmosferei prin absorbţia bioxidului de carbon şi eliberarea
oxigenului precum şi rolul de materii prime pentru unele industrii, ca
alimentară, textilă sau farmaceutică, găsim justificat interesul omului pentru
perfecţionarea continuă a procedeelor de înmulţire şi cultivare a plantelor.
Secolul XX este considerat pe bună dreptate secolul marilor progrese
care au condus la îmbogăţirea şi acumularea informaţiilor legate de natură,
de descifrare a mecanismelor eredităţii, de descifrare a legităţilor din
domeniul fenomenelor biologice şi a factorilor mutageni, a modului cum
aceştia pot fi manipulaţi pentru inducerea variabilităţii în scopul creării de
noi forme vegetale, implementarea de noi procedee de cultivare şi înmulţire
a plantelor.
S-a consolidat concepţia că celula vegetală conţine în nucleul său
totalitatea informaţiei genetice necesară dezvoltării unui organism complet.
Ea se supune principiului clasic al totipotenţei celulare. Regenerarea de
plante pornind de la o singură celulă conținută de tip haploid sau diploid a
stat şi stă la baza tehnicii înmulţirii plantelor in vitro.
Cultura de ţesuturi vegetale s-a dezvoltat ca urmare a cercetărilor lui
Gottlieb Haberlandt care, intuind capacitatea regenerativă a celulelor
plantelor superioare, a încercat să cultive ţesuturi vegetale. El publică în anul
7
1902 lucrarea „Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzelle‖ în care este
fundamentată teoretic ideea că orice celulă diploidă sau haploidă conţine
informaţia genetică ereditară imprimată în genom. La acea vreme,
experienţele sale nu au fost încununate de succes deoarece a folosit explante
din celule cu un grad înalt de diferenţiere morfofuncţională (ţesut palisadic,
stomate etc.) dar şi a limitelor pe care le aveau la acea dată cunoştinţele de
fiziologie vegetală, cunoştinţele în stabilirea compoziţiei substratului de
cultură, în ce priveşte natura şi concentraţia substanţelor macro şi
microelemente, a proporţiei în care trebuie acestea folosite, a
indispensabilităţii prezenţei în mediu a unor surse de C organic, vitamine şi
stimulatori de creştere.
Ideea lui Haberlandt a fost respină de botaniştii contemporani (E.
Küster, 1926), care susţineau că obţinerea de plante întregi prin multiplicare
de celule somatice nu este realizabilă.
Haberlandt lansează totuşi ipoteza totipotenţialităţii celulare, concept
pe care îl găsim reformulat de Schleiden şi Schwann (1939) la care îşi
contribuiseră în perioada 1920 – 1939 White, care a reuşit să obţină calus
din vârfurile rădăcinilor de tomate şi R.J. Cautheret (1934), care a obţinut
calusuri folosind explante de salcie, plop, ulm, tutun şi morcov și pe care le-
a stimulat cu auxine şi le-a repicat în medii sterile, Wirchow în 1858,
Bernard, 1878 şi anatomistul vegetal Goebel, toți citaţi de White în 1963.
Capacitatea unor celule eucariote de a funcţiona ca „organisme
primitive‖ în condiţiile separării de planta mamă susţinută de Haberlandt a
fost exploatată prin diferite practici de înmulţire vegetativă (butăşire,
marcotaj sau altoire).
Vöchting şi Rechinger (1893), citaţi de White (1963), au iniţiat
experimente pentru determinarea limitelor de divizibilitate ale materialului
8
vegetal și tudiile lor au ajuns în faza în care nu au pierdut din capacitatea
regenerativă.
În 1957, W.D. Stewart elaborează prima metodologie de cultivare
in vitro a ţesuturilor vegetale pe medii nutritive conţinând hormoni de
creştere.
Progresele din domeniul biologiei au permis abia în zilele noastre
generarea de plantule dintr-o singură celulă perfecţionată odată ci evoluția
cunoştinţele despre structura şi funcţionalitatea celulelor şi organitelor
celulare.
Literatura de specialitate (1904) citează experienţele efectuate de
Hanning care a obţinut plantule la diverse crucifere pornind de la embrionii
extraşi din seminţe imature la Raphanus sativus, R.landra, R.candatus şi
Cochlearia danica, experienţele dovedind posibilitatea creşterii pe medii
artificiale, cu adaos de zaharoză, a unor fragmente de plante.
Laibach (1925, 1929) demonstrează utilitatea practică a tehnicii de
înmulţire in vitro pentru ameliorarea plantelor. El a izolat embrionii din
seminţe neviabile din încrucişarea lui Linum perene cu Linum austriacum, i-
a adus la maturitate şi i-a cultivat pe medii nutritive. Această metodă a servit
mai târziu la realizarea de hibrizi ce dădeau naştere la seminţe sterile,
respectiv la embrioni avortaţi.
Între 1904 şi 1932 au fost efectuate numeroase încercări de cultivare
pe medii artificiale a unor explante, dar rezultatele au dovedit că cercetările
în domeniu se aflau în impas (White, 1963). Mulţi cercetători s-au aliat în
această perioadă ideii susţinută de Küster (1926), potrivit căreia, cultivarea
ţesuturilor vegetale este „nerezolvabilă‖ (Morel, 1948). Cu toate acestea,
experienţele botaniştilor au continuat,

9
 În jurul anilor 1930, savanţii Gautheret în Franţa şi concomitent
White în Statele Unite efectuează cercetări în direcţia cultivării in vitro a
explantelor provenite din ţesut cambial prelevat de la arţar, salcie, ulm, plop,
(Gautheret, 1931) şi rădăcini excizate de la plantele de tomate (White,
1934).
Odată cu descoperirea în 1934 a primului fitohormon (acidul β
indolil acetic) de către Kögl, Haagen – Smit şi Erxleben a fost deschisă o
nouă etapă în succesul cultivării in vitro a explantelor vegetale (Moore,
1979).
În Franţa, Gautheret şi Nobecourt (1939), lucrând independent, obţin
calus din fragmente prelevate din rădăcinile metamorfozate (tuberizate) de
morcov. White (1938), Gautheret şi Nobecourt (1939) realizează aproape
simultan cultivarea in vitro a calusului, reuşind să menţină în viaţă ţesuturile
inoculate şi să stimuleze proliferarea acestora, dovedind posibilitatea
transferării şi înmulţirii acestor ţesuturi prin subcultură.

Putem considera că prin cercetările lor, White (1938), Gautheret şi

Nobecourt au pus bazele cultivării in vitro a explantelor vegetale: organe,
ţesuturi şi celule. Totodată, ei şi-au adus contribuţia şi în domeniul alcătuirii

10
mediilor de cultură privind compoziţia, concentraţia în macro şi
microelemente esenţiale pentru nutriţia explantelor, prezenţa unei surse de C

Fig.I.2. Cultură de calus obținută de White și Gautheret

constând în cea mai mare parte din vacuole de celule parenchimatice
cu reminiscențe dispersate de activitate meristematică

şi N organic, a unor vitamine şi auxine.

Culturile de calus şi subcultivarea acestora au reuşit şi datorită
descoperirii în 1934 a rolului fiziologic al auxinei acidul 3 indolilacetic
(AIA), care introdusă în mediu de cultură favorizează declanşarea şi
susţinerea proceselor regenerative.
În 1941, Van Querbeek şi colaboratorii demonstrează efectul
stimulator al laptelui de cocos asupra dezvoltării embrionilor şi a formării de
calus din explante de Datura.
11
 White şi Braun, în 1942, apoi Braun – singur, în 1945- reuşesc
cultivarea unor ţesuturi tumorale caulinare pe medii aseptice. Meritele în
multiplicarea şi propagarea in vitro a unor plante horticole revin lui Morel şi
Martin (1952, 1955). Ei au obţinut material săditor devirozat pornind de la
plante infectate cultivate pe medii aseptice. Astfel, la nivelul materialului
săditor au fost eradicate virozele la cartof, orhidee, garoafe, dalii etc.
(Margara, 1982).
Morel şi Martin au demonstrat pe dalii (1952) şi cartof (1955) că din
meristemele prelevate de la plante mame infectate se pot regenera clone
sănătoase. Morel (1960) la Cymbidium stabileşte tehnica de micropropagare
in vitro care reprezintă un prim pas în micropropagarea industrială. El
apreciază că dintr-un singur explant într-un singur an se pot obţine 4
milioane de plante identice din punct de vedere genetic, libere de viroze. Cu
această metodă s-a revoluţionat tehnica înmulţirii orhideelor, extinsă mai
târziu la garoafe, crizanteme şi alte specii ornamentale, la pomii fructiferi, în
viticultură şi silvicultură.
O serie de alţi cercetători (Gregory, 1940; Taylor, 1950; Nitsh, 1951;
Sparrow şi colab., 1955; Maheshwari şi Lal, 1958; Vasil, 1957, 1959 şi alţii)
adoptă o direcţie deosebit de interesantă, aceea a regenerării şi diferenţierii
de plantule in vitro folosind componente florale, antere sau grăunciori de
polen, fructe ori seminţe imature (Maroti, 1976).
Tehnica multiplicării in vitro a explantelor s-a perfecţionat în paralel
cu rezultatele cercetărilor din domeniul studiilor compoziţiei şi consistenţei
mediilor de cultură. Heller (1951) experimentează creşterea ţesuturilor pe
mediu gelificat cu agar sau cu silicagel iar în 1955, Miller şi colab., izolează
din sperma de heringi, chinetina. În 1957, Skoog şi Miller avansează ipoteza

12
„balanţei hormonale‖, a raportului dintre auxină şi citochinină, care
favorizează iniţierea de rădăcini şi muguraşi dintr-o cultură de calus.
Skoog (1956) şi Miller (1957) descoperă importanţa chinetinei şi
aduc elemente noi privind efectul acestui hormon, precum şi acţiunea
raportului între chinetină şi auxină asupra proceselor de organogeneză la
explantele cultivate in vitro, deoarece manipularea acestei balanţe
influenţează reuşita direcţionării proceselor de diferenţiere morfologică la
ţesuturile cultivate prin această metodă.
Astfel, sporirea cantităţii de auxină determină orientarea proceselor
de morfogeneză spre rizogeneză în timp ce creşterea proporţiei de chinetină
induce formarea de muguraşi şi lăstăraşi, iar la concentraţii ridicate fiecare
hormon administrat separat determină generare de calus şi inhibarea
proceselor de organogeneză.
Experienţele lui Muir (1953) reprezintă o premieră în sensul că
obţine suspensii subcelulare cu celule de Tagetes erecta şi Nicotiana
tabacum iar Nickell reușește micropropagarea cu celule de Phaseolus
vulgaris. În 1954, Muir şi colab. izolează ca explant o celulă care apoi a fost
crescută pe punte de hârtie de filtru.
În 1954, Muir şi colaboratorii reuşesc izolarea unei unice celule
dintr-o suspensie de celule sau din calus şi obţin prin diviziuni repetate un
conglomerat de celule de tip calus. Doi ani mai târziu, Nicckel (1956)
descrie modul de creştere în cultură continuă a unor suspensii celulare de
fasole.
În deceniile cinci şi şase ale secolului XX înregistrăm rezultatele
unor cercetători în domeniu printre care amintim:
În 1944, Skoog iniţiază experimente pentru studierea proceselor de
organogeneză pe calus de tutun, studiu care reprezintă un progres în
13
domeniul controlului evoluţiei inoculilor vegetali in vitro şi un salt calitativ
pentru dezvoltarea culturilor de ţesuturi şi celule de plante. Studiile de
organogeneză efectuate de Skoog în1944 pe calus de tutun reprezintă un
progres important în domeniul controlării evoluţiei inoculilor vegetali in
vitro.

Fig.I.3. Cultură de calus la specia Nicotiana

tabacum
Caplin şi Steward în 1948 şi Steward şi Caplin, 1951, 1952
realizează un pas în dezvoltarea culturii in vitro la cormofite prin adăugarea
în mediile de cultură a laptelui din nucă de cocos şi a auxinei de sinteză 2,4
diclorfenoxiacetic cu rol stimulator asupra creşterii ţesuturilor de morcov şi
de cartof. Aceste experienţe relevă faptul că unii fitohormoni sau substanţe
fitoefectoare pot acţiona sinergic.
Torrey (1957) realizează o cultură de celule vegetale în picătură
suspendată, Jones şi colab. (1960) obţin o microcultură pe o lamă de
microscopie. Steward şi Shantz (1956) şi Reinert (1956) studiază creşterea
unei suspensii celulare de Picea glauca.
Reinert (1958) şi Steward împreună cu colaboratorii (1958) studiază
problema embriogenezei într-o suspensie provenită din rădăcini de morcov.
14
Experienţa inoculării unei celule şi formarea unei suspensii celulare se
datorează lui Jones şi colab. (1960), iar obţinerea de clone dintr-o celulă
unică revine lui Hildebrandt (1958).
Skoog (1944) şi Skoog şi Tsui (citaţi de Gautheret, 1959)
demonstrează pe explante tisulare constând din măduvă de tutun o sporire a
creşterii masei de calus şi formarea de muguraşi în condiţiile aplicării de
adenină şi ridicării conţinutului de fosfat în mediile de cultură.
În anul 1959 se realizează dintr-o singură celulă o plantulă (Braun).
Această performanţă repetată şi prin experienţele lui Vasil şi Hildebrandt
(1965), Chandra şi Hildebrandt (1967), confirmă valabilitatea ipotezei emisă
la începutul secolului de Hildebrandt, aceea a totipotenţialităţii celulei
vegetale şi anume că dintr-o celulă somatică, diploidă poate fi regenerată o
plantulă ce îşi poate continua şi încheia ciclul biologic complet la trecerea ei
în cadrul natural de viaţă.
Progresele cele mai importante în domeniul cultivării explantelor
vegetale pe medii aseptice s-au înregistrat după anul 1960, astfel:
Bergman, 1960, relizează experimentul de obţinere a unei culturi de
celule cu circa 90% celule libere individualizate prin metoda de filtrare a
populaţiei de celule. Încorporarea celulelor într-o placă de mediu de cultură
agarizat a condus la fenomenul că fiecare celulă izolată a generat câte o
colonie de celule vizibilă cu ochiul liber iar după separare s-au realizat clone
pornind de la o celulă unică.
În anul 1960, Cocking izolează pe cale enzimatică protoplaşti din
rădăcini, vârful acestora sub influenţa unei enzime de origine fungică –
celulaza – duc la formarea după un timp a unei noi membrane celulare.

15
 Kohlenbach (1966) izolează mecanic celule din mezofil foliar
separate din frunzele de Macleaya cordata pe care reuşeşte să le cultive in
vitro.
Nagata şi Takebe în anul 1970 demonstrează că proptoplaştii izolaţi
din mezofil de frunze de tutun formează în timp mici colonii celulare.
Ulterior, Takebe şi colab. cultivă protoplaşti de tutun după metoda descrisă
de Bergman (1960) reuşind obţinerea de calus din culturi de celule generate
din protoplaşti, prin care se regenerează plantulele. Randamentul acestor
metode la diferite specii continuă să crească.
S-a născut, astfel, ideea realizării tehnicilor de fuziune a
protoplaştilor pentru obţinerea de hibrizi somatici între speciile la care
hibridarea sexuată nu este posibilă.
În 1972, Carlson şi colab. obţin primul hibrid somatic produs prin
fuziune de protoplaşti de la Nicotiana glauca x Nicotiana langsdorffii.
Paralel cu descoperirile teoretice în domeniul cercetărilor genetice,
care fundamentează şi pun bazele multiplicării in vitro, se înregistrează
progrese importante în domeniul cercetărilor aplicative, acela de cultivare a
explantelor pe medii aseptice.
Printre cei care au contribuit la dezvoltarea sistemului special de
cultivare in vitro a celulelor amintim pe Steward, Mages şi Smith (1958),
Tulecke şi Nickell (1959, 1960). Ulterior, Byrne şi Koch (1962) construiesc
instalaţii de mare capacitate pentru culturile de celule.
O realizare deosebită constă în punerea la punct a multiplicării
exemplarelor vegetale în ritm accelerat, lucru greu de imaginat ca fiind
realizabil cu trei decenii în urmă.
Multiplicarea prin subculturi succesive in vitro realizată de
Murashige, 1977 şi 1978 dintr-un singur meristem de orhidee, care a făcut
16
posibilă obţinerea a 4 milioane de exemplare, copii fidele ale plantei
donatoare, a demonstrat şi eficienţa economică a metodei prin intermediul
căreia se face economie de material biologic. Acest fapt a determinat
practicienii să asimileze procedeele elaborate în laboratoarele de cercetare şi
să standardizeze metodele pe profil industrial, creând adevărate industrii
horticole şi silvice pentru obţinerea prin această metodă a materialului
vegetal pentru plantat. Clonarea in vitro în ritm intensiv a exemplarelor
valoroase a uşurat mult munca amelioratorilor.

1.2. Avantajele și dezavantajele multiplicării in vitro.

Avantajele micropropagării in vitro - superioară metodelor de
înmulţire vegetativă clasică - constau în rapiditate (scurtarea timpului),
obţinerea de plante juvenilizate, lipsa bolilor şi vigoare mai mare.
Metoda evită variabilitatea genetică şi permite obţinerea de material
nevirozat în final, conducând la creşterea calităţii materialului vegetal.
Prin această metodă este permisă şi multiplicarea speciilor care nu au
seminţe viabile sau care nu se pot înmulţi natural pe cale vegetativă.
Culturile de explante vegetale in vitro reprezintă modele, instrumente
valoroase în cercetarea modernă în domeniul biologiei vegetale. Ele prezintă
următoarele avantaje:
 Permit studierea acţiunii fitohormonilor, a implicării permeabilităţii,
absorbţiei, fotosintezei, respiraţiei, metabolismului, în morfogeneză,
genetică şi biochimie.
 Sunt domenii de abordare multidisciplinară.
 Pun la dispoziţie mijloacele stăpânirii şi dirijării creşterii.
 Permit crearea de plante adaptate la condiţii vitrege de viaţă într-o
perioadă scurtă de timp (rezistente la acţiunea dăunătoare a unor
17
 agenţi stresanţi) și plante create în decurs de câteva luni prin
comprimarea evoluţiei filogenetice (Gill, 1980).
Din punct de vedere istoric, dezvoltarea şi evoluţia cunoştinţelor în
domeniul tehnicilor de cultivare in vitro a celulelor şi ţesuturilor vegetale
cunoaşte 5 etape distincte:
1. Între anii 1939 – 1902
- perioadă când s-a lansat teoria unităţii structurale fundamentale a lumii vii
(Schleiden şi Schwann, 1939),
- celula a fost acceptată ca unitate structurală de bază a organismelor vii,
fiind apoi emis postulatul conceptului de totipotenţialitate
(omnipotenţialitate) celulară a lui Haberlandt, 1902.
2. În perioada 1902 – 1920
- se cunoaște o perioadă de stagnare a cercetărilor în domeniu, deoarece
primele experimente cu culturile de explante nu au condus la rezultate
favorabile.
3. Etapa anilor 1920 – 1939,
- înregistrează primele succese în domeniul creşterii in vitro a embrionilor, a
rădăcinilor, a obţinerii de calus, ţesuturi care cultivate apoi pe medii aseptice
şi subcultivate periodic prin repicări au condus la obţinerea de material
vegetal (White, Gautheret şi Nobecourt ).
4. Etapă anilor 1939 – 1966
- este caracterizată de studiile a numeroşi cercetători privind
comportamentul diferitelor explante cultivate pe diferite medii de cultură, în
scopul cunoaşterii factorilor implicaţi în procesele de înmulţire şi
diferenţiere a celulelor, gradul lor de autonomie în funcţie de substrat,
condiţiile de cultură, provenienţa şi natura explantului.

18
- în această direcţie, în 1953 s-a reuşit cultivarea meristemelor caulinare,
aplicale (Morel şi Martin) şi obţinerea de plante libere de viroze folosind ca
plantă donatoare o plantă polivirusată, ocazie cu care s-a emis teoria (Skoog
şi Miller-1957) referitoare la controlul hormonal al organogenezei (rolul
balanţei auxină/citochinină), obţinerea de embrioni somatici (Steward şi
Reinert - 1958, 1959), primele culturi de celule (Muir, Torrey şi Jones şi
colab., 1954 – 1960), izolarea enzimatică de protoplaşti (1960) şi obţinerea
primului hibrid somatic (Carlson, 1972).
5. Perioada începând din 1966 şi până în zilele noastre
- delimitează etapa modernă a culturii de celule şi ţesuturi vegetale,
caracterizată prin extinderea largă a utilizării explantelor pentru multiplicare.
În această perioadă, cercetările fundamentale în biologie cunosc o acumulare
de cunoştinţe în domeniile citologiei, citofiziologiei, biologiei moleculare,
geneticii şi ameliorării la nivel ultrastructural şi molecular precum şi în
biochimie, fiziologie etc.
Paralel cu cercetările biologice fundamentale apar o serie de
subramuri de biotehnologii vegetale cum ar fi citofitotehnologiile:
 înmulţirea şi clonarea cultivarilor valoroşi;
 micropropagarea şi generarea de material vegetal sănătos;
 elaborarea de tehnologii de modificare a genomului unor specii
cormofite; exploatarea capacităţii de biosinteză a celulelor izolate în
condiţii de cultură intensivă;
 obţinerea de embrioni somatici, producerea de seminţe artificiale;
 clonarea rapidă a unor soiuri rezultate din lucrările de ameliorare.

1.3. Cercetarea în domeniul culturii de țesuturi in vitro în țara noastră.

19
 Începând cu anul 1975, în țara noastră au fost abordate cercetări
sistematice privind problemele înmulţirii plantelor in vitro fiind amenajate
laboratoare de culturi de ţesuturi la Institutul de Cercetări Biologice din
Bucureşti, Institutul de Cercetări Silvice din Bucureşti, în unităţile de
cercetare agricolă şi horticolă de la Fundulea, Vidra, Mărăcineni, Ştefăneşti,
în unităţile de învăţământ superior agricol din Cluj-Napoca, Bucureşti, Iaşi,
Facultatea de Biologie din Bucureşti, Facultatea de Farmacie din Bucureşti
şi în unităţi de producţie cum ar fi Întreprinderea de Sere Codlea (1988).
Ulterior au luat fiinţă numeroase nuclee de cercetare în domeniul
culturilor de explante in vitro, colective care s-au dezvoltat şi laboratoare
care s-au dotat pentru a contribui la lărgirea cercetărilor şi cunoştinţelor în
acest domeniu.
În anul 1984 menţionăm apariţia primei monografii cu acest profil
intitulată „Culturi de celule şi ţesuturi vegetale – aplicaţii în agricultură‖
Ed.Ceres, autori Cachiţă C.D., Raicu P. Badea M.E.
În anul 1999 la Iaşi, la Institutul Agronomic „Ion Ionescu de la Brad‖
apare tot în acest domeniu lucrarea „Biotehnologiile viitorului‖ autor
Constantin Milică.
În anul 2000 apare la Sibiu lucrarea „Biotehnologie vegetală‖ vol.I
„Bazele teoretice şi practice‖ autori Dorina Cachiţă-Cosma şi Camelia Sand.
În învăţământul superior agricol, primele cursuri în domeniul
culturilor de celule şi ţesuturi vegetale au luat fiinţă la Institutul Agronomic
„N.Bălcescu‖ din Bucureşti sub formă de cursuri postuniversitare, între anii
1985 – 1988, fiind editat şi un volum intitulat „Curs practic de culturi de
ţesuturi in vitro, cu aplicaţii în legumicultură şi floricultură‖ autori Cachiţă
C.D. şi Petrescu C.(1985). Din anul 1987 acest curs s-a introdus sub formă
opţională la secţiile de biologie şi la facultăţile de horticultură din ţară.
20
 Ca urmare a progreselor teoretice şi practice din domeniu din
ultimele decenii, tehnicile culturilor cu explante in vitro au căpătat o amplă
dezvoltare şi extindere în ţara noastră, apărând o serie de bioindustrii
profilate pe creşterea in vitro a diferitelor explante, care impunea pregătirea
în acest domeniu a unor specialişti biotehnologi. Ca urmare, este înfiinţată
în anul 1995 la Bucureşti, în cadrul Universităţii de Ştiinţe Agricole şi
Medicină Veterinară, Facultatea de Biotehnologie cu ramuri ale
biotehnologiei vegetale ce se constitue în discipline fundamentale
independente.

Mişcarea mondială din domeniul culturilor de explante este foarte

activă. În anul 1972 a luat fiinţă „International Association for Plant Tissue
Culture‖ la care România a aderat în anul 1975. Din patru în patru ani au loc
Congrese Mondiale organizate de această asociaţie.
La noi în ţară se înfiinţează Asociaţia Română de Culturi de Ţesuturi
şi Celule Vegetale. Prima manifestare ştiinţifică din ţara noastră cu tematica
culturilor de celule şi ţesuturi vegetale a fost oraganizată la Cluj Napoca în
anul 1981 de Institutul de Cercetări de Biologie.

21
 În 1989, tot la Institutul de Cercetări Biologice din Cluj Napoca s-a
organizat al IV-lea Simpozion Naţional de Culturi de Explante.
În noiembrie 2000 se organizează la Universitatea Babeş Bolyai –
Facultatea de Biologie din Cluj Napoca al X-lea Simpozion de Culturi de
Ţesuturi şi Celule Vegetale care marchează 25 de ani de la iniţierea primelor
cercetări în domeniul culturilor de celule şi ţesuturi în România.

22
 Cap.II. BAZELE TEORETICE ALE MICROPROPAGĂRII IN VITRO

2.1. Noțiuni esențiale de biologie celulară

Celula, care reprezintă unitatea morfologică, structurală şi
funcţională de bază a organismelor vii a fost observată la microscop pentru
prima dată în 1665 de către Hook, fiind minuţios cercetată de-a lungul
timpurilor, dar abia în secolul al- XX-lea s-a reuşit ca această unitate
structurală a materiei vii să fie pe deplin cunoscută şi cunoştiinţele în acest
domeniu să poată fi folosite în domenii de activitate inexistente în urmă cu
multe decenii.
Ştiinţa care se ocupă de studierea structurii celulei, a funcţionării şi a
chimismului celular, poartă numele de citologie.
Fig.II.1. Celula de spirulina la microscop

Orice celulă vie, indiferent de ―specializarea― ei, din moment ce este vie şi
posedă un nucleu este capabilă să reproducă întreaga plantă din care
provine.

23
 Această proprietate remarcabilă a celulei vegetale stă la baza
dezvoltării culturilor in vitro. Orice individ al regnului vegetal poate sau va
putea fi cultivat in vitro fără excepţie.
Celula vegetală poate parcurge toate etapele dezvoltării sale istorice
pentru ca apoi să redevină embrion. Datorită proprietăţii manifestată de
ţesuturi şi celule, enunţată de Haberland încă în 1902, aceea a
―totipotenţialităţii―, celulele vegetale pot evolua în toate direcţiile.
Manipularea celulelor plantelor superioare în contextul studiilor
privind tehnicile culturilor de celule şi ţesuturi vegetale se adresează tipului
de celule eucariote (eu = adevărat, karyon = nucleu – în limba greacă) celule
care caracterizează marea majoritate a plantelor, de la grupa algelor (mai
puţin algele albastre), grupa ciupercilor, a cormofitelor ca şi a celulelor
animale.
Celulele eucariote au o caracteristică principală aceea că au prezent
nucleul care este un organit celular individualizat.
La plantele superioare, nu vorbim de celulele solitare, ci de celule
organizate sub forma unor grupări ce constau într-o asociaţie permanentă de
celule ce formează ţesuturile, în care celulele au aceeaşi origine, mărime şi
formă sau pot avea forme şi origini diferite dar îndeplinesc o aceeaşi funcţie.
Un ţesut constituie o unitate anatomică şi funcţională permanentă în care
celulele ce constituie ţesutul sunt unite între ele printr-un ciment de pectat de
calciu.
Mărimea, structura şi funcţiile celulelor plantelor diferă mult unele
de altele şi depind de specie, vârstă, funcţiunea pe care o îndeplinesc, stadiul
de dezvoltare ontogenetică a ţesutului sau organismului din care au făcut
parte pe tot parcursul vieţii lor (în perioada de viaţă sau în repaus).

24
 Toate aceste considerente, toţi aceşti factori endogeni trebuie luaţi în
considerare atunci când prelevăm un ţesut pe care dorim să-l cultivăm in
vitro, deoarece reuşita unei culturi pe medii artificiale depinde de natura
celulelor ce compun un explant.
Cunoaşterea din punct de vedere anatomic și funcțional a
elementelor structurale şi tisulare ale celulei este absolut necesară deoarece
ne asigură alegerea corectă a unui explant pentru a evita în cazul iniţierii
unei culturi in vitro, a folosirii unui ţesut maturizat, puternic diferenţiat
morfologic sau a unui explant cu multe celule moarte, explant inapt şi
inadecvat pentru multiplicarea in vitro.
Descrierea părţilor componente ale celulelor vegetale
Membrana celulară (fig.1) delimitează la exterior celula vegetală -
spre deosebire de celula animală- sub forma unui perete rigid pectocelulozic
care conferă celulei forma şi o apără de impactul cu factorii externi. Peretele
celular este lipsit de viaţă iar din punct de vedere chimic și este alcătuit din
macromolecule de celuloză asociate şi pachete de 15-20 micele –
microfibrile.
Figura II.2. Celula vegetală de ing. Trifan Daniela

25
 Aceste elemente sunt agregate în matricea peretelui celular care pe
lângă celuloză şi hemiceluloză conţine şi substaţe pectice și se numește
peretele celular primar, cu o grosimea de 1-3 µ.
În cazul celulelor îmbătânite sau a celor care suferă modificări
secundare de perete celular primar, membranele pot fi încrustate cu
substanţe minerale SiO2, carbonaţi sau cu substanţe organice: celuloză,
hemiceluloză, lignină, suberină, ceară sau cutină (la exterior alcătuind
ţesuturi protecţie).
În acest caz, aceste modificări de ordin secundar pot mări rigiditatea
peretelui celular (lignina), impermeabiliza prin suberificare, cutinizare sau
cerificare, peretele celular.
La cormofite peretele celular joacă rol mecanic, rol major în
menţinerea poziţiei ortotrope a plantelor, pentru reducerea gradului de
permeabilitate a membranelor pentru apă şi aer, reducerea schimburilor
dintre plantă şi mediu. Exemplul ar fi cel al suberulului, epiderma cerificată
sau cea cutinizată de la suprafaţa frunzelor care reduc transpiraţia plantelor.
Peretele celulelor care a suferit modificări în care celulele şi-au încheiat
creşterea poartă numele de perete secundar şi conţine 41-45% celuloză, 30%
hemiceluloze şi în unele cazuri 22-28% lignine (Salisbury şi Ross, 1992).
Modificările secundare ale peretelui duc la schimbări în fiziologia
celulei în sensul că dispare capacitatea celulei de a creşte şi a se reproduce
iar pe măsura avansării procesului de modificare a structurii pereţilor
celulari descreşte treptat vitalitatea celulelor, scăderea permeabilităţii
acestora, alterarea schimburilor dintre celule sau cu mediul exterior.
Aceste celule se izolează funcţional iar conţinutul lor se necrozează.
Fără cunoaşterea elementelor structurale tisulare din punct de vedere
anatomic şi funcţional, alegerea corectă a unui explant din ţesutul maturizat
26
sau cu multe celule moarte poate compromite din start iniţierea unei culturi
in vitro.
În concluzie, singurele ţesuturi sau celule potrivite pentru această
tehnică sunt celulele cu pereţi primari de natură pectocelulozică,
nemodificaţi secundar.

Fig. II.3.MITOZA, (2n=6)/1. interfaza, 2.profaza, 3. prometofaza,

4. metafaza, 5. anafaza, 6. telofaza, 7. două celule fiice

Apariţia peretelui celular are loc imediat după ce s-a produs diviziunea
nucleului (sfârşitul telofazei).
În zona mediană a celulei mame protoplasma celulelor nou formate
secretă molecule de celuloză şi hemiceluloză care formează câte un strat
27
delimitator ce va deveni peretele celular. În zona mediană care separă cele 2
celule fiice se distinge o formaţiune de natură pectică –pectat de calciu- care
poartă numele de lamelă mijlocie (fig.1) şi joacă rol de ciment intercelular
ce leagă celulele unui ţesut sau organ care consolidează structura de monolit
a plantei.
Odată cu creşterea celulei sub acţiunea hormonului auxină, are loc şi
un proces de labilizare a microfibrelor de celuloză şi datorită presiunii
endogene a celulei (vacuola) se produce o distanţare a spaţiilor
intermicelare, în zonele rarefiate citoplasma amplasează noi micele de
celuloză. În procesul de labilizare a membranei celulare un rol joacă şi
enzimele pectinaza, fosfatoza-acidă invertaza, etc. Acest tip de creştere a
peretelui celular primar se numeşte intersuscepţiune. Depunerile de lignine
au loc centripet pe peretele celular spre interiorul celulei, lumenul celulei
micşorându-se treptat. Acest tip de îngroşare a peretelui celular se numeşte
‖creştere prin apoziţie‖.

Figura II.4. Plasmodesme

Depunerile de lignine -uneori neuniforme- constituie ―armături― de-a lungul

pereţilor vaselor lemnoase, ele împiedicând strivirea din cauza presiunii
28
celorlalte celule și permit fluxul ascendent de la rădăcini la frunze al sevei
brute prin xilem. Acestea sunt, însă, tipuri de celule ―moarte― care sunt total
neindicate ca inoculi la culturile in vitro.Punţile de citoplasmă care poartă
denumirea de plasmodesme (Fig.II.4.) sunt formaţiunile ce străbat peretele
celular la nivelul unor orificii ultrafine – punctuaţiuni care asigură
comunicarea între celulele unui ţesut.
Cerificarea, cutinizarea, suberificarea, lignificarea, gelificarea,
mineralizarea sunt modificări secundare ale peretelui celular care apar în
cazuri particulare.
Peretele celulozic este în general mai elastic la celula tânără şi mai
rigid, deci mai puţin elastic, la celula bătrână.

Protoplastul
Protoplastul sau citoplastul reprezintă conţinutul viu al celulelor şi
ocupă interiorul cavităţii celulare denumită şi lumen celular.
La exterior, protoplastul este delimitat de peretele pectocelulozic, iar
pereţii celulari ai celulelor care se învecinează sunt lipiţi unii de alţii prin
intermediul lamelei mijlocii.
Protoplastul cuprinde două categorii de componente variate ca
formă, mărime și rol biologic şi anume:
1. Componente sau organite celulare care sunt vii şi înglobate în
protoplasmă sau citoplasmă:
 nucleul;
 reticulul endoplasmatic;
 mitocondriile (condriomul);
 plastidele (plastidomul);
 dictiozomii (aparatul Golgi);
29
  peroxizomii;
 ribozonii;
 microzomii (sferozomii);
 lizozomii;
 centrul celular;
2. Componentele celulare nevii înglobate în protoplast:
 vacuomul (totalitatea vacuolelor dintr-o celulă);
 substanţele de rezervă (incluziunile ergastice);
 amidonul;
 picăturile lipidice;
 sărurile minerale (cristale, macle, cistoliţi sau rafidii);
 corpusculi, conglomerate, formaţiuni floculare, agregate
(variate suspensii vacuolare).
Celulele vegetale pot fi diferenţiate în:
- celule cu cloroplaste – situație când aparţin unor
parenchimuri asimilatorii;
- celule fără cloroplaste – situație când în citoplasmă se
disting alte tipuri de plastide (leucoplaste sau
cromoplaste).
În culturile de cloroplaşti întâlnite în mcropropagare, tipurile de celule
discutate se disting în câmpul microscopic.
Citoplasma
Masa fundamentală a celulelor vii în care sunt înglobate celelalte
organite celulare (nucleu, reticul endoplasmatic, aparatul Golgi, plastidomul,
condriomul, peroxizomii, ribozomii, microzomii şi lizozomii) şi o parte din
produşii de metabolism rezultaţi din activitatea celulară, poartă denumirea
de citoplasmă.
30
 Citoplasma este alcătuită dintr-o materie semifluidă, translucidă, de
natură proteică, care formează un sistem coloidal complex. În interstiţiile
moleculare ale sistemului coloidal citoplasmatic apa, în care sunt dizolvate
săruri şi elemente în stare ionică, radicali liberi sau substanţe organice
hidrosolubile, formează mediul de dispersie al fazei coloidale. La exteriorul

Fig.II.5.Citoplasma și citosolul

citoplasmei, la contactul ei cu peretele celular pectocelulozic este prezentă o

formaţiune cu structură ordonată, semipermeabilă (lipoproteică) care poartă
numele de plasmalemă.
Odată cu înlăturarea pe cale enzimatică a peretelui celular
pectocelulozic, protoplastul rămâne înfăşurat în membrana plasmatică.
În culturile de protoplaşti trebuie anihilate sau atenuate forţele de
respingere dintre aceştia, trebuie facilitat procesul de resorbţie a
plasmalemelor a doi protoplaşti învecinaţi pentru a realiza fuziunea dintre ei

31
şi amestecul a două mase protoplasmatice provenite de la două celule
străine.
În scopul facilitării acestui proces în mediul de cultură trebuie
administrate substanţe tensioactive care detensionează forţele electrice ale
membranelor, demobilizează moleculele de fosfolipide în legătură cu
proteinele ce alcătuiesc structura trilamelară lipoproteică a plasmalemei,
substanţe ce vor descuraja forţele de respingere a protoplaştilor facilitând
fuzionarea acestora.
A doua membrană plasmatică numită tonoplast delimitează
citoplasma de sucul vacuolar. Compoziţia chimică şi funcţiile acesteia se
aseamănă cu ale plasmalemei dar este mai selectiv semipermeabilă decât
plasmalema.

Fig.II.6. Structura celulei vegetale

Ambele membrane plasmatice reglează prin absorbţie sau permeabilitate

accesul substanţelor din celule (desosbţia sau excreţia). Între cele două
membrane plasmatice se găseşte citoplasma fundamentală sau hialoplasma
în care se află răspândite celelalte organite celulare ce poartă numele de
organite plasmatice.
Rolul fiziologic al citoplasmei este multiplu şi constă în :
32
  sediul unor reacţii metabolice de catabolism şi
anabolism;
 locul de acţiune a o serie de enzime;
 este traversată de ioni care intră sau ies din celulă.
Citoplasma este excitabilă, se mişcă (proces numit dineză) iar în momentul
mitozei sau meiozei suferă diviziune –citocineză- proces urmat de refacerea
şi creşterea citoplasmei până la volumul celulei mamă din care au rezultat
celulele fiice.

Nucleul
―Centrul vital― al celulei, centrul de coordonare a proceselor vitale,
în care este localizată cea mai mare parte a zestrei ereditare nucleul este
organitul de formă sferică cu cele mai mari dimensiuni 5-50 µ.
Funcţie de activitatea nucleară celulele se diferenţiază arbitrar în:
 celule cu activitate nucleară intens metabolic predominant sintetică
(S);
 celule aflate într-o fază activă de diviziune fază numită;
 cineză în care se produce atât cariocineza cât şi citocineza în urma
căreia celulele se înmulţesc.
Capacitatea de diviziune este proprie numai celulelor tinere denumite
celule meristematice sau embrionare care înafară de multiplicare nu au altă
funcţie. Ca urmare a acestei activităţi, celulele cresc ca număr începând cu
stadiul de ou, stadiul de embrion, plantulă pentru ca în final sa ajungă în
stadiul de plantă.
Nucleul are rol major în multiplicare, în procesele de diferenţiere
celulară, în controlul sintezei proteice, în cicatrizare etc. Fiind sediul
eredităţii, nucleul are rolul primordial în transmiterea caracterelor ereditare,
33
a determinismului genetic de la celula mamă la celulele fiice și de la părinţi
la urmaşi.
În celula vegetală, forma şi dimensiunea nucleilor variază pe scara
filogenetică. Majoritatea celulelor au un singur nucleu de formă sferică sau
ovală. Dimensiunea nucleului este mare în cazul celulelor meristematice
(raportat la volumul celular) şi descreşte pe măsura diferenţierii celulelor, a
specializării lor funcţionale a transformării lor, proces prin care treptat
celulele îşi pierd capacitatea de a se divide, dobândind în schimb alte
aptitudini.
Nucleul este delimitat la exterior de citoplasmă printr-o anvelopă
nucleară (dublă membrană) discontinuă, un înveliş la care prin examen
microscopic (prin tehnici de criodecapaj) s-au pus în evidenţă numeroşi pori
prin care carioplasma (nucleo-plasmă) comunică cu citoplasma. Masa
fundamentală a nucleului ocupată de carioplasmă este traversată de o reţea
de filamente foarte fine, granulate numite reţea cromatică, constituită din
cromatină. Circa 96% din masa cromatinei sunt nucleoproteine cu ADN la
care se adaugă holoproteine şi fosfolipide. Cromatina este constituită
structural din fibre cromatiniene care reprezintă cromozomii în faza
corespunzătoare perioadei de sinteză, respectiv intervalului dintre două
procese succesive de diviziune. Filamentele cromatiniene în cursul diviziunii
se transformă în cromozomi. ADN-ul cromatinei este purtătorul genelor,
anumite segmente de AND conţine şi informaţii privind proteosinteza.
În celulele somatice nucleii conţin o cantitate constantă de ADN
notată 2n = celule diploide.
Celulele de reproducere deţin numai jumătate din cantitatea de ADN
a celulelor somatice notate n = celule haploide, deoarece în urma meiozei, a
diviziunii, se produce o reducere la jumătate a ADN-ului nuclear.
34
 Meioza mai poartă denumirea de diviziune reducţională:
2 celule reproducătoare {femelă (oosfere) prin unire → ou sau zigot → celulă
diploidă{masculă (spermatia)
ce conţine cantitatea caracteristică de ADN şi dublarea numărului de
cromozomi
zigotul prin → mitoze repetate → multitudine de celule diploide → embrion
celula de diploidă
Reticulul endoplasmatic
Analizată la microscopul electronic, citoplasma prezintă în structura
sa formaţiuni reticulare sub forma unor canicule, vezicule şi cisterne ultra
microscopice diferite ca forme şi dimensiuni, care străbat hialoplasma şi
care formează reticulul endoplasmatic. De acesta aderă nişte corpuşoare
minuscule, fine, sferice ce poartă numele de ribozomi. Reţeaua reticulului
endoplasmatic este legată de anvelopa nucleară şi există asocieri ale acesteia
cu dictiozonii aparatului Golgi.

Fig.II.7. Aparatul Golgi și reticul endoplasmatic

35
Reticulul endoplasmatic conţine circa 100 de enzime implicate în procese de
biosinteză, are în celulă rolul de ordin circulator intracelular, rol în
biosinteza proteinelor plastice din pereţii celulari, a proteinelor de rezervă,
precum și a unor protein-enzime.

Aparatul Golgi
Vizibil tot prin examen electronomicroscopic, aparatul Golgi este
reprezentat de totalitatea dictiozomilor dintr-o celulă şi apare sub form unor
grupări compacte de saculi -cisterne- dispuse în structuri suprapuse turtite în
zona mediană având extremităţile (centrifug) dilatate. Privită în secţiune,
apare sub forma unor pişcoturi alungite adunate în pachete suprapuse. La
capătul distal al saculilor se disting vezicule şi microvezicule care se risipesc
centrifug în hialoplasmă.
Formaţiunea Golgiană cuprinde 4 – 10 discuri (saculi turtiţi) ce pot fi
observaţi numai la microscopul electronic. În celulă, aparatul Golgi are rol
în procesele de secreţie, în cele de vacuolizare, la formarea peretelui celular
primar (în telofază) etc.

Condrionul
Totalitatea mitocondriilor dintr-o celulă reprezintă condriomul.
Mitocondriile răspândite în diferite zone în citoplasmă sunt organite celulare
vizibile numai la microscopul electronic. Au forme şi mărimi diferite sunt
ovoidale alungite sau sub formă de pişcot. Compartimentarea interiorului
mitocondriilor asigură o suprafaţă mare de reacţie.
Celula adultă specializată (diferenţiată) are un număr de mitocondrii
mai mic decât celulele pe cale de diferenţiere care au o activitate fiziologică
bogată.
36
 Ultrastructura mitocondriilor se prezintă dintr-o membrană externă,
interiorul organitului fiind ocupat de o matrice, o suprafaţă fundamentală
care printr-un proces de pliere, fragmentează conţinutul mitocondriei în
numeroase compartimente. Pliurile se numesc criste. Alte mitocondrii, în loc
de criste, au cavitatea lor interioară plină cu tubuli.
Membrana mitocondriilor este dublă şi este alcătuită din
lipoproteine.
Mitocondriile sunt adevăratele uzine energetice ale celulelor, fiind
bogate în enzime (succinat-dehidrogenaza, dehidrogenaza, citocromoidaza,
carboxilaza) implicate în catabolism şi legate de funcţionarea ciclului Krebs
care asigură sinteza ATP-ului în celulă.

Plastidomul
Plastidele sunt organite proprii celulelor vegetale, amplasate în
citoplasmă şi care pot fi observate la microscopul optic. Cu toate acestea,
structura lor este vizibilă doar la microscopul electronic. La plantele
superioare forma plastidelor este alungită de tip reticular. Totalitatea
plastidelor dintr-o celulă formează plastidomul.
După formă, structură și funcţii, plastidele se împart în: proplastide,
cloroplaste, proteplaste, aminoplaste, leucoplaste, oleoplaste şi etioplaste.
Provenienţa lor este comună, ele derivând din proplastide (plastide tinere
care se găsesc în celulele meristematice).
Structura plastidelor este determinată la exterior de citoplasmă, care
le delimitează printr-o anvelopă plastidială (membrană dublă) iar în interior
au o masă fundamentală densă, ce poartă numele de stromă. La examen
microscopic, în stromă se disting lamele şi vezicule de forme, mărimi,
structuri şi conţinut variat la diferitele tipuri de plastide.
37
 O proprietate comună tuturor plastidelor este interconvertibilitatea,
adică în anumite condiţii ele se pot transforma unele în altele.

Cloroplastele
Sunt plastidele verzi ce conţin în structură lor pigmenţii verzi,
clorofilieni. Cloroplastele au formă ovală, sferică sau lenticulară iar numărul
lor variază între 20–100/celulă. La exterior sunt delimitate de o membrană
dublă lipoproteică, în interior masa fundamentală este de numită stromă, iar
în aceasta se găsesc ribozomi care participă la biosinteza proteinelor
specifice cloroplastului.
Membrana externă are un număr mare de pori, suprafaţa lor fiind de
30-40 nm2). Membrana internă este mai puţin permeabilă comparativ cu cea
externă și nu are pori, formează pliuri sau tilacoide pe axul longitudinal al
cloroplastului iar în acesta se găsesc 2-8 formaţiuni sub formă de disc,
aşezaţe sub forma unui fişic, denumiţi saculi granali. Ei alcătuiesc aşa
numitul granum, iar totalitatea lor formează grana cloroplastului.
Într-un cloroplast se găsesc 40-60 de grane, iar suprafaţa tilacoidelor
este mai mare de 500 de ori comparativ cu suprafaţa membranei externe.
Legăturile dintre tilacoidele granale se realizează prin intermediul
tilacoidelor stromei. Între cele două membrane, externă şi internă a
cloroplastelor, se află un spaţiu denumit lumen.
În decursul vieţii celulei, cloroplastele suferă modificări
ultrastructurale, se îmbogăţesc cu elemente constructive rezultate în urma
funcţiilor îndeplinite de cloroplaste, în principal în urma procesului de
asimilaţie clorofiliană.
Pigmenţii asimilatori din cloroplaste, localizaţi în lamelele granale,
asigură desfăşurarea în tilacoide a reacţiilor anabolice primare de formare a
38
glucozei care treptat polimerizează în molecule de amidon care se depune în
stroma cloroplastelor. Periodic, amidonul este hidrolizat – mobilizat din
cloroplaste – şi transportat prin vasele liberiene prin floem spre ţesuturi sau
organe, consumat fiind în procesul de catabolism cu eliberare de energie.
Înafară de pigmenţii clorofilieni, cloroplastele mai conţin pigmenţi
galbeni, caroten şi xantofilă, dar, totuşi, pigmenţii verzi care predomină dau
culoarea verde caracteristică ţesuturilor cu parenchimuri asimilatoare
(frunze, tulpini ierboase etc.).

Vacuomul
Pe măsura creşterii celulelor în urma extensiei peretelui celular şi a
volumului celulelor, vacuomul –care iniţial în celulele meristematice este
extrem de redus- sporeşte în volum şi la celula adultă ajunge să ocupe 80-
90% din cavitatea celulei, fapt văzut cu microscopul optic.
Vacuola este ca o vezică care are la exterior o membrană de natură
lipoproteică plasmatică, numită tonoplast. Vacuola are o autonomie
structurală, între vacuole nenexistând comunicare fizică, vacuolele unei
celule fiind despărţite unele de altele prin punţi de citoplasmă numite
trabecule.
Conţinutul vacuolei – sucul vacuolar sau sucul celular- este
predominant lichid iar în el sunt dizolvate substanţele hidrosolubile. La
anumite celule care sunt definitivate funcţional în sucul vacuolar plutesc
particule, agregate, conglomerate, sferule, cristale, precipitate sau emulsii de
natură fosfolipidică ce se pot depune treptat pe faţa interioară a
tonoplastului.
Vacuola sau totalitatea vacuolelor dintr-o celulă au rol divers şi
complex. În celulele vegetale acest rol a fost mai puţin studiat, cunoştiinţele
39
citologice despre celule îmbogăţindu-se la acest capitol datorită studiilor şi
investigaţiilor efectuate pe celule animale.
Studiile efectuate în funcţionarea celulei vegetale, mai puţine la
număr, s-au axat pe analizarea structurii şi funcţiilor cloroplastelor,
vacuolele fiind destul de neglijate în cercetare.
Rolul şi funcţiile vacuomului au devenit evidente în urma
cercetărilor citofiziologice legate de starea turgescenţă a celulelor. Forţa de
turgescenţă rezultată din presiunea cu care cloroplastul presează asupra
peretelui celular pectocelulozic este generată la nivelul vacuolelor, presiune
cu care sucul vacuolar presează citoplasma care la rândul ei presează asupra
peretelui celular. În procesul de asimilaţie și aprovizionarea celulelor cu apă,
asigură realizarea presiunii de turgescenţă apa, ca principal component al
sucului vacuolar, ce serveşte la menţinerea tonusului celular, celulele putând
funcţiona normal, asigurând realizarea presiunii de turgescență.
Circulaţia apei în plantă se supune legilor fizice ale osmozei şi
deficitului hidric creat în plantă. În lipsa apei, ţesuturile, organele sau
întreaga plantă este afectată de această ― criză―, plantele ajungând să se
ofilească, procesele fiziologice şi metabolice fiind perturbate iar dacă starea
persistă, plantele mor, destrucţiile endocelulare provocate de lipsa apei
devenind ireversibile.

2.3 Particularităţile morfologice şi funcţionale ale celulei vegetale şi

implicaţiile lor în tehnicile de multiplicare a celulelor şi ţesuturilor in vitro
În tehnica culturilor de celule sau ţesuturi in vitro una din problemele
principale o reprezintă separarea celulelor unui ţesut pentru a reuşi
individualizarea fiecărei celule. Această operaţie impune macerarea

40
cimentului pereţilor celulari – a pectatului de calciu - care poate avea loc pe
două căi:
1. în mod spontan natural (la unele tipuri de fructe denumite popular
păsătoase, mere, pere, pepeni etc.)
2. în mod artificial, proces ce poate fi provocat prin:
 fierbere la tuberculii de cartof;
 tratamente enzimatice (cu enzime pectolitice);
 inducerea unui calus într-o masă de mediu lichid, steril, prin
agitare, prin care după un număr de zile se vor desprinde
agregate celulare sau celule în suspensie;
 procedeu de macerare enzimatică.
Tehnica se complică atunci când dintr-un ţesut urmărim să izolăm
protoplaştii și când sunt necesare manevre de mare fineţe executate în
condiţii de perfectă asespsie. În acest caz, pe lângă enzimele pectolitice,
trebuie intervenit şi cu enzime celulozice.
Pentru evitarea dezechilibrelor fiziologice în cazul culturilor de
protoplaşti trebuie realizată izoosmoza între sucul vacuolar şi presiunea
osmotică a mediului de cultură
În tehnica culturilor de celule şi ţesuturi in vitro se poate realiza şi un
proces de embriogeneză la nivelul celulelor haploide (mascule sau femele)
prin androgeneză (culturi de antere sau saci de polen – microspor) sau prin
ginogeneză (culturi de saci embrionari respectiv din oosferă – macrospor).
Unele plantule rezultate din aceste culturi pot fi haploide. Haploizii
reprezintă un material biologic deosebit de valoros în ameliorare. Prin
diploidizarea setului cromozomial haploid se pot obţine linii homozigote.
În carioplasmă nucleolii formaţi din fibrile şi granule de ARN se
disting în nucleu în interfază, sunt mult mai mici ca masa nucleară şi au un
41
rol în sinteza ARN-ului ribozomal (ARNr), în transferarea ARN-ului
mesager (ARNm) spre citoplasmă şi în desfăşurarea mitozei.
În cursul diviziunii nucleului, nucleolul dispare ca entitate în profază
şi reapare în telofază.
Ciclul celular sau ciclul de viaţă a celulei meristematice este alcătuit
din alternanţa fazelor mitozei cu fazele postmitotice, cu faza de sinteză şi
cea premitotică.
Cromozomii se individualizează în profază, în final cele două
cromatide ce formează un cromozom se clivează longitudinal şi rămân unite
într-o zonă punctiformă care poartă numele de centromer.
Cariograma sau cariotipul care serveşte la analizarea numărului de
cromozomi, la descrierea morfologiei şi depistarea anomaliilor
cromozomiale se poate stabili printr-o idiogramă când în timpul
cariocinezei, cromozomii se află etalaţi la ecuatorul celulelor. Este de reținut
că fiecare specie are un număr caracteristic de cromozomi.

Fig.II.8.Diviziunea mitotică - reprezentare schematică

42
În interfază, fiecare jumătate de cromozom îşi reface ADN-ul lipsă,
cantitatea de ADN din celula tănără se dublează astfel încât la finele
interfazei celula meristematică este pregătită pentru o nouă diviziune.
O serie de factori chimici sau fizici ce poartă denumirea de factori
mutageni (radiaţiile ionizante, colhicina etc.) pot perturba procesul de
diviziune prin:
 blocarea sintezei ADN-ului;
 inhibarea formării aparatului mitotic;
 apariţia de aberaţii cromozomiale;
 blocarea mitozei.
Fitohormonii pot însă interveni – între anumite limite – în reglarea
proceselor mitotice şi pentru restabilirea stării de echilibru în organismul
dereglat.
Perturbaţiile în timpul mitozei pot duce la formarea de celule
poliploide care pot regenera plante poliploide.
Poliploidia este un factor de variabilitate prin care se modifică
ereditatea şi este posibil să apară noi caractere. Poliploidia naturală poate fi
întâlnită spontan dar o regăsim şi în culturile in vitro, mai ales în celulele
calusului. Ea poate apare prin:
 mărirea numărului de garnituri de cromozomi proprii și atunci se
numește autopoliploidie sau
 sporirea numărului de cromozomi în urma hidratării și avem de-a
face cu alopoliploidia.
Poliploidia naturală este larg răspândită la plante şi este foarte
influenţată de climatul aspru, din acet motiv fiind des răspândită în regiunile
arctice şi chiar în cele desertice sau acolo unde avem oscilaţii termice mari.

43
 Creşterea numărului de cromozomi în celulă depinde de mărirea
volumului celular care are influență și asupra habitusului plantelor, putând
duce la apariţia de modificări morfologice.
Diferitele organe ale plantei poliploide cum ar fi rădăcina, tulpina,
frunza, inflorescenţa, floarea, fructul sau seminţele, pot suferi modificări
pozitive sau negative pe care amelioratorii au misiunea să le examineze în
cursul ciclului de vegetaţie al plantei şi să facă selecţia prin izolarea acelor
genotipuri interesante. Prin manipularea genomului, prin poliploidizare
artificială ei pot lansa în specia respectivă noi caractere, lucru foarte
important, mai ales la speciile de interes economic.
Celulele poliploide sau aneuploide ce apar la culturile in vitro, mai
ales în culturile de calus, se produc prin mecanisme asemănătoare celor
caracteristice in vivo, prin endomitoză sau prin endoreduplicare. Plantele
regenerate in vitro care provin din structuri constituite de tip meristeme sau
apexuri au variabilitate cromozomială scăzută. La cele regenerate din
calusuri, poliploidia depinde de condiţiile de cultură, de specie sau de soi.
Această variabilitate naturală sau provocată la culturile in vitro este
exploatată de amelioratori în scopul rezolvării cerinţelor crescânde ale
producătorilor agricoli, horticoli şi silvici.
Variabilitatea intervenită în cultura in vitro care nu se exprimă
morfologic poate duce la producerea unor modificări fiziologice,
biosintetice, sau ale tipului de creştere ori a structurilor organitelor celulare.
Trebuie cunoscute particularităţile şi specificul biologic al celulelor
cultivate in vitro, gradul lor de multiplicare, regenerare, morfogeneză,
procesele de dediferenţiere sub acţiunea factorilor de mediu în special cei
prezenţi în substrat – în regim artificial – pentru că studiile de genetică,

44
inginerie genetică sau biologie moleculară au ca modele experimentale
variatele tipuri de culturi in vitro.
Studierea celulei in vitro și inducerea variabilităţii ei genetice stau la
baza biotehnologiei vegetale, ramură care priveşte genetica, ameliorarea şi
respectiv conservarea proprietăţilor plantei și a speciei.
În cazul culturilor in vitro trebuie cunoscute problemele legate de
structura cloroplastelor deoarece în această tehnică asistăm la o
spectaculoasă manipulare a proprietăţilor de interconvertibilitate a unui tip

Fig. II.9. Structura cloroplastului:

1 - membrana externă; 2 - spatiul intermembranar; 3 -
membrana internă; 4 - stroma; 5 - lumen; 6 - membrana
tilacoidală; 7 - grana; 8 - tilacoidul intergranar; 9 - amidon;
10 - ribozom; 11 - ADN plastidial; 12 - plastoglobulă

de plastidă în alt tip de plastidă, respectiv al cloroplastelor şi

leucoplastelor în amiloplaste şi invers, a cromoplastelor în cloroplaste.
Din cauza prezenţei abundente în mediile de cultură a unei resurse
glucidice (energetice) celulele cultivate in vitro sunt heterotrofe sau
45
fotomixotrofe. Pe durata cultivării, cromofitoinoculii îşi convertesc temporar
metabolismul pe o asimilaţie de tip heterotrof, stroma cloroplastelor
celulelor aflate în cultură se încarcă cu amidon datorită prezenţei zaharozei.
Amidonul nu are unde migra în faza de întuneric a fotosintezei şi blochează
în acest fel cloroplastul.
În momentul când plantulele multiplicate in vitro sunt transferate ex
vivo pe medii bogate în zaharoză sau pe alte medii cu glucide și cu valoare
energetică – glucoză ori fructoză – acestea trec treptat la un regim de viaţă
fotoautotrof, adaptându-se la condiţiile de viaţă naturală, iar cloroplastele se
eliberează de amidon şi redevin funcţionale.
În timpul post-aclimatizării, amidonul din cloroplastele celulelor
fotomixotrofe sau heterotrofe, sub forma sa de substanţă de rezervă, joacă
rol ca sursă energetică endogenă în scopul susţinerii proceselor de
morfogeneză, a rizogenezei, în adaptarea plăntuţelor la condiţiile mediului
septic de viaţă.
În unele cazuri, amiloplastele, leucoplastele ori cromoplastele
prezente în organele de rezervă, respectiv în explantele prelevate de la
acestea în timpul creşterii in vitro la lumină, se transformă în cloroplaste
care ulterior se încarcă cu amidon.
În prezent au luat un avânt deosebit tehnicile de cultivare in vitro a
diferitelor tipuri de explante pe medii sărace în glucide sau chiar în absenţa
acestora din mediu, direcție dezvoltată de şcoala japoneză de culturi de
celule şi ţesuturi in vitro condusă de Kozai (citat de Cristea, 2000). Tipul
acesta de culturi in vitro se numesc culturi fotoautotrofe.
Lipsa glucidelor în mediu de cultură face ca atunci când intensitatea
luminoasă şi concentraţia în dioxid de carbon în atmosferă cresc,
cloroplastele sunt forţate să înmagazineze amidon în stroma plastidială din
46
fotosinteza realizată in vitro, energia acumulată în moleculele de amidon să
asigure multiplicarea acestora, susţinerea proceselor de organogeneză,
regenerarea plăntuţelor care odată transferate ex vitro să aibă şi o capacitate
de adaptare superioară plantulelor generate pe medii aseptice în prezenţa
zaharozei.
Cunoaşterea cerinţelor celulelor autotrofe în tehnica de cultivare in
vitro serveşte la adoptarea unor proceduri mai puţin costisitoare dar şi la
obţinerea unor produşi secundari de metabolism ce pot prezenta interes în
industria farmaceutică, produşi a căror sinteză implică căi biochimice legate
de fiziologia cloroplastelor şi de procesele de fotosinteză.
Elementele de citofiziologie vegetală în tehnica de cultură in vitro
trebuie avute în vedere când recoltăm plantele sau organele pe care vrem să
le folosim ca donatoare de explante, dar şi în cazul aplicării unor tratamente
chimice la plante.
Deficitul hidric care este legat de turgescenţa celulelor și de prezenţa
apei în vacuole, factorii traumatogeni şi şocul suferit de explante în
momentul inoculării în mediul de cultură pot anihila total capacitatea
regenerativă a celulelor.
Compoziţia şi concentraţia mediilor de cultură trebuie aleasă astfel
încât la nivelul culturilor, în special de celule şi protoplaşti, să nu apară
exosmoza apei din celule sau endosmoza care să conducă la o explozie
(citoliză) a conţinutului celular. Acest fenomen apare frecvent în culturile de
grăunciori de polen sau în cele de protoplaşti atunci când nu există un
echilibru osmotic între sucul vacuolar şi mediul de cultură.
Există, de asemenea, pericolul introducerii inoculilor în mediul de
cultură inadecvat din punct de vedere chimic sau fizic, în special când
celulele se pregătesc dedicat pentru conservare prin frig (crioconservare) sau
47
pentru culturi de tip stres-selecţie în regim hipertonic când nerespectarea
indicaţiilor tehnice poate duce la producerea unui proces de exosmoză, ce
poate provoca plasmolizarea celulelor. Dacă celulele nu sunt rezistente la
şocul osmotic sau în cazul când nu s-a practicat o selectare de linii rezistente
la asemenea şocuri, prin plasmoliză, în final, celulele pot muri.
Diferitele metode de cultură, culturi de ţesuturi, celule sau protoplaşti
au fost pus la punct în urma unor cercetărilor care au urmărit echilibrarea
fizică şi chimică a mediilor şi condiţiilor de cultură în aşa fel încât pe
parcursul operaţiilor de prelevare şi postinoculare starea fiziologică a
celulelor să fie afectată cât mai puţin. În acest mod vom favoriza păstrarea
în totalitate a totipotenței celulare iar celulele sau ţesuturile își vor păstra
capacitatea de regenerare.
Cunoaşterea reacţiilor celulelor la diferite condiţii de aclimatizare
oferă şansa să realizăm o cât mai facilă aclimatizare a plăntuţelor la
condiţiile ex vitro, mai ales în perioada iniţială de acomodare a acestora la
un regimul sever de mediu (comparativ cu măsurile asigurate in vitro)
necesare pentru atingerea unui procent mai ridicat de aclimatizare.
Trebuie cunoscută capacitatea de toleranţă a celulelor în diferite
regimuri de viaţă pentru a nu suprasolicita rezistenţa celulelor la condiţii de
stres, pentru ca în tehnica folosită, celulele să supravieţuiască şi să-şi
menţină capacitatea de regenerare.

2.3. Biologia dezvoltării plantelor (cormofite) în cazul culturilor de celule şi

ţesuturi in vitro
Creşterea plantelor reprezintă un proces complex morfologic,
fiziologic şi biochimic prin care are loc sporirea numărului de celule prin
acumularea de masă vegetativă, când au loc modificări cantitative
48
ireversibile iar în final plantele ating dimensiunile caracteristice fiecărei
specii.
Paralel cu procesul de creştere cantitativă, are loc şi procesul de
dezvoltare, de evoluţie individuală a plantelor, acestea parcurgând o serie de
etape calitative care încep cu germinarea şi se încheie cu înflorirea şi
fructificarea. Dezvoltarea parcursă conduce la realizarea ciclului ontogenetic
care cuprinde modificări morfologice, anatomice şi fiziologice ce se produc
într-o succesiune riguroasă care este determinată de factorii ereditari
influenţaţi la rândul lor de factorii de mediu.
Cunoaşterea aspectelor legate de biologia dezvoltării plantelor
superioare este deosebit de importantă pentru înţelegerea proceselor ce au
loc în tehnica multiplicării in vitro.
Procesele biologice care au loc în timpul înmulţirii, creşterii şi
dezvoltării plantelor parcurg etape de acumulări prin sinteza unor compuşi
endocelulari, compuşi care joacă două roluri şi anume: rol plastic (de
constituţie - în cazul proteinelor şi celulozelor) dar şi rol de material genetic
(cazulul ADN-ului şi ARN-ului).
Procesul citofiziologic de multiplicare celulară, grandios şi de mare
amploare, poate fi obervat numai la microscop. Cu toate că această
multiplicare celulară este un fenomen cantitativ, el nu este sesizabil cu
ochiul liber. Totuşi miliardele de celule care rezultă din înmulţirea celulelor
meristematice sunt vizibile cu ochiul liber printr-o creştere în lungime a
organelor care se formează şi se dezvoltă.
Plantele verzi, ca organisme autotrofe, îşi produc singure substanţele
necesare creşterii şi dezvoltării, realizând cel mai spectaculos proces din
lumea vie prin care transformă energia luminoasă în energie chimică:
procesul de fotosinteză
49
 Pentru acest proces – fotosinteza – ele au nevoie de lumină, căldură,
apă şi elemente minerale, sintetizați ca factori climatici şi factori de nutriţie.
Acumularea de elemente chimice din mediul înconjurător şi
metabolizarea lor în celulă se realizează prin procese de anabolism – sinteză
– și atunci apar compuşi complexi proprii. Eliberarea energiei chimice,
transformarea sau degradarea acestor compuşi de sinteză sau substanţe
complexe în compuşi simpli până la CO2 şi H2O, se realizează printr-o altă
latură a metabolismului, catabolismul, dezasimilaţia sau procesul de
respiraţie.
În procesul de acumulare şi de sinteză are loc sporirea volumului
celular ceea ce declanşează procesul de creştere. Deci, creşterea este o
mărire ireversibilă a dimensiunilor celulelor, ţesuturilor şi a organelor,
fenomen care duce în final la creşterea dimensiunilor întregului organism,
dimensiuni prestabilite genetic ereditar pentru fiecare specie de plante.
Meristemele sunt ţesuturi care îndeplinesc funcţia de multiplicare
celulară, ele divizându-se continuu, pe tot parcursul vieţii. Ele sunt celule
tinere pe tot parcursul procesului de multiplicare.
La plantele adulte, construirea arhitecturii corpului lor se realizează
prin câteva tipuri de meristeme categorisite după criterii ca: localizare,
caracteristici şi origine, fiecare având anumite semnificaţii din punct de
vedere ontogenetic şi anume:
 meristeme histogene -sunt cele care generează ţesuturi;
 meristeme organogene - sunt cele care generează organe şi anume:
 radiculare apicale;
 caulinare apicale;
 foliare:

50
 meristeme embriogene - sunt cele care dau naştere la embrioni.
La plantele superioare, organogeneza este indefinită, dar atât timp cât
planta sau părţi din aceasta sunt vii, procesul de multiplicare celulară şi
formarea de masive histogene din meristeme este continuu. (meritos =
divizibil în lb.grecă).
La cormofite, după formarea oului sau zigotului, prima diviziune
înseamnă o polarizare care va da naştere la embrionul bipolar, una din
celulele meristematice generează polul caulinar iar cea de a doua polul
radicular. Acest fenomen este valabil şi în cazul formării embrionilor
somatici care au origine în câte o celulă somatică.
După germinaţie din embrioni (zigotici sau somatici) se formează
plantule la care, în zona hipocotilă şi în cotiledoane, activitatea
meristematică intră în declin. În continuare, pe măsură ce plantula creşte, se
transformă în plante la care ţesuturile meristematice (embrionare sau
formatoare) se găsesc în vârfurile extreme ale rădăcinilor şi tulpinilor
principale (care constituie axa plantei) sau secundare.
Caracteristicile specifice ale celulelor meristematice se referă la
faptul că fiind celule tinere, ele se află într-un proces permanent de
multiplicare - dar excludem de aici perioadele reci sau excesiv de secetoase,
la care pereţii celulari primari nemodificaţi secundar sunt bogaţi în
citoplasmă şi au vacuomul slab dezvoltat, având vacuole numeroase şi
minuscule și au raportul neoplasmatic extrem de ridicat şi un metabolism
foarte intens. În cazul celulelor meristemelor secundare, acestea apar
alungite şi turtite, cu un vacuom mai bine dezvoltat şi un raport
nucleoplasmatic mai scăzut decât la celulele meristemului primar.
Pereţii despărţitori care se formează între celulele fiice la încheierea
mitozei pot avea orientare periclinală (longitudinală ), paralelă cu suprafaţa
51
organului, sau anticlinală (transversală) adică perpendiculară pe suprafaţa
organului.
→ După localizarea meristemelor, acestea pot fi:
 meristeme embrionare (localizate în embrion);
 meristeme apicale (localizate în vârfurile de creştere, tulpini sau
rădăcini);
 meristeme intercalare ce pot fi:
 discontinui (deasupra nodurilor unor tulpini);
 continui laterale: cambiu (strat libero-lemnos) şi
felogen (strat generator subero-felodermic).
→ După caracterul celulelor meristematice:
 meristeme primordiale (promeristeme) din care fac parte celulele
embrionilor şi cele mai tinere masive meristematice care formează
vârfurile vegetative sau domurile meristematice;
 meristeme primare (semimeristeme) derivate din meristemele
primordiale.
După originea celulelor meristematice, se cunoaște o clasificare în
funcţie de evoluţia teoriilor emise de unii cercetători:
→ după Hanstein (1868 – 1870) meristemul radicular ar fi:
 dermatogen (generează rizodermă);
 periblem (generează scoarţă);
 plerom (formează cilindrul central.
 după Haberland (1900) meristemele sunt:
 protoderm (din care apar ţesuturile protectoare rizoderma şi
epiderma);
 procambiu (din care se formează ţesuturile conducătoare şi cele
mecanice);
52
  meristem fundamental (din care apar parenchimurile corticale şi
medulare.
→ după Schmidt (1924) meristemul apical al tulpinilor este format din:
 tunica (pătura externă de celule care formează ţesutul protector şi o
parte din scoarţă);
 corpusul (pătura care generează celule ce dau naştere la o parte din
scoarţă, cilindrul central şi măduvă).
→ după Plantefol (1947 – 1948) care a emis teoria „inelului iniţial‖,
meristemul apical al tulpinii este constituit din:
 meristem de aşteptare care corespunde zonei apicale axiale şi joacă
rol în formarea primordiilor florale şi a inflorescenţelor;
 inelul iniţial (zona periferică) care are forma unui inel central
înconjurat de celule care periodic vor genera frunzele şi scoarţa
tulpinii;
 meristemul medular ce ocupă poziţia centrală şi este aşezat sub
meristemul de aşteptare, celulele derivate din acest meristem vor da
naştere parenchimului medular.
În ţara noastră, Jitaru şi Toma (1980) prezintă o sinteză a clasificării acestor
categorii de meristeme pe care o prezentăm mai jos.
Ţesuturi meristematice primordiale – promeristeme care pot fi:
 fără celule
 cu o celulă iniţială
 cu mai multe celule iniţiale
Ţesuturi meristematice primare – semimeristeme care pot fi:
 apicale
 intercalare
 laterale
53
Ţesuturi meristematice secundare care pot fi:
 cambiul
 felogenul
Ţesuturi meristematice meristemoide (meristemoizi) care pot fi grupate la
nivelul ţesutului protector şi au zone lipsite de celule cu activitate
meristematică numite de specialiști „câmpuri de inhibiţie‖ sau „zone de
blocaj‖.
La nivelul explantelor cultivate in vitro, grupuri de celule cu caracter
meristematic pot proveni din celule cu caracter embrionar, preexistente în
explante, și care în urma proceselor citologice pot deveni primordii
radiculare, caulinare sau foliare. Aceste centre meristematice pot evolua
anormal și se transformă în meristeme radiculare sau caulinare sau pot
evolua prin regresie în calus. Aceşti meristemoizi prezenţi la nivelul
explantelor, în cazul tehnicii in vitro, pot avea efect benefic în procesle
regenerative şi de morfogeneză.
În cazul multiplicării in vitro are loc neogeneza de zone sau centre
meristematice din celule dediferenţiate, celule care sunt considerate
meristeme speciale întrucât acestea nu există în structurile organelor.
Generarea lor este determinată de explantare, de condiţiile speciale de
cultură şi de prezenţa regulatorilor de creştere în substratul de cultură.
Autonomia explantelor sau celulelor meristematice în condiţiile
cultivării in vitro precum și dirijarea proceselor de morfogeneză într-o
anumită direcţie dorită este dificilă, întrucât natura ţesuturilor şi celulelor din
structura explantelor poate exercita influenţe de durată pe parcursul mai
multor subculturi, explantul fiind independent deja de planta mamă, dar
păstrându-și totuşi informaţia genetică moştenită de la aceasta.

54
 Diferenţierea celulară
Celulele tinere diferenţiate după divizarea continuă, suferă
transformări structurale şi o specializare morfologică şi fiziologică căpătând
caracteristici noi, proprii celulelor adulte mari. Progresiv modificările
secundare ce survin îngreunează schimburile dintre aceste celule cu cele
învecinate cu toate că majoritatea celulelor diferenţiate din corpul plantelor
rămân vii, cu o intensă activitate metabolică dar îşi pierd capacitatea de a se
divide.
Integritatea sistemului, continuitatea celulelor unui ţesut,
comunicarea dintre celulele şi ţesuturile unor organe din organismul viu se
menţin datorită unor substanţe elaborate de către celule, substanţe care pot
migra la distanţe mari şi pot asigura relaţia organismului unitar cu
perceperea factorilor de mediu.
Controlul asupra diferenţierii şi funcţionării altor celule de către un
grup de celule poartă denumirea de proces de inducţie. Celulele
asemănătoare ca structură şi funcţiune care determină în ţesutul respectiv
specificitatea fiziologică, facilitează prin interrelaţiile dintre ţesuturi buna
funcţionare a organelor şi activitatea intregii plante.
Procesul de dediferenţiere este invers procesului de diferenţiere
celulară. El rar se petrece natural, spontan. Dediferenţierea este provocată de
acţiunea unor şocuri externe asupra celulelor diferenţiate deci
dediferenţierea se produce ca reacţie la acţiunea traumatică exogenă.
În cazul multiplicării in vitro în condiţiile detaşării explantelor
dediferenţierea se produce în sens regenerativ datorită acţiunii
fitohormonilor. Prin dediferenţiere, celulele se transformă în celule
meristematice apte de a se divide.

55
 Capacitatea celulelor de a se dediferenţia este inegal răspândită în
corpul plantei şi depinde de cât de avansat este procesul de diferenţiere în
morfostructura celulară.
În condiţiile cultivării explantelor in vitro, capacitatea regenerativă a
celulelor este exploatată la maximum. Sigur că aptitudinile regenerative ale
inoculilor depind de provenienţa explantului de condiţiile de cultură şi de
manifestarea integrală a întregii informaţii genetice existentă în genomul
inoculului. Succesul operaţiei de regenerare de plante din diferite tipuri de
explante depinde de reuşita metodelor de transformare a celulelor
nemeristematice în celule meristematice obţinute prin dediferenţiere.
În condiţiile de cultură in vitro dediferenţierea şi revenirea celulelor
la starea de celulă meristematică este condiţie pentru instalarea şi
progresarea proceselor regenerative şi realizarea neoformării unui nou
organism vegetal.
Fazele dediferenţierii sunt, pe scurt, următoarele:
1. Prima fază caracterizată prin:
 amorsarea proceselor de dediferenţiere;
 producerea dediferenţierii celulelor, dobândirea caracteristicilor
citologice ale unui ţesut meristematic secundar cu celule aplatizate ce
seamănă ca aspect şi structură cu cambiul
2. A doua fază a dediferenţierii constă în:
 dediferenţierea celulelor până la stadiu de meristem primar;
 generarea de promeristeme sau meristemoizi din care pot apărea
centre organogene sau embriogene;
3. A treia fază de dediferenţiere se caracterizează prin:

56
  formarea din celulele dediferenţiate a calusului neorganizat, omogen
structural, la nivelul căruia se pot forma meristemoizi sau centri
embriogeni.
Putem considera că dediferenţierea celulelor detaşate de planta
mamă sau de unele organe anulează interdependenţa explantelor de
organismul donor, celulele eliberate de această stare putând să-şi exprime în
aceste condiţii totipotenţa deţinută în genom.
Deci, in vitro, celulele se pot dediferenţia mai rapid şi mai uşor, ele
fiind scoase de sub inter-relaţiile şi incidenţa factorilor endogeni care
asigură echilibrul fiziologic al unui organism viu.

Morfogeneza: organogeneza şi embriogeneza

Morfogeneza este diferenţierea histologică complexă a celulelor care
în final duce la formarea de organe – proces numit organogeneză, sau la
generare de embrioni – proces numit embriogeneză.
Organogeneza este procesul de refacere a organelor prin activitatea
meristemelor după tipul fitohormonilor folosiţi, generând organe sau calus.
Embriogeneza este procesul în care, pornind de la zigot, celulă
somatică sau gameţi (andro şi ginogeneză) se generează un embrion.
Morfogeneza are la bază citodiferenţierea ca exprimare a
competenţei celulare indusă de determinismul genetic.
În condiţiile explantării şi inoculării in vitro, capacitatea de
citodiferenţiere a celulelor depinde de capacitatea celulelor de a-şi modifica
starea lor de competenţă sub influenţa unor factori interni şi externi.
Dintre factorii interni amintim fitohormonii şi natura ţesuturilor
explantelor din punct de vedere al susţinerii şi viteza de avansare a
proceselor de morfogeneză (organogeneză sau embriogeneză).
57
 Rolul mediului de cultură se încadrează în grupa factorilor externi
alături de care amintim sursa de energie, temperatura, lumina şi regimul
fotoperiodic. Toți acești factori pot exercita o influenţă decisivă asupra
proceselor regenerative şi de morfogeneză.

Organogeneza
Prin organogeneză se înţeleg procesele de formare, creştere şi
diferenţiere celulară şi tisulară a organelor.
În tehnica de multiplicare in vitro este vorba de apariţia rădăciniţelor
(rizogeneza), a muguraşilor şi tulpiniţelor (caulogeneza) şi a frunzuliţelor
(filogeneza).
În rizogeneză sau formarea rădăcinilor, pe lângă factorii endogeni –
în principal cel genetic- un rol important îl au fitohormonii, mai exact
auxinele (endogene sau exogene) sau unele substanţe cu acţiune benefică
asupra rizogenezei, substanţe formate în tinerele frunzuliţe ca rezultat al
activităţii fotosintetice.
Aerarea (oxigenarea) zonei în care se produce rizogeneza,
temperatura, pH-ul, rezervele energetice endogene stimulează și chiar
condiţionează rizogeneza alături de factorul genetic (gen, specie, soi): cu
toate acestea, soiul, specia si genul din care provine planta au rol
determinant în capacitatea rizogenă a unor explante și trebuie sa se țină cont
de aceste date în activitățile de micropropagare.
Caulogeneza, procesul de formare a tulpinilor, se află, deasemenea,
sub controlul genetic şi fitohormonal şi evoluează în funcţie de condiţiile de
mediu şi unii factori endogeni în mai mică măsură, însă, decât în cazul
rizogenezei.

58
 Caulogeneza este stimulată de un anumit raport între auxine şi
citochinine, raport care este în favoarea citochininelor.
În cazul culturilor in vitro apariţia centrilor meristematici, a
muguraşilor şi apoi a tulpiniţelor, este favorizată de prezenţa în mediul de
cultură a chinetinei, a benziladeninei.
Polaritatea fragmentelor: este proprietatea de care trebuie să se ţină
seama atunci când fragmentele vegetative se introduc în substratul rizogen
sau mediul de cultură; vorbim de apexurile/meristemele apicale sau axilare
utilizate pentru înmulţire.

Embriogeneza
Procesul de formare a embrionului sau embriogeneza a căpătat o
nouă dimensiune după descoperirea embriogenezei somatice în suspensia de
celule, în anul 1958 de către Steward şi Reinert. Embrionul, ca entitate
morfoanatomică distinctă, este un stadiu intermediar de trecere de la
gametofit la sporofit în ciclul biologic al unui organism, la spermatofite în
cazul embriogenezei in vitro neogeneza unui embrion din celule somatice
purtând denumirea de embriogeneză „nonzigotică‖ sau embriogeneza
‖somatică‖, diferită ca origine de embriogeneza zigotică.
Zigotul (embrion derivat din ou sau zigot) este rezultatul fecundării
gametului femel (oosfera) de către gametul mascul (spermatia).
Când formarea embrionului se produce în lipsa fecundării,
fenomenul se numeşte apomixie. În acest caz, embrionul ia naştere din
elemente ale nucelei sau sacului embrionar sau chiar celule ale
integumentelor ovulului.
În cazul apomixiei, producerea embrionului se poate face prin:

59
  partogeneză când are loc la nivelul oosferei nefecundate şi este:
haploidă (generativă) sau diploidă (somatică);
 apogamie când geneza embrionului are loc dintr-o celulă a sacului
embrionar;
 aposporie când formarea embrionului are loc dint-o celulă
vegetativă a nucelei sau a integumentului;
 poliembrionie – formarea mai multor embrioni din acelaşi ovul prin
apogamie cât şi prin aposporie. Acest tip de embrioni se numesc
embrioni adventivi iar embriogeneza se mai numeşte embriogeneză
asexuată.
În cazul multiplicării in vitro la nivelul explantelor, în calusul
celulelor în cultură în suspensii fenomenul de embriogeneză se declanşează
printr-o serie de multiplicări celulare dintr-o celulă unică prin diviziuni
succesive, formându-se un embrion nezigotic asemănător cu embrionul
zigotic din punct de vedere al mărimii, structurii şi comportamentului
specific fiecărei specii. Acest embrion este denumit embrion somatic iar
fenomenul căpătă denumirea de embriogeneză somatică.
Manifestarea totipotenţialităţii celulei vegetale în acest caz, al
embriogenezei somatice, are loc prin:
 androgeneză (neoformarea unui embrion, apoi a unei plante haploide
dintr-un microspor sau grăuncior de polen); şi
 ginogeneză (neoformarea unui embrion din oosfera nefecundată,
embrion care este haploid care va da naştere unei plante haploide).
În inducerea genezei de embrioni din celule somatice în tehnica de
multiplicare in vitro, laptele din nucă de cocos care este introdus în mediul
de cultură, datprită faptului că este bogat în citochinine, joacă un rol pozitiv
hotărâtor.
60
 Ca şi în cazul organogenezei, şi în embriogeneza somatică există
embriogeneză somatică directă - când embrionii somatici iau naştere din
celulele explantelor care s-au folosit la iniţierea culturii şi embriogeneză
somatică indirectă - când embrionii se formează din celule de calus ori din
suspensii celulare care provin din calus sau protoplaşti.
Embriogeneza somatică are avantajul că embrionul zigotic, somatic
diploid sau haploid deţine într-un tot echilibrat structurat morfofuncţional
atât rădăciniţa, tulpiniţa cât şi muguraşul care asigură viitoarei plante un
excelent debut în viaţă, odată cu germinaţia.
Prin embriogeneză somatică, într-un timp scurt şi cu mare viteză, se
pot obţine un număr mare de copii ale unui organism vegetal elită.
Plantele rezultate din embrioni somatici, identice din punct de vedere
genetic cu donatorul de explante, sunt eradicate de agenţi patogeni, au
creştere uniformă, sunt robuste, au o mare productivitate iar produsele lor
sunt superioare din punct de vedere calitativ.
Embrionii somatici pot fi stocaţi pe o perioadă lungă de timp ca
material biologic în bănci de gene. Din embrionii somatici, prin tehnica
multiplicării in vitro, se pot obţine produşi secundari de metabolism ce pot
constitui sursă de extracte cu efecte fitofarmaceutice.
Pe calea embriogenezei somatice, studiile de mutageneză pot permite
selecţia rapidă de noi mutanţi de la care se pot obţine noi soiuri valoroase ce
pot fi multiplicate uşor şi introduse în cultură.
Embriogeneza in vitro permite producerea unui număr mare de
haploizi şi triploizi într-un interval scurt de timp şi cu randament economic
ridicat.

61
 Cap.III. LABORATORUL DE CULTURI IN VITRO

3.1 Alcătuirea laboratorului de micropropagare

Laboratoul de culturi in vitro este împărţit în două spaţii strict
delimitate care asigură fiecare în parte fluxul tehnologic continuu dacă este
nevoie. Spaţiile laboratoului de microînmulţire sunt încăperi amenajate facil
pentru întreţinere şi evacuare, cu pardoseală din gresie sau mozaic, cu pereţii
acoperiţi cu faianţă sau vopsea de ulei pentru a se putea întreţine uşor şi a fi
facil pentru procesele de asepsie. Orice defecţiune care s-ar produce în
cadrul laboratorului, de mai lungă durată, poate provoca perturbaţii grave în
desfăşurarea lucrărilor, stagnând fluxul operaţiunilor şi ducând la pierderi
majore de material vegetal.
Un aspect important care trebuie subliniat este acela al asigurării
unei curăţenii perfecte în toate compartimentele laboratorului, praful şi
murdăria constituind surse constante de germeni, agenți patogeni și respectiv
de infecţii.
Respectând condiţiile de asepsie, evităm infectarea mediului de
cultură cu microorganisme, în caz contrar, acestea se vor înmulţi (mediile
fiind deosebit de bogate în nutrienţi şi vitamine), flora dezvoltată în
recipientul de cultură devenind concurentă pentru ţesuturile şi celulele
inoculate. Infecţiile microbiene şi fungice avansează în scurt timp (2-5 zile
de la inoculare) iar mediul de cultură îşi modifică proprietăţile, se alterează,
în el fiind eliminate toxine, pH-ul se modifică şi, treptat, dezvoltarea
explantelor este încetinită şi ulterior stopată definitiv.
În consecinţă, unul din aspectele majore pe care trebuie să le avem în
vedere atunci cînd dorim să iniţiem culturi in vitro îl constituie asigurarea

62
unei asepsii perfecte, atât a materialului biologic cît şi a recipientelor şi a
mediilor de cultură.
Laboratoarele de microînmulţire pot fi laboratoare pentru cercetări
cu profil biologic, fiziologic, ameliorare, laboratoare de microînmulţire care
deservesc interese didactice, laboratoare de microînmulţire pentru afaceri la
scară redusă şi ultima categorie, laboratoare de microînmulţire pentru afaceri
la scară industrială.
Cerinţele pentru realizarea acestor spaţii sunt multiple şi ţin atât de
siguranţa procesului de producţiei cât şi de securizarea operaţiunilor. De
obicei, laboratoarele sunt împărţite în două zone: zona sterilă şi zona
nesterilă.
 Zona nesterilă - este spaţiul destinat activităţilor care se desfăşoară
în condiţii nesterile şi este reprezentată de spălător, laboratorul de
preparare a mediilor de cultură, spaţiile de incubare, camera
frigorifică, încăperea cu autoclave etc.
 Zona sterilă, încăpere aseptică, sterilă - este spațiul care conţine mai
multe hote de lucru cu flux laminar orizontal de aer steril ce sunt
folosite pentru următoarele procedee de lucru: dezinfectarea
materialului vegetal, prelevare şi inoculare explante in vitro şi
repicare sau subcultivare.
Dimensionarea zonelor şi încăperilor se va face ţinând cont de
volumul de activitate pe care laboratorul urmează să îl aibă, de amploarea
personalului care va deservi laboratorul, mobilierul şi aparatura folosită. În
funcţie de specificul activităţii, inclusiv mobilierul sau aparatura vor fi
diferite, ca în cazul culturilor de meristeme versus obţinerea de material
pentru aclimatizat şi plantat.

63
 Când se urmăreşte obţinerea de material de plantat devirozat nu
trebuie scăpată din vedere necesitatea amenajării de încăperi pentru
aplicarea termoterapiei, precum şi a unui laborator profilat pe testarea şi
certificarea calităţii şi a stării de sănătate a plantelor generate in vitro.
Materialul de plantat rezultat, transferat din in vitro în mediul septic, după
aclimatizarea lui în camera de creştere, urmează să fie plantat în seră.
Aceasta este o construcţie specială care deservește noile plante pentru cazul
în care se urmăreşte păstrarea culturii în condiţii de protejare față de agenţi
fitopatogeni. Desigur, materialul rezultat din micropropagare poate fi
transferat și într-o construcţie obişnuită.

Noi plante de banan micropropagate, în seră.

Faptul că unele din activităţile din laboratorul de microînmulţire sunt

sezoniere, desfăşurându-se în funcţie de fenofazele speciilor lucrate, obligă
elaborarea planului de afaceri în așa manieră încât acesta să genereze o
diversificarea a activităţilor, astfel încât investiţia să se justifice şi activitatea
să fie în flux continuu.
Ambele zone trebuie să răspundă condiţiilor standard de amenajare a
laboratoarelor ştiinţifice de lucru şi să primească avizele de funcţionare de la
64
forurile specializate. Se vor asigura instalaţii de apă, lumină, canalizare,
încălzire, gaze, toate în condiţii perfecte de funcţionare și cu toate avizele
necesare.

Alcatuirea zonei nesterile

Spălătorul
Acesta poate fi amenajat într-o încăpere de cca. 16 mp, cu canalizare
în pardoseală, ciment mozaicat sau gresie pe jos, cu o panta ușoară în
condițiile în care vorbim de scurgere prin pardoseală.
Spălarea sticlăriei se va face în bazine de capacitate corespunzătoare,
în funcţie de volumul inoculărilor zilnice. După evacuarea culturilor, mediile
cu agar se colectează în găleţi şi se aruncă la gunoi, deoarece agarul înfundă
instalaţiile de canalizare, nefiind solubil în apa. Recipientele golite de mediu
cu agar, precum şi cele etanşeizate prin aplicare de folie de polietilenă la
cald, prealabil spălării, vor fi înmuiate în apă.
În consecinţă, în spălător - în funcţie de volumul de sticlărie
manipulată zilnic - trebuie să avem în vedere amenajarea unor bazine pentru:
înmuierea sticlăriei, pentru spălarea propriu-zisă a acesteia şi, eventual, un al
treilea bazin pentru limpezirea sticlăriei spălate.
Deasupra chiuvetei se va instala un distilator cu capacitate de 5—10
litri cu apă distilată (prezentând scurgere bazală, unde se va racorda un tub
de cauciuc, cu clemă) prin intermediul căruia vom avea, în imediata
apropiere a acesteia, o sursă de apă distilată, necesară pentru limpezirea
finală a sticlăriei.

65
Chiuveta va fi prevăzută cu robinete de apă caldă şi rece şi cu un sistem de
iluminare care să asigure o
Fig.III.1.Distilator de apă.
lumină corespunzătoare ca
intensitate, pentru crearea
condiţiilor optime de
verificare a gradului de
curăţire a obiectelor
spălate. În încăpere se vor
monta rastele pentru
uscarea sticlăriei. Pe pereţii
rămaşi liberi se pot amplasa
dulapuri, în scopul
depozitării sticlăriei, a unor
materiale şi a reactivilor
care nu necesită condiţii
speciale de păstrare.

În spălător se va proceda şi la curăţarea materialelor vegetale de tipul

rădăcinilor, rizomilor, bulbilor, tuberculilor etc.
În cazul în care nu avem posibilitatea să asigurăm apă caldă la
robinet, în apropierea chiuvetei se va instala un boiler. În vecinătatea
chiuvetei trebuie să existe cutii pentru gunoi (preferabil cu capac) şi un
suport pentru perii de diferite forme şi mărimi, necesare pentru spălarea
sticlăriei. Pentru scurgerea sticlăriei se va avea în vedere şi amenajarea unor
suporturi având perforaţii sau grătare.

66
Laboratorul pentru pregătirea mediilor de cultură
Este încăperea destinată preparării mediilor de cultură, care trebuie
să fie spaţioasă, să permită accesul concomitent a 3-4 persoane şi să fie
corespunzător iluminată. Laboratorul va deţine instalaţii de canalizare, de
apă curentă (rece şi caldă), gaze, electricitate, pompă pentru vid.
Pardoseala va fi acoperită cu materiale uşor lavabile. Dacă spaţiul o permite,
vor fi aşezate mese atât la perete cât şi în centrul încăperii. Mesele de lucru
vor fi faianţate sau vor fi acoperite cu material plastic ori cu folie
melaminată, pentru a putea fi întreţinute uşor şi pentru a rezista la reactivi.
Pe pereţi şi sub mese se vor monta dulăpioare, în scopul depozitării în ele a
sticlăriei şi a substanţelor. În laborator trebuie să fie instalate chiuvete cu apă
rece şi caldă iar, în vecinătatea lor, se vor amplasa recipiente cu apă distilată
şi bidistilată.
În dreptul meselor se vor afla instalaţii de gaz (aproximativ 3-4 guri
de gaz repartizate pe pereţi diferiţi), prize pentru curent de 220 V, precum şi
instalaţie de vid (pentru operaţiunile de filtrare).
În laborator vor fi amplasate diferite aparate şi anume: etuve, (din
care, cel puţin o etuvă - de capacitate mare va funcţiona în regim de 160—

Fig.III.2. Balanță analitică

67
180°C şi o alta de tip bacteriologic, necesară pentru incubare, la întuneric, a
inoculilor şi care va funcţiona la 24-38 °C) ; 1-3 agitatoare magnetice (dacă
se poate cu plită electrică) care vor fi necesare pentru operaţiunile dizolvare
a substanţelor, mai ales atunci cînd avem în vedere prepararea soluţiilor
stoc; în laborator sînt indispendabile şi
1-2 bain marrie, de mare capacitate,
pentru prepararea mediilor cu agar (se
pot face şi improvizaţii, folosind, ca
înlocuitori, vase de bucătărie, în care se
introduce un material textil, pentru a
proteja recipientele în timpul fierberii
apei), mai ales cînd nu dorim să folosim
autoclavul pentru solubilizarea agarului.
Fig.III.3. Plită cu agitator
magnetic De mare utilitate în laborator este un
pH-metru; în laborator este indispensabilă şi prezenţa unui frigider, de mare
capacitate, cu congelator, pentru păstrarea soluţiilor stoc, a unor substanţe şi
mediile de cultură până la folosire, după sterilizare.Materialul vegetal, pînă
în momentul prelevării explantelor, poate fi păstrat în camera frigorifică.

Fig.III.4. Cuptor cu microunde

68
Fig.III.5. Etuvă

Fig. III.6. Trusă pH-metru portabilă

69
 Într-o cameră învecinată laboratorului se vor instala balanţe
electronice care să permită cântărirea până la subunităţi de gram (100 — 10
mg), microscop optic şi un stereomicroscop, destinate examinării
materialului biologic, pre sau post inoculare.
În laborator trebuie să existe un sortiment variat şi în cantităţi
îndestulătoare de sticlărie, care va deservi toate procesele care se defășoară
în fluxul muncii.
 Sterilizarea
Încăperea care se preconizează a fi utilizată în scopul sterilizării,
respectiv în care va funcţiona autoclavul, poate avea dimensiune variabilă,
în funcţie de numărul autoclavelor şi de tipul şi mărimea acestora. Pentru a
nu se produce o strangulare a fluxului operaţiunilor de inoculare este de
dorit să dispunem de două autoclave funcţionale, de mare capacitate, pentru
a permite sterilizarea concomitentă a cât mai multe flacoane cu mediu.

Fig. III.7. Autoclav

Autoclavarea recipientelor cu medii de cultură se face la temperatura de

121°C şi 1,1 atmosfere, pe o durată de timp care variază în funcţie de
încărcătură. Flacoanele cu medii se depozitează în casolete metalice de tip
70
medical, coşuri din sârmă, ori în tăvi metalice pentru ca apoi să se introducă
în autoclav, cu perforaţiile neobturate; celelalte tipuri de suporturi cu
flacoane vor fi învelite în hârtie de împachetat, perforată din loc în loc
pentru a permite accesul aburului din autoclav în interiorul ambalajelor.
După autoclavare, la transportare, casoletele vor avea perforaţiile obturate.
Încăperea în care se montează autoclavele trebuie să aibă pardoseală
din ciment, cu scurgere. Mediile, odată sterilizate, pot fi păstrate pentru o
perioadă de timp (preferabil la întuneric), în cameră frigorifică, pentru a
evita degradarea vitaminelor şi a hormonilor şi pentru a preîntâmpina
deshidratarea mediilor în urma procesului de evaporare a apei.

Fig. III.8. Bidistilator

71
Apa distilată este indispensabilă în laborator, atât pentru prepararea apei
bidistilate cât şi pentru spălarea materialului biologic sau la clătirea finală a
sticlăriei. Bidistilatoarele, în general, sunt din sticlă specială, lipsită de ioni
de natriu. Bidistilatoarele de mare capacitate sunt electrice.
Camera de creştere
Camera de creştere sau de incubare a culturilor este destinată
păstrării în condiţii optime a inoculilor, în vederea asigurării bunei
dezvoltări a acestora. Ea trebuie să întrunească condiţii maxime de
septicizare, să nu fie igrasie, să nu fie demisol sau subsol, deşi literatura
veche recomandă, din contră, acest tip de amplasament pentru evitarea
fluctuaţiilor mari de temperatură. Recent, nu se mai recomandă
amplasarea camerelor de creştere sub nivelul solului, deoarece pot aparea

Fig. III.9.Camera de creștere

72
probleme legate de umiditate, microorganismele specifice zonelor calde şi
umede, fără aerisire.
Amenajarea etajelor în camerele de creştere trebuie făcută de aşa
manieră încât să se folosească la maximum spaţiul disponibil, permiţându-se
totodată accesul cu uşurinţă la recipientele cu inoculi. În cazul în care
încăperea nu poate fi climatizată, se recomandă ca distanţa dintre poliţe să
fie ceva mai mare, de circa 40—50 cm. S-a constatat că rafturile de 1 m
lăţime, cu înălţimea de 2 m şi de lungime variabilă, sunt cele mai practice.
Flacoanele de cultură cu inoculi trebuie expuse la lumină, pe etajere
metalice, iluminate în regim prestabilit, reglabil, preferabil automatizat,
folosindu-se tuburi fluorescente amplasate deasupra culturilor, la o distanţă
de 30-40 cm. În cazul utilizării poliţelor din sticlă — la care dedesubt, în
imediata apropiere a recipientelor se găsesc instalate tuburile de iluminare

Fig. III.10.Cameră de creștere

73
(corespunzătoare raftului de jos) — aşezarea flacoanelor trebuie să fie făcută
pe un strat izolator, de exemplu din polistiren expandat, pentru a nu se
supraîncinge, situaţie în care mediul de cultură gelificat cu agar se va
deshidrata şi va crăpa.
Regimul de temperatură al camerelor de creştere se recomandă a fi la
25-27°C (±2°C faţă de temperatura dorită) iar umiditatea de 50%, dar nu sub
50%. Fluctuaţiile de temperatură, chiar şi numai cele provocate ca urmare a
stingerii tuburilor fluorescente în perioada de întuneric, produc modificări
ale volumului aerului din recipientele de cultură prin creşterea sau scăderea
presiunii interioare, cu formarea unor curenţi care vehiculează în recipiente
spori şi germeni, provocând infectarea secundară a mediilor de cultură, chiar
după o lungă perioadă de timp de la inoculare.
Tuburile fluorescente vor fi montate astfel încât să se evite orice
posibilitate de incendiu şi să se asigure o iluminare uniformă a suprafeţelor.
Fotoperioada optimă, adecvată unei creşteri corespunzătoare a celor mai
multor tipuri de explante, este aceea de 16 ore lumină/8 ore întuneric.
Recomandările privind intensitatea optimă a luminii, la suprafaţa mediilor
cu inoculi, variază de la caz la caz; de regulă, se indică ca iluminarea să
corespundă la cea 2—2,6 Klucşi.
Transferarea din in vitro în mediul septic se face trecînd plantele
printr-o etapă de ac1imatizare. O primă acomodare a plantelor la viaţa în
mediul septic se face în condiţiile camerei de creştere. Plantulele eliberate de
mediu vor fi spălate în apă menţinută la temperatura camerei, apoi vor fi
introduse cu rădăcinile într-un substrat inert simplu de tip perlit, nisip sau
vermiculit, sau în amestec cu turbă, argilă, mraniţă etc. cu asigurarea
umidităţii ridicate. Regimul de iluminare şi cel termic vor rămîne, la început,
în limitele obişnuite în care au fost cultivate plantulele in vitro, pentru ca
74
 apoi treptat, timp de cca. 3-4
săptămâni, să se aducă plantulele la
regimul obişnuit de cultură. Uneori,
literatura recomandă trecerea
plantulelor pentru o primă perioadă
de aclimatizare în incinte cu ceaţă şi
abia după cca. 2-3 săptămâni să
de facut poza si inlocuit
intre în procesul standard de
aclimatizare.

Alcătuirea zonei sterile

Camera sterilă
Este încăperea în care se execută sterilizarea, prelevarea şi inocularea
explantelor. Pereţii încăperii aseptice vor fi vopsiţi în ulei sau vor fi placaţi
cu faianţă, pardoseala va fi din ciment pentru a fi uşor lavabilă, dar nu va
avea canalizare în podea.

Fig.III.12. Hotă cu flux de aer laminar vertical

75
Camera sterilă este bine să fie amenajată în apropierea laboratorului de
preparare a mediilor. În camera sterilă vor fi montate nişe sau boxe (hote) cu
flux laminar orizontal continuu, de aer steril. Acestea au forme şi dimensiuni
variate iar asepsia aerului este asigurată prin filtre speciale care reţin
particulele mai mari de 0,2 mm. Hotele vor fi orientate pe peretele opus uşii
şi ferestrelor, pentru a evita formarea curenţilor de aer.
Manevrele efectuate în condiţiile hotei cu flux de aer steril cer
deprinderea operatorului, cu un mod special de executare a mişcărilor,
nefiind permis să se interpună mâna, penseta sau alte obiecte (chiar dacă sînt
sterile), între curentul de aer steril şi recipientul deschis; în caz contrar,
adeseori, procentul de infecţii poate fi mai ridicat decât în condiţiile
executării aceloraşi operaţiuni, în nişele aseptice, improvizate.
De regulă, nişa sau hota trebuie încărcată — înaintea începerii
lucrului — numai cu obiecte sterilizate, iar operatorul se va spăla cu alcool
pe mâini de fiecare dată cînd părăseşte şi revine în perimetrul baleiat,

Fig.III.13. Hotă cu flux de aer laminar vertical

76
„scăldat" de fluxul laminar, orizontal, de aer steril. În condiţiile efectuării
unor inoculări obişnuite, hota va fi pusă în funcţiune cu cca. 20 de minute
înainte de începerea operaţiunilor.
Hota sterilă va fi prevăzută cu instalaţie de gaze (ori cu lămpi de
spirt) şi, dacă este posibil, şi cu instalaţie de vacuum; în spaţiul propriu-zis
de lucru vor fi aşezate şi suporturi pentru instrumente sterile şi, fireşte, atât
în nişă cât şi în cameră, vor fi montate instalaţii obişnuite de iluminat şi
tuburi pentru emanaţie de raze ultraviolete necesare sterilizării.

3.2. Dotările laboratorului

Sticlăria
În general, într-un laborator de culturi de ţesuturi se utilizează toate
tipurile de recipiente din sticlă de uz comun în laboratoarele de chimie-
biologie. În laboratoare sunt necesare şi pipete, cilindrii gradaţi, pâlnii,
baloane cotate (de diferite capacităţi), sticle şi borcane pentru reactivi (de
variate tipuri şi mărimi) precum şi vasele Erlenmeyer şi Berzelius, de
dimensiuni diverse, capsule Petri, casolete, baghete, tuburi din sticlă, sticlele
de ceas, nuci filtrante, filtre Millipor, seringi, exicatoare etc.
Ca recipiente de cultură pot fi folosite şi baloanele cu fund plat ori
variate vase din sticlă incoloră, de forme şi mărimi diferite. Pe lîngă
recipiente din sticlă, se folosesc frecvent şi flacoane sau capsule Petri, din
material plastic, livrate sterilizat, ambalate fiind în pungi din polietilenă.
Acest tip de recipiente nu se sterilizează, mediul sterilizat şi cald turnându-
se în recipientele sterile, în condiţii de perfectă asepsie (în hota sterilă). În
condiţii de producţie se folosesc dispozitive automate de injectare (la cald) a
unor cantităţi fixe de mediu comparabil cu procedeele similare din fabricile
de medicamente.
77
 Flacoanele cu medii de
cultură, în vederea sterilizării vor fi
obturate cu dopuri de vată hidrofilă,
înfăşurate cu tifon; periodic — după
utilizări repetate — dopurile de vată
vor fi autoclavate şi apoi uscate în
etuvă. După folosire îndelungată,
dopurile de vată trebuie înlocuite cu
altele noi.
Aparatura şi dispozitivele.
La descrierea dotării
spaţiilor de lucru s-a menţionat o
parte din aparatura necesară,
respectiv: boxa sau incinta sterilă,
autoclav, aparatul de distilat şi
bidistilat apă, frigiderele de mare
capacitate, agitatoarele magnetice (cu plită pentru încălzirea mediilor),
balanţele (analitică şi tehnică), pH-metrul, etuvele, microscopul şi
stereomicroscopul, 1—2 lupe, centrifuga pentru sedimentarea biomasei în
suspensiile celulare, compresorul, o pompă de vid, dispozitivul de
repartizare a mediului, recipientele de cultură, aparatul de fotografiat.
Instrumentarul.
În tehnicile de culturi de ţesuturi se lucrează cu instrumentar de tip
chirurgical şi anume: pense de diferite forme şi mărimi, mai lungi decît
eprubetele în care urmează să inoculăm, cît mai elastice, foarfeci şi bisturie,
anse, cuţite, scalpele, lame de ras, perforatoare (de diferite dimensiuni), care

78
să permită explantarea unor cilindrii de ţesut etc. Mai sunt necesare ace,
seringi, ace spatulate, lampă de spirt etc.
Materiale diverse.
În laborator sunt necesare şi alte materiale de mică valoare, înafară
de sticlărie, şi anume: site cu azbest, clame, triunghiuri cu şamotă, trepiede,
tuburi din sticlă sau din cauciuc, becuri de gaz etc. Acestea deservesc o
gamă variată de procedee de lucru în cadrul unui laborator de
micropropagare.
Vata este necesară în cantităţi mari deoarece, înafară de confecţio-
narea de dopuri, ea serveşte şi la spălarea suprafeţelor de lucru, a flacoanelor
şi a mâinilor operatorilor, cu alcool.
În laborator îşi găsesc utilizarea şi o trusă mecanică, termometre de
cameră, mănuşi din cauciuc (de uz menajer), folie incoloră din polietilenă
(pentru acoperirea vaselor de cultură), elastice (pentru fixarea foliei de
polietilenă la gîtul recipientelor), folie din aluminiu (pentru închiderea sau
acoperirea flacoanelor cu mediu), site de metal (pentru strecurarea
materialului vegetal în operaţiunea de sterilizare), tăvi metalice, coşuri din
sârmă, casolete metalice, suporturi pentru eprubete, vase şi cutii din plastic,
perlit, vermiculit, sfoară, aţă, tifon, hârtie de filtru şi de împachetat etc.
Substanţele necesare în laborator.
În laboratorul de culturi de ţesuturi se folosesc nenumărate substanţe
chimice. Astfel, pe lângă sărurile anorganice şi compuşii organici utilizaţi la
prepararea soluţiilor nutritive, în laborator mai sunt necesari reactivi de uz
comun (baze şi acizi) precum şi unele substanţe indispensabile pentru
sterilizarea materialului vegetal, a suprafeţelor de contact, sau unele
preparate destinate curăţirii încăperilor şi a obiectelor.

79
a) Materiale chimice.
În această categorie se încadrează detergenţii sau săpunurile (solide
ori lichide), soda şi prafurile de curăţat — de uz menajer — alcoolul utilizat
pentru dezinfectare (se poate folosi şi spirtul sanitar), acidul clorhidric
tehnic, amestecul cromic (folosit în scopul curăţirii veselei), bromocet,
cloramină, hipoclorit etc.
Între substanţele chimice de uz comun intră şi reactivii obişnuiţi din
laboratoarele de chimie, şi anume:
acizi minerali (clorhidric, sulfuric, azotic) şi baze (hidroxidul de potasiu,
natriu, amoniu, de puritate tehnică şi cu grad ridicat de calitate), utilizaţi în
curăţarea sticlăriei şi necesari în prepararea unor soluţii;
 acizi organici (acetic, citric, oxalic),
 alcool etilic (absolut, de 96 sau 70°),
 acetonă, eter, cloroform (utilizaţi în cantităţi mici),
 dimetilsulfoxid (DMSO), polietilenglicol (PEG), Tween, apă de
brom, clorură mercurică, hipoclorit de natriu sau de calciu, perhidrol

b) Substanţele necesare pentru prepararea mediilor de cultură.

Pentru alegerea unui mediu de cultură adecvat creşterii anumitor
tipuri de inoculi nu trebuie să se procedeze empiric. Trebuie analizat tipul de
explant, provenienţa lui şi sezonul în care se recoltează. Se alege mediul cel
mai echilibrat (vezi tabelul 1), pentru a se asigura o evoluţie bună a
inoculilor. Dacă nu ne putem decide, vom face experienţe de tatonare, cu
diferite medii.

80
Tipuri de concentraţii ale compuşilor frecvent întâlniţi în mediile de
cultură (în mM/1) (după Le Possard şi colab., 1974)

Constituenţii Concentraţie (în mM/1)

Scăzută Medie Ridicată

SĂRURI MINERALE
NH4NO3 5 10 20
KNO3 — 10 20
KHSPO4 0,1 — —
NaH2PO4 __ 1 2
KC1 1.9 __ —
CaCl, 1 2 3
MgSO4 0,5 1,5 3
H3BO3 0,01 0,05 0,15
MnSO4 0,01 0,05 0,1
ZnSO4 0,001 0,02 0,04
CuSO4 0,00001 0,0001 0,0015
Na2Mo04 0,00001 0,0001 0,001
CoCl2 0,0001 0,0005 0,001
KI 0,0005 0,0025 0,005
FeSO4 0,01 0,05 0,1
Na,EDTA 0,01 0,05 0,1
AUXINE 0,0001 0,001 0,01
CITOCHININE 0,0001 0,001 0,01
SUBSTANŢE ORGANICE
Inozitol 0,1 0,3 0,6
Acid nicotinic 0,004 0,02 0,04
Piridoxină HC1 0,0006 0,003 0,006
Tiamină HC1 0,0001 0,002 0,04
Biotină 0,00004 0,0002 0,001
Acid folic 0,0005 0,001 0,002
Pantotenat de calciu 0,0002 0,001 0,005
Riboflavină 0,0001 0,001 0,01
Acid ascorbic 0,0001 0,001 0,01
L-Cisteină HC1 0,01 0,06 0,12
Glicină 0,0005 0,005 0,05
Zaharoză 6 60 120

81
Sera de aclimatizare
În urma preocedurilor desfășurate în laboratoarele de
microînmulțire rezultă plante cu rădăcină, care urmează a fi trecute in vivo
și care trebuie să devină apte pentru viața din afara sistemului controlat al
laboratorului. Pentru aceasta, laboratoarele de micropropagare sunt obligate
să dețină și o seră de suprafețe adaptate tipului de activitate și volumului de
lucru, cu parametri controlați, unde să poată desfășura ultima etapa a
micropropagării, „aclimatizarea‖. Menținând umiditatea, temperatura,
lumina și aerisirea la parametri optimi pentru specia luată în discuție, serele
sunt ultimul pas înaintea transplantării noilor plante în containere
individuale sau plăci alveolare și distribuite clientului. Dotările și
particularitățile tehnnologice ale acestei sere sunt standard, cu mese de
lucru, sistem de iluminat, sistem de irigat, sistem de ceață artificială și
căldură.

82
 Cap. IV. ASEPSIA ÎN CULTURILE VEGETALE IN VITRO
4.1. Măsuri generale de igienă și asepsie
Una din condițiile esențiale privind activitatea în cadrul unui
laborator de micropropagare și reușita activităților care se derulează în
cadrul acestei discipline este asepsia, pornind de la laboratoare și terminând
cu sterilizarea materialului vegetal cu care se lucrează. În natură, speciile
horticole conviețuiesc cu o seamă de specii, unele nocive, altele nu, dar care
se hrănesc din aceeași sursă, plantă sau specia horticolă, unele devenind
periculoase pentru cultură și necesitând combatere fitotehnică, altele
rămânând inofensive. În ceea ce privește culturile in vitro, însă, trebuie să
ținem seama de o serie de aspecte de igienă și dezinfectare, care curăța atât
explantele cât și spațiul în care lucrăm, știut fiind că, urmare a compoziției
pe care o are mediul de cultură, proliferarea agenților patogeni se face
exponențial corespunzător cu explantul în sine.
Asepsia este procesul - operaţiunea- de distrugere pe cale fizică sau
chimică, de filtrare, înlăturare fizică, spălare sau ultrasonare a micro-
organismelor şi a sporilor acestora. În micropropagare se folosesc două căi
de sterilizare, cea prin distrugerea germenilor şi cea care constă în
eliminarea acestora.
DISTRUGEREA GERMENILOR
Varianta aceasta de dezinfectare se poate face prin diverse metode pe
care un laborator de micropropagare le poate avea la îndemână: arderea prin
flambare; încălzirea cu căldură uscată sau vapori supraîncălziţi; iradierea cu
raze gamma, microunde sau UV; agenți chimici gen alcool etilic, soluţii
clorurate, oxid sau pentaoxid de etilenă– care prezintă dezavantajul de a fi
deosebit de inflamabil, prezentând risc ridicat și necesitând manipulare în
condiții de siguranță; apă oxigenată sau apă bromată.
83
 ELIMINAREA GERMENILOR și a altor agenți dăunători se poate
face prin filtrarea acestora, fie prin spălarea lor în curent de apă sau apă
staţionară cu adăugarea de agenţi spumanţi.
TIPURILE DE INFECȚII
Micropropagarea depinde de
asigurarea asepsiei culturii și de lipsa
infecțiilor, acestea ducând fie la
compromiterea totală a culturilor fie la
pierdere de resurse, material vegetal și finanțe
în scopul recuperării ei. În micropropagare se
cunosc două tipuri de infecții, primare și
secundare.
Infecţiile primare - eliminarea
acestora este o condiție esențială pentru
reușita unei culturi in vitro. Acestea apar
imediat după inoculare, la 2-3 zile şi sunt
cauzate de igiena deficitară, dezinfecţia
necorespunzătoare a materialului vegetal, a
instrumentarului şi vaselor de cultură. Ele pot
fi cauzate de ciuperci şi bacterii iar o cultură
odată infectată, este compromisă şi trebuie

Fig. IV.1. Infecție aruncată.

bacteriană pe explant Infectiile secundare - se declanșează
după câteva săptămâni de la inoculare și periclitează întreg procesul
tehnologic, astfel încât este neceasar să se respecte principiile și regulile
asepsiei la nivelul materialului vegetal, al recipientelor de lucru și mediilor
de cultură folosite, indiferent dacă sunt solide, semisolide sau lichide și
84
suspensii, precum și respectarea asepsiei la nivelul procesului tehnologic.
Un aspect important se referă la calificarea personalului care trebuie
să fie instruit și să dețină cunoștințe avansate de microbiologie, despre
natura și evoluția germenilor (virusuri, bacterii, alge, drojdii, mucegaiuri)
precum şi căile de transmitere şi de reproducere a acestora.

4.2. Asepsizarea încăperilor, a instrumentarului și a altor obiecte de

laborator.
Sterilizarea hotelor
Succesul activităților în micropropagare depinde în mare parte de
sterilitatea proceselor, de asepsizarea încăperilor și a intrumentarului, de
buna mentenanță și în condiții optime de lucru a dispozitivelor electrice de
lucru. Hotele cu flux laminar continuu sunt unul din punctele cheie în
procesul de producție, iar păstrarea lor în condiții aseptice este esențială.
Înainte de demararea etapelor de lucru din camera sterilă, hotele se pornesc
și se sterilizează la raze ultraviolete (UV). Dispozitivele sunt dotate din
fabricație cu lumina UV, astfel încât după 20 de minute de UV pornit, hota
va fi sterilă și pregătită pentru inocularea materialului vegetal. De reținut
este că lămpile UV se întrerup cu 20-30 de minute înainte de accesul
personalului care deserveşte lucrul la hote din cauza riscului de contaminare
cu ozon.
Instrumentarul
Toate dispozitivele folosite în cadrul laboratoarelor de
micropropagare trebuie să respecte protocoalele de sterilizare și să fie
supuse acestora altfel, succesul etapelor care se derulează în camera sterilă
nu este garantat. Sterilizarea casoletelor, sterilizarea recipientelor cu mediu
steril, a instrumentarului, a flacoanelor cu inoculi în etapa de repasare, se
85
execută după procedee standard de laborator. Operațiunile se desfășoară fie
la etuvă, autoclav, fie în alcool 70°, fie prin fierbere în baie de apă sau prin
flambare.
De cele mai multe ori, procedeele de asepsizare se produc încrucișat
cu scopul de a se asigura o deplină sterilizare a instrumentarului sau a
aparatelor implicate în procesele de lucru. În timpul lucrului la hote,
instrumentarul care se sterilizează în paralel cu celelalte operațiuni care se
desfășoară poate fi fierbinte în urma sterilizării, motiv pentru care se acordă
o atenție deosebită răcirii acestuia înainte de a fi folosit și a intra în contact
cu materialul vegetal.
Operatorul
Personalul calificat care lucrează la hotă este, de asemenea, sursă
continuă de infecții pentru materialul vegetal supus micropropagării, dacă nu
chiar primul agent de contaminare. Una dintre grijile sale este sterilizarea
perioadică a mâinilor atâta vreme cât se află în proces de lucru la hotă, prin
pulverizarea constantă cu alcool medicinal. De asemenea, purtarea
mănușilor chirurgicale poate reprezenta un avantaj în ceea ce privește
limitarea propagării infecțiilor sau germenilor dăunători.

4.3. Asepsizarea vaselor de cultură

Vasele de cultură reprezintă viitoarea „casă‖ pentru fragmentele de
țesuturi sau explantele supuse procesului de micropropagare și necesită
totală asepsizare, astfel încât să nu permită proliferarea niciunuia dintre
factorii de infecții.
Literatura de specialitate recomandă presterilizarea vaselor de
cultură, chiar dacă există riscul slăbirii rezistenței acestora urmare a

86
procesului de sterilizare sau poate apărea fenomenul de emitere a unor
compuși toxici ce apar în urma acestui proces.
Vasele de cultură au dopuri fie din cauciuc, plută sau alte materiale
plastice care necesită presterilizare. Trebuie să ne asigurăm asupra
rezistenței materialului din care sunt confecționate, să le dezinfectăm,
fierbem și sterilizăm. În condițiile în care se folosesc dopuri din vată
acoperite de staniol, acestea se sterilizează odată cu mediul de cultură.

4.4. Asepsizarea mediilor de cultură, apei și a altor substanţe

Mediul de cultură reprezintă suportul de viață al explantelor pe
perioada cât trăiesc in vitro și trebuie să asigure condiții de hrană și sănătate
culturilor. Sterilizarea mediului este o etapă necesară fără de care nu se
poate realiza micropropagare în condiții normale. Etapele pe care acesta le
parcurge sunt: pregătire, porționare, obturare sau acoperire și sterilizare.
Se recomandă ca dopul sau capacul să nu fie închis etanș pentru a se
permite circulația vaporilor fierbinți de apă - sursa de sterilizare, de altfel,
între recipient și mediul autoclavului.
Sterilizarea mediului sau a apei distilate, a hârtiei de filtru pe care se
lucrează sau a sticlăriei se face la 1,1 atmosfere presiune, timp de 20-30 de
minute și la 120°C în autoclav. Vasele nu se vor umple cu mai mult de ¾ din
volum, pentru a nu se produce accidente odată cu modificarea presiunii de la
finalul autoclavării, prezentând risc de explozie. Odată autoclavat și
sterilzat, mediul de cultură se va lăsa la răcit, în spații deschise, cu aer care
circulă, iar recomandarea pentru folosire este dată la 24-48 de ore de la
sterilizare și răcire.
SUPRAAUTOCLAVAREA produce o alterare a calităţii mediului de
cultură prin deteriorarea echilibrul ionic din mediu, ceea ce afectează
87
capacitatea de solidificare a agarului și duce la caramelizarea zaharozei. Pe
de altă parte, SUBAUTOCLAVAREA permite dezvoltarea coloniilor de
microorganisme, ceea ce va duce la inutilizarea lotului de mediu.
Pentru mediile lichide se poate folosi un alt tip de sterilizare,
sterilizarea la rece, care se produce prin filtrare cu nuci filtrante de sticlă,
porţelan sau filtre Millipor.
Una din procedurile care poate aduce un plus de siguranță în asepsia
mediilor de cultură este folosirea de substanțe sterilizante în mediul de
cultură însuși, practică mai puțin folosită în cadrul laboratoarelor de
micropropagare, dar care poate inhiba dezvoltarea virusurilor. Pentru acest
procedeu se recomandă folosirea penicilinei, streptomicinei sau a
cloramfenicolului. În condițiile în care se țintește eliminarea bacteriilor și
ciupercilor, se recomandă a se folosi oxidul de propilenă. Din păcate, se pare
ca acesta provoacă mutații, inhibă sau stopează organogeneza, generează o
debilitate crescută la trecerea plantelor din in vitro în in vivo şi scade
capacitatea adaptativă a plantelor.

4.5. Asepsizarea materialului vegetal

Asepsizarea materialului vegetal este considerată una din primele
etape din micropropagare și este o condiție primordială a reușitei în această
ramură a biotehnologiei. Ea se realizează numai cu agenți chimici iar reușita
ei depinde de o serie de factori: specia, vârsta, fenofaza plantei donor în
momentul recoltării, condiţiile ecologice în care s-a dezvoltat, organul
prelevat și poziţia sa în plantă sau ţesutul folosit, fiecare dintre acestea având
o importanță deosebită pentru stabilirea protocolului corect de dezinfecție și
asigurarea unui material vegetal steril.

88
 Indiferent de unde provine planta, indiferent de climatul sau fenofaza
în care se află, organele subterane sunt cele mai populate în paraziți, în
simbionți, saprofiți și spori, astfel încât protocoalele de dezinfecție vor ține
cont de acest aspect important. Pe de altă parte, pentru mugurii, tulpinile,
ramurile şi organele cu pilozitate se ține cont de faptul că pe ele aderă sporii
germenilor cu uşurinţă, că pilozitatea împiedică accesul dezinfectantului
direct pe suprafaţă, motiv pentru care trebuie distrusă tensiunea superficială
prin adăugarea unui spumant la detergent.
Criteriile de care se ține cont în succesul asepsizării sunt variate și de
multe ori caracteristice speciei sau cultivarului folosit dar, ca regulă de bază,
trebuie să evaluăm corect metoda de asepsizare, să alegem conform
substanţele pentru sterilizare, concentraţia acestora precum și durata de timp
alocată asepsizării.
Detergenţii. Privire generală.
Indiferent de tipul de detergent folosit pentru dezinfectarea
materialului vegetal, el trebuie să îndeplinească o serie de calități care să le
confere capacitate de a asigura sterilizarea explantelor. Trebuie să aibă
acţiune suficient de puternică pentru a putea distruge agenții patogeni de
Fig. IV.2. Distribuția agenților de dezinfecție și nivelul de asepsizare
după Yeoman and Macleod (1977).
Agentul sterilizant Concentrația Timpul Nivelul de
uzuală(%) (minute) asepsizare

Hipoclorit de calciu 9-10 5-30 Foarte bună

Hipoclorit de sodiu 2(20% sol. comercială) 5-30 Foarte bună
Peroxid de hidrogen 10-12 5-15 Bună
Apă bromată 1-2 2-10 Foarte bună
Nitrat de argint 1 5-30 Bună
Clorură mercurică 0,1-1 2-10 Satisfăcătoare
Antibiotice 4-50 mg l-1 30-60 Destul de bună

89
suprafață și/sau interiori, nivelul lor de toxicitate să nu distrugă ţesuturile
provocând necroze, deoarece aceasta presupune lipsa hranei în mediul in
vitro și moartea explantului. O condiție importantă este ca detergentul să
poată fi îndepărtat cu ușurință, fără să creeze probleme de suprahidratare sau
distrugere a țesuturilor. Cu toate acestea, sterilizarea explantului este un
proces care se petrece la suprafața explantului motiv pentru care, în
condițiile în care materialul vegetal supus micropropagării are țesuturile
Fig. IV.3. Modul de acțiune al diferiților agenți antimicrobieni
după Falkiner (1990)
Agentul antimicrobian Modul de acțiune Mențiuni

Aminogicozide Bactericidă
Streptomicină
Kanamicină Inhibă sinteza proteică prin
Neomicină interacțiunea cu ribozomii 30S
50S
Gentamicină
Spectinomicină aminociclitol
Qinolone Bactericidă
Acid nalidixic Interferează cu replicarea ADN-
Ofloxacină ului bacterian prin inhibarea
ADN girazei
Norfloxacină
Ciprofloxacină
Β-Lactami Bactericidă
Penicilină
Ampicilină
Cefuroxime Inhibă sinteza pereților celulei
bacteriene
Tetracicline Inhibă sinteza proteinelor prin Bacteriostatic
acțiunea asupra robozomului
30S
Cloramfenicol Inhibă sinteza proteinelor prin Bacteriostatic
acțiunea asupra robozomului
50S

90
profunde infectate, pot să apară infecții târzii și la a doua sau a treia
repasare, cu bacterii, fungi, micoplasme sau fungi, exponate care se regăsesc
și în țesuturile explantei.
Principalii dezinfectanți sunt: alcool etilic în diverse concentrații
(70%, 96% sau absolut) și se recomandă doar la organele cu pilozitate mare,
epiderma cutinizata puternic, muguri bine închişi și care necesită clătire
rapidă pentru a evita arderea explantului, apa bromată – mai puțin folosită,
clorura mercurică - deosebit de toxică și care se pare că prezintă remanență
în explante dar cercetările nu sunt elocvente în acest moment, hipocloritul de
sodiu sau Apa de Javel – se folosește în varii concentrații și timpi de
expunere și cere clătiri abundente ulterior. Protocoalele de dezinfecție pentru
majoritatea plantelor pentru care se aplică procedeee de multiplicare in vitro
au deja stabiliți detergenții, concetrațiile, duratele de imersiune sau timpii de
clătire. Pentru speciile care intră în vizorul cercetătorilor, stabilirea
protocoalelor de dezinfecție se face prin tatonări repetate până la atingerea
scopului dorit.

4.6. Verificarea unei bune asepsizări

În vederea evitării accidentelor cauzate de infecţii este obligatorie
verificarea periodică a hotelor cu flux laminar de aer în ceea ce priveşte
asepsizarea aerului din interiorul hotei. Acest lucru se face cu aparate care
măsoară gradul de impurificare a aerului. În funcţie de aceste rezultate, se
stabileşte momentul de schimbare a filtrelor.
În aceeaşi ordine de idei, se verifică şi gradul de asepsizare din
camera de creştere şi din camera sterilă prin mijloace fizice, chimice si
biologice.

91
 Fizice: manometre, termometre cu sau fără sistem de înregistrare
grafică;
 Chimice: substanţe sub formă de pulberi cu punct de fuziune
cunoscut, benzi de hârtie impregnate cu diverse substanţe (testul
Bowie & Dick), lichide aşezate în tuburi care la o anumită
temperatură îşi schimbă culoarea. Dintre pulberi, menționăm sulful
cu punct de topire 118°C și acidul picric la 130°C;
 Biologice: cu Bacillus stearothermophylus comercializat sub formă
de Sterotest 120 (fiole cu conţinut limpede și culoare violet), care
este un indicator pentru controlul sterilizării cu autoclav la 120°C pe
o durată de 30 de minute, fiind puse în incubator la 56°C. Menţinerea
aspectului, culorii şi transparenţei arată o sterilizare corectă iar
virajul la galben şi o uşoară opalescenţă arată o sterilizare sub
parametrii de eficienţă.

92
 Cap. V. MEDIILE DE CULTURĂ

5.1. Generalități
Momentul de mare răscruce în realizarea mediilor de cultură a fost
anul 1962, când T. Murashige şi F. Skoog au elaborat și publicat reţeta de
mediu de cultură care le poartă numele și astăzi prescurtat MS. Deși elaborat
pentru țesuturi de tutun, MS a devenit astăzi mediul de bază în culturile in
vitro, mediul de inițiere fiind folosit pentru o varietate largă de specii.
Mediul de cultură este un suport fizico-chimic pentru susținerea
vieții la explante în condițiile închise ale recipientelor de cultură și are
nevoie de o serie de atribute pe care să le îndeplinească pentru a putea fi
asociat unui protocol de micropropagare a unei specii.
Principala condiție pe care trebuie să o îndeplinească un mediu de
cultură este aceea de a putea să hrănească corect și suficient explantul aflat
în diverse stadii de evoluție (de la inițiere la înrădăcinare) și să îi asigure
condiții optime de dezvoltare în ceea ce privește necesitățile ei fiziologice
(pH, presiune osmotică, umiditate, echilibru ionic). Din punct devedere al
caracteristicilor administrative, mediile de cultură trebuie să fie ușor de
preparat, să aibă o rețetă care să se poate reproduce și să prezinte stabilitate
după încheierea procesului de pregătire, să fie stabil și să nu manifeste
modificări fizico-chimice de substanță sau stare, infecții sau alte
dezechilibre. De asemenea, orice laborator de micropropagare va aprecia un
cost mic per unitatea de mediu, ceea ce presupune substanțe constituente
necostisitoare și accesibile.
La nivel mondial se recunosc ca fiind cele mai folosite o serie de
rețete de mediu, dar nu sunt nici pe departe singurele, existând și specii care
au medii de cultura dedicate. Dintre cele mai cunoscute medii de cultură,
93
retinem: B5 (Gamborg şi colab. 1968), N6 (Chu, 1978), Nitsch&Nitsch
(NN, 1969), Quoirin&Lepoivre (QL, 1977), DKW (Driver&Kuniyuki,
1984) şi WPM (Lloyd & McCown, 1980)- ultimele fiind recomandate în
special pentru speciile lemnoase și pomicole, compoziția lor variind în limite
relativ mici, cu atenție asupra variației cantităților compușilor anorganici
(macroelementele, microelementele, chelatul de fier), variațiile necontrolate
putând afecta echilibrul ionic ceea ce va pune în pericol răspunsul fiziologic
al plantei în respectivul mediu de cultură.
Mediile de cultură pot fi de trei feluri după constituția lor: lichide,
solide și semisolide și presupun anumite criterii după care se evaluează
necesitatea folosirii unui anumit mediu pentru o lucrare. Pentru a decide
foosirea unui anume tip de mediu de cultură se ține seama de tipul de
explant, de modul de cultivare al plantei donor, de proveniența acestuia –
din mediu exterior sau spațiu de cultură protejat, stadiul de dezvoltare a
explantului, de specie și de soi, mărimea, sezonul de recoltare (important
mai ales pentru culturile din muguri) precum și de scopul culturii.
Majoritatea speciilor cunoscute astăzi și care au fost testate au un
mediu de cultură la care au reacționat pozitiv și care este listat în literatura
de specialitate. O altă categorie sunt speciile care nu au încă un mediu de
cultură viabil care să producă culturi stabile genetic și a treia categorie,
speciile la care, în urma testărilor, s-a ajuns la concluzia că sunt recalcitrante
la micropropagare și micropropagarea nu se poate lista ca metodă de
înmulțire pentru ele deocamdată.
Un rol important în stabilirea mediilor de cultură pentru plantele
horticole în vederea ușurării muncii de reproducere, multiplicare și ridicarea
standardelor de comercializare a acestora atât cantitativ (populația planetei
cere multă hrană zilnic, care trebuie produsă rapid), dar și calitativ (gusturile
94
consumatorului s-au rafinat, cerând variație mare) îl au fiziologii, specialiști
în nutriția plantelor, cei care pot evalua constant necesarul de hrană al unui
explant și dozarea substanțelor constitutive ale mediului de cultură, astfel
încât procesul de multiplicare in vitro să se desfășoare în bune condiții.

5.2. Compoziţia mediului de cultură

Compoziţia mediului de cultură este diferită de la o specie la alta iar
de la începuturile microînmulţirii până astăzi au fost elaborate multe reţete,
odată cu acumularea informaţiilor despre specia în discuţie, cu evoluţia
fiziologiei şi a biologiei moleculare, domeniul nefiind nici pe departe închis
cercetării.
Modificările care apar la nivel molecular într-o plantă care se află în
stare de carenţă sau exces din punct de vedere al nutriţiei sunt relativ
cunoscute la această dată, recomandarea în micropropagare fiind aceea de a
asigura un echilibru între elementele componente ale elementelor din mediul
de cultură, altfel cultura este supusă eşecului.
Odată despărţit de planta mamă, explantul va avea nevoie de condiţii
de mediu speciale pentru evoluţie, de mediu complet steril şi de hrană
adecvată - adică acea soluţie nutritivă complexă formată din apă, săruri
minerale (macroelemente şi microelemente) - substanţe anorganice şi
substanţe organice (glucide, vitamine, fitohormoni, agar etc).
Apa
Toate organismele au în componenţa lor apă sau au nevoie de apă,
iar acest fapt fiziologic se regăseşte şi în cadrul micropropagării in vitro a
plantelor. Ea intră în componenţa mediului de cultură sau a procedeelor de
sterilizare şi autoclavare a recipientelor, dar este întâlnită şi în recipientele
de cultură, numai că aici are un circuit închis. Nu este recomandat ca
95
eprubetele cu explante să dobândească condens, deoarece acesta poate ridica
riscurile de infecţii, iar acest aspect se poate controla odata cu reglarea
temperaturii în camera de creştere.
În cazul în care recipientele de cultură nu sunt închise etanş, această
apă rezultată din condens se poate evapora şi poate să contribuie şi la
dezechilibrarea hidrică a explantelor și pierderea turgescenţei celulare.
Ajunsă în această situaţie, explantele îşi modifică metabolismul şi pot să
apară modificări de stare fiziologică şi biologică.
Apa folosită în micropropagare este apă bidistilată sau distilată,
ideală pentru realizarea mediului de cultură, nerecomandându-se folosirea
apei pure sau ultrapure deoarece aceasta este o apă „moartă‖, fără viaţă, fără
proprietăţi fizico-chimice necesare procedurilor şi proceselor fiziologice din
micropropagare.
Un alt aspect este pierderea apei în cadrul preceselor de sterilizare.
Sterilizarea explantelor în alcool produce deshidratarea majoră a ţesuturilor
mai ales în cazul frunzelor neacoperite de pruina sau strat ceros,
recomandările pentru timpul de submersie fiind foarte reduse în acest caz
sau chiar înlocuirea alcoolului cu hipoclorit de Ca sau Na.

5.3. Compuşii anorganici şi organici

Compușii anorganici
Se cunosc şase elemente indispensabile creşterii plantelor: N, P, K,
Ca, Mg, şi S.
Cele mai folosite săruri sunt fosfaţii, azotaţii, clorurile şi sulfaţii de
Ca, K, Mg, Mn, Al, Fe, Mo, Zn, Cu, Na. Fiecare etapă a micropropagării
cere un anumit element în mod suplimentar iar absorbţia acestora se va face
sub formă de ioni, necesar de reţinut fiind că rolul fiziologic al fiecărui
96
element din mediul de cultură variază în funcţie de concentraţie, natura
explantelor şi specificul culturii.
Cantitatea de substanţă folosită în eleborarea mediilor a împărţit
aceste elemente în
MACROELEMENTE -C, O, H, N, P, S, K, Ca, Mg
şi
MICROELEMENTE - Fe, Mn, Zn, Al, B, Cu, Mo, Na, Co, I.
Proporţiile în care acestea se folosesc în mediile de cultură se aleg
conform cu scopul urmărit, fie folosind reţetele deja consacrate, fie prin
tatonări personale.
Rolul elementelor în compoziţia mediului este dat de concentraţia în
care se foloseşte elementul, de forma chimică în care se găseşte precum şi de
tot ceea ce ţine de partea vegetală, adică subiectul micropropagării.
Dintre rolurile importante pe care le au macroelementele, enunţăm
câteva:
 Omiterea N, S sau P în cazul culturilor de liber secundar la morcov
provoacă moartea inoculilor în cca. 2 luni de la inoculare,
observându-se că există o sensibilitate mare a celulelor la S şi P,
elemente care trebuie dozate foarte atent în compoziţia mediului de
cultură;
 Lipsa cationului de K - carenţa duce la încetinirea creşterii culturilor;
 Carenţa de N care persistă poate provoca dereglări în metabolismul
glucidelor şi proteinelor, iar prezenţa acestei carenţe se poate observa
prin creşterea concentraţiei de pigmenţi antociani în vacuole;
 Mărirea concentraţiei cationului de K duce la mărirea ratei creşterii
culturilor de tutun şi viţă-de-vie sălbatică;

97
  Carenţele de Ca şi Mg generează tulburări vegetative culturilor - cea
de Mg provocând modificări în masa foliară- până la moartea
celulelor;
 Absenţa NH4NO3 pentru culturile de Lactuca sativa generează doar
calus, fără să se producă diferenţierea muguraşilor;
 Ţesuturile senescente sau ameliorate cer medii cu conținut de Ca
suplimentar, complementar cu K.
 N are rol important în embriogeneza somatică şi produce fenomenul
de vitrificare în funcţie de forma în care se află (amoniacală sau
nitrică).
Rolul microelementelor în mediul de cultură este dat de faptul că
intră în compoziţia unor sisteme enzimatice catalogate drept vitale pentru
metabolismul vegetal. Aşadar, sunt indispensabile şi importante, lipsa lor
din mediile de cultură provoacă, până la a treia repasare, decesul culturii.
 Fe intervine în metabolizarea intranucleară, sinteza ARN şi sinteza
proteică; necesită a fi administrat sub forme chelatizate, deoarece
este greu de asimilat.
 Lipsa Zn modifică sinteza auxinei.
 Mn participă la proteosinteza şi formarea ARN-ului în celulele
rădăcinilor de mazăre şi are rol important în cazul rizogenezei la
tomate dar trebuie avut în vedere raportul Mg/Mn deoarece se pot
produce perturbaţii grave la nivel celular;
 B are rol în procesele de diviziune şi creştere celulară;
 Al este catalizator în multe reacţii chimice şi nu s-au raportat
fenomene de carenţă evidentă în caz de lipsă;
Cercetările din acest moment pot recomanda anumite medii de
cultură pentru diverse specii nefiind nicidecum restrictiv, imaginaţia şi
98
perseverenţa fiind ultimele bariere în ceea ce priveşte elaborarea mediilor de
cultură pentru speciile horticole.
 WHITE (1943) - recomandat pentru culturile de ţesuturi tumorale.
 HELER (1953) - recomandat pentru multe culturi, mai puţin tutun.
 KNUDSON (1925) - recomandat pentru orhidee şi ferigi.
 MURASHIGE-SKOOG (1962) - recomandat pentru culturi de calus
la tutun şi culturi de celule la majoritatea speciilor fiind numit mediu
universal.
 GAMBORG (1968) recomandat în germinarea în condiţii aseptice a
seminţelor
COMPUŞII ORGANICI
În 1934, WHITE a reuşit să afirme în lumea biotehnologiilor că
zaharoza şi extractul neautolizat de drojdie care conţine glicină/aminoacizi şi
tiamina/vitamine aduc superioritate nutriţională mediilor de cultură,
producând reacţii pozitive de creştere explantelor. Cam în aceeași perioadă
a fost descoperit și principiul de acţiune al AUXINELOR.
În 1938, ROBBINS şi SCHMIDT au adăugat reţetelor de mediu
piridoxina, adică vitamina B6 (precursor al unor enzime) şi acidul nicotinic.
Şi acesta a fost începutul unei noi ere în elaborarea mediilor de cultură şi a
importanţei compuşilor organici.
Cele mai importante surse organice care intră în componenţa acestor
medii şi pe care le folosim la această dată sunt: zharoza/glucoza, aminoacizi,
vitamine, extract de drojdie, fitohormonii/substanţele reglatoare de creştere,
cazeina, sucuri naturale şi agarul, regăsite în mediu în funcţie de tipul
celulelor cultivate sau de tipul explantului, de scopul culturii şi de rezerva
proprie de hormoni ai explantului.

99
 Fig. V.1. Compoziția principalelor medii de cultură folosite
Componente Murashige& Gamborg WPM White
Skoog B-5 Nitsch&

Nitsch
Macroelemente în mg/L (mM)
NH4NO3 1.650(20,6) - 400(5,0) - -
NH4H2PO4 - - - - -
NH4SO4 - 134(1,0) - - -
CaCl2 *2H2O 332,2(2,3) 150(1,0) 96(0,7) 166(1,1) -
Ca(NO3)2*4H2O - - 556(2,4) - 288(1,2)
MgSO4*7H2O 370(1,5) 250(1,0) 370(1,5) 185(0,75) 737(3,0)
KCl - - - - 65(0,9)
KNO3 1900(18,8) 2500(24,8) - 950(9,4) 80(0,8)
K2SO4 - - 990 - -
KH2PO4 170,3(1,3) - 170,3(1,3) 68,5(0,5) -
NaH2PO4 - 130,5(0,9) - - 16,5(0,12)
Na2SO4 - - - - 200(1,4)
Microelemente în mg/L (mM)
H3BO3 6,2(100) 3,0(49) 6,2(100) 10(162) 1,5(25)
CoCl2*6H2O 0,025(0,1) 0,025(0,1) - - -
CuSO4 *5H2O 0,025(0,1) 0,025(0,1) 0,25(1) 0,025(0,1) 0,01(0,04)
Na2EDTA 37,3(100) 37,3(100) 37,3(100) 37,3(100) -
Fe2(SO4)3 - - - - 2,5(6,2)
FeSO4 *7H2O 27,8(100) 27,8(100) 27,8(100) 27,8(100) -
MnSO4*H2O 16,9(100 10,0(59) 22,3(132) 18,9(112) 5,04(30)
KI 0,83(5) 0,75(5) - - 0,75(5)
NaMoO3 - - - - 0,001(0,001)
Na2MoO4*2H2O 0,25(1) 0,25(1 0,25(1 0,25(1 -
ZnSO4*7H2O 8,6(30) 2,0(7,0) 8,6(30) 10(35) 2,67(9)
Compuși organici în mg/L (mM)
Mioinositol 100(550) 100(550) 100(550) 100(550) -
Glicina 2,0(26,6) - 2,0(26,6) 2,0(26,6) 3,0(40)
Acid nicotinic 0,5(4,1) 1,0(8,2) 0,5(4,1) 5(40,6) 0,5(4,1)
Piridoxină HCl 0,5(2,4) 0,1(0,45) 0,5(2,4) 0,5(2,4) 0,1(0,45)
Tiamină HCl 0,1(0,3) 10,0(30) 1,0(3,0) 0,5(1,5) 0,1(0,3)
Biotina - - - 0,2(0,05) -
Sursa: Plant Tissue Culture Concepts and Laboratory Exercises, 2th Edition,
2000, CRC Press Boca Raton, Florida
Carbonul organic
Mediul de cultură conţine adaos de carbon glucidic, ceea ce asigură
substrat respirator pentru culturi și trebuie știut că prin degradarea
glucidelor se obţine energia necesară proceselor vitale, multiplicării,

100
creşterii şi diferenţierii celulare. Trebuie reţinut că, deşi plantulele sunt verzi
şi posedă clorofilă, sau calusul este activ, aceste materiale vegetale nu sunt
total autotrofe şi pentru a fi ţinute în viaţă avem nevoie de surse de carbon
organic care să ajute procesul de fotosinteză - proces nedesfășurat integral,
sau să suplinească proasta funcţionare a cloroplastelor.
Formele în care avem posibilitatea de a suplini lipsa de sinteză a
substanţelor energetice sunt a) GLUCIDELE; b) ALCOOLII şi c) ACIZII
ORGANICI.
Dintre glucide, zaharoza prezintă eficienţă maximă în procesele
metabolice la nivelul culturilor in vitro (alte surse fiind glucoza, fructoza,
maltoza, rafinoza şi amidonul) într-o concentraţie optimă de 2%. Excesul de
zaharoză poate duce la plasmolizarea celulelor urmare a presiunii osmotice
create.
Culturile vegetale evoluează optim la o concentraţie a zaharozei de
2-3% (3% glucoză doar pentru culturi de meristeme la unele specii
lemnoase) cu limite extinse între 1,2% - 8% (pentru cartof). De asemenea, se
recomandă ca la autoclavare să se respecte strict temperatura de sterilizare
deoarece uneori se poate produce fenomenul de caramelizare sau de alterare
a zaharozei.
Dintre alcooli, glicerolul poate fi folosit ca sursă energetică,
potenţând efectul glucidelor, dovedit până în acest moment ca fiind sigurul
cu eficienţă, dar mult mai slab ca performanţă decât zaharoza.
MONOALCOOLII - ca metanol, etanol, propanol sau butanol- nu pot fi
utilizaţi, fiind toxici chiar şi la diluţii mari.
Azotul organic
Ţesuturile vegetale sunt autotrofe faţă de azot, preluându-l din
substanţele anorganice, ceea ce nu limitează însă folosirea acestuia în
101
mediile de cultură. În 1939, WHITE a dovedit că GLICINA îmbunătăţeşte
creşterea rădăcinilor la tomate iar UREEA şi unele BAZE AZOTATE pot fi
surse eficiente de azot organic. Deşi atenţionează asupra faptului că sursele
de azot organic în culturi pot fi toxice, în 1981, BIONDI şi THORPE
recomandă folosirea aminoacizilor în mediile de cultură atunci când se
urmăreşte formarea de calus.
Vitaminele
Avantajele vitaminelor în cultura explantelor s-au descoperit
întâmplător între anii 1922-1940 când, după WHITE, orice mediu de cultură
trebuie să conţină vitamine. Acestea erau considerate indispensabile vieţii
plantelor după cunoștințele biologiei vremii. Dintre acestea, amintim câteva:
VITAMINA B1 (TIAMINA)
 Valoare biologica importantă;
 Stimulează creşterea celulelor şi a ţesuturilor.
VITAMINA B6 (PIRIDOXINA)
 Precursor al enzimelor, considerată indispensabilă.
VITAMINA H (BIOTINA)
 Utilizată încă din 1946 (Morel);
 Exercită efect stimulator asupra culturilor de celule.
ACIDUL FOLIC
 Efect stimulant asupra ţesuturilor tumorale dar şi efect toxic urmare a
descompunerii în acid p-aminobenzoic (factor de creştere, însă).
ACIDUL NICOTINIC
 Utilizat încă din 1938 şi considerat indispensabil.
VITAMINA C (ACIDUL ASCORBIC)
 Acţiune antioxidanta şi folosită pentru diminuarea acţiunii fenolice a
unor specii recalcitrante la micropropagare şi care elimină fenoli.
102
INOZITOL (glucid/vitamină)
 Obligatoriu în mediul de cultură dar nu se cunoaşte clar rolul
fiziologic pe care îl exercită asupra culturilor.

Fitohormonii/fitoregulatorii
Fitohormonii stimulelază, inhibă sau intervin calitativ şi cantitativ în
creşterea şi dezvoltarea explantelor şi sunt folosiţi în concentraţii foarte
mici, de ordinul mM sau μM. De la început trebuie să se facă diferenţa între
fitohormoni şi fitoregulatori.
FITOHORMONII ► produc modificări la nivelul proceselor de
morfogeneză, organogeneză, embriogeneză, cu urmări în dezvoltarea
celulară, tisulară, organică, diferenţierea celulară sau la nivelul întregii
plante.
FITOREGULATORII ► sunt regulatori chimici, organici, compuşi de
sinteză care ―imită‖ efectele hormonilor naturali, devenind indispensabili în
biotehnologiile vegetale.
INFLUENŢA FITOHORMONILOR care se poate manifesta în
plantă printr-un răspuns imediat sau întârziat, depinde de starea fiziologică
a centrilor receptori (celule, ţesuturi, organe), stadiul de dezvoltare al
organelor plantei, natura şi nivelul semnalului, de interacţiile acestuia cu
alţi fithormoni, condiţiile de mediu ş.a.m.d.
Multiplicarea şi creşterea celulară, care sunt catalogate ca fiind
fenomene complexe, pot produce reacţii particulare urmare a interacţiunii
dintre fitohormonii explantei şi fitoregulatorii administraţi în mediul de
cultură, acesta fiind motivul pentru care reţetele de mediu variază în
concentraţii de hormoni de la specie la specie, în funcţie de bagajul endogen
al acesteia.
103
 O scurtă trecere în revistă a paşilor făcuţi de evoluţia fitohormonilor
vegetali ne arată că DARWIN, în 1880, intuieşte existenţa fitohormonilor,
pentru ca peste un secol, încă să nu se cunoască pe deplin mecanismele de
interacţiune dintre fitohormoni şi toate procesele pe care le implică.
Frits Warmolt WENT (1928) identifică auxina A în urina umană,
descoperire care permite lansarea unei noi ştiinţe: fitotehnologia. Anii ‗30
aduc descoperirea acţiunii giberelinelor, acidului abscisic şi etilenei, pentru
ca SKOOG (1955-1956) să izoleze din sperma de heringi chinetina (6 –
furfurilaminopurina); în anii 1956, STEWARD lansează citochininele
native din laptele de cocos.
În acest moment se cunosc cinci mari categorii de fitohormoni:
AUXINE, CITOCHININE, GIBERELINE,
ACIDUL ABSCISIC, ETILENA.
Auxinele
În plante, auxinele se găsesc sub forme libere (AIA) sau legate, sub
multiple combinaţii ale AIA cu acid aspartic, glutamic sau acid ascorbic.
Tipuri de auxine cunoscute:
 AIA (auxina nativa);
 AIB (acidul 3-indolilbutiric- nu se găseşte în toate speciile
vegetale);
 ANA (acidul 1-naftilacetic);
 2,4-D (acidul 2,4-diclorfenoxiacetic);
 4ACFA SAU ACPA (acidul 4- clorfenoxiacetic);
 ANOA (acidul 2-naftoxiacetic);
 2,4,5-T (acidul 2,4,5-triclorfenoxiacetic);
 DICAMBA (acidul 3,6-dicloro-2-metoxibenzoic);
 PICLORAM (acidul 4 amino-3,5,6-tricloro-2-piridincarboxilic);
104
  AMCA (acidul 2-metic-4-clorfenoxiacetic).
Actiunea fiziologică a auxinelor:
1. Creşterea în lungime a celulelor (mărirea plasticităţii pereţilor
celulari);
2. Permeabilizarea membranelor plasmatice;
3. Influenţe pozitive asupra sintezei ARN ribozomal;
4. Stimulează diviziunea celulară (alături de citochinine);
5. Influenţează sinteza de etilenă;
6. Influenţează creşterea celulelor în tropisme;
7. Implicate în fenomenul de dominanţă apicală, caulinară;
8. Acţiune inhibitoare asupra căderii frunzelor şi fructelor;
9. Acţiune rizogenă—stimularea butaşilor în înmulţirea vegetativă;
10. Inhibă formarea embrionilor somatici.
Folosite în concentraţii mici, auxinele dezvoltă o acţiune benefică
asupra creşterii celulei vegetale, pe când în concentraţii mai mari dezvoltă o
acţiune inhibitoare sau chiar toxică, cum este cazul dicamba sau 2,4-D, caz
în care auxinele de sinteza devin ierbicide. Dintre auxinele de sinteza, cele
mai cunoscute şi folosite sunt ANA şi 2,4-D, fiind, de altfel, şi cele mai
stabile.
Viteza de degradare şi capacitatea de acţiune a auxinelor exogene
depinde de mulţi factori: tipul ţesutului, natura şi concentraţia auxinei,
fenofaza plantei, organul supus tratamentului şi multe altele, studiile arătând
că rădăcinile sunt mai receptive la concentraţii scăzute de auxine, pe când
tulpinile, frunzele şi fructele (în formare) cer concentraţii mai ridicate de
auxine.

105
Citochininele
Hormoni care acţionează asupra proceselor de diviziune celulară,
citochininele fac posibilă diviziunea celulară, în absenţa lor, celulele
nedivizându-se. Le găsim în cantităţi relativ mari în organele de
reproducere, în seminţe şi fructe. În 1955, la 3 luni de la izolarea
citochininei, se sintetizează benziladenina/benzilanimopurina/BA/BAP, care
va deveni cea mai eficientă şi utilizată dintre citochinine.
Citochininele native se regăsesc în multe extracte vegetale (drojdie
de bere, germeni de porumb sau lapte din nucă de cocos). Biosinteza
citochininelor se realizează în rădăcini şi embrioni și în meristeme şi se
folosesc, de regulă, în diluţii mari, suportând bine autoclavarea.
Tipuri de citochinine:
 K sau KIN(CHINETINA sau KINETINA),
 Z (ZEATINA),
 BA sau BAP (BENZILADENINA sau BENZILAMINOPURINA),
 2iP (IZOPENTENILADENINA),
 TDZ (TIDIAZURON).
Ecuaţia balaţei hormonale cunoscută astăzi și aplicată în micropropagare
este dată de relaţia:
AUXINE + CITOCHININE = BALANŢA HORMONALĂ
Modificarea balanţei hormonale în favoarea uneia sau alteia dintre
substanţe produce următoarele stări de fapt:
Concentraţii sporite de auxine ►potenţează rizogeneza.
Concentraţiile sporite de citochinine ► potenţează formarea de muguri şi
generarea de tulpiniţe.
Concentraţii sporite din ambele ►potenţează morfogeneza şi procesele de
calusare.
106
Actiunea fiziologică a citochininelor:
1. Impulsionează diviziunea celulară;
2. Stimulează formarea de muguraşi şi tulpiniţe, în funcţie de
concentraţie şi balanţă;
3. Stimulează proteosinteza (au fost găsite citochinine legate de ARN
transfer);
4. Rol în prevenţia senescenţei;
5. Efect antagonic auxinelor, anihilând dominanţa apicală a mugurelui
terminal;
6. Susţine capacitatea de supravieţuire a inoculilor;
7. Favorizează şi susţine multiplicarea celulară;
Giberelinele
Giberelinele au fost descoperite în 1926 de KUROSAWA şi izolate
abia în 1935, cea mai activă giberelină fiind la acest moment acidul giberelic
(AG3). Au o importanţă mai mică decât auxinele şi citochninele în procesele
metabolice, dar au acţiune similară cu auxinele, neexercitând vreo influenţă
asupra proceselor de elongaţie celulară ca auxinele.
Seminţele conţin cea mai mare cantitate de gibereline, cele imature
fiind cele mai bogate în fitohormoni. Folosirea giberelinelor în culturile in
vitro se face când se urmăreşte favorizarea alungirii meristemelor caulinare,
apicale şi când se fac culturi de meristeme la specii precum tomate sau
cartof. Deşi nu s-a demonstrat că absenţa giberelinelor în mediul de cultură
poate provoca deservicii, totuşi, absenţa giberelinelor în mediul de cultură
poate genera un fenomen de creştere globuloasă.
Actiunea fiziologică a giberelinelor:
1. Produc alungirea internodiilor tulpinilor şi a rahisului
inflorescenţelor;
107
 2. Ajută la înlăturarea fenomenului de nanism;
3. Rol în reglarea nivelului endogen de auxină;
4. Suprimarea latenţei la nivelul seminţelor, mugurilor sau organelor de
rezervă;
5. Acţiune complexă în anteză;
6. Rol în formarea fructelor partenocarpice;
7. Rol în germinarea seminţelor;
8. AG3 nu exercită vreo acţiune asupra rizogenezei.
Etilena
Fitohormon recent recunoscut, identificat însă încă din 1901 de
NELJUBOV, etilena este o hidrocarbură nesaturată gazoasă ce a fost greu de
identificat în celule deoarece fructele verzi au un conţinut mic de etilenă,
mai multă etilenă găsindu-se în fructele aflate în proces de maturare.
Auxinele naturale stimulează biogeneza de etilena iar la nivelul culturilor in
vitro etilena intensifică activitatea auxinelor endogene sau exogene.
Mai puţin utilizată în culturile in vitro deoarece este gazoasă, etilena
se foloseşte sub formă de acid 2-cloroetilfosfonic (ACEP). Etilena este însă
prezentă şi în recipientele de cultură şi explantele care suferă de fenomenul
de vitrificare (hiperhidrie) au o productie de etilenă care duce la lignificarea
vaselor lemnoase şi rigidizarea peretilor celulari parenchimatici.
Acţiunea fiziologică a etilenei (cercetările continuă pe acest subiect):
1. Control asupra creşterii permeabilităţii membranelor plasmatice;
2. Stimuleaza căderea frunzelor, maturarea şi căderea fructelor;
3. Influenţează deschiderea florilor, ofilirea şi decolorarea;
4. Induce senescenţa ţesuturilor;
5. Intervine în transportul auxinei;
6. Celulele supuse traumelor produc şi emană etilenă;
108
 7. Stimulează rizogeneza adventivă;
8. Inhibă creşterea în lungime a rădăcinilor;
9. Influenţează geotropismul rădăcinilor;
10. Stimulează creşterea izodiametrică a celulelor.
Acidul abscisic (ABA)
Rar utilizat, are rol de inhibare a creşterii şi prezintă, totuşi, un rol
important în viaţa cormofitelor;
Acţiunea fiziologică a acidului abscisic:
1. Produce inhibiţie asupra creşterii şi dezvoltării embrionilor,
mugurilor şi meristemelor;
2. Este implicat în procese de latenţă a organelor de rezervă, mugurilor
şi seminţelor;
3. În concentraţii scăzute, AAB inhibă efectele AIA şi ale giberelinei;
4. BIOSINTEZA AAB se află în frunze (în toate etapele dezvoltării
plantei);
5. Utilizat în mică măsură în culturile de ţesuturi.
Fig. V.2. Fitoregulatorii de creștere cu masele lor moleculare și
transformarea din mg/l în μM echivalenți și invers
Corespondența în mg/l a Corespondența în μM a
concentrației exprimată în concentrației exprimată
μM în mg/l
Fitoregulatori Masa 0,1 1,0 10,0 100,0 0,1 0,5 1,0 10,0
moleculară
ABA 264,3 0,0264 0,264 2,64 26,4 0,38 1,89 3,78 37,8
BA 225,2 0,0225 0,225 2,25 22,5 0,44 2,00 4,44 44,4
GA3 346,4 0,0346 0,346 3,46 34,6 0,29 1,44 2,89 28,9
IAA 175,2 0,0175 0,175 1,75 17,5 0,57 2,85 5,71 57,1
IBA 203,2 0,0203 0,203 2,03 20,3 0,49 2,46 4,90 49,0

109
 K-IBA 241,3 0,0241 0,241 2,41 24,1 0,41 2,07 4,14 41,4
Kin 215,2 0,0215 0,215 2,15 21,5 0,46 2,32 4,65 46,7
NAA 186,2 0,0186 0,186 1,86 18,6 0,54 2,69 5,37 53,7
TDZ 220,3 0,0220 0,220 2,20 22,0 0,45 2,27 4,54 45,4
Zea 219,2 0,0219 0,219 2,19 21,9 0,46 2,28 4,56 45,6
2,4D 221,04 0,0221 0,221 2,21 22,1 0,45 2,26 4,52 45,2

5.4. Compușii fenolici, compușii antivirali și extractele vegetale

Compușii fenolici sunt compuși toxici, eliberați în special de speciile
lemnoase aflate în condiții de stres și care prin acțiunea lor antagonică
substanțelor de creștere, inhibă reacțiile metabolice, oprind creșterea și
potențând fenomenul de dormanță indus de AAB, senescența și necroza,
ceea ce duce la periclitarea culturii.
Eliminarea lor în mediul de cultură se face atât de către celulele
agresate cât și de către explantul în general prin celulele din profunzimea sa.
Întregul proces se poate sintetiza sub forma:

Eliminarea fenolilor → oxiderea → brunifcarea mediului → necrozarea

celulelor → moartea inoculilor.

Fig. V.3. Mediu de cultură curat și mediu de cultură cu reacție fenolică

110
PREVENȚIA se realizează prin câteva tehnici recomandate, dar și aici,
cercetările continuă în funcție de specia asupra căreia se aplică
micropropagarea, a protocoalelor folosite și a tipurilor de probleme cre
survin:
 Operarea a 2-3 culturi succesive, repasări și mediu nou;
 Precultivarea meristemelor pe medii de cultura lichide, timp de 3
zile, la 15°C, lumină continuă la 500 lucsi și apoi trecere pe mediu
solid;
 Adăugarea în mediul de cultură a unor substanțe antioxidante:
cisteina, HCl, acid ascorbic, acid citric, DDT(ditiotreitol);
 Adăugarea în mediul de cultură de cărbune vegetal;
 Păstrarea în întuneric a explantelor inoculate pentru o perioadă scurtă
de timp.
Optarea pentru una sau alta din soluțiile de mai sus ține de specia în
discuție și de conținutul său în fenoli și compuși toxici, de gradul de
interacțiune al plantei la procedeele de micropropagare și de mediul folosit.
Extractele vegetale
Extractul de drojdie de bere, hidrolizatul de cazeina, sucul de
portocale, sucul de tomate, laptele din nuca de cocos, extractul de malț,
extractul de endosperm imatur de porumb etc. sunt doar câteva dintre
substanțele auxiliare care se folosesc în mai mică sau mai mare măsură în
culturile in vitro. Ele se utilizează de regulă în concentrații scazute (de 0,1-1
g.l). Există reacții necunoscute ale acestora în mediul de cultură urmare a
necunoașterii complete a compoziției chimice, astfel încât recomandările
sunt încă limitate. Cercetările continuă, însă, stimulate fiind de compoziția
ofertantă și conținutul de vitamine, aminoacizi și minerale pe care aceste
substanțe le au și care pot aduce un beneficiu de nutriție explantelor in vitro.
111
Compușii antivirali
Folosirea lor are drept scop obținerea de culturi libere de viroze.
Dintre acești compuși amintim ribavirina, DHT (2,4-dioxohexahydro -
1,2,5-triazina) care prezintă, însă, fitotoxicitate iar eficacitatea este
condiționată de tipul de virus, specia virusată și chiar de cultivar (BOXUX
1995). În acest sens, folosirea compușilor virali în compoziția mediului de
cultură în scopul limitării reacțiilor oxidative este o procedura puțin
întâlnită în practica curentă, cercetările efectuate până acum vizând specii
ca Cymbidium, Prunus sp. sau Malus sp..
Agarul
Explantele cultivate în mediul de cultură trebuie să rămănă la
suprafață, imersarea lor și lipsa oxigenului ducând la moarte alor. Astfel, un
agent de solidificare va veni să rezolve problema, dar el va trebui să
îndeplinească niște condiții de baza, cum ar fi: stabilitate termică, lichid la
temperaturi înailte și solid după aceea, la răcirea mediului. Acesta este
agarul, produs natural, polizaharid obţinut din alga roşie Gelidium amansii
care trăieşte în Oceanul Indian şi Marea Chinei. El aduce un procent
suplimentar de elemente chimice (Ca și Mn), influențând potențialul osmotic
și difuzia nutrienților în mediu și este cel mai cunoscut agent gelificator
utilizat în prepararea mediilor de cultură. Îl găsim comercializat sub diverse
forme: solzi, fibre sau pulbere. Se folosește în concentrații variabile, în
funcție de rețeta de mediu folosită, între 0,6-1% (Street, 1977).
Pe langă agar se mai întâlnesc agaroza, gelrita - o gumă gelificată
produsă de bacteria Pseudomonas elodea, care poate fi o bună alternativă la
agar datorită costurilor mult mai mici și unei stabilități enzimatice mult mai
bune, starea fizică nefiind afectată de valoarea pH-ului, așa cum se întâmplă
la agar.
112
Cărbunele activ
Are diverse recomandări de la autorii de specialitate și îl vom găsi
în mediul de cultură al speciilor lemnoase recalcitrante la micropropagare,
folosit pentru reducerea emisiei de fenoli sau în mediul de înrădăcinare, în
cazul unor culturi de apexuri și antere sau în cazul culturilor de conifere.
Concentrațiile în care este folosit variază de la 2-5%.

5.5. Prepararea mediilor de cultură şi pH-ul

Pentru evitarea erorilor de cântărire sau măsurare, mai ales în cazul
substanţelor care intră în componenţa mediilor de cultură în concentraţii de
ordinul µM sau mM, se utilizează soluţii stoc corespunzătoare fiecărei mari
grupe de substanţe.
Dintre acestea, enumerăm: soluţie stoc de macroelemente; soluţie
stoc de microelemente; soluţie stoc de chelat de fier; soluţie stoc de
vitamine; soluţie stoc de aminoacizi şi soluţie stoc de hormoni.
Concentrația unei substanțe poate să fie exprimată în diverse moduri.
Prezentăm în continuare câteva modalități întâlnite în literatura de
specialitate pentru a indica diferite concentrații ale culturilor de celule.
- Concentrația exprimată în volume procentuale (v/v). Această
exprimare este utilizată frecvent pentru laptele de cocos, sucul de roșii și
sucul de portocale. De exemplu, pentru a prepara 100ml lapte de cocos 5%
concentrație, peste 5ml de lapte de cocos se adaugă 95ml apă distilaă, astfel
încât volumul final al soluției să fie 100ml.
- Concentrația exprimată în procente de masă (m/v). Această
exprimare este utilizată pentru exprimarea concentrației de agar și de zahăr.
De exemplu, pentru prepararea unei soluții de agar de 1% (m/v) trebuie să
dizolvăm 10g agar la 1l de mediu nutritiv.
113
 - Concentrația exprimată în moli. Un mol corespunde unei cantităţi
de substanţă, numeric egală cu masa moleculară a acesteia exprimată în
grame. O soluție 1M indică că 1 mol din substanță este dizolvat într-un litru
și soluția 0,01M indică faptul că 0,01 din masa moleculară este dizolvată
într-un litru. Exprimarea în moli este specifică în mod particular
fitoregulatorilor. Concentrația molară este utilizată pentru a compara cu
precizie reactivitatea relativă a diverșilor compuși. De exemplu, o
concentrație micromolară (1μM) de IAA trebuie să conțină același număr de
molecule cu o concentrație de 1μM de chinetină, acest lucru neputând fi
făcut pentru unități de măsură bazate pe masă.
- Concentrație exprimată în miligram per litru (mg/l). 1 mg/l
semnifică cantitatea de substanță de 1 mg dorită în volumul final al soluției
de 1 litru. 1 mg = 10-3g. Acest tip de exprimare se întâlnește de regulă la
fitoregulatori și macroelemente.
- Concentrație exprimată în microgram per litru (μg/l). Această
exprimare se folosește pentru microelemente și chiar pentru fitoregulatori.
Semnifică o cantitate de 1 μg de substanță într-un litri de soluție. 1 μg =
0,001 mg (10-3mg) = 0,000001 (10-6g)
- Concentrație exprimată în părți per milion (ppm). Uneori,
constituenții mediilor de cultură pot fi exprimați în ppm, adică o parte
dizolvată într-un milion de părți, ca de exemplu 1 mg/l
În condiţiile în care concentraţia normală se notază cu X, soluţiile
stoc pot avea concentraţii de 10 ori mai mari (10X), de 100 de ori mai mari
(100X) sau de 1.000X. Cu cât cantitatea de substanţă dintr-o soluţie este mai
mică, de ordinul µgram/l, cu atât soluţia stoc va fi mai concentrată. Dacă în
mediul de cultură Murashige&Skoog, KNO3 are concentraţia de 1.900 mg/l,

114
soluţia stoc de macroelemente pentru mediul MS de 10X va avea o
concentraţie KNO3 de 19.000 mg/l.
Soluţiile stoc sunt specifice pentru fiecare mediu de cultură iar
soluţia stoc de macroelemente are, de regulă, concentraţia de 10X, cea de
microelemente de 1.000X iar vitaminele 100 X.
Pentru calculul volumului de soluţie stoc se foloseşte următoarea
formulă:

Y ml soluţie stoc = Volumul de mediu (ml) x Concentraţia cerută

C soluţiei stoc (g/l)
În funcție de specificul laboratorului și diferitele tipuri de medii pe
care le preparăm, acestea pot avea
 concentrații NORMALE de săruri notate cu X;
 pot fi dublu concentrate – notate cu 2X;
 sau pot avea concentrația de săruri redusă la jumătate, caz în care se
notează cu X/2.
Pentru ușurarea muncii în laborator, pentru fiecare tip de mediu de
cultură se întocmește o schemă de preparare a acestuia în care se calculează
la început toate componentele mediului, urmând ca la fiecare preparare să se
urmărească doar tipul soluției stoc și cantitatea finală din aceasta.
Pentru ușurarea preparării soluțiilor stoc, în condițiile în care în
laborator se folosesc mai multe medii de cultură și există implicit mai multe
soluții stoc (macro, micro și vitamine), se prepară și o soluție mamă a unei
anumite substanțe, din care se vor lua cantitățile necesare pentru soluția stoc
propriu zisă.
Soluția mamă se realizează prin cântărirea pentru fiecare sare a unei
cantități constante (de regula 100g pentru macroelemente și 10g pentru
115
microelemente) care se dizolvă într-un volum cunoscut de soluție (de regulă
1l), ajungându-se la concentrații de 100g/l, respectiv 10g/l.
Pentru a prepara soluția stoc propriu zisă de 1000X, 100X sau 10X,
se diluează un anumit volum din fiecare soluție mamă în funcție de sărurile
care intră în compoziția soluției stoc respective.
Formula folosită pentru calculul soluției mamă este:
Z ml soluţie mamă = Volumul soluţiei (mg/l) x Concentrația soluţiei stoc
C soluţiei mamă (g/l)
Prin folosirea celor două tipuri de soluții se ușurează munca de
preparare a mediului de cultură și se evită pe cât posibil erorile care pot
apărea. În practica curentă se pot folosi și medii de cultură gata preparate,
care se pot achiziționa de la firme de profil, dar care au costuri substanțial
ridicate.
La prepararea soluțiilor stoc pot apărea precipitați insolubili care au
drept cauză adăugarea incorectă în soluții a sărurilor de Ca.
Alături de soluțiile stoc de macro și micro elemente, un compus de
bază al mediului de cultură este Chelatul de fier.
Exemplu de calcul
Pentru a determina câte grame per litru (g/l) sunt necesare pentru o
soluție cu concentrație 1M este nevoie de o verificare prealabilă a substanței
cerute, în acest exemplu având chinetina. Masa moleculară a chinetinei este
215,2, a.î. o soluție 1M va fio soluție care va avea concentrația de 215,2 g/l.
Utilizand factorii de conversie și eliminând valorile egale nu putem avea
nicio eroare.
o soluție 1M = 1mol X 215,2 g = 215,2 g/l
1 litru 1 mol

116
 SCHEMA DE PREPARARE A MEDIULUI DE CULTURĂ

Substrat (sigla) ...............preparat în data .....................pentru faza ............................................

specia……………………………………ml de substrat......................................................................
necesari……………………………recipiente ...................................................................................

ml/recipient…………pH măsurat…………pH dorit………….pH corectat cu ...................................

Conc. Cant. totala

Componente dorită Conc. sol. stoc ml(g) pt 100ml ml(g)

Săruri minerale

MACRO

MICRO

CHELAT DE FIER

Vitamine/aminoacizi

AMESTEC-

INOZITOL

Altele

Gibereline
GA-3

ALTELE

Auxine

ANA; AIA; IBA

ALTELE

Citochinine

BENZILADENINĂ (BAP)

ALTELE

Diverse

Zaharuri

ZAHAROZĂ

ALTELE

Subst gelifiante

AGAR

ALTELE

117
Pentru a fi accesibil plantelor, Fe trebuie să fie legat de un agent de
chelatare, care în cazul culturilor in vitro este Na2EDTA, sarea disodică a
acidului etilen-diamiono-tetra-acetic (C10H14N2O8Na2.2H2O). Ca sursa de
Fe, se folosește sulfatul feros cu 7 molecule de H2O, FeSO4.2H2O.
Raportul dintre sulfatul feros și agentul de chelatare trebuie să fie de 1:2.
O altă componentă de bază sunt vitaminele, ale căror soluții stoc au
concentrații cuprinse între 100 - 1.000X. Diverși autori de medii de cultură
au propus rețete proprii care însoțesc mediul respectiv.
Substanțele care determină sensul evoluției explantelor și anume,
cele fitoregulatoare, se găsesc și ele sub formă de soluții stoc în diferite
concentrații care se diluează în momentul folosirii până la concentrația
dorită. Solvenții folosiți se regăsesc de cele mai multe ori alături de rețetele
de preparare a soluțiilor care în final, în mediul de cultură, au concentrații
cuprinse între 0,1 – 10mg/l.
Ph-ul și precipitarea mediilor de cultură
Mediul de cultură necesită un pH prietenos dezvoltării vieții și
derulării proceselor metabolice modificate din interiorul vaselor de cultură.
Determinarea pH-ului mediului de cultură se face înainte de a se adauga
substanțele solide, prin măsurarea cu pH-metrul calibrat corespunzător. De
obicei, valorile pe care mediul de cultură le are se încadrează între 5,5 – 5,8,
excepție făcând recomandările speciale pentru alte valori – cum ar fi
organogeneza care cere un pH de 7 pentru inducerea mai bună a mugurilor
adventivi - și lucrările de cercetare. Pentru reglarea pH-ului, se folosește fie
NaOH 0,1 N și se adaugă picături de substanță în mediul aflat pe o plită cu
agitator magnetic până se atinge valoarea dorită, fie HCl în condițiile în care
din anumite considerente pH-ul are valori prea mari și trebuie redus.

118
Plantă de mușcată cultivată în mediu lichid cu aspecte de vitrificare
Sursa: P.C. Debergh și R.H. Zimmerman (ed.), Micropropagation, 45-
69@1991, Kluver Academic Publishers

Există situația în care mediul precipită urmare a ionilor bivalenți de Fe care

precipită și oxidează în Fe trivalent, precipitat sub forma de ion fosfat feric.
Apare, astfel, turbiditatea și pH-ul scade cu 0,2 – 0,5 unități. Corecțiile se
fac cu citrat de Na (variația este limitată la 0.15 unități pH), dar pe acest
subiect, cercetările continuă.
Importanța unui pH corect stabilit este dată de faptul că el
influențează gradul de solidificare al mediului și gradul de absorbție a
elementelor nutritive și/sau hormoni.
Odată ce pH-ul a fost corectat și adus la valorile necesare, se adaugă
restul de substanțe, agarul și zaharoza și se încălzește până acestea se
dizolvă complet. Tehnologia de preparare se evidenţiază în cadrul lucrărilor
practice din programa analitică a Facultății de Horticultură.

5.6. Problemele și infecțiile mediilor de cultură

Folosirea substanțelor termolabile în compoziția mediului de cultură,
a căror sterilizare nu se poate face prin autoclavare, este posibilă prin
adăugarea acestora în mediu ulterior autoclavării, în momentul în care
temperatura mediului ajunge la o valoare de 35-37°C.
În cadrul procesului de producere a mediului de cultură pot surveni o
serie de probleme care pot periclita atât lotul de mediu necesar inoculării sau
altei faze din micropropagare, cât și întreaga cultură ulterioară.
Precipitatele insolubile

119
 Nerespectarea ordinii la amestecare a unor compuşi duce la formarea
fosfaţilor insolubili. Frecvent, sărurile cu calciu se dizolvă şi se folosesc
pentru prepararea soluţiilor stoc de macroelemente separat de alte săruri şi se
adaugă doar în momentul preparării mediului deoarece la un pH mediu de
5,6 acestea precipită. Pentru reducerea riscului precipitării se mai recomandă
să se folosească soluţii stoc de macroelemente mai diluate (10X).
Infecțiile
Infecțiile sunt cele mai periculoase evenimente care pot să apară și,
în funcție de momentul apariței lor, putem identifica cel puțin o cauză
primară care a dus la acest eveniment în scopul reglementării problemelor.
Sursele infecțiilor pot fi soluțiile stoc învechite, vasele de cultură
nespălate și nedezinfectate corespunzător, autoclavarea necorespunzătoare,
lipsa curățeniei în camera de preparare a mediului ș.a.m.d.
Categorii de infecții/probleme din mediile de cultură:
1. origine micotică: fructificații de diferite culori (negru –
Aspergillus sp., verde-albastru – Penicillium sp.)

Fig. V.4. Plantă de mușcată

cultivată în mediu lichid cu
aspecte de vitrificare
Sursa: P.C. Debergh și R.H.
Zimmerman (ed.),
Micropropagation, 45-69@1991,
Kluver Academic Publishers

120
 2. origine bacteriană: în mediu și la suprafața lui, în zona de contact
cu planta, se formează un halou translucid, de culoare alb gălbuie;
3. brunificarea mediului: provocat de oxidarea fenolilor emişi de
plantă sau a altor substanțe toxice eliminate de specie;
4. vitrificarea/sticlozitatea: proces ce se produce în recipientele de
cultură, relativ controversat și încă în studiu;
5. deshidratarea mediului: arată o umiditate necorespunzătoare în
recipientul de cultură.

Fig. V.4. Cultură

contaminată cu Cornell
Fungi.
Sursa:
<http://www.flickr.com/ph
otos/7950949@N05/favori
tes/page4/
?view=lg>.

Fig.V.5. Cultură in vitro cu

infecție cu tulpină de
Penicillium

121
Nesolidificarea mediului după răcire este o altă problemă care poate apărea
în procesul de producție. Dintre cauzele care ar putea genera această
problemă enumerăm: prea puțin agar (sub 5-6g/l), un pH prea mic (sub 5,5)
sau o temperatură de autoclavare prea mare. Se menționează că un mediul
odată autoclavat, care la răcire prezintă defecte, este puțin probabil să poată
fi refolosit și nu se recomandă re-autoclavarea, deoarece compuși chimici
care intră în compoziția sa devin instabili.

122
 Cap.VI. FAZELE PROPAGĂRII IN VITRO

6.1. Etapa 0: Pregătirea materialului vegetal în vederea prelevării explantului

Etapele micropropagării au fost sistematizate în cinci faze, după alţi
autori ar exista patru, dar toţi au căzut de acord asupra conţinutului acestora.
Acestea sunt: pregătirea materialului vegetal, iniţierea şi stabilizarea culturii,
multiplicarea culturii, înrădăcinarea şi aclimatizarea. În plus, înainte de orice
activitate de laborator se execută o etapă pregătitoare, o etapa documentară,
care se dovedește a fi crucială pentru desfăşurarea cu succes a întregului
proces.

Se va consulta literatura de specialitate, se vor face cercetări asupra

materialului vegetal care se supune procesului de micropropagare, se
răspunde la o serie de întrebări referitoare la tipul de cultură dorit, natura,
mărimea şi numărul de inoculi, natura şi proveniența explantului, gradul de
123
dezvoltare al plantei mamă, fenofaza, condiţiile de creştere, mediul de
cultură ales şi compoziţia acestuia precum şi variaţiile la care va fi supus.
Se execută o serie de activități standard de laborator privind
necesarul de lucru, tipul de instrumentar necesar procedurii ce urmează a se
desfășura în etape repetitive. În urma documentării şi a stabilirii protocolului
de lucru, se statuează regimul culturii, parametrii factorilor reglabili ca
temperatura, umiditatea şi lumina – fotoperioadă, precum şi particularităţile
tehnice ale întregului proces.
Morfologia explantului
Pregătirea materialului vegetal pentru prelevare şi inoculare
presupune analiza morfologiei lui, confirmarea faptului că explantul este
viu, că nu este necrozat, că nu suferă modificări de ţesut sau ţesuturi
mecanice distruse. De asemenea, ideal este să prezinte zone cu ţesut
meristematic bogat.
În scopul realizării unei fişe tehnice complete, se vor nota:
 Originea explantelor, specia, varietatea, clona sau linia;
 Determinarea ecologică a provenienţei plantei donor: câmp deschis,
sere, solarii, camere de creştere, depozite sau culturi primare;
 Expoziţia pe planta donor a segmentului folosit;
Studiile efectuate în scurta istorie a acestei tinere ramuri a biotehnologiilor
sunt în măsură să ofere deja direcţii clare în ceea ce privește evaluarea
explantelor:
 Se recomandă ca explantele să fie recoltate din porţiunile tinere ale
plantei donor;
 Se consideră că plantele din spațiile închise au şanse de infestare mai
mică;

124
  Se consideră că există o corelare între localizarea explantului pe
planta mamă şi contaminarea cu germeni dăunători (distanța faţă de
sistemul radicular), ştiindu-se deja că zonele cele mai expuse
agenţilor patogeni sunt rădăcinile. De asemenea, cea mai ridicată
capacitate regenerativă ştim la această dată că o au cotiledoanele,
hipocotilele şi muguraşii.
Variabilitatea de reacţie
În funcţie de biotipurile unei specii, de soiurile alese sau de varietăţi
precum şi în funcţie de de originea sa biologică (morfologică, funcţională
sau de fenofază şi sezon), explantul poate manifesta o mare variabilitate de
reacţie în micropropagare. Tipurile de reacții pe care le întâlnim provin din
considerente morfofuncţionale ca:
 Zona de prelevare: vârful, mijlocul sau baza ramurii;
 Ramură umbrită sau nu, solarizată sau nu;
 La plante lemnoase: zonele mai apropiate de polul radicular
sunt cele mai bine aprovizionate cu apă, hrană şi hormoni;
 Prezenţa meristemelor: vârfuri, rădăcini, noduri, bractee,
inflorescenţe sau apexuri.

Fig.VI.2. Tipuri de explant.

Sursa:
Central University of Gujarat,
Surya Pratap Singh

125
De asemenea, atunci când se prelevează segmente de plante sau organe ce
vor fi supuse micropropagării, se va ţine cont - şi se menționează ca aspect
important privind condiţionarea fiziologică a segmentului - şi condiţiile
ecologice, acestea având un rol important în aspectul variabilității.
Totipotența celulară
Principiul care stă la baza micropropagării se numeşte totipotența
celulară şi reprezintă capacitatea fiecărei celule vegetale de a se reproduce
identic în forma iniţială a celulei care a generat-o, principiu care dă
posibilitatea multiplicării plantelor din varii tipuri de segmente, organe sau
ţesuturi. Teoretic, toate celulele vii ale plantei sunt totipotente dar aceasta
vine şi cu prețul unei variabilităţi genetice uluitoare.
Sintetizând principiile care stau la baza micropropagării, putem
spune că natura ţesuturilor componente reprezintă suma variabilităţilor
structurale şi funcţionale uriaşe pe care le posedă planta şi care se manifestă
prin principiul totipotenței celulare. Acesta permite manifestarea regenerării
la nivelul inoculilor şi, în final, diferenţierea celulară.
Vârsta plantei donor sau a organului din care se prelevează
Reprezintă un aspect important în faza de documentare şi pregătire a
materialului de inoculat iar riscul prelevării din plante bătrâne este prezent
sub forma infecţiilor şi virozelor mult mai agresive. În condiţiile în care
avem de-a-face cu o plantă donor bătrână, există procedee care ajută la
prelevarea de organe din planta respectivă, stimulând metabolismul:
 Tratamente termice;
 Stimularea drajonării (juvenilizarea);
 Regulatori de creştere;
 Regim special de iluminare;
 Culturi de plantă mamă în regim de termoterapie;
126
Momentul recoltării
Este crucial şi limitat, chiar la o unică fenofază. Recoltarea de
material destinat micropropagării se poate face:
 În cursul germinaţiei seminţelor;
 Într-un anumit moment din formarea celulelor generative la nivelul
inflorescenţei;
 Punctual, la un moment dat în timpul creşterii frunzelor, fructelor
sau seminţelor;
 În perioada de latenţă a mugurilor;
Recolatarea explantelor ar trebui să se facă conform recomandărilor
manualelor de specialitate, cu respectarea condiţiilor menţionate pentru
specia, genul, familia sau cultivarul respectiv, deoarece în funcţie de sezon,
există o serie de factori care intervin şi modifică starea biologică şi
echilibrul fiziologic al explantului.
Plantele lemnoase din climatul temperat pun probleme mari în ceea
ce priveşte perioada de recoltare a materialului vegetal pentru inoculare,
reuşita acestei operaţiuni depinzând de sezon, momentul recoltării şi
condiţiile pedoclimatice.
Mărimea explantului
Dimensiunea explantului la recoltare se cere a fi minimă, la limită,
dar să se asigure totipotența celulară. Ea este standardizată pentru fiecare
specie sau soi, în funcţie de natura explantului, fenofaza plantei donor sau a
organului din care se prelevează.
Prelevarea explantului în bune condiţii şi îndeplinind parametri de
calitate se face şi în baza unor cunoştinţe temeinice de anatomie vegetală
precum şi urmare a cunoaşterii amplasării ţesuturilor care se vor preleva,
adică a structurii botanice a speciei.
127
 La nivel industrial, acolo unde volumul de activitate este foarte mare,
se preferă să se lucreze cu apexuri şi meristeme apicale datorită faptului că
aceste două categorii prezintă rata cea mai mare de propagare, cu cele mai
mari creşteri sau cele mai mici şanse de infectare datorită prezenţei
meristemelor.
Un explant de dimensiuni mari înseamnă şi pericolul de infecţie mai
mare dar şi o deshidratarea accentuată, în ciuda avantajului că promite o
regenerare mai rapidă în mediul de cultură.
Pe de altă parte, atunci când se prelevează explantul, se ţine cont de
faptul că o suprafață de contact mai mare cu mediul de cultură înseamnă o
mai bună asigurare a schimburilor gazoase, o mai bună absorbţie a hranei şi
a apei.
Sterilizarea materialului vegetal
Este principala activitate a etapei 0 din micropropagare şi reprezintă
cheia unei inoculări corecte şi a evoluţiei satisfăcătoare a unei culturi, fiind
realizată cu scopul de a elibera ţesutul ce urmează a fi micropropagat de
agenţii patogeni. Succesul asepsizării depinde de foarte mulţi factori, dintre
care amintim:
 selectarea corectă a metodei de asepsizare, în funcţie de explant, de
tipul de ţesut cu care se lucrează şi toate celelalte aspecte listate în
capitolul anterior;
 substanţele alese pentru sterilizare, ţinând cont că sunt ţesuturi
fragile, foarte tinere sau, din contră, lemnoase, greu de sterilizat; se
folosesc agenţi chimici, în diferite concentraţii în funcţie de natura
explantului, de tipul lui.
 concentraţia acestora în raport cu timpul de expunere la substanţa
activă şi clătirile ulterioare;
128
  durata de timp alocată asepsizării.
De asemenea, se va ține cont de FACTORII care influenţează tipul
de asepsizare și care au fost discutați până acum: specia; condiţiile
ecologice; organul; ţesutul; poziţia în plantă; vârsta și fenofaza plantei în
momentul recoltării țesutului vegetal ce urmează a intra în laborator.
Sterilizarea materialului vegetal trebuie să fie suficient de puternică
pentru a elimina bacterile sau microorganismele pe care le posedă explantul,
nivelul de toxicitatea nu trebuie să distrugă însă țesuturile explantului sau să
producă necroze, deoarece asigurarea hranei va fi întreruptă în aceste cazuri
și decesul explantului este garantat.
Îndepărtarea dezinfectantului trebuie să se facă cu ușurință, să poată
fi curățat complet de pe țesut, asigurând astfel o rată mare de succes la
iniţierea culturii. În condiţiile în care procesul de sterilizare nu a fost
efectuat corespunzător se poate întâmpla situaţia ca la a doua sau a treia
repasare să apară infecţii. Considerate latente, ele sunt generate de
micoplasme, de fungi aflaţi înţesuturile profunde ale organelor, de bacterii
sau chiar virusuri şi aduc pagube mari lotului micropropagat.
Tipuri de dezinfectanţi agreaţi şi testaţi deja în laboratoarele de
micropropagare sunt alcoolul, hipoclorit sodiu, hipoclorit de calciu, apa
oxigenată, apa bromată, azotat de argint, clorura mercurică şi antibioticele.
Ele se folosesc în funcţie de recomandările literaturii de specialitate şi de
scopul propus.
Sterilizarea materialului biologic se face la hotă, în mediu complet
steril, conform procedurilor stabilite inţial. Îndepărtarea agentului sterilazant
se va face tot la hotă, alături de toate celelalte operaţiuni. Se reţine că
păstrarea materialului, a explantului, în stare submersa mai mult timp decât

129
este recomandat de literatura de specialitate produce prin anaerobioză
necrozarea ţesuturilor şi moartea materialului vegetal.

6.2. Etapa1: Inițierea şi stabilizarea culturii

Inocularea presupune introducerea explantului sterilizat, aseptic, în
medii de cultură sterile preparate anterior și presupune două subfaze:
sterilizarea materialului şi inocularea materialului.
Procedurile şi tehnicile de lucru necesare parcurgerii acestei etape
sunt standardizate internaţional şi specifice în acelaşi timp fiecărui laborator
în parte, în funcţie de regimul de lucru al laboratorului, de volum şi de
încadrarea sa ca în zona didactică sau ştiinţifică. Se va ţine cont de
protocolul de lucru la hotă şi protocolul de lucru în spaţile aseptice, de
procedurile care trebuiesc urmărite atunci când operatorul se află în lucru la
hotă, asigurându-se că flxul operaţiunilor se desfăşoară constant, ritmic,
ordonat, fără sincope.
Etape
Manipularea explantului se face cu grijă, cu instrumentar sterilizat şi
RĂCIT în prealabil. Indiferent de cultura urmarită sau de mediul folosit (ne
referim la cel solid acum), la inocularea in vitro a explantelor se va respecta
polaritatea: polul caulinar plasându-se în afara mediului. Plasând explantul
orizontal sau uşor oblic (la inoculi meristematici – apicali sau axilari- se va
căuta a se pune în contact mediul cu suprafaţa secţionată) suprafaţa de
contact va fi mai mare şi se va asigura astfel o rată de absorbţie a hranei mai
bună.
Explantul se introduce uşor în mediul de cultură, cât să prezinte
stabilitate şi să nu se răstoarne la următoarele manipulări efectuate în

130
decursul procedurii. Recipientele se etanşeizează, se etichetează şi se trimit
în camera de creştere.

Fig. VI.3. Eprubete înclinate Fig.VI.4. Eprubete de cultură

Sursa:http://www.recorder.co Sursa:
m/lifetimes/15018628- aedanqjanelles.blogspot.com/201
95/test-tube 1/09/plant-tissue-culture.html

Stabilizarea
Literatura de specialitate cunoaşte deja detalii amănunţite privind
culturile in vitro la o serie întreagă de specii horticole sau dendrologice,
tatonările şi experienţele dezvoltate arătând cum perioadă de incubare şi
creştere variază în funcţie de tipul culturii, specia şi natura explantului
folosit, condiţiile din camera de creştere şi protocolul folosit.
131
 În această etapă a micropropagării, explantul se află în spaţiul
camerei de creştere, cu factori de mediu controlaţi şi îşi acomodează
procesele metabolice conform compoziţiei mediului de cultură în care a fost
inoculat.
Creşterile survenite în această etapă se raportează la mediul de
cultură folosit şi la tipul de cultură iniţiată, fiind urmărite calitatea
materialului vegetal, starea de turgescenţă, starea de sănătate precum şi
gradul de evoluţie. Creşterile sunt gestionate şi influenţate de balanţa
hormonală astfel încât, pentru culturile de calus, spre exemplu, se vor folosi
auxine şi citochinine în concentraţii mai ridicate, pentru lăstarii adventivi,
procent mai ridicat de citochinine iar pentru lăstarii laterali, citochinine în
cantitate mai mică sau deloc, în funcţie de natura explantului.
În același timp, aceasta este perioada în care infecţiile apar în
condiţiile unei dezinfecţii necorespunzătoare sau a unui mediu de lucru
septic. Indiferent de tipul de cultură inițiat, se estimează că avem o
stabilizare a culturilor în primele 14 zile de la inoculare, după această dată,
infecţiile care survin sunt puse pe seama infecţiilor latente, a virusurilor în
mod special. Categoriile de infecţii şi alte probleme ce pot să apară în
mediul de cultură sunt:
 infecţii de origine micotică, origine bacteriană;
 brunificarea mediului;
 vitrificarea/sticlozitatea;
 deshidratarea mediului.
Etapa de stabilizare a culturiii in vitro presupune şi evidenţierea
tuturor factorilor de mediu care intervin, a modificărilor de stare in vivo sau
ex vivo faţă de arealul de cultură şi se recomandă a se efectua notări zilnice

132
în ceea ce priveşte evenimentele care survin asupra culturii în sine, în scopul
evidenţierii succesului sau eşecului inițierii şi validităţii protocolului de
lucru, mai ales atunci când vorbim de un laborator de cercetare.
Particularități
În studile efectuate asupra plantelor s-a evidenţiat că explantele
generate din plante ierboase generează primele manifestări vegetative la 14
zile maxim de la inoculare, faţă de explantele provenind de la plantele
lemnoase care manifestă vegetativ la 40-60 de zile.

6.4. Etapa 2: Multiplicarea

Denumită şi subcultivare sau repicare, reprezintătransferul sau
pasarea inoculilor pe medii proaspete sau alte medii, cu compoziţie diferită
(prezintă în reţeta de cultură hormoni), prin realizarea de subculturi. Este
considerată o operaţiune indispensabilăîn toate ramurile biotehnologiei.
În general, schema de evoluţie a explantelor în funcţie de culturăşi
tipul de mediu este:

Meristemele apicale şi apexurile caulinare → tulpiniţe cu rădăcinuţe →

vitroplantule (similar înmulţire vegetativăbutaşi);
Nod, internod şi alte segmente de organe → muguraşi → tulpiniţe;

În industria micropropagării se foloseşte termenul de coeficient de

multiplicare şi reprezintă raportul dintre numărul lăstarilor puşi la
multiplicare şi numărul final al lăstarilor obţinuţi până la finalul etapei şi
este strâns legat de tipul mediului de culturăşi de condiţiile de mediu.

133
 Subculturile se realizează prin: despărţirea culturii generale,
transformarea tulpiniţelorîn noi inoculi prin microsecţionare sau separarea
glomerulelor cum se produce la orhidee.
Multiplicare clonalăpresupunedetaşarea materialului biologic din
cultura iniţialăşi multiplicarea lui de câte ori este nevoie, pe medii cu aport
de citochinine.
Culturile de calus se repică periodic, fragmentate, pe medii proaspete
cu adaus de auxine.
La culturile de rădăcini multiplicarea se operează periodic,
obligatoriu prin tăieri în masa radicularăși transferarea apexurilor pe medii
lichide, în caz contrar, cultura moare.
Un eveniment nedorit care poate aparea in aceasta etapa a culturilor
in vitor este senescenta culturii, îmbătrânirea şi epuizarea ei.Are diverse
cauze printre care amintim carenţe provenite din hrănirea neadecvată a
celulelor din mediul de cultură, epuizarea proprietăţilor mediilor de cultură
sau chiar toxicizarea mediului de cultură.
Unul din criteriile care poate aduce un aport considerabil de reuşita
culturii in vitro este momentul optim de repasare. MOMENTUL
multiplicării se va alege înfuncţie de scopul culturii, de natura şi tipul
culturii şi de particularităţile de reacţie a explantelor aflate în recipientele de
cultură, literatura recomandând pentru câteva specii timpii optimi pentru a se
determina acest moment. Pentru a recunoaşte o cultură care necesită
repasare, trebuie să fim atenţi şi să urmărim modificările de stare survenite
în cultură:
 calusul devine brun, cenuşiu sau se usucă;
 frunzuliţele bazale se îngălbenesc;
 creşte gradul de vâscozitate al suspensiilor celulare.
134
6.5. Etapa 3: Înrădăcinarea
Reprezintă etapa de pregătire a materialului vegetal pentru trecerea
in vivo, în spaţii protejate întâi şi apoi în câmp prin stimularea apariţiei
sistemului radicular. Plantele rezultate din tehnicile de multiplicare in vitro
au rădăcinuţele glabre, fără perişori absorbanţi, ceea ce va face dificilă
următoarea etapă, aclimatizarea. Scopul acestei etape este de a forma
rădăcini cât mai sănătoase şi multe, pentru a permite creşterea rezistenţei
plantei la aclimatizare.
Mediul de înrădăcinare folosit are auxine în concentraţii mari şi
gibereline, adaos de cărbune vegetal şi zaharoză în concentraţie redusă.
Acest mediu permite limitarea lăstăririi axilare, stimularea alungirii lăstarilor
şi, cel mai important, inducerea rizogenezei şi formarea rădăcinilor.
Aspectul cel mai important este cel al caracterului rădăcinilor, care
fiind foarte slab dezvoltate pun probleme mari de adaptabilitate. Şi, odată ce
planta este scoasă din mediul său de cultură, procesele metabolice se
modifică, iar administrarea hranei plantei va trece în atribuţiile sistemul
radicular.
Din aceste considerente se urmăreşte cuplarea etapei de înrădăcinare
cu aclimatizare, mai ales la speciile recunoscute ca fiind tolerante la
înrădăcinare (portaltoii de măr, GF 677 sau gutuiul Colt). PROBELEMELE
ce pot să apară la înrădăcinare sunt generate de mediul cu auxine care poate
produce inhibiţia plantelor şi regresul evoluţiei acestora. Ca metodă de
limitare a inhibiţiei, se temperează această tendinţă printr-un
tratamentinductiv cu auxine cencentrate şiabia apoi se trece la introducerea
în mediul de înrădăcinare.

135
6.6. Etapa 4: Aclimatizarea
Considerată una din cele mai dificile sau critice etape din
micropropagare, aclimatizarea este ultima fază a micropropagării şi constă
în pregătirea plantelor pentru mediul ex vivo.
Ca procedură, manualele de specialitate recomandă plasarea
lăstarilor înrădăcinaţi în substraturi, depozitarea lor în spaţii cu umidiate
ridicată şi factori de mediu strict controlaţi (în special temperatura),
fortificarea lor şi creşterea în câmp pentru câteva luni pentru ca, în final, să
se ajungă la livrarea materialului săditor.
Etapa este critică şi durează aproximativ douăsăptămâni şi poate
prezenta cazuri de eşec în aclimatizare, mai ales urmare a nespălării
corespunzatoare a agarului de pe rădăcini, substanţă care, odată rămasă pe
rădăcini, va constitui principala sursă de infecţii şi bacterioze. Acestea vor
debilita tânara plantă, până la eliminare. De asemenea, ghivecele şi
containerele în care se mută noile plante vor trebui sterilizate, pentru a limita
posibilităţile de infectare. În aceste condiţii, se factratamente cu fungicide,
se foloseşte ceaţa artificială pentru a ridica umiditatea mediului iar substratul
care se foloseşte pentru ghivece necesită şi el calităţi multiple: să fie uşor,
poros, să reţină apa, să permită distribuţia rădăcinilor rapid, să nu se taseze
şamd.
Există situaţii întâlnite la unele specii, când plantele scoase din faza
de înrădăcinare intră în repaus, caz în care se face tratament cu gibereline
200ppm, pentru scoaterea acestora din repaus.
Concluzionând, pentru această etapă sereţine că problema majoră este
deshidratarea plantelor şi uscarea lor, problemă care se gestionează în
condiţii de spaţii controlate, cu instalaţii necesare modificării condiţiilor
climatice.
136
 METODE DE PROPAGARE IN VITRO A CULTURILOR DE CELULE ŞI
ŢESUTURI VEGETALE

7.2 Organogeneza

Organogeneza reprezintăcapacitatea ţesuturilor vegetale de a forma

organe de novo, bazată pe înşuşirea celulelor somatice specializate de a
dediferenţiaşia se reîntoarce la stadiul de celule meristematice, capabile de
diviziune activăşi cu generare de primordii de organe, lăstari, frunze, flori
sau părţi florale.
Ea se împarte în:
 Organogeneza directă/adventivă sau cultura de muguri adventivi;
Primordiile se dezvoltă direct din meristemoizii derivaţi direct din
explantul iniţial.
 Organogeneza indirectă, sau regenerarea plantelor prin intermedul
calusului;
Celulele explantului iniţial se divid şi generează ţesut calusal, în
care apar meristemoizii, din care, ulterior dau rădăcini adventive.
În practica micropropagării, un loc aparte îl au meristemoizii, celule
cu caracteristici meristematice rezultate în urma diviziunii celulare repetate,
cu plasticitate morfogenetică mare, fapt ce le conferă posibilitatea de a
forma diferite primordii de organe în condiţiile unor factori climatici diferitţi
şi pe diferite medii de cultură.
Schematic, evoluţia plantei prin dediferenţierea meristemoizilor se
poate lista:
Explant iniţial ► meristemoid ► primordii de organe
(organogeneză directă)
137
Explant iniţial ► calus ► meristemoid ► primordii de organe
(organogeneză indirectă)
ORGANOGENEZA DIRECTĂ
Foloseşte diverse organe din plantele selecţionate, de la frunze la
peţiol, hipocotil sau epicotil, în funcţie de ce anume oferă specia, oferind
avantajul economic al folosirii oricărui tip de porţiune vegetală.
Literatura de specialitate lansează ipoteza a trei faze în cadrul
organogenezei directe, şi anume: dediferenţierea celulară, diviziunea
celulară şi dediferenţierea primordiilor şi formarea cu definitivare a
organelor. În ciuda avantajelor economice, organogeneza are încă nişte
limitări care ţin de instabilitatea culturii. Deşi se recomandă a se folosi
material deja multiplicat in vitro pentru iniţierea acestui tip de cultură, totuşi,
riscul apariţiei anomaliilor genetice este mare.
Factorii care influenţează cultura sunt de mai multe categorii:
 Faza de vegetaţie în care se află planta donatoare şi mărimea ei,
plantele tinere, din primii ani de viaţă fiind cele mai recomandate;
 Dimensiunea explantului se recomandă a fi cât mai mare pentru ca
rata de supravieţuire în etapele micropropagării să fie cât mai bună;
 Din perspectiva procedurii, pH-ul mediului de cultură trebuie să se
situeze în jurul valorii de 7 (faţă de celelalte culturi, unde se
recomandă a fi în jurul valorii 5,5), compoziţia mediului este, de
asemenea, importantă, luminaprin lipsa ei pare că favorizează
organogeneza (se recomandă tratamente cu întuneric imediat după
inoculare timp de 7-10 zile)
Metodă folosită în micropropagare, necunoscută pe deplin,
organogeneza directă nu se foloseşte la scară largă datorită mutaţiilor

138
genetice ce pot surveni în cadrul procesului şi care ar pune în pericol lotul de
plante realizate astfel.

ORGANOGENEZA INDIRECTĂ
Metodă de micropropagarecare, prin culturi succesive de calus,
formează meristemoizi şi care, la rândul lor, evoluând, formeză plante noi.
Capacitatea de regenerare a calusului este mare după 2 sau 3 subcultivări, în
condiţiile în carese păstreză anumite condiţii de iluminare – lumină de
intensitate slabă.
Factorii care influenţează organogeneza indirectă sunt în primul rând
cei genetici, care ţin de specie şi chiar de soi dar şi de capacitatea de
calusare, deşi aceasta este o însuşire a tuturor speciilor. Plantele manifestă
eterogenitate mare în privinţa reacţiei de calusare şi există specii care
calusează slab, mai bine sau foarte bine. Condiţiile biologice în care se află
planta, starea de sănătate, starea fiziologică, vârsta, tipul explantului, sunt,
de asemenea, criterii definitorii pentru organogeneză. Prezenţa
auxinei 2.4D în mediul de cultură, a fitohormonilor, este o condiţie esenţială
a formării unei culturi în organogeneza indirectă.
Tehnică incomplet cunoscută, organogeneza indirectă a dat rezultate
bune la unele specii ca Malus pumila, Prunus amigdalus, Actinidia sp., sau
Prunus insititia.

7.3. Culturile de apexuri

Considerată cea mai răspândită cultură in vitro, este prima dintre

culturile aplicabile la toate speciile, soiurile şi cultivarurile, cu excepţia
plantelor reticente la acest procedeu. Asociată cu termoterapia, cultura de
139
 apexuri este un
procedeu bun pentru
realizarea de culturi
libere de virusuri atât
la portaltoi cât şi la
soiuri, având la bază
prezenţa
meristemelor apicale.
După cum se ştie,
meristemele prezintă
cea mai mică rată de
infectare cu agenţi
patogeni. Explicaţia privind această reacţie nu este pe deplin şi satisfăcător
oferită de oamenii de ştiinţă, dar una din ipotezele care explică aceasta
devirozare este asocierea la cultura de apexuriprin menţinerea ramurilor sau
a plantelor donor în temperaturi până în pragul biologic de suportabilitate
(37-39°C), reducându-seastfel riscul transmiterii virusurilor. Certificarea
materialului săditor însă este o condiţie esenţială pentru a fi siguri că
materialul biologic transmis este liber de virusuri şi sănătos.

Meristem apical de Hypericum uralum

Credit: Encyclopædia Britannica, Inc.

Cultura foloseşte ca material vegetal APEXUL, vârful de creştere al unui

lăstar, segment întâlnit atât la plantele ierboase cât şi la lemnoase. De
140
asemenea, se mai pot folosi segmente uninodale, minibutaşi de un nod, de
dimensiuni mici de câţiva milimetri, porţiuni de lăstari obţinuţi prin
secţionarea de o parte şi de alta a unui nod şi eliminarea frunzei aferente.
Controlul hormonal al dominanţei apicale presupune participarea
tuturor hormonilor - un rol important avându-l auxinele biosintetizate în
mugurii apicali care, datorită concentraţiei mărite din apropierea mugurilor
laterali, au efect inhibitor asupra creşterii acestora.
Apexurile au creştere nedeterminată în mediul in vitro astfel încât, cu
ajutorul hormonilor şi a balanţei hormonale care se va modifica în favoarea
auxinelor, neogeneza de lăstari ne va da posibilitatea să avem cu ajutorul
acestei tehnici proliferare nelimitată.

7.4. Cultura de minibutaşi

Culturile de minibutaşi sunt derivate din culturile de apexuri şi sunt
specificeşi recomandate speciilor, soiurilor sau cultivarurilor care prezintă
dominanţă apicală pronunţată şi au internodii lungi.
Cu dimensiuni de 1 nod şi descrişi anterior în cultura de apexuri,
butaşii prelevaţi de la explant se pot aşeza în recipientele de cultură şi
orizontal, iniţiindu-se în acest sens o culturăde gen ―marcotaj‖ sau
―microbutăşire‖.
Poziţionarea explantului orizontal înlătură dominanţa apicală şi
permite creşterea mugurilor în condiţiile defolierii prealabile, ceea ce
permite avansarea mai multor creşteri noi, lăstari, toate în schimbul unei
singure creşteriapicale. Odată ajunşi la o lungine acceptabilă, de 5/6 cm,
aceştia pot fi trecuţi în faza de înrădăcinare. Metoda se mai numeşte şi
―marcotaj in vitro‖.

141
7.5. Culturile de meristeme
Meristemele sunt ţesuturi tinere, cu o activitate celulară intensăîn
plantă, formate din celule nespecializate funcţional, care au diviziune
continuăşi care asigură creşterea în lungime şi grosime. Suntdispuse de
obicei terminal, atât în partea hipogee cât şi în partea epigee a plantelor.
În funcţie de poziţia lor în plantă, meristemele se împart în mai multe
categorii:
Tipuri de meristeme
A. După tipul structurii pe care o generează
1. PRIMARE (caracter embrionar):
 Terminale - vârful rădăcinilor şi tulpinilor, în muguri; de mare
importanţă la pomii fructiferi;
 Laterale – cambiu, strat generator libero-lemnos;
 Intercalare - la baza internodiilor de la monocotiledonate;
 Foliare – în frunzele aflate în curs de dezvoltare (rol major în
organogeneză);
 Adventive – în rădăcini şi parte aeriană.
2. SECUNDARE (influenţează creşterea în grosime)
 Cambiu şi felogen;
3. SPECIALE (localizate la nivelul explantelor cultivate in vitro):
 Promeristemul – faza timpurie de formare a meristemului cu
importanţăîn embriogeneza somatică;
 Meristemoidul – aglomerare meristematică nestructurată care poate
da naştere la diferite organe;
Embrioidul – grup de celule meristematice care generează embrioni
somatici.
B. Dupa zona în care se găsesc meristemele:
142
1. RADICULARE
 Structura mai simplă;
 Funcţii limitate;
 Categorii: apicale, laterale, adventive.
2. CAULINARE
 Mult mai complexe funcţional şi morfologic;
Culturile de meristeme sunt importante în micropropagare şi sunt
căutate de producători, urmare a unor particularităţi deosebite ale celulelor
meristematice. Vorbim despre pereţi subţiri, nemodificaţi, de un nucleu
mare şi de o mare cantitate de citoplasmă şi mitocondri, ceea ce permite o
evoluţie favorabilă în cadrul culturii.
Cultura de meristeme permite o rapidă multiplicare a plantelor
horticole şi o stare bună de sănătate. Plantele generate in vitroprovenind din
culturi de meristeme care la prelevare au avut alăturat doar două primordii
de frunze sunt, teoretic, libere de virusuri, urmare a metabolismului
accentuat al celulelor meristematice. Pe langă eliminarea virozelor, cultura
de meristeme permite şi eradicarea unui număr mare de fungi, micoplasme
sau bacterii care pot scăpa protocoalelor clasice de dezinfecţie.
Teoriile privind acţiunea antivirală a acestui tip de cultură sunt mai
multe, dar nu au reuşit să elucideze pe deplin mecanismul prin care, totuşi,
cultura de meristeme asigură cea mai bună rată de sterilizare şi eliminare a
virusurilor din plante: competiţie între celulele gazdăşi parazit sau faptul că
celulele agresate sunt capabile să elimine virusurile, având o rată mai mare
de multiplicare decât a parazitului sau a virusului.
Tehnologia de prelevare şi inoculare

143
 Un rol important în prelevarea unui material de lucru optim pentru
culturile in vitro îl are epoca de recoltare şi se va ţine cont de faptul că se
recomandă evitarea perioadelor de dormanţă sau de latenţă la speciile vizate.
Materialul selecţionat, meristemul, se prelevează din materialul vegetal
sterilizat sub lupa binocular şi se inoculează în recipientele cu mediul de
cultură realizat la un pH de 5.5-5.8 şi o concentraţie de macroelemente aflată
la jumătate.
Recomandarea pentru unele specii este ca să se ţină meristemele timp de 3-7
zile la întuneric, în scopul limitării procesului oxidativ, proces deteriorativ
care pune în pericol evoluţia
culturii.
În camera de creştere,
Meristem apical
Primordii de frunze temperatura va varia în
funcţie de specie: între 22°C,
Meristem excizat 25°C sau şi mai mult, în
pentruinoculare
cazul viţei-de-vie;
intensitatea luminoasă se va
stabili între 2.400 - 10.000
lucsi, coniferele cerând o intensitate luminoasă mai mare.
Succesul unei culturi de meristeme depinde de numeroşi factori
ca:dimensiunea explantului (0,1 mm la cartof până la 0,3mm), de localizarea
mugurelui, în sensul în care mugurii poziţionaţi în vârful lăstarilor vor avea
o ratămai bună de evoluţie decât cei cei de la bază care sunt mai bătrâni,
sezonul de prelevare. La speciile pomicole se va ţine seama de satisfacerea
nevoii de frig şi de tipul de dezinfecţie folosit.
Avantajele culturii de meristeme:

144
 1. Permite înmulţirea clonală a materialului biologic valoros, care
trebuie conservat, salvat sau păstrat;
2. Eliminarea bolilor şi dăunătorilor, a visururilor şi a altor agenţi
patogeni;
3. Material nou, juvenilizat, cu capacitate mare de multiplicare;
4. Poate produce material mult, de calitate, care să fie stocat în
băncile de gene.

7.6. Cultura de calus

Calusul este o masă neorganizată de celule, mai mult sau mai puţin
diferenţiate cu o capacitate variabilă de proliferare,care apare în urma unei
răniri mecanice suferită de plantă ca formă de apărare şi regenerare celulară.
În culturile de ţesuturi, calusul este foarte des întâlnit şi este o cultură de
bază, el putând constitui un scop în sine sau o eroare şi atunci este un
dezavantaj.
Cultura de calus este încă în studiu şi ştiinţa urmează să răspundă la
o serie de întrebări ce ţin de evoluţia culturilor de calus, a stabilităţii
genetice a plantelor obţinute din culturile de calus, motiv pentru care, deşi
este prima culturăîncercată a biotehnologiilor horticole in vitro, ea are încă
multe necunoscute.
Creşterea calusului se consideră a fi nedefinită, nu se opreşte din
producere vreodată, deoarece calusul poate fi înmulţit şi subcultivat periodic
pe un mediu nou, cu o periodicitate de 5-6 săptămâni pentru ca celulele să
nu îşi piardă viabilitatea.
Generalităţi pentru iniţierea culturii:
 Cultura de calus este parte integrantă şi fază intermediară a
organogenezei indirecte;
145
  Necesită un pH optim: 5.6 – 6.0 (7 la culturile de Actinidia sp. )
înainte de autoclavare;
 Cere o balanţăcontrolatăîntre concentraţiile de auxine şi citochinine,
de regulă auxinele sau citochininele în exces favorizează formarea
calusului;
 Se recomandă utilizarea auxinelor şi citochininelor numaiîn mediu
(2.4 –D sau ANA);
 Sursele de carbon (zaharoză, glucoză, maltoză, galactoză) pot induce
modificări la nivelul diferenţierii, precum şi în creşterea şi
morfologia calusurilor.
Cultura de calus are trei etape:
1. Inducerea formării calusului sau faza de inducţie.
Pentru inducţia calusului, prima etapă a culturii de calus, se va folosi
material vegetal de orice tip - rădăcini, tulpini, frunze, flori sau ţesuturi,
după cum recomandă literatura de specialitate sau după necesităţile
cercetării.Pentru juvenilizare, se vor folosi cotiledoane, puiet sau embrioni
imaturi.
Reacţia explantului la cultura de
calus este variabilă în funcţie de
tipul morfologic al explantului,
putând varia capacitatea
proliferativă, textura, culoarea sau
morfologia celulelor componente.
Pentru a forma calusul,
acesta se stimulează prin hormonii specifici, auxine, citochinine sau o
combinaţie de auxine şi citochinine, reţetă care variază în funcţie de specie.
În faza de inducere de calus, ţesuturile parenchimatice care reprezintă masa
146
calusuluiintră într-un proces de dediferenţiere celulară. Trebuie menţionat
căţesuturile meristematice nu au nevoie de procese de dediferenţiere, fiind
capabile de diviziune rapidăşi formarea de calus direct. În această fază,
celulele evoluează în diferite organe: lăstari, rădăcini sau embrioni somatici.
2. Proliferarea calusului sau faza de diviziune.
Procesul de înmulţire al calusului, faza a doua, este direct gestionaă de
balanţa hormonilor care se regăsesc în mediul de cultură. Procesul în urma
căruia calusul se divide nu este pe deplin cunoscut, dar se presupune că se
formeazăîn urma interacţiunii hormonilor eliberaţi de celulele rănite. În
această etapă, celulele din alcătuirea calusului devin meristematice, se divid
activ, rapid şi scad în volum.
3. Regenerarea organică sau faza de diferenţiere.
Este o fază controversată a culturii de calus, urmare a evoluţiilor care se
petrec în cultura de celule de calus. În acest moment, rata creşterii calusului
scade, ajungându-se la un echilibru între creşterea în volum şi diviziune.
Faptul că generarea de organe are la baza principiul totipotenţei
celulare, ne permite astăzi să multiplicăm de ordinul unu/zeci de mii
plantele, câteva grame de calus putând genera mii de neoplantule.
Cu toate acestea, culturile de calus au instabilitate geneticăşi
fiziologică mare, ceea ce limitează cultivarea în scopul conservării
germoplasmei sau pentru multiplicare clonală (variabilitatea somaclonală
este însă intens studiată în acest moment în ameliorare iar comportamentul
celulelor în culturile de calus va da, într-un final, răspunsurile necesare).

7.7. Microaltoirea
Ca tehnică a micropropagării, microaltoirea este recent apărută,
urmare a descoperirii incompatibilităţii dintre portaltoi şi altoi la multe
147
specii de interes horticol. Ea generează plante mamă libere de virusuri şi alte
boli care ulterior pot fi utilizate ca sursă de ramuri altoi pentru altoirea
tradiţională.Primul pom liber de virusuri obţinut prin microaltoire a fost
generatîn 1970, prin microaltoirea la Citrus (Murashige şi colab.)
Ca tehnică a micropropagării, microaltoirea are aplicabilitate pentru diverse
scopuri:
1. multiplicarea unor specii care răspund dificil la cultura de
meristeme (cireş, cais);
2. aproape exclusiv pentru producerea de pomi liberi de virusuri la
speciile: piersic, măr, cais, cireş, prun.
Tehnica microaltoirii presupune altoireain vitro, în condiţii
ASEPTICE a unui apex meristematic pe un portaltoi obţinut din seminţe sau
din minibutaţi cultivaţi tot in vitro prin una din tehnicile sau metodele de
micropropagare care permit acest lucru.
1. OBŢINEREA PORTALTOIULUI
Portaltoiul se poate obţine din seminţe, din minibutaşi sau meristeme
apicale şilaterale, toate prin tehnici şi proceduri de multiplicare in vitro. Un
aspect important trebuie acordat ieşirii din dormans, în cazul seminţelor, fie
prin stratificare, tratamente cu citochinine, gibereline, sau frig. Se înlătură
endocarpul cu menţinerea tegumentelor seminale, se verifică viabilitatea,
seminţele se sterilizeazăîn etanol 70% timp de 1 min, hipoclorit de sodiu
0.7% clor activ şi Tween 20 cu 0.3%, 20 minute şi se efectueazăclătiri cu
apă distilată sterilă pentru îndepărtarea agenţilor de sterilizare în totalitate.
Urmeazăinoculare pe mediu MS (-) pentru germinare şi plasarea lor în
camera de creştere în condiţii controlatede temperaturăla20°C şi întuneric.
2. PREGĂTIREA ALTOIULUI

148
 Altoiul care urmeaza a fi inoculat, ―altoit‖ pe portaltoi, se poate
extrage dintr-un apex meristematic de la lăstari crescuţi în vitro, sau dela
ramuri sau lăstari obţinuţiin vivo, caz în care se introduce protocolul de
sterilizare.
3. ALTOIREA PROPRIU ZISĂ
Se înlătură cotiledoanele de la portaltoii obţinuţi invitro, portaltoiul
se secţionează transversal iar apexul meristematic al altoiului se detaşeazăşi
se plasează pe zona inciziei. Noua cultură se trece într-o eprubetă sterilă, pe
mediu de cultură steril LICHID, într-o atmosferă saturată de umiditate,
pentru a asigura limitarea atacului bolilor criptogamice şi pentru a favoriza
calusarea.
4. ACLIMATIZAREA
Atunci când altoiul atinge dimensiuni de 1.5-2 cm lungime se va
trece în faza de aclimatizare, trecându-se gradual in vivo, printr-o umiditate
relativă a aerului ridicată şi controlată.
AVANTAJE acestei tehnici:
 Plantele altoite sunt produse într-un timp relativ scurt;
 Condiţiile de creştere (mediul de culturăşi camerele de
creştere) sunt controlate eficient;
 Util în devirozarea materialului genetic virozat, pentru
cazurile în care specia nu suportă termoterapia din cauza
riscului de apariţie a mutaţiilor genetice sau la speciile care se
înmulţesc greu in vitro;
 Aplicabilă speciilor care se înmulţesc uşor in vitro, dar care
nu înrădăcinează;
 Avantaj pentru cercetarea ştiinţifică privind compatibilitaţile
între altoi şi portaltoi.
149
 DEZAVANTAJELE acestei tehnici:
Este considerată o tehnică pretenţioasăşi preţioasă, necesitând un personal
înalt calificat.

7.8. Cultura de embrioni şi endosperm

Cultura de embrioni sau de segmente embrionare prezintă utilitate în
cadrul micropropagării putând fi aplicată speciilor care manifestă latenţa
seminţelor sau în cazul în care avem specii ale căror seminţe nu germinează,
chiar puse în condiţii favorizante de lumină, temperatură şi umiditate.
EMBRIOGENEZA SOMATICA
Embriogeneza este procesul de formare a embrionului fie dintr-un
zigot, fie dintr-o celulă somatică - vegetativă sau generativă – şi se bazează
pe capacitatea regenerativă a fiecărei celule vegetale, urmare a principiului
totipotenţei celulare şi a faptului că nu numai embrionul zigotic genereaza
embrion, ci fiecare celulă vegetală, chiar haploidă fiind. Embriogeneza
somatică este proprietatea generală a celulelor cormofite.
Aceasta tehnică a fost lansată începând cu 1958, de Steward şi
Reinert prin studii pe Daucus carota şi suspensii de celule şi a fost
completată în 1979 de Thomas şi colab., pe studii la Umbelifere. În acest
moment au fost puse în evidenţă peste 135 de specii cu capacitate
embriogenară, din 81 de genuri şi 32 de familii.
Embriogeneza somatică se întâlneşte la nivelul calusului, în culturile
de celule derivate din calus sau din culturile de protoplaşti, la nivelul
epidermei, la explante din fragmente de tulpini, segmente uninodale precum
şi la fragmente de pistil, hipocotile sau cotiledoane.
EMBRIOGENEZA SOMATICĂ DIRECTĂ

150
 În cadrul ei, embrionii iau naştere din celulele aparţinând ţesuturilor
plantelor care au servit la iniţierea culturii. Embrioni somatici se găsesc atât
în celule nucelare (Citrus sp.), celule epidermice, hipocotil (Daucus carota)
sau în celulele somatice.
Problema importantă la cultura de embrioni este MOMENTUL
OPTIM pentru recoltarea izolarea şi inocularea embrionilor. Se cunoaşte
deja că la unele specii, pentru cultura de embrioni, se recomandă extragerea
timpurie a embrionilor de sub influenţa plantei mamă împreună cu ţesutul
nutritiv la hibrizii interspecifici şi la soiurile timpurii de piersic.
MEDIUL DE CULTURĂ folosit în cazul culturii de embrioni
necesită atenţie în ceea ce priveşte regulatorii de creştere, aceştia având o
importanţă vitală în culturile de embrioni somatici. Lipsa AUXINELOR
împiedică formarea embrionilor somatici în faza de maturare, însă, prezenţa
auxinelor în mediul de cultură perturbă maturarea acestora, recomandându-
se reducerea sau eliminarea completă a auxinelor din mediu. Pentru unele
specii, este importantă prezenţa în mediu a unui raport corect
auxine/citochinine (2,4-D). Natura şi concentraţia glucidelor este alt element
vital al culturii de embrioni, mărirea concentraţiei de zaharoză putând
preveni GERMINAŢIA PRECOCE a embrionilor somatici. De asemenea,
temperatura, lumina şi compoziţia aerului din vasele de cultură influenţează
embriogeneza somatică.
Procedura embriogenezei somatice, listată sintetic:
1. Sterilizarea materialului donor;
2. Excizarea embrionului imatur;
3. Inoculare pe mediu;

151
 4. Diferenţierea embrionilor somatici în diferite stadii de dezvoltare
(globulară, cordiformă, torpilă, cotiledonară) şi suprapunerea
diferitelor stadii de evoluţie.
Suprapunerea stadiilor de dezvoltare face aproape imposibilă
automatizarea culturilor, ceea ce aduce costuri mari de manoperă şi ridică
preţul produsului final.

EMBRIOGENEZA SOMATICĂ INDIRECTĂ

Înseamnă regenerarea embrionilor somatici din calus şi este limitată
sau condiţionată de capacitatea de regenerare a fiecărei specii, care este
variabilă, unele specii regenerând numai organe, altele numai embrioni
somatici şi altele ambele categorii. Felul explantului aduce şi el un plus de
variabilitate în ceea ce priveşte această capacitate. Vârsta explantului şi a
plantei donor şi numărul de multiplicări care se operează dau, de asemenea,
dimensiunea calităţii procesului.
Procedura embriogenezei somatice indirecte, listata sintetic:
1. Iniţierea culturii de calus;
2. Multiplicarea calusului şi identificarea calusului EMBRIOGEN
(acesta ridică probleme la nivel global, deoarece nu sunt încă date
certe despre criteriile de identificare şi proceduri);
3. Inducţia pe un mediu nou de cultură;
4. Formarea embrionilor somatici.
Embriogeneza somatică ca proces în micropropagare, prezintă nişte
condiţionări de care se ţine cont în cadrul elaborării protocoalelor de lucru, a
reţetelor mediilor de cultură şi în stabilirea condiţiilor mediului ambiant în
camerele de creştere:

152
  Auxinele în concentraţie mare înseamnă inducţia embrionilor
somatici;
 Acidul abscisic stimulează formarea embrionilor în culturile de calus
şi celule în suspensie;
 Giberelinele şi etilena inhibă procesele de inducţie;
 Ţesuturile juvenile favorizează şansele formării embrionilor
somatici;
 Temperatura ridicată stimulează formarea embrionilor somatici;
 Laptele de cocos, foarte bogat în citochinine, are un rol important în
inducţia procesului de embriogeneza somatică.
Din această perspectivă, embriogeneza somatică are şi limitări pe
care evoluţia ştiinţifică sigur le va depăşi:
 Materialul genetic este relativ instabil în procesele
embriogenezei;
 Există riscul apariţie de mutaţii;
 Nerecomandat pentru multiplicarea clonală, urmare a
instabilităţii genetice manifestate;
 Nu se poate aplica tuturor speciilor urmare a faptului că nu toate
speciile formează embrioni somatici;
 Culturile repetate duc la deprecierea calusului;
 Apariţia fenomenului de dormans.
Importanţa embriogenezei somatice:
 Embrionul, ca material înmulţitor, este structurat morfofuncţional
(rădăciniţă, tulpiniţă, muguraş);
 Viteza uluitoare de propagare, ceea ce permite la o singură inoculare
producerea unui număr foarte mare de plante;

153
  Plantele derivate din embriogeneză somatică sunt identic genetice cu
donorul;
 Creşterea plantelor este uniformă;
 Plantele sunt robuste;
 Embrionii pot fi stocaţi pentru o lungă perioadă de timp în bănci de
gene;
 Prezintă material important de studiu pentru mutageneză.

7.9. Cultura embrionilor zigotici

Cultura embrionilor zigotici presupune separarea embrionilor
zigorici de ţesutul ovular, cultivarea acestora în condiţii aseptice, pe medii
de cultură speciale care potenţează dezvoltarea ovulului, în condiţii speciale,
care asigură creşterea şi diferenţierea embrionară normală. Apărută ca o
necesitate în pomicultură, în scopul obţinerii de timpurietate la unele soiuri
de drupacee, este o metodă mult utilizată în acest moment în acest domeniu
al horticulturii, în scopul elaborării de noi soiuri
În mod cauzal,
PROBLEMA este avortarea embrionilor întâlnită în ameliorarea plantelor.
CAUZA o reprezintădereglarile fiziologice din procesul de creştere al
seminţei şi fructului.
REZOLVAREA o aduce embriocultura = cultura de embrioni zigotici.
Ce oferă EMBRIOCULTURA?
Reprezintă extragerea embrioniului abia format cu o porţiune de ţesut
nucelar sau cultivarea ovulului fecundat, depăşindu-se astfel barierele
incompatibilităţii.

154
 Cu aplicabiliatate în POMICULTURĂ, embriocultura permite
cultivarea unor embrioni imaturi proveniţi de la încrucişările soiurilor
extratimpurii şi timpurii de sâmburoase, pentru ca în VITICULTURĂ să
rezolve imposibilitatea obţinerii unor descendenţi hibrizi când genitorul
matern este un soi apiren în care embrionul avortează în mod natural.
Iniţierea culturii depinde sau este influenţată de mărimea
cotiledoanelor şi variază de la specie la specie, astfel: cireş – 28/35 de zile
de la înflorire, sau dupăîntărirea sâmburelui; vişin – 29/41 de zile; piersic –
81/97 de zile.
MEDIUL DE CULTURĂ folosit în embriocultură are formula cu
atât mai complexă cu cât stadiul de dezvoltare al embrionului în momentul
prelevării este mai incipient şi se recomandă chiar şi folosirea de extracte
naturale de endosperm.
Spre deosebire de alte culturi, unde fragilitatea ţesuturilor impune
protocoale rafinate şi dificile de sterilizare în scopul conservării ţesuturilor,
aici, STERILIZAREA se poate realiza la concentraţii mai mari, deoarece
endocarpul şi tegumentul permit acest lucru.
Embriogeneza poate folosi embrioni maturi, proveniţi de la speciile
la care sămânţa ajunge la maturitate şi se foloseşte în scopul obţinerii
timpurietăţii la plante, micşorându-se durata protocolului ameliorativ sau
embrioni imaturi, proveniţi de la speciile care nu ajung să menţină embrionii
şi este destinată înlăturării intersterilităţii sau pentru valorificarea unor
genotipuri valoroase.
Embriogeneza este o cultură realtiv uşoară datorită simplificării
dezinfectării, a mediului de cultură, spre deosebire de cultura embrionilor
imaturi, unde dificultatea apare pe masură ce aceştia sunt mai tineri,

155
ridicându-se pretenţiile de cultivare iar rata aclimatizării plantelor rezultate
este destul de mică.

7.10. Sămânţa sintetică

Creată în folosul embriogenezei somatice, prin generarea unui
endosperm artificial care să protejeze şi să hrănească embrionul, conceptul
de sămânţă sintetică a apărut relativ recent şi a fost dezvoltat în scopul
conservării produselor micropropagării, ştiut fiind că plantele produse in
vitro menţin o sensibilitate iniţială la angajarea în mediul exterior, in vivo.
Astfel, sămânţa sintetică are un înveliş de protecţie care protejează lăstarii,
butaşii şi embrionii împotriva deshidratării, în primul rând, dar şi al
infecţiilor.
Deoarece embrionii somatici îşi pierd repede valabilitatea, se
folosesc gelurile de încapsulare cu substanţe chimice nutritive, regulatori
osmotici şi pesticide sau se intervine la nivel tehnologic prin semănarea
embrionilor în flux lichid cu ajutorul tehnologiilor puse la punct pentru
culturile in vivo.
Speciile au pretenţii diferite faţă de nutriţie, motiv pentru care nu se
pot elabora reţete standardizate pentru alcătuirea mediului nutritiv al semiţei
sintetice, endospermului artificial, aceasta constituind una din principalele
inconveniente ale tehnicii.
AVANTAJE ale seminţei sintetice:
1. Permite folosirea şi producerea de seminţe la speciile care nu produc
de obicei seminţe;
2. Înlocuiesc seminţele hibride;
3. Folosirea unor genotipuri speciale;
4. Importanţă maximă în ameliorare;
156
 Dintre dezavantaje, amintim:
1. Se deshidratează repede şi necesită sisteme de învelişuri care să le
păstreze umiditatea relativă;
2. Embrionul este menţinut în stare de repaus cu ajutorul unor substanţe
chimice;
3. Semănatul presupune scoaterea embrionului din repaus;
4. Procent variabil spre mic de plante viabile obţinute;
5. Pesticizarea seminţei trebuie limitată, deoarece la dezvoltarea
embrionului, acestea împiedică micorizarea.
6. Alginatul de calciu are permeabilitate mare pentru elemente solubile;
7. Rădăcinile lăstarilor cresc mai lent;
8. Capsulele sunt lipicioase şi se manipulează greu la semănare.
Procedura de realizare se bazează pe aşa numita tehnică de
încapsulare, în condiţiile realizării unei seminţe cât mai uniforme pentru
uşurarea mecanizării. În acest sens, încapsularea butaşilor nu este încă
posibilă din cauza limitărilor tehnologice. Etape:
 Incapsularea embrionilor în alginat de sodiu 2-4%;
 Scufundarea embrionilor în alginat de sodiu 2-4%;
 Îmbăierea individuală în clorura de calciu 50 μM, cu pH 7;
 La max 30 de minute distanţă, capsulele se întăresc şi pot fi
manipulate;
 Se păstrează în condiţii de refrigerare, la 3-6 °C, în condiţii aseptice.
Încapsularea organelor este o extensie a seminţei sintetice, putând fi
încapsulaţi bulbi proveniţi din culturi in vitro, minibutaşi şi rozete de frunze
de la diverse specii: kiwi, zmeur, măr, crin etc. Prin încapsularea acestuia,
materialul vegetal se poate păstra cu cheltuieli mai reduse, promiţând
economie de spaţiu cât şi de forţă de muncă.
157
 Tehnica este în explorare, permite deja standardizare, dar are încă de
răspuns la întrebări privind compoziţia subtratului în care se află şi testarea
în continuare a speciilor pentru a vedea care se pretează la această procedură
cu cele mai bune rezultate.

7.11. Cultura de antere, polen, ovare, ovule şi ţesut nucelar

O serie de alţi cercetători (Gregory, 1940; Taylor, 1950;
Nitsh, 1951; Sparrow şi colab., 1955; Maheshwari şi Lal, 1958; Vasil, 1957,
1959 şi alţii) adoptă o direcţie deosebit de interesantă, aceea a regenerării şi
diferenţierii de plantule in vitro folosind componente florale, antere sau
grăunciori de polen, fructe ori seminţe imature (Maroti, 1976).
Culturile acestea sunt culturi moderne, apărute odată cu stabilizarea
tehnologiei de micropropagare.Tehnologia pentru cultura de polen şi antere
este relativ simplă,anterele se recolteazăşi se desprind când florile se aflăîn
faza de boboc, se sterilizează şi se inoculează pe mediu de cultură solid sau
lichid.
În cazul culturilor de polen se recomandă transferarea periodică a
anterelor pe mediu proaspăt pentru a ―coloniza‖ câtmaimulte vase de
cultură.
Cultura de ovar, ovuli şi ţesut nucelar este folosităîn cazul
incompatibilităţilor dintre soiuri sau specii, în condiţiile în care mare parte
din incompatibilităţi provin din disfuncţii ale polenului sau organelor
sexuale.
Inocularea OVARELOR se face înainte sau după polenizare în
funcţie de compatibilitatea existentă, putându-se realiza şi fecundarea in
vitro. Cultura de ovar şi ovuli nu este aplicabilă direct în microînmulţire,
nefiind o tehnică pusă la punct ca protocol.
158
 7.12. Cultura de protoplaşti
Cultura de protoplaşti este o tehnică de micropropagare relativ
recentă, cu aplicabilitate directăîn pomicultură, care permite, teoretic,
producerea de hibrizi între specii şi soiuri de orice fel. Ca procedură,ea
presupune unirea în condiţii specifice a două celule cărora li se dezagregă
enzimatic (sau mecanic) structura peretelui celular, obţinându-se astfel
hibrizi somatici.
Cultura de protoplaşti se bazează pe ingineria genetică, iar
intervenţiile la nivelul celulei fac posibile transferul de gene, selecţia de
plante rezistente la agenţii patogeni şi boli. Ca tehnică, explantele se tratează
enzimatic pentru a li se distruge peretele celular, proces care se petrece pe
baza presiunii osmotice, pentru ca mai apoi, prin fuziunea protoplaştilor să
se poată obţine noi celule.
Practic, tehnologia nu este încă pusă la punct, având încă mai multe
limitări, dintre care enumerăm apariţia calusului himeric în locul hibrizilor,
instabilitatea genetică şi selectivitatea aleatorie.
Deşi permite, ca avantaj, obţinerea de hibrizi între speciile
incompatibile natural sau hibrizi între speciile care nu înfloresc sau care nu
au timp săîşi matureze organele, lipsa tehnologiilor de selecţie a plantelor,
descendenţii instabili genetic, sterili sau chiar cu mutaţii fizice, calusul
himeric enunţat mai sus şi neasigurarea transmiterii caracterelor necesare
ţin, deocamdată, această tehnică, în rezervă.

MICROPROPAGAREA IN VITRO A SPECIILOR HORTICOL

8.2 Micropropagarea in vitro a viței-de-vie

159
 Literatura de specialitate afirmă că la vița-de-vie factorul definitoriu
îl constituie soiul, ca factor biotic principal (Stamp & colab, 1982, Bădițescu
şi colab, 1981, Brezeanu și colab. 1982, Vişoiu 2001). Pentru viţa-de-vie
aflată în faza de înrădăcinare se recomandă un fotoperiodism de 16 ore,
întâlnit în toate laboratoarele de cercetare din lume, reducerea acestei
perioade antrenând şi o diminuare a ratei de înrădăcinare, direct
proporţională cu scăderea cheltuielilor cu energia electrică.
În ţara noastră există cercetări efectuate pe micropropagarea la viţa-de-vie
elaborate de Vişoiuşi listate în lucrarea de doctorat „Tehnologia devirozării
soiuriulor de viță-de-vie roditoare și de portaltoi prin clonare in vitro‖ –
2001.

Potentialul organogen al genului Vitis

GENOTIP EXPLANT MEDIU REGU REFERINTE
DE LATO
CULTUR RI DE
A CREST
ERE
V. vinifera Apex Mille&M (3- Harris şi
meristematic urashige 4)BAP( Stevenson
(1976) 80)
AdS
Riesling,Cabernet, Meristem Murashig (2)BAP Mirancea şi
Fetească fragmentat e&Skoog colab.(1982)
(1962)
Riesling Meristem Murashig (2) Mirancea şi

160
 întreg e&Skoog BAP colab. (1982)
(1962)
Vitis spp. Apex Chee şi (1,1)B Chee şi Pool
meristematic Pool AP+(0, (1983)
(1982) 09)AN
A
V. berlandieri x Apex Murashig (2,25)B Novak şi
V. riparia meristenatic e&Skoog AP Jukova (1983)
(1962)
V. vinifera Apex Stevenso (0,023) Monette
meristematic n şi IBA+(2 (1886)
Monette )BAP+(
(1983) 60)AdS

În ultimii ani s-au dezvoltat tehnici noi care se apropie de

embriogeneza somatică în cazul micropropagării viţei-de-vie. În 1980,
Barlass şiSkene pun la punct protocolul de multiplicare in vitro la viţa-de-
vie pornind de la cultivarea pe medii aseptice a fragmentelor de apexuri de
cca. 1mm, prelevate din vârful tulpinilor. În 60 de zile de la inoculare au fost
generaţi lăstari de 3 cm care, subcultivaţi ca butaşi de 1 ochi, în 10-14 zile
au condus la obţinerea de cca. 8.000 de plante de viţă-de-vie într-un timp
total de 3-4 luni. (Bhakwani şi Razdan, 1983).
Pornind de la concluzia exprimată în 1983 de Chee şi Pool, conform
căreia, comparând speciile V.vinifera, V. Riparia, V. Cinerea, V. LabruscaV.
Argentifolia, a rezultat că soiurile speciei V. vinifera au o capacitate
regenerativă net superioară (75%) decât celelalte specii (5-50%), se poate

161
afirma că folosirea micropropagării la viţa-de-vie reprezintă o tehnică sigură
pentru această specie, care poate permite obţinerea rapid de plante
devirozate.

8.3 Micropropagarea in vitro a speciilor pomicole

Micropropagarea speciilor pomicole cunoaşte o reală expansiune în
cadrul biotehnologiilor, odată cu rezultatele bune avute de cercetători
privind înmulţirea fie a speciilor care înrădăcinează greu, fie a speciilor cu
deficiențe de polenizare, fie a speciilor care prezintă variaţie genetică mare
şi nu pot fistabilizate prin metode vegetative de multiplicare.
Efortul cercetărilor s-a îndreptat către elaborarea unor medii de
cultură care să permită sporirea ratei de multiplicare a speciei respective
precum şi stabilitatea clonala, aceasta fiind un deziderat important în
micropropagarea speciilor pomicole folosite ca portaltoi.
Majoritatea mediilor de cultură pentru speciile pomicole sunt solide,
urmare a folosirii agarului ca agent de solidificare, existând încercări de
folosire a mediului lichid la genul Prunus – pentu faza de multiplicare şi
înrădăcinare cât şi la Juglans nigra – în scopul lungirii lăstarilor (Heile-
Sudholt şi colab, 1986).
Medile de cultură sunt pe atât mai spectaculoase şi permit variaţii
mari în cercetare, cu cât conţin auxine în diferite concentraţii, ştiut fiind că
rolul acestora în multiplicarea in vitroeste crucial. Dintre fazele
micropropagării, înrădăcinarea pune cele mai mari probleme, reţetele
încercate pentru speciile pomicole de interes fiind foarte variate şiconţinând
stimulatori ai rizogenezei în varii concentraţii.

162
 Putem comenta câteva din cercetările autohtone privind înmulțirea
speciilor pomicole valoroase, cercetări conduse la Institutul de Cercetare şi
Producție pentru Pomicultură Piteşti-Mărăcineni (Teodorescu R., 2005)
Măr
–înrădăcinare in vitro a portaltoiului de măr D1R57T120 cu rezistență la
rapăn (Venturia inaequalis) şi făinare (Podosphera leucotricha) în 1985;
- culturi in vitro pentru soiurile Pionier, Generos şi Ladyspur în 1991;
- lipsa auxinelor în mediu şi o concentratie de 2mg/l BAP la portaltoiul
MM106 aduce cele mai bune rezultate culturii în 1983;
- IBA 0,5mg/l favorizează înrădăcinarea in vitroa MM106, M26 si M9, într-
un procent mai mare de 75%;
- cele mai multe cercetări se fac în acest moment pentru înrădăcinarea in
vitro a microbutașilor.
Prun
- raportul auxine/citokinine se stabilizează şi produce o rată de multiplicare
de 3 microlăstari/explant (Ana Spath) şi 14 microbutași /explant (Centenar)
– 1983 şi 1985
Cireşşivişin
- se stabilesc mediile de cultură pentru o serie de portaltoi de cireşşivişin
precum şi soiuri;
- se produc culturi in vitro pentru soiurile Bing, Sam, Cerna, Stella (cireş) şi
Chantenmorelle, Nana, Meteor (vişin)
Păr
- se stabilesc mediile de cultură pentru soiurile de portaltoi Alamâi,
Harbuzeşti, Cu miez roşuşi PC.56; PC.56 a avut şi o reacţie pozitivă în faza
de înrădăcinare în mediu suplimentat cu ceaţă artificială – 1987;

163
 Gutui
- microlăstarii de la portaltoiul BA.29 au fost înrădăcinaţi pe mediu de
cultură fără fitoregulatori, după un tratament prealabil cu acid indolilbutiric
10,1 mg/l – 1996.
Kiwi
Prima livadă din România a fost plantată în 1993 iar de atunci au fost
efectuate o serie de experimente pentru a stabili condiţiile optime de
creştere. În 1993 a fost început la Facultatea de Horticultură din Bucureştiun
program de înmulţire la kiwi, folosind mai mult de 1000 de plante hibride
obţinute de la firma Vitroplant din Cesena, Italia. Cu o experienţă de peste
30 de ani în domeniu, Vitroplant din Cesena, Italia, foloseşte
microînmulţirea pe scară industrială la Actinidia arguta,atât pentru obţinerea
de portaltoi cât şi pentru obţinerea în ameliorare a seminţelor.
Actinidia arguta este o specie care se pretează foarte bine la
înmulţirea in vitro spre deosebire de măslin, de exemplu, la care stabilitatea
genetică nu este incă sigură. Studiile recente au scos în evidenţă prezenţa
unei proteine extrase din fructul de kiwi,numită kiwellin, care manifestă
proprietăţi puternice antialergice. Pentru depăşirea problemelor apărute în
înmulţirea clasică a Actinidiei, după introducerea în cultură în Europa, o
serie de autori au pus la punct diferite tehnici de microînmulţire in vitro.
Obţinerea unor rezultate pozitive a fost posibilă datorită stabilirii
procedurii de sterilizare amaterialului iniţial. Astfel, utilizarea în calitate de
sterilizant a hipocloridului de sodiu (0,6 - 1,5 %) timp de 15-30 minute în
prezenţa detergentului Tween 20 de 1% a contribuit esenţial la
diminuareariscului de contaminări. O altă posibilitate de a steriliza
fragmentele detaşate de la planta -mamă este folosirea diacidului în diferite
concentraţii şi timp de expunere. Astfel, menţinerea îndiacid de 0,1% timp
164
de 7 minute pentru Actinidia, s-a dovedit a fi optimă.Numeroşi cercetători
au testat un şir de medii nutritive în scopul optimizării lor pentru declanşarea
procesului de morfogeneză. Cel mai des utilizat substrat este mediul
Murashige-Skoog(MS). Rugini, E., 2003 recomandă de a utiliza acest mediu
în stare semisolid cu adaos de 20mg/l zaharoză, regulatori de creştere ca
zeatină - 4,6 μM şi IAA- 0,3 μM sau 4,6 μM - zeatină, 2,9μM GA3 şi 2,2
μM BA. Deseori, în relaţie cu scopul propus, se recurge la reducerea
cantitativă a mediului nutritiv până la 75% ori 50%. Un alt mediu utilizat în
special pentru cultivarea explantelor provenite din frunze şi peţiol de la
Actinidia este mediul Gamborg B5. Caracteristic pentru el este conţinutul
mai redus de N, microelemente ca Fe, Mn, Zn în comparaţie cu MS, pecând
conţinutul de K este mai ridicat, ceea ce conduce la reglarea sporită a
permeabilităţii membranelor celulare. În mediul Hildebrandt o importanţă
deosebită i se atribuie azotaţilor,fosfaţilor, sulfaţilor şi clorurii de K, Ca, Mg
şi Na. Pentru cultivarea Actinidiei în condiţii in vitro au fost utilizate şi alte
medii ca: Standardi, Pieric, WPM, LQ, Nitsh, Cheng‘s K(h).
Pentru dediferenţierea ţesuturilor în vederea producerii calusului a
fost folosită o mare diversitate de metode şi substanţe. Astfel, Muleo R. şi
colab. (1990) a indus formarea calusului din frunză cu 1,0 mg/l de 2,4 D la
întuneric. Alţi autori au recurs la folosirea 4PU în doze de 0,1 mg/l. Acest
produs s-a dovedit şi un bun stimulator al diferenţierii de muguri şi lăstari pe
calusul format.
Formarea calusului din peţiol a fost vizibilă în cazul adaosului în substratul
nutritiv MS a hormonilor BA (2,2 μM) şi ANA (0,27 μM). O altă variantă
de inducere a calusului laActinidia pe mediul MS din porţiuni de tulpină
afolosit fitohormonii BAP (0,5-2 ppm) şi IAA (0,05 ppm) sau BAP +
zeatină. Combinaţiile auxinelor 2,4 D şi IAA şi a citochininelor BAP şi
165
kinetină au fost testate cu succes pe explantele derivate din tulpină, peţiol,
frunze şi rădăcini. ANA (0,0 2 mg/l) şi zeatina (0,1 mg/l) adăugate la mediul
Standardi (1983) având ca explante limbul foliar şi peţiolul au dat dovadă de
un înalt potenţial calusogenetic. Majoritatea surselor de specialitate ce
analizează influenţa citochininelor asupra proceselor de organogeneză fie
directă sau indirectă denotă faptul că hormonul folosit cel mai frecvent
pentru obţinerea calusului de Actinidia este zeatina în doze de 0,5 – 1,0
mg/l.
În faza de proliferare, diferiţi autori recomandă utilizarea diferitor
medii de cultură cu o combinaţie de fitohormoni variabila. O înaltă rată de
proliferare a lăstarilor a fost atestată de Lionakis S. şi Zirari A., (1991),
utilizând mediu lichid suplimentat cu 8,9 μM BA şi 0,3 μM IBA. Marino G.
şi Battistini, S. (1990), au demonstrat că BAP cauzează hiperhidricitatea
frunzelor, efect ce nu a fost depistat în cazul zeatinei, care a condus
nemijlocit la sporirea ratei de proliferare. De asemenea, o proliferare activă a
fost obţinută de Pais M. 1987 pe (MS) mediu după o perioadă de subcultură
de patru săptămâni cu 0,5 mg/l acid ascorbic, ca antioxidant şi 2,3 zeatină,
0,3 IAA. Segmente de lăstari obţinuţi pe acest mediu au fost transferaţi pe
un mediu identic, modificându-se conţinutul hormonal şi anume utilizarea a
5 mg/l de DTT şi excluderea acidului ascorbic. Acest mediu numit H2 a
condus la o proliferare activă după cinci săptămâni de cultură.
De cele mai multe ori, obţinerea rizogenezei a fost posibilă datorită
tratării directe a bazei lăstarilor obţinuţi in vitro cu IBA şi apoi transferul lor
în sol bine aerat. Diferite concentraţii de auxine au fost utilizate în acest
scop cu succes: suplinirea mediului MS cu 2,5 μM de IBA timp de 1 lună
sau tratarea cu 4,9 μM de IBA timp de 20 secunde. Morini S. (1986) a
constatat faptul că IBA în mediul nutritiv, în concentraţie2,5; 4,9; 9,8 μM
166
influenţează direct numărul rădăcinilor formate la Actinidia.Pentru formarea
rădăcinilor la neoplantulele obţinute, autorul recomandă utilizarea variantei
cu 2,5 μM şi plantarea ulterioară a lor în perlit steril. Aclimatizarea
plantulelor trebuie efectuată treptat, reducând umiditatea în camera de
cultivare de la 100% la 80% timp de 30 zile cu menţinerea fotoperioadei de
16 ore zi/8 ore întuneric.
Sotiropoulos T.E şi colab. (2006) au studiat reacţia speciei Actinidia
deliciosa la prezenţa în mediul de cultură a metioninei şi a borului (B).
Prezenţa B în substratul nutritiv poateafecta procesul de organogeneză in
vitro. Odată cu mărirea concentraţiei B are loc creşterea ratei deproliferare a
mugurilor.
La specia Actinidia deliciosa var.deliciosa, Harada(1975), folosind
2,4 D sau ANA (0,1-10 mg/l) în cultura de rădăcină şi tulpină, a obţinut
embrioizii până la stadiul globular, cu pierderea pe mai departe a capacităţii
de dezvoltare şi dediferenţiere.
Dezvoltarea metodelor de micropropagare la kiwi constituie o parte
considerabilă a programelor de studiere a acestei culturi, care implică tehnici
de ameliorare in vitro deoarece micropropagarea clonală ofera uniformitatea
genetică a materialului vegetativ la această specie.

8.4 Micropropagarea in vitro a speciilor floricole

Culturile de flori, arbori şi arbuști au mare importanță şi din această
cauză necesitatea culturilor intensive este evidentă. Desigur, majoritatea
permit înmulţireape cale vegetativă, tehnică standardizată pentru realizarea
materialului vegetal, dar care aduce cu ea şi inconvenientul major al
propagării virusurilor sau altor boliprecum şi o durata mare de producţie.

167
 În scopul limitării propagării bolilor la speciile floricole se poate
folosi cu succes cultura de meristeme, care permite înmulţirea acestora şi
producerea unui material liber de viroze. În ciuda faptului că, asociată cu
termoterapia, cultura de meristeme elimină multe virusuri, totuşi, încă nua
fost descoperit antidotul virusului marmorat al garoafelor, spre exemplu.
Garoafa
Plată decorativă deosebit de apreciată la nivel mondial, este o cultură
foarte rentabilă în spaţii protejate dar înmulţită vegetativ,nu limitează
transmiterea bolilor de la o plantă la alta. Prima multiplicare in vitro la
garoafe a fost făcută în 1957 de Quak, iar aceasta a permis ca astăzi să avem
culturi de plante ornamentale fără virusuri. Cele mai bune rezultate la
culturile in vitro pe garoafe s-au obţinut cu ajutorul culturilor de meristeme
iar studiile au arătat că dimensiunea meristemului joacă un rol hotărâtor.
Pamfil (1984) afirmă că dimensiunea de 0,2 mm la meristem aduce o
eficiență maximă a devirozării, procentul acesteia fiind direct
proporţionalşicu gradul de contaminare al plantei şimărimea meristemului.
În plus, cea mai bună evoluţieîn cultură au avut-o meristemele apicale
(54,44%) faţăde cele axilare. Murashige şiShabde (1977) folosesc mediul de
cultură MS modificat, 1mg/l AIA dând rezultatele cele mai bune alături de
chinetină şitot ei menţioneazăcă pentru multiplicarea in vitro a garoafelor,
un mare rol îl are mediul de cultură, în mod special macroelementele,
hormonii şiglucidele.
De asemenea, pentru cultura in vitro a garoafelor se poate practica
microbutaşirea, obţinându-se 80.000 plante dintr-un singur meristem, într-un
an, având în vedere poziţionareaacestora pe neoplantula iniţială(82,78%
minibutaşide vârf, 51,11% minibutaşibazali) şise oferă astfel o bună
stabilitate genetică materialului obţinut(Pamfil, 1984).
168
 Crizantema
Cunoaştemîn acest moment trei metode de înmulţirevegetativăin
vitro: cultura de meristeme, care vine şicu avantajul devirozării plantei,
cultura de fragmente uninodale, şicultura din frunze sau fragmente florale
(boboci, elemente florale, peduncul).
Mediul de cultură recomandat pentru cultura crizantemei este pe
baza de microelemente Heller iar condiţiile optime în care se dezvoltă
cultura sunt stabilite la 16 ore lumină/24 ore, intensitate luminoasă de 2.600
lucsi şio temperatură situată la aproximativ 24°C.

Saintpaulia Ionatha
Prima încercare reușită în multiplicarea a Saintpaulia s-a petrecut în
1937, când cercetătorii Naylor şiJohnson au obţinutplante noi din cultivarea
pe hârtie de filtru umectată a unor fragmente de frunze, pentru ca mai târziu,
în 1972, să fie generate primele neoplantule in vitro. Mediul de cultură
folosit a conţinuto balanță echilibrată a hormonilor cu aport de ANA 1mg/l
si BA de 1mg/l. Cercetătorii români de la Centrul de Cercetări Biologice
Cluj-Napoca au obținut plante de Saintpauliain vitro folosind fragmente de
limb foliar sau peţiol, acesta din urmă având însă o rată lentă de
multiplicare. Cea mai bună variantă de multiplicare pentru Saintpaulia este
recomandată de CachiţaCosma, Petrescu (1993) şiconstă în prelevarea şi
cultivarea in vitro a unor fragmente de dimensiune cca. 1 cm din lamina
frunzei sau din boboci care, ulterior, se microbutăşesc. Etapa de înrădăcinare
este uşortrecută de această specie şise recomandă substrat anorganic, nisip

169
cu perlit şiîmbunătăţit săptămânal cu soluţie ANA pentru accelerarea
rizogenezei.

Freesia
O altă specie deosebit de apreciată este freesia, floare des întâlnită pe
piaţade consum şi care vine pe sezonul rece, când avem puţine plante în
vegetaţieşisortimentul este redus în climat temperat continental. Din păcate,
înmulţireavegetativă la freesia este deficitară, planta producând aproximativ
5-6 tuberobulbi, ceea ce asigură o rată de multiplicare foarte mică. Astfel,
cercetările îndreptate către multiplicarea in vitro sunt pe deplin justificate. În
1974 şi 1976 se reuşeşte producerea pe neoplantule de freesie folosind
cultura de calus din meristem, tulpină, bulbi şi flori, iar devirozarea plantei a
fost posibilă prin culturi de meristeme în 1968. Cercetările efectuate de
Cachiţa şi Lazar (1983, 1984) au pornit de la datele oferite de Pierik şi Bajaj
(1975) şi, folosind balanţa hormonală drastic modificată, lipsa hidrolizatului
de cazeină, agar şi zaharoza în minus, au reuşit producerea de noi plante de
freesia, observându-se că bobocii terminali de pe apexurile inflorescențelor
şi cei subapicali au o capacitate regenerativă diferită în funcţie de poziţia
acestora în inflorescenţă şi de natura regulatorilor de creştere folosiţi. În
plus, se recomandă ca inoculii (bobocii sau butonii florali) să fie menţinuţi la
întuneric pentru o perioadă de cca 8 săptămâni, pentru ca apoi să fie trecuţi
la lumină continuă sau regim 16 ore lumină/24 ore.

Trandafirul
Anual, în Franța, se obțin prin multiplicare in vitro între 200.000-
400.000 plante de trandafir pornind de la un singur mugure, putând fi

170
folosite ca plante cultivate pe rădăcini proprii sau pot să furnizeze muguri
altoi pentru înmulțirea vegetativă clasică. Primele cercetări ş tatonări privind
înmulţireala trandafiri au fost făcute în 1967 de către Hill, în 1968
obţinându-se rezultate satisfăcătoare de către Iacobs şicolab. iar Davies şi
Wilkowska reliefează că un factor decisiv în multiplicarea in vitro la
trandafiri este sensibilitatea soiului care generează răspunsuri complet
diferite la modificarea concentraţiei de citochinine şi auxine.
Este metoda cea mai nouă şi mai modernă de producere a
materialului săditor pe rădăcini proprii, pornind de la un mic grup de celule
meristematice care se găsesc în vârfurile de creştere ai mugurilor.
Principiul acestei metode constă în extirparea unor ţesuturi
meristematice de dimensiuni reduse (0,3 mm) luate din vârfurile de creştere
şi cultivarea lor pe medii artificiale şi în condiţii de laborator controlate, în
aşa fel ca să se obţină în final o plantă mică cu lăstari şi rădăcini.
În momentul de faţă, pe plan mondial, există sute de laboratoare care
se ocupă de înmulţirea in vitro a plantelor, printre care trandafirii ocupă un
loc de frunte. Se apreciază că se obţin anual peste 25 de mii. de plante prin
această metodă.
În ţara noastră s-au făcut cercetări numeroase, mai ales la Institutul
de Pomicultură din Piteşti-Mărăcineni, prin care s-a reuşit elaborarea unei
tehnici de înmulţire care are ca finalitate practică obţinerea în timp scurt a
unor cantităţi mari de plante identice din punct de vedere genetic cu planta
mamă.
Cercetările românești afirmă că există câteva elemente fundamentale
de care trebuie să se ţină cont la cultura in vitro a trandafirului: sursa de
explante (planta donor să fie sănătoasă, viguroasă şi autentică), epoca de

171
prelevare a explantelor, natura explantelor (mugurii subcutanaţi dând cele
mai bune rezultate iar mugurii apicali, de cele mai multe ori fiind floriferi) şi
specificitatea soiului. Mediul de cultură folosit pentru iniţierea culturilor este
unul fără auxine sau cuo cantitate mică (0,004-0,1 mg/; ANA), cantităţile
mari de auxine generând cantităţi considerabile de calus la baza
explantelor.BAP este un factor limitativ în iniţierea culturilor iar
înrădăcinarea plantelor se face bine în condiţiile în care sărurile au fost
reduse la jumătate iar acidul naftilacetic este în concentraţie de 0,05-0,1 mg/l
(Coman, 1983). Aclimatizarea în condiţii normale aduce însă pierderi la
cultura de rosa, dar ca soluţie, se poate trece şi în mediu anorganic de
turbă/mraniţă cu perlit şi stimulare cu Radistim, soluţia propusă aducând un
procent satisfăcător la aclimatizare 85-92% (Coman, 1983).

8.5 Micropropagarea in vitro a cartofului

Una din speciile serios afecatete de virusuri şi care se răspândesc cu
mare uşurință urmare a metodelor vegetative de multiplicare este cartoful,
specie horticolă de mare însemnătate pentru alimentaţia mondiala umană şi
animală. Astfel, cercetările în micropropagare privind înmulţirea cartofului
au apărut încă din 1954, când Norris a realizat primele culturi de meristeme
la cartof iar cercetările ulterioare au arătat ca procentul de plante devirozate
scade direct proporţional cu descreşterea mărimii explantului meristematic,
viabilitatea pe care o prezintă inoculul micşorându-se odată cu diminuarea
mărimii acestuia. Prima devirozare completă la cartof a fost obţinută în 1973
de Mac Donald deşi din 1950 s-a demonstrat că virusul care provoacă
răsucirea frunzelor la cartof poate fi inactivat în tubercul, prin tratamente
termice cu căldură.

172
 Evoluţia micropropagării la acestă specie a trecutşi printr-o fază de
cercetare care recomandă asocierea mai multor forme de tratamente,
termoterapie sau adăugarea în substratul de cultură a unor compuşi chimici
inhibitori virali, antimetaboliţi. Din păcate, aceasta din urmă soluţie nu şi-a
dovedit eficienţa.
Pentru a reuşi procedura de multiplicare in vitro a cartofului şi
devirozarea acestuia, trebuie luate în calcul câteva aspecte: condiţiile de
cultură, de la compoziţia mediului la factorii de mediu, tipurile de
subcultivări, provenienţa materialului biologic, soiulşi cultivarul, tipul de
explant, dimensiunea acestuia şimomentul recoltării (foarte important după
unele cercetări), condiţiile de totală asepsizare şi aclimatizarea plantelor,
toate acestea fiind, în aceeaşimăsură şi piedici în stabilizarea unei culturi in
vitro la cartof. Din păcate, cercetările nu au reușit să stabilizeze 100%
reuşita multiplicării in vitro la cartof, unele linii din PVX şi PVS - două
virusuri care afectează această specie, persistând latent şi după 10 săptămâni
de tratament cu termoterapie. Rezultatele au arătat că prelungirea
termoterapiei peste 6-8 săptămâni nu se justifică, fiind ineficientă. (Stace-
Smith, 1970).
Multiplicarea in vitro a cartofului se poate face şi prin culturi de
microbutaşi, studii în acest sens făcându-se şi în centrele de cercetare din
România folosindu-se procedeele de micropropagare de la garoafe (Rudelle,
1982).
În faza de aclimatizare, noile plante de cartof se plantează direct în
spaţiile acoperite, pe parapeţi, în perlit, şi se ţin acoperite cu polietilenă timp
de 5 săptămâni în scopul forţării dezvoltării sistemului radicular.

8.6. Micoriza şi culturile in vitro

173
 Micoriza reprezintă legătura care se stabileşte între rădăcinile
plantelor şi microorganisme cu avantaje reciproce pentru cei doi parteneri
din perspectivă nutriţională. Sunt deja cunoscute exemplele nodozităţilor
dela speciile leguminoase, unde cel mai edificator exemplu îl reprezintă
bacteriile fixatoare de azot.
În micropropagare se obţinplante care nu au micoriză, dar metoda
prezintă avantajul de a produce plante libere de virusuri, rapid, astfel încât
ideea de a introduce micoriza şi în cadrul micropropagării a devenit pe
deplin justificată, cercetările în direcţia acesta dezvoltandu-se odată cu
microînmulţirea.
Deşi pare simplă ideea micorizării rădăcinilor neoplantulelor, există
nişte bariere care trebuie trecute: cultivarea in vitro a micorizei,
selecţionarea plantei gazdă şi condiţiile asocierii celor doi parteneri, primele
cercetări în acest sens datând din 1921. În plus, micoriza este de 3 feluri:
 ECTOMICORIZA: sunt rădăcini de dimensiuni mici, scurte,
acoperite în totalitate de hifele ciupercii, ca o pâslă care penetrează
parenchimul rădăcinilor. Rolul lor este de a mări zona de contact
dintre rădăcină şi substrat.
 ENDOMICORIZA: sunt vezicule sau îngroșări care apar la suprafaţa
rădăcinii, ciuperca găsindu-se localizată în parenchimul cortical iar
celulele care sunt colonizate de endomicoriză au un comportament
foarte activ. Întâlnite la peste 80% din plantele de cultură.
 ECTOMICORIZELE: maipuţin răspândite la speciile pomicole, dar
le regăsim la castan, alun.
Tehnica microrizării se reduce la obţinerea plantelor care urmează a fi
micorizate, aduse până în faza de înrădăcinare, la selecţionarea ciupercii
care se pune pe mediu de multiplicare şi a treia fază, micorizarea propriu
174
zisă, care presupune trecerea micropantulelor înrădăcinate pe un substrat de
turbă şi perlit care a fost în prelabil îmbunătăţit cu agentul de micorizare,
adică ciuperca.
S-a descoperit ca micorizele au rol important în absorbția azotului şi
fosforului (la măr s-a observat o mărire a ratei absorbţiei cu 50-80%), că
asigură o reacţie mai bună a plantelor la soluţia calcaroasă a solului sau apei,
inhibând manifestările de cloroză, iar unele micorize chiar elimină auxine,
stimulând în acest fel procesul de înrădăcinare a butaşilor, toate acestea fiind
numai avantaje pe care le poate oferi micoriza în procesul de multiplicare in
vitro.

MIC GLOSAR
Agar: agent de solidificare, natural, extras din alge marine.
Autoclav: Maşină capabilă să sterilizeze sub presiunea aburilor.
Calus: formaţiuni de celule nediferenţiate.
Ciclu ontogenetic: exprimă totalitatea etapelor și a manifestărilor de viață
desfășurate într-o anumită succesiune, prin care trec plantele de la obținerea
lor din sămânță sau pe cale vegetativă, până la moarte.
Clona: un grup de plante propagate din părţi vegetative, derivate din culturi
repetate provenite dintr-un singur individ. Clonele sunt considerate uniform
genetice.
175
Contaminare: infectare cu un organism nedorit într-un mediu controlat.
Cultură de celule: cultivarea celulelor sau evoluţia lor in vitro, incluzand şi
cultura unei singure celule.
Cultură de embrioni: cultură in vitro a unor embrioni maturi sau imaturi.
Cultură: Creşterea unei plante in vitro, intr-un mediu steril.
Culturi de ţesut: cultura in vitro a celulelor, ţesuturilor, organelor şi plantelor
în condiţii aseptic total.
Embrioni somatici: structuri de tip embrion, non-zigotice, formate din celule
somatice.
Endomitoză: Duplicare a cromozomilor fără diviziune nucleară (şi celulară).
Explant: parte sau segment excizat dintr-o plantă care se foloseşte în cadrul
culturilor in vitro.
Ex vitro: spaţiul în care sunt scoase plantele generate in vitro şi
transplantate de obicei în sol sau ghivece cu substrat.
Hormon: Compuşi naturali (sau de sinteză) care se găsesc în plantă şi
influenţează creşterea şi dezvoltarea plantelor.
Hotă cu flux laminar: Spaţiu închis de lucru unde aerul este sterilizat şi
controlat de filtre HEPA
In vitro: care creste în sticlă.
In vivo: care creşte natural.
Inocul/explant: porţiune de organism (lăstar, frunză, calus etc) folosit în
iniţierea micropropagării.
Înmulţire adventivă:dezvoltarea organelor precum mugurii, frunzele,
radacinile, lastarii somatici şi embrioni din lastari şi ţesut din rădăcină sau
ţesut calus.
Mediu de cultură: soluţie nutritivă sau substrat de cultură folosit în culturile
de celule, cu reţeta specifică.
176
Meristem: grup de celule nediferenţiate care sunt situate în vîrful lăstarilor,
mugurilor, rădăcinilor care se divid activ şi generează ţesuturi şi organe.
Micropropagare: multiplicarea plantelor pornind de la părţi vegetative prin
intermediul mediului de cultură.
Nediferenţiat: celule care nu au diferenţiat.
Propagare clonală: multiplicare asexuată a plantelor dintr-un singur individ
sau explant.
Subcultivare: divizarea şi transferarea unei culturi sau unei porţiuni din
explant pe un mediu nou de cultură cu aceeaşi sau cu reţetă diferită.
Tehnici aseptice: proceduri folosite in scopul prevenirii infecţiilor cu
microorganisme de gen: fungi, bacterii, viruşi, micoplasma, care pot afecta
culturile de celule ţesut sau organe.
Totipotenţă: capacitatea celuleor plantelor de a regenera întreaga plantă în
condiţii de cultivare pe medii de cultură potrivite.
Zigotul: embrion derivat din ou sau zigot, este rezultatul fecundării
gametului femel (oosfera) de către gametul mascul (spermatia).

177
BIBLIOGRAFIE
1. A. Roşu, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaţii în amelioare, Ed.
Ametist, 1999
2. Alan Doyle & J. Bryan Griffiths, Cell and tissue culture: laboratory
procedures in biotechnology, John Wiley & Sons Ltd, 1998 .
Cachita-Cosma Dorina, C. Deliu, L. Rakosy-Tican, A. Ardelean, Tratat de
biotehnologie vegetala, vol 1. Editura Dacia, Cluj Napoca, 2004.
Cachiţa Cosma Dorina, Petrescu Corneliu, Curs de biotehnologii, Academia
Universitară Atheneum, Bucureşti, 1993.
Department of Horticulture Auburn University, Plant Propagation, 2005.
Dodds H.J., Roberts L., Experiments in Plant Tissue Culture, CAMBRIDGE
UNIVERSITY PRESS, 1985.
F. Stănică, Microînmulţirea plantelor horticole şi alte tehnici de cultură in
vitro, Editura Grand, 1999.
Gail M. Lang, The green world, Horticulture, Chelsea House, An imprint of
Infobase Publishing, 2007.
Gamborg O.L., Murashige T., Thorpe T.A., Vasil I.K., Plant tissue culture
media, In vitro, 1976.
Gamborg, O.L. si Wetter, L.R., Plant tissue culture, National Research
Council, 1975.
Hoza Dorel, Biotehnologie pomicola, 1997.
Le Bui Van, Introduction to plant biotechnology, University of Science,
Vietnam, 2009.
178
Lorraine Mineo, Plant Tissue Culture Techniques, Department of Biology
Lafayette Easton, Pennsylvania 1990.
Plant biotechnology practical manual for biotech, UCLA, 2002.
Rhitu Rai, Genetics and plant Breeding, Introduction to Plant
Biotechnology, National Research Centre on Plant Biotechnology Lal
Bhadur Shastri Building New Delhi, 2007.

179
1. Corymbia citriodora (Aromatic Eucalyptus), din
http://www.hometissueculture.org/gallery.html
2radacini de Drosera pygmaea and wonderful root system. , din
http://www.hometissueculture.org/gallery.html
3. cultura de calus la tutun - , Karen Bohmert2, * ,1, Ilse Balbo1, Alexander
Steinbüchel2, Gilbert Tischendorf and, Lothar Willmitzer1, Constitutive
Expression of the β-Ketothiolase Gene in Transgenic Plants. A Major
Obstacle for Obtaining Polyhydroxybutyrate-Producing Plants

II.9. wikipedia

pag 83. fig. IV ... Author: International Institute of Tropical Agriculture

License: Creative Commons Attribution-NonCommercial License READ LICENSE

180