Conf. univ. , dr.

Adrian Peticilă

MICROÎNMULŢIREA
PLANTELOR HORTICOLE

@2013
 ISTORICUL CULTURILOR DE CELULE
ŞI ŢESUTURI VEGETALE

Rolul plantelor în viaţa şi echilibrul planetei.

• „aurul verde”;
• sursă de hrană şi energie pentru om şi animale;
• purificator al atmosferei;
• materii prime pentru unele industrii (alimentară, textilă, farmaceutică);

Secolul XX: celula vegetală conţine în nucleul

său totalitatea informaţiei genetice necesară
dezvoltării unui organism complet.

Ea se supune principiului clasic al totipotenţei.

Tehnica înmulţirii plantelor in vitro

Celulă haploidă sau diploidă

↓
Regenerarea plantelor
 Pionierii

Gottlieb Haberlandt

(28 noiembrie 1854 - 30 ianuarie 1945)

1902 - lucrarea „Kulturversuche mit

isolierten Pflanzenzelle”;

“ orice celulă diploidă sau haploidă

conţine informaţia genetică ereditară
imprimată în genom”.

1926 - teoria este respină de botaniştii

contemporani - E.K ü s t e r.
 Pionierii
1839 -Vöchting şi Rechinger
au iniţiat experimente pentru determinarea limitelor de divizibilitate ale
materialului vegetal, fără pierderea capacităţii regenerative.
1904 - Hanning
a obţinut plantule la crucifere pornind de la embrioni extraşi din
seminţe imature la Raphanus sativus, R.landra, R.candatus şi Cochlearia danica,
a certificat creşterea pe medii artificiale cu adaos de zaharoză a unor
fragmente de plante;
1934 - R. J. Cautheret
a obţinut calusuri folosind explante de salcie, plop, ulm, tutun şi morcov
pe care le-a stimulat cu auxine şi le-a repicat în medii sterile;
1939 - Wihte
a reuşit să obţină calus din vârfurile rădăcinilor
de tomate;
1939 - Schleiden şi Schwann
schiţează conceptul totipotenţei celulare lansat
ulterior de Haberlandt;

Hermann Vöchting
 Pionierii

1957 - W. D. Stewart
elaborează prima metodologie de cultivare in vitro a ţesuturilor
vegetale pe medii nutritive conţinând hormoni de creştere.
1925, 1929 - Laibach
demonstrează utilitatea practică a tehnicii de înmulţire in vitro
pentru ameliorarea plantelor, izolând embrionii din seminţe neviabile
din încrucişarea lui Linum perene cu Linum austriacum şi cultivându-i pe
medii nutritive.
1934 - Kögl, Haagen – Smit şi Erxleben
primul fitohormon (acidul β indolil acetic) deschide o nouă
etapă în succesul cultivării in vitro a explantelor,

-----------------------------------------------------------------------------------------------

White (1938), Gautheret şi Nobecourt au pus bazele cultivării in vitro a explantelor

vegetale: organe, ţesuturi şi celule. Totodată, ei şi-au adus contribuţia şi în domeniul
alcătuirii mediilor de cultură privind compoziţia, concentraţia în macro şi
microelemente esenţiale pentru nutriţia explantelor, prezenţa unei surse de C şi N
organic, a unor vitamine şi auxine.
 Pionierii

1955 - Miller şi colab.

izolează din sperma de heringi, chinetina

1957- Skoog şi Miller

avansează ipoteza „balanţei hormonale” a raportului dintre auxină
şi citochinină care favorizează iniţierea de rădăcini şi muguraşi dintr-o
cultură de calus.

1977 şi 1978 - Murashige

multiplicarea prin subculturi succesive in vitro dintr-un
singur meristem de orhidee a făcut posibilă obţinerea a 4 milioane de
exemplare, copii fidele ale plantei donatoare şi a demonstrat şi
eficienţa economică a metodei prin care se face economie de material
biologic.
 ETAPELE ISTORICE ALE DEZVOLTARII
TEHNICILOR DE MULTIPLICARE IN VITRO

1. 1939 – 1902; teoria unităţii structurale fundamentale a lumii vii (Schleiden şi Schwann,
1939) iar celula a fost acceptată ca unitate structurală de bază a organismelor vii, fiind apoi
emis postulatul conceptului de totipotenţialitate (omnipotenţialitate) celulară a lui
Haberlandt, 1902 .

2. 1902 – 1920; o perioadă de stagnare a cercetărilor în domeniu

3. 1920– 1939; primele succese în domeniul creşterii in vitro a embrionilor, a

rădăcinilor, a obţinerii de calus, ţesuturi care cultivate apoi pe medii aseptice şi
subcultivate periodic prin repicări au condus la obţinerea de material vegetal.(
White, Gautheret şi Nobecourt).

4. 1939 – 1966; studii efectuate de numeroşi cercetători privind comportamentul

diferitelor explante cultivate pe diferite medii de cultură, pentru cunoaşterea şi a
factorilor implicaţi în procesele de înmulţire şi diferenţiere a celulelor, gradul lor de
autonomie funcţie de substrat, condiţiile de cultură, provenienţa şi natura
explantului.

5. 1966 şi până în zilele noastre; extinderea largă a utilizării explantelor pentru

multiplicare, dezvoltarea citologiei, citofiziologiei, biologiei moleculare, geneticii şi
ameliorării la nivel ultrastructural şi molecular, biochimiei, fiziologiei.
 Subramuri de biotehnologii vegetale
Citofitotehnologii

• înmulţirea şi clonarea cultivarilor valoroşi;

• micropropagarea şi generarea de material vegetal sănătos;
• elaborarea de tehnologii de modificare a genomului unor specii cormofite;
• exploatarea capacităţii de biosinteză a celulelor izolate în condiţii de cultură
intensivă;
• obţinerea de embrioni somatici, producerea de seminţe artificiale;
• clonarea rapidă a unor soiuri rezultate din lucrările de ameliorare.
 Prezenţe româneşti

1975 - au fost abordate cercetări sistematice privind problemele înmulţirii

plantelor in vitro fiind amenajate laboratoare de culturi de ţesuturi la Institutul de
Cercetări Biologice din Bucureşti, Institutul de Cercetări Silvice din Bucureşti, în
unităţile de cercetare agricolă şi horticolă de la Fundulea, Vidra, Mărăcineni,
Ştefăneşti, în unităţile de învăţământ superior agricol din Cluj Napoca, Bucureşti,
Iaşi, Facultatea de Biologie din Bucureşti, Facultatea de Farmacie din Bucureşti şi
în unităţi de producţie cum ar fi Întreprinderea de Sere Codlea (1988).

1984 - apare prima monografie de profil intitulată „Culturi de celule şi ţesuturi

vegetale – aplicaţii în agricultură‖ Ed.Ceres, autori Cachiţă C.D., Raicu P. Şi
Badea M.E.

1985 – 1988 - primele cursuri în domeniul culturilor de celule şi ţesuturi vegetale din
mediul universitar au luat fiinţă la Institutul Agronomic „N.Bălcescu‖ din Bucureşti
sub formă de cursuri postuniversitare.

1987 - acest curs s-a introdus sub formă opţională la secţiile de biologie şi la
facultăţile de horticultură din ţară.

1985 – se introduce la Bucureşti, în cadrul USAMV, Facultatea de Biotehnologie cu

ramuri ale biotehnologiei vegetale, si devine disciplina fundamentala independenta.
 Prezenţe româneşti

1972 - ia fiinţă „International Association for Plant Tissue Culture” la care România a
aderat în anul 1975.

La noi în ţară se înfiinţează ―Asociaţia Română de Culturi de Ţesuturi şi Celule

Vegetale‖.

1989 - Institutul de Cercetări Biologice din Cluj Napoca organizează al IV-lea

Simpozion Naţional de Culturi de Explante.

noiembrie 2000 - se organizează la Universitatea Babeş Bolyai – Facultatea de

Biologie din Cluj Napoca al X-lea Simpozion de Culturi de Ţesuturi şi Celule Vegetale
care marchează 25 de ani de la iniţierea primelor cercetări în domeniul culturilor de
celule şi ţesuturi în România.
 SUNPRIDE
Royal Base Corporation
 CULTURILE DE TESUTURI DE
PLANTE

Propagarea in vitro
 Tehnica rapidă (comparativ cu înmulţirea vegetativă)

Folosite pentru:
1. Micropropagare
2. Regenerare
 Micropropagarea

dintr-o singură plantă se produc

multe clone identice genetic
 formă rapidă de multiplicare;
 proces asexuat de creare de noi plante, identice;
 conservarea germoplasmei, prin menţinerea
heterozigotismului, care s-ar pierde prin seminţe.
 obţinerea de plante libere de virusuri;
 proces continuu, nediferenţiat de anotimpuri sau
condiţii de climă
Un singur segment nodal va
produce un explant cu 4-6
noduri în decurs de 4-6
săptămâni.

Fiecare explant se multiplică,

producând alte 4-7 explante.
Sute de plante pot fi produse astfel
dintr-un singur segment nodal.

Plantele obţinute sunt clone ale

plantei mamă.
 Specii care permit micropropagarea

arbuşti ornamentali, coleus,

difenbachia, ficus, caladium, pomi
fructiferi, semiarbuşti, viţa-de-vie,
trandafiri, orhidee, clematis, liliac,
begonia, frezia, iris, narcisa,
muşcata, petunia, lalelele,
rododendron, azalea, muştar,
porumb, soia, grâu, orez, bumbac,
tomate, cartofi, citrice, gazon,
ceapă, asparagus, varză, castraveţi,
mazăre, fasole.
 Avantajele micropropagării

 Tehnologie care economiseşte spaţiul şi timpul;

 Rezultat favorabil - se pot produce milioane de
specii florale uniforme genetic;
 African Biotechnologies produce anual peste 6
milioane de banane şi plante de interior la ghivece
 La bulboase: dacă se produc 5-7 bulbi/an prin metode
convenţionale, micropropagarea poate ridica
producţia la 1000/an la iris, gladiolă, narcisă,
Hyacinthus sau Amaryllis
 Liberde virusuri;
 Conservarea speciilor cu caractere excepţionale.
 Avantaje globale

 Facilitareacirculaţiei în siguranţă a
germoplasmei între naţiuni - asigură schimbul
de material organic vegetal între ţări fără
pericolul bolilor sau molimelor.

 Ideal pentru:
 Culturi cu reproducere vegetativă;
 Culturi cu producţie mică de seminţe sau cu
procent mare de seminţe heterozigote
 Limitări

 Costul/unitate poate să îl depăşească pe cel al

metodelor convenţionale de propagare, din cauza
facilităţilor, a mentenanţei şi a costurilor de la borator;

 Multe specii sunt recalcitrante la această metodă

 Apariţiaivariaţiei somacloanle urmare a instabilităţii

unor plante (schimbări de epigenetică şi genetică)
 Regenerarea

procesul prin care o plantă îmbătrânită, prin micropropagare, poate fi

transformată într-o plantă complet noua

Violeta
africană
regenerând
rădăcini
Regenerarea este posibilă urmare a caracteristicii plantelor
de a fi totipotente, prin folosirea hormonilor

• Culturi diferenţiate: segmente nodale, frunze, rădăcini

etc.

• Culturile de celule nediferenţiate (embriogeneză) sunt

totipotente: pot deveni o planta complet noua prin
diferenţiere.
 Hormonii sunt regulatori chimici naturali care se găsesc în plante şi
care influenţează creşterea plantelor.

Regulatorii de creştere sunt versiunea sintetică a hormonilor din

plante.

Citochininele induc creşterea vegetativă.

Auxinele induc rizogeneza.

Acţiunea diferiţilor hormoni/regulatori aspra plantelor nu este una

identică:

• plante diferite raspund diferit la acelaşi stimul chimic

• diferite părţi de plantă reacţionează diferit la acelasi
stimul chimic
 Etapele micropropagării

Ţesutul de iniţiere se numeşte explant si este format din celule

diferenţiate, care se vor transforma în ţesuturi diferenţiate: radăcini,
frunze, ovare, cotiledoane etc)

Ţesutul trebuie să fie

steril, complet liber
de microorganisme.
 ETAPELE MICROPROPAGARII
Gfh

Prelevare

Initiere
Planta donor Ptoliferare 2
Proliferare

Explante crescute

Aclimatizare
Explant inradacinat

Inradacinare

Pepiniera

Transfer in vivo
From: Plant Propagation Concepts and Laboratory Exercises. Beyl& Trigiano, CRC Press2008.
 Etapele micropropagării

etapa 1.
Iniţierea culturii
etapa 2.
Multiplicarea
etapa 3.
Înrădăcinarea
etapa 4.
Aclimatizarea
 etapa 1.
Iniţierea culturii

Factorii care se iau în

consideraţie:

A. Selecţia plantei:
• caracteristicile genetice
(cultivarul, corectitudinea
genetică, plantă
sănătoasă);
• controlul agenţilor patogeni
în plantă;
• condiţia fiziologică a
plantei.
Factorii care se iau în
consideraţie:

B. Dezinfecţia:
• fungi, bacterii, păduchi,
mucegai, viruşi, patogeni
interni,
• plante şi explante sănătoase;
• perioada din an în care se
face recoltarea explantului
pentru iniţierea culturii.
Factorii care se iau în consideraţie:

C. Mediul de cultură:
• diferite reţete, în funcţie de
specie.
Factorii care se iau în consideraţie:

D. Oxidarea:
• fenomen generat de reacţia
explantului în funcţie de
concentraţia de fenoli din
plantă;
• inhibă creşterea;
• necesită reinoculare pentru
stabilizarea culturii.
 etapa 2.
Multiplicarea

Factorii care se iau în consideraţie:

A. Păstrarea culturii:
• culturile stabilizate continuă
dezvoltarea rapidă a noilor
organe ;
• proliferarea creşterilor axilare şi
laterale;
• creşterile variază cu specia şi
cultivarul.
Factorii care se iau în consideraţie:

B. Noi explante:
• explantul iniţial se secţionează
dând naştere la noi plante;
Factorii care se iau în
consideraţie:

C. specia, mediul de
cultură, reacţia la
inoculare şi condiţiile de
laborator modifică rata de
multiplicare;
 etapa 3.
Înrădăcinarea

Factorii care se iau în

consideraţie:

A. Scopul :
•pregătirea noile plante pentru
transferul din cultura sterilă;
•înrădăcinarea şi aclimatizarea
sunt considerate stadii limită în
microînmulţire;
•înrădăcinarea se poate face in
vitro sau in vivo;
•necesită mediu de înrădăcinare
special.
 etapa 4.
Aclimatizarea

Factorii care se iau în

consideraţie:

A. Transferul plantelor din

mediul in vitro in mediul in vivo,
în condiţii nesterile de viaţă;
• pericolul major este
deshidratarea;
• procentele de pierderi variază cu
specia;
 Conf. univ., dr. Adrian Peticilă

MICROÎNMULŢIREA
PLANTELOR HORTICOLE

@2013
LABORATORUL DE
CULTURI IN VITRO
 Două spații

Zona nesterilă/generalităţi

Def.= spaţiul destinat activităţilor care se desfăşoară în condiţii nesterile.

Conţine:

spălător;
laboratorul de preparare a mediilor de cultură;
camere de creştere;
depozit de sticlărie;
depozit de substanţe chimice
încăperea cu autoclave.
 Zona sterilă/generalităţi

Def. = încăpere aseptică, sterilă, în care se execută sterilizarea, prelevarea şi

inocularea explantelor

Contine:
mai multe hote de lucru cu flux laminar orizontal sau vertical de aer steril.

Procese:
• dezinfectarea materialului vegetal;
• prelevare;
• inoculare explante in vitro;
• repicare sau subcultivare.
 Caracteristicile spaţiilor laboratorului de microînmulţire
încăperi amenajate facil pentru întreţinere şi evacuare;
pardoseală din gresie sau mozaic sau alte materiale moderne;
pereţii acoperiţi cu faianţă sau vopsea de ulei, pentru a se putea întreţine uşor şi
a fi facil pentru procesele de aseptizare;
asigurarea unei curăţenii perfecte în toate compartimentele laboratorului
(praf + murdărie = surse de germeni →infecţii)

Orice defecţiune de lungă durată poate provoca perturbaţii grave în

desfăşurarea lucrărilor, stagnând fluxul operaţiunilor → bani pierduţi.
 Dimensionarea

•se va face ţinând cont de specificul activităţii;

•volumul de activitate pe care laboratorul urmează să îl aibă;
•amploarea personalului care va deservi laboratorul;
•mobilierul şi aparatura folosite.
Ex: culturi de meristeme
Scop: obţinerea in vitro de material devirozat;
Specific: prelevarea explantelor se face la stereomicroscop. În
consecinţă, fiecare operator va lucra la un astfel de aparat, instalat în
nişa sau boxa sterilă. Dimensionarea recipientelor de cultură.
Inocularea şi creşterea culturilor.
Încăpere pentru termoterapie.
Laborator profilat pe testarea şi certificarea calităţii şi a stării de
sănătate a plantelor generate in vitro.
Camera de creştere.
Seră (construcţie specială — în cazul în care se urmăreşte păstrarea
culturii în condiţii de protejare de agenţi fitopatogeni sau construcţie
obişnuită).
 Alcatuirea zonei nesterile

Spălătorul
Încăpere cu ciment pe jos şi cu canalizare în pardoseală, ciment mozaicat
sau gresie, cu panta usoara in conditii de scurgere in pardoseala.

Cuprinde
•bazine pentru înmuierea sticlăriei şi pentru spălarea propriu-zisă a
acesteia şi, eventual, un al treilea bazin pentru limpezirea sticlăriei
spălate.
•distilator (de 5—10 litri)
•apă caldă şi rece
•sistem de iluminare
•rastele pentru uscarea sticlăriei.
•dulapuri în scopul depozitării sticlăriei, a unor materiale şi a reactivilor
care nu necesită condiţii speciale de păstrare.
•cutii pentru gunoi (preferabil cu capac) şi un suport pentru perii
necesare pentru spălarea sticlăriei.
 Laboratorul pentru pregătirea mediilor de cultură
Caracteristici:
cameră spaţioasă (să permită accesul concomitent a 3—4 persoane)
corespunzător iluminată.

Dotat cu instalaţii de: canalizare, apă curentă (rece şi caldă), gaze, electricitate,
pompă pentru vid etc.

Pardoseala: materiale uşor lavabile.

Mesele de lucru vor fi faianţate sau vor fi acoperite cu material plastic ori cu folie
melaminată, pentru a putea fi întreţinute uşor şi pentru a rezista la reactivi.

Aparatura:
1 —3 agitatoare;
1 — 2 bain marie;
pH-metru;
frigider de mare capacitate, cu congelator.
balanţe electronice - subunităţi de gram (100 — 10 mg);
microscop optic şi un stereomicroscop.

Sticlarie
 Sterilizarea

Ce este sterilizarea?
Ce se sterilizează: mediul de cultură, apa distilată, instrumentar, sticlarie şi alte vase de
cultura, hartia de filtru.

1. Recipientele cu medii de cultură se sterilizează prin autoclavare la temperatura de 121

°C, pe o durată de timp care variază în funcţie de încărcătură. Odată sterilizate, pot fi
păstrate o perioadă de timp, în cameră frigorifică, la întuneric, pentru a evita degradarea
sau fotooxidarea vitaminelor şi a hormonilor şi pentru a preîntâmpina deshidratarea
mediilor, prin evaporarea apei.

2. Apa distilată este indispensabilă în laborator, atît pentru prepararea apei sterile cît şi
pentru spălarea materialului biologic sau la clătirea finală a sticlăriei. Se foloseşte în
procese de clătire a materialului vegetal, în dezinfectie, in lucrul la hota.

3. Instrumentar - necesar în lucrul la hota, în mediul aseptic, cu material liber de

virusuri şi boli.

4. Sticlaria folosită în cadrul procedurilor de lucru la hota va fi sterilizată.

5. Hârtia de filtru care se foloseşte tampon între materialul vegetal sterilizat şi suprafaţa
hotei se sterilizează.
 Camera de creştere

este destinată păstrării în condiţii optime a inoculilor, în vederea asigurării

bunei dezvoltări a acestora.

CONDITII: condiţii maxime de aseptizare, să nu fie igrasie, să nu fie demisol

sau subsol, deşi literatura veche recomandă, din contra, acest tip de
amplasament pentru evitarea fluctuaţiilor mari de temperatură. Recent, nu se
mai recomandă amplasarea camerelor de creştere sub nivelul solului, deoarece
pot aparea probleme legate de umiditate, microorganismele specifice zonelor
calde si umede, fără aerisire. Asigurarea climatizarii camerelor de creştere într-
un anumit regim de temperatură, de preferinţă 21—23°C (±2°C faţă de
temperatura dorită) şi cu o U de 50%, dar nu sub 50% (!).

ARHITECTURA: etajere metalice cu poliţe de sticlă amenajate spaţial şi cu

acces facil; sistem de iluminare automatizat, pereţi zugraviţi în alb lavabil
(faianţă nu mai este recomandată pentru că dezvoltă microrganisme între
rosturi), pardoseala din ciment, pentru a fi uşor de întreţinut.
 SISTEMUL DE ILUMINARE

•tuburi fluorescente amplasate deasupra

culturilor, la o distanţă de 30—40 cm.
•trebuie să asigure necesarul specific
speciei luate în cultură; aşezarea
flacoanelor să fie făcută pe un strat izolator,
de exemplu din polistiren expandat pentru
prevenirea supraîncălzirii mediului şi a
deshidratării acestuia.

Atentie!!Fluctuaţiile de temperatură produc

modificari ale volumului de aer din
recipientele de cultură → formarea unor
curenţi din exterior spre interior care
transportă germeni→infectarea secundară
a mediilor de cultură.

Atentie!! Tuburile fluorescente trebuie să

asigure iluminarea uniforma şi să nu fie
sursă de incendiu.

Fotoperioada optimă: 16 ore lumină/8 ore întuneric, la 2-2,6 klucsi.

 ROL

Asigură condiţii controlate necesare etapelor micropropagării in vitro;

Asigură condiţiile necesare primei etape din aclimatizare şi trecerea in vivo.

in vitro in vivo

(Pelargonium sp)
 Alcătuirea zonei sterile

Camera sterilă
Def. = camera care foloşeşte la sterilizarea, prelevarea, inocularea şi multiplicarea
explantelor.
Caracteristici
Pereţii vopsiţi în ulei sau placaţi cu faianţă.
Pardoseala din ciment pentru a fi uşor lavabilă, dar nu va avea canalizare în
podea.

Dotari
nişe sau boxe (hote) cu flux laminar,
orizontal, continuu, de aer steril; asepsia
aerului este asigurată prin filtre speciale
care reţin particulele mai mari de 0,2 mm;
periodic, filtrele trebuie schimbate, întrucît
ele se uzează ; hotele vor fi orientate pe
peretele opus uşii şi ferestrelor, pentru a
evita formarea curenţilor de aer. În spaţiul
propriu-zis de lucru vor fi aşezate suporturi
pentru instrumente sterile şi vor fi montate
instalaţii obişnuite de iluminat şi tuburi
pentru emanaţie de raze ultraviolete
necesare sterilizării.
 Operatorul la hota
Nu este permis să se
interpună mâna,
instrumentarul sau alte
obiecte chiar sterile între
curentul de aer steril şi
recipientul deschis.

De regulă, nişa sau hota

trebuie încărcată — înaintea
începerii lucrului — numai cu
obiecte sterilizate, iar
operatorul se va spăla cu
alcool pe maini de fiecare dată
cînd părăseşte şi revine în
perimetrul baleiat de fluxul
laminar, orizontal, de aer
steril.

Hota va fi pusă în funcţiune

cu cca 20 de minute înainte de
începerea operaţiunilor.
 Dotarile laboratorului
Sticlăria
- se utilizează toate tipurile de
recipiente din sticlă dintr-un
laborator de agro sau biochimie.
- sunt necesare pipete, cilindrii
gradaţi, pâlnii, baloane cotate (de
diferite capacităţi), sticle şi borcane
pentru reactivi (de variate tipuri şi
mărimi), vase Erlenmeyer şi
Berzelius de dimensiuni diverse,
capsule Petri, casolete, baghete,
tuburi din sticlă, sticlele de ceas, nuci
filtrante, filtre Millipor, seringi,
exicatoare etc.
- recipiente de cultură: pot fi folosite
baloanele cu fund plat ori variate
vase din sticlă incoloră, de forme şi
mărimi diferite.
Flacoanele cu medii de cultură, în
vederea sterilizării vor fi obturate cu
dopuri sau capace.
 Aparatura şi dispozitivele

boxa sau incinta sterilă, autoclav, aparatul de distilat şi bidistilat apă,

frigiderele de mare capacitate, agitatoarele magnetice (cu plită pentru
încălzirea mediilor), balanţele (analitică şi tehnică), pH-metrul, etuvele,
microscopul şi stereomicroscopul, 1—2 lupe, centrifuga pentru
sedimentarea biomasei în suspensiile celulare, compresorul, o pompă de
vid, dispozitivul de repartizare a mediului, recipientele de cultură, aparatul
de fotografiat.
 Instrumentarul

În tehnicile de culturi de ţesuturi se lucrează

cu instrumentar de tip chirurgical: pense (de
diferite forme şi mărimi, mai lungi decît
eprubetele în care urmează să inoculăm), cît
mai elastice, foarfeci şi bisturie, anse, cuţite,
scalpele, lame de ras, perforatoare (de diferite
dimensiuni), care să permită explantarea unor
cilindrii de ţesut, etc.;

Categoria a doua: ace, seringi, ace spatulate,

lampă de spirt etc.
 Materiale diverse

În laborator sînt necesare şi alte materiale de mică valoare, şi anume: site

cu azbest, clame, trepiede, tuburi din sticlă sau din cauciuc, becuri de
gaz etc.

Vata este necesară în cantităţi mari atat pentru dezinfectarea mâinilor

operatorului, a dezinfectării şi spălarii hotelor şi a suprafeţelor de lucru
cât şi pentru confecţionarea dopurilor.

Alte obiecte: trusă mecanică termometre de cameră, mănuşi din cauciuc

(de uz menajer), folie incoloră din polietilenă (pentru acoperirea vaselor
de cultură), elastice (pentru fixarea foliei de polietilenă la gîtul
recipientelor), folie din aluminiu (pentru închiderea sau acoperirea
flacoanelor cu mediu), site de metal (pentru strecurarea materialului
vegetal în operaţiunea de sterilizare), tăvi metalice, coşuri din sîrmă,
casolete metalice, suporturi pentru eprubete, vase şi cutii din plastic,
perlit, vermiculit, sfoară, aţă, tifon, hîrtie de filtru şi de împachetat etc.
 Substanţele necesare în
laborator

sărurile anorganice şi compuşii organici utilizaţi în prepararea soluţiilor nutritive,

reactivi de uz comun (baze şi acizi), substanţe indispensabile pentru sterilizarea
materialului vegetal, si preparate destinate curăţirii încăperilor şi obiectelor.

1. Materiale chimice
•detergenţii sau săpunurile (solide ori lichide),
•soda şi prafurile de curăţat — de uz menajer;
•alcoolul utilizat pentru dezinfectare (se poate folosi şi spirtul sanitar);
•acidul clorhidric tehnic;
•amestecul cromic (folosit în scopul curăţirii veselei);
•cloramină;
•hipoclorit etc.

Între substanţele chimice de uz comun intră şi reactivii obişnuiţi din laboratoarele

de chimie, şi anume: acizi minerali (clorhidric, sulfuric, azotic) şi baze (hidroxidul
de potasiu, natriu, amoniu, de puritate tehnică şi cu grad ridicat de calitate), utilizaţi
în curăţirea sticlăriei şi necesari în prepararea unor soluţii; acizi organici (acetic,
citric, oxalic), alcool etilic (absolut, de 96 sau 70°), acetonă, eter, cloroform (utilizaţi
în cantităţi mici), dimetilsulfoxid (DMSO), polietilenglicol (PEG), Tween, apă de
brom, clorură mercurică, hipoclorit de natriu sau de calciu, perhidrol etc.
 2. Substanţele necesare pentru
prepararea mediilor de cultură

Se analizeaza tipul de explant, provenienţa lui şi sezonul în care se recoltează. Se

aleage mediul cel mai echilibrat pentru a se asigura o evoluţie bună a inoculilor.

Dacă nu ne putem decide, vom face experienţe de tatonare, cu diferite medii.

Tipuri de concentraţii ale compuşilor frecvent întilniţi în mediile de cultnră (în
mM/L) (după De Possatd şi colab., 1974)
Constituîenţii Concentraţie (în mM/1)
Scăzută Medie Ridicată
SĂRURI MINERALE
NH4NO3 5 10 20
KNO3 — 10 20
KHSPO4 0,1 — —
NaH2PO4 __ 1 2
KC1 1.9 __ —
CaCl, 1 2 3
MgSO4 0,5 1,5 3
H3BO3 0,01 0,05 0,15
MnSO4 0,01 0,05 0,1
ZnSO4 0,001 0,02 0,04
CuSO4 0,00001 0,0001 0,0015
Na2Mo04 0,00001 0,0001 0,001
CoCl2 0,0001 0,0005 0,001
KI 0,0005 0,0025 0,005
FeSO4 0,01 0,05 0,1
Na,EDTA 0,01 0,05 0,1
A UXINE 0,0001 0,001 0,01
CITOCHININE 0,0001 0,001 0,01
SUBSTANŢE ORGANICE
Inozitol 0,1 0,3 0,6
Acid nicotinic 0,004 0,02 0,04
Piridoxină HC1 0,0006 0,003 0,006
Tiamină HC1 0,0001 0,002 0,04
Biotină 0,00004 0,0002 0,001
Acid folie 0,0005 0,001 0,002
Pantotenat de calciu 0,0002 0,001 0,005
Riboflavină 0,0001 0,001 0,01
Acid ascorbic 0,0001 0,001 0,01
L-Cisteină HC1 0,01 0,06 0,12
Glicină 0,0005 0,005 0,05
Zaharoză 6 60 120
 Sera de aclimatizare

Spaţiu destinat trecerii explantelor de la condiţii in vitro la conditii in vivo cu

parametri controlaţi.
 Conf.univ. dr. Adrian Peticilă

MICROÎNMULŢIREA
PLANTELOR HORTICOLE

@2013
 Asepsia în culturile vegetale in
vitro

ASEPSIZARE = STERILIZARE
Def. = procesul, operaţiunea de distrugere (cale fizică sau chimică), filtrare, înlăturare
(fizică), spălare sau ultrasonare a micro-organismelor şi a sporilor acestora;

Căi de sterilizare: A) distrugerea germenilor şi B) eliminarea germenilor.

DISTRUGEREA GERMENILOR
Arderea prin flambare;
Încălzirea cu căldură uscată sau vapori supraîncălziţi;
Iradierea cu raze gamma, microunde sau UV;
Agenti chimici: alcool etilic, soluţii clorurate, oxid sau pentaoxid de etilenă
(INFLAMABIL!!), apă oxigenată, apă bromată.

ELIMINAREA GERMENILOR
Filtrarea;
Spălarea în curent de apă sau apă staţionară cu agenţi spumanţi.
 INFECŢIILE PRIMARE
PREVENIREA INFECŢIILOR PRIMARE ESTE CONDIŢIE
SINE QUA NON ÎN CULTURILE IN VITRO

INFECŢIILE SECUNDARE
Se declanşează după câteva săptămâni de la inoculare.

PREVENIRE:

 Respectarea regulilor de asepsie la nivelul materialului vegetal;

 Respectarea asepsiei la nivelul recipientelor şi mediilor de cultură;

 Respectarea asepsiei la inoculare, cu instrumentar sterilizat ;

 Respectarea manipularii flacoanelor, fără contaminare.

 CONDITIE

Personalul trebuie să aibă cunoştinţe minime de microbiologie,

despre natura germenilor (virusuri, bacterii, alge, drojdii,
mucegaiuri) şi căile de transmitere şi reproducere a acestora.
 STERILIZAREA ÎNCĂPERILOR, A
SUPRAFEŢELOR ŞI
INSTRUMENTARULUI

Sterilizarea atmosferei încăperilor, mobilierului şi altor obiecte,

căile de acces, nişele, incintele.
Sterilizarea hotelor

!!! UV !!! Se întrerup cu 20-30 minute înainte de accesul personalului care

deserveşte lucrul la hote – pericol de contaminare.
Sterilizarea casoletelor, recipientelor cu mediu steril, a instrumentarului,
flacoanele cu inoculi în caz de repasare: la etuvă, autoclav, alcool 70°,
fierbere în baie de apă sau electrică, flambare.

Înainte de începerea operaţiunilor de lucru la hota: sterilizarea

instrumentarului prin introducere în alcool, flambare sau alte substanţe
bactericide.
Sterilizarea periodică a mâinilor operatorului prin pulverizare de alcool
etilic şi sterilizarea permanenta a instrumentarului în timpul lucrului.

!!!ATENTIE!!! Instrumentarul sterilizat poate fi fierbinte.

Acţiunea lui asupra plantelor poate sa le provoace daune totale.
 STERILIZAREA RECIPIENTELOR DE
CULTURĂ ŞI
DEZINFECTAREA ALTOR OBIECTE

• Recipientele de cultură - trebuie să fie presterilizate.

!!!ATENTIE!!! Presterilizarea poate produce degradarea calitătii sticlei şi

poate elibera compuşi toxici care influenţează negativ culturile.

• Dopurile de cauciuc sau din plută sau material plastic –

termorezistente, spălate, fierte şi sterilizate în prealabil.

• Dopurile de vată (se preferă) se asepsizează odată cu mediul de cultură.

• Aparatura care se introduce în hota sterilă se dezinfectează cu alcool etilic

70°
 STERILIZAREA LICHIDELOR, A APEI
ŞI A MEDIILOR DE CULTURĂ

Mediul de cultura: porţionat, obturat şi

sterilizat.

Dopul sau capacul nu se va închide etanş,

pentru
a permite circulaţia vaporilor de apă – agent
sterilizant.

Autoclavare la 120°, timp de 20-30 minute,

1 atm.

Vasele nu se umplu mai mult de ¾ din

capacitate - risc explozie din cauza variaţei de
presiune de la sfarşitul autoclavării.

Inocularile se operează numai după răcirea

mediului de cultură, la 24-48 h.
SUPRAAUTOCLAVAREA = se produce o alterare a calităţii mediului
de cultură prin deteriorarea echilibrul ionic din mediu, afectarea
capacităţii de solidificare a agarului, caramelizarea zaharozei.

SUBAUTOCLAVAREA = se dezvoltă coloniile de microorganisme, ceea

ce duce la inutilizarea lotului de mediu.
 ► Sterilizarea se poate face şi în kukta - oala sub presiune- cu capacitate
de 8-10 l.

Durata sterilizare: 15-25 minute de la momentul declanşarii emisiei de

vapori

► Sterilizarea la rece: se poate aplica mediilor lichide, prin filtrare cu nuci

filtrante de sticlă sau porţelan sau filtre Millipor.

► Substanţele dezinfectante în mediul de cultură

• practică mai putin uzitată

• inhibă dezvoltarea bacteriilor sau ciupercilor (oxidul de propilenă)
• inhibă viruşii (penicilina, streptomicina, cloramfenicol)

RISC: provoacă mutaşii, inhibă organogeneza, stopează organogeneza,

debilitate crescută la trecerea plantelor din in vitro în in vivo şi scade
capacitatea adaptativă)

► Sulfamidele în mediul de cultură

• au acţiune bacteriostatică puternică dar nu se folosesc în mediul de cultură

 ASEPSIZAREA
MATERIALULUI VEGETAL

Condiţie esenţială şi primă etapă în culturile in vitro.

☻ Se realizează numai cu agenţi chimici. ☻

Factori care influenţează tipul
de asepsizare:

1. specia;
2. condiţiile ecologice;
3. organul;
4. ţesutul;
5. poziţia în plantă;
6. vârsta;
7. fenofaza plantei.
 Succesul asepsizării depinde de:

 selectarea corectă a metodei de asepsizare;

 substanţele alese pentru sterilizare;
 concentraţia acestora;
durata de timp alocată asepsizării.

!!!! Organele subterane au cel mai

mare grad de infectare cu agenţi
patogeni (paraziţi, simbionţi sau
saprofiţi şi sporii lor)
 ATENTIE!!!

Mugurii, tulpinile, ramurile şi organele cu pilozitate:

------- aderă sporii germenilor cu uşurinţă;

------- împiedică accesul dezinfectantului direct pe suprafaţă;
------- tensiune superficială (→ spumant)
------- proceduri speciale: antibiotic în mediul de cultură ( ex.: Pelargonium sp)
 Privire generală asupra dezinfectanţilor

1. acţiune suficient de puternică;

2. toxicitatea nu trebuie să distrugă

ţesuturi/necroze;

3. trebuie să poată fi îndepărat cu

uşurinţă;

4. sterilizarea este doar de suprafaţă →

pot să apară infecţii la a 2-3 repasare
(bacterii, virusuri, micoplasme sau fungi
aflate în ţesuturile din organe)
 Tipuri de dezinfectanţi

ALCOOL ETILIC

Concentraţii variate: 70, 96 sau absolut.

Puternic liposolubilizant
Coagulant proteic excelent
Se recoamandă doar la organele cu pilozitate mare,
epiderma cutinizata puternic, muguri bine închişi.
Scufundare 5-60 sec.
Necesită clătire RAPIDĂ cu apă distilată pentru
rehidratare

APA BROMATĂ – mai puţin eficientă

CLORURA MERCURICĂ – toxicitate mare

HIPOCLORIT DE CALCIU sau SODIU (Apa de Javel)

Concentraţii variate;

Se recomandă submersarea unor porţiuni vegetale mai mari,

din care se va selecţiona ulterior materilaul de inoculat/NECROZARE;

Conţin 15-20% Cl → se recomandă folosirea imediată a dezinfectantului pentru

eficienţă;

Concentraţii recomandate: 1-8%;

Probarea eficacităţii soluţiilor pe bază de clor activ: colorarea în alb a zonelor lezate
prin tăiere sau înţepare;

Se recomandă spălarea ulterioară în aprox. 5 băi succesive (a 10-15 min fiecare) în

apă distilată, sterilă.
 PROCEDURI
RECOMANDATE

Fructe
PRESTERILIZARE: alcool etilic absolut
STERILIZARE: hipoclorit de Ca sau Na 2%, 10 minute.
POSTSTERILIZARE: clătiri în apă sterilă cu extragerea ţesuturilor care
interesează.
PROCEDURĂ: cultura de ovule.

Flori

PRESTERILIZARE: alcool etilic 70-90%, 1 minut

STERILIZARE: hipoclorit de Ca sau Na 2-5%, 15-20 de minute.
POSTSTERILIZARE: cca. 5 clătiri în apă sterilă
PROCEDURA: cultură de antere, multiplicare, propagare, iniţiere cultură
calus.
 PROCEDURI RECOMANDATE

Frunze
PRESTERILIZARE: ştergere suprafaţă limb cu alcool etilic absolut.
STERILIZARE: clorură mercur 0,1%, cca 1 minut..
POSTSTERILIZARE: cca 5 clatiri în apă sterilă să şi tamponare exces apă cu
hârtie filtru sterilă.
PROCEDURĂ: cultură calus, probeleme de diferenţiere - cere prezenţa
nervurii principale.
OBSERVAŢII: greu de sterilizat, necrozează usor.

Fragmente de tulpină
PRESTERILIZARE: clătire apă curgătoare şi alcool etilic absolut.
STERILIZARE: hipoclorit de Ca sau Na (2-5%, până la 10%), 15-30 de
minute; apă distilată, 1 oră.
POSTSTERILIZARE: cca. 3 clătiri în apă sterilă.
PROCEDURĂ: cultură de calus, multiplicare, propagare. Pentru cultura
de neoplantule.
OBSERVAŢII: respectarea polarităţii naturale.
 PROCEDURI
RECOMANDATE

Seminţe
PRESTERILIZARE: alcool etilic absolut, 10 sec., spălare apă distilată sterilă.
STERILIZARE: hipoclorit de Ca sau Na (10%), timp de 20-30 min./apa bromată
(1%), 5 min./clorură de mercur (15-30%)%, 15-20 min./fenol (5%).
POSTSTERILIZARE: cca 5 clătiri în apă sterilă
PROCEDURĂ: cultură de rădăcini, cultură de calus, nuguraşi şi organe pentru
regenerare neoplantule..
OBSERVAŢII: germinare pe hârtie de filtru, umectare constantă.

Organe de rezervă

PRESTERILIZARE: apă curgătoare cu agitare.

STERILIZARE: hipoclorit de Ca sau Na (2%), 20-30 de minute.
POSTSTERILIZARE: cca. 3 clătiri în apă sterilă.
PROCEDURĂ: cultură de calus, cultură de neoplantule.
 Conf.univ.dr. Adrian Peticilă

MICROÎNMULŢIREA
PLANTELOR HORTICOLE

@2013
 MEDIILE DE CULTURĂ

Def.: Medii aseptice, compozitie chimica de natura complexa, care

pot inlocui partial organismul matern al explantei, asigurand hrana
acestuia in conditii modificate.
Suportul fizico chimic necesar cresterii si dezvoltarii explantelor.

CATEGORII
Lichide, semisolide si solide.

CRITERII DE SELECTARE A MEDIULUI DE CULTURĂ:

Tipul de explant, modul de cultivare, proveniența, stadiul de dezvoltare

a explantului, specia, soiul, marimea, sezonul (important mai ales
pentru muguri), scopul culturii.
 GENERALITĂȚI

 Dacă nu există cercetări referitoare la multiplicare in vitro pe o specie,

se fac tatonari pe mediile standard cunoscute → modificari de
concentratie auxine, citochinine → reactia plantei.

 Mediile de cultură ajung la proprietățile finale numai după

sterilizare și autoclavare

 Cei care au studiat necesarul de elemente chimice pentru hrana

explantelor și evolutia lor: fiziologi specializați in nutriția plantelor.

 Recomandări:
Cultură de calus - Gamborg (B5), Gautheret, Heller, Murashige-Shoog
(MS).
Cultură de rădădcini – White.
Cultură diverse organe – Gamborg, Murashige-Shoog.
Cultură antere - Nitsch.
 COMPOZIȚIE

COMPUȘI ANORGANICI: apă, săruri minerale (macro și micro elemente)

COMPUȘI ORGANICI: glucide, vitamine, regulatori de creștere, agar etc.

COMPUȘII ANORGANICI
1. APA
Existența fară apă?
Procesele vitale în plante; metabolismul plantelor și apa.

Procesul de prelevare
Inoculare Depind de cantitatea
Cultura in sine
Aclimatizare
► de apă.

Reechilibrare osmotică prin imersie în concentrație salina moderată.

 COMPOZIȚIE

COMPUȘII ANORGANICI
1. APA

Apa în recipietele de cultură: circuit închis.

Reglarea temperaturii în camera de creștere;
Condensul din recipiente și pierderea acestuia prin neetanșeizarea
recipientelor
►
dezechilibrarea hidrică a explantelor.

apa bidistilată sau distilată vs. apa pură sau ultrapură

☺ ☻
optimă pentru considerată apă
realizarea moartă sau
mediului de nebiologică.
cultură.
 COMPOZIȚIE

COMPUȘII ANORGANICI
2. SĂRURILE MINERALE

Cele mai frecvente saruri folosite sunt

. fosfatii, azotatii, clorurile si
sulfatii de Ca, K, Mg, Mn, Al, Fe, Mo, Zn, Cu, Na.

Rolul fiziologic al fiecarui element din mediul de cultura

variaza in functie de concentratie, natura explantelor,
specificul culturii etc.

MACROELEMENTE
C, O, H, N, P, S, K, Ca, Mg

MICROELEMENTE
Fe, Mn, Zn, Al, B, Cu, Mo, Na, Co, I.

Proportiile lor in mediile de cultura se aleg conform cu scopul urmarit, fie

folosind retele deja consacrate, fie prin tatonari personale.
 COMPOZIȚIE

COMPUȘII ANORGANICI
MACROELEMENTE

Rolul macroelementelor in
. compozitia mediului

Exemple:
 omiterea N, S sau P in cazul culturilor de liber secundar la morcov
provoaca moartea inoculilor in cca 2 luni de la inoculare.
 Lipsa cationului de K duce la incetinirea cresterii culturilor.
 Marirea concentratiei cationului de K duce la marirea ratei cresterii
culturilor de tutun si vita de vie salbatica.
 Carentele de Ca si Mg genereaza tulburari vegetative culturilor, pana
la moartea celulelor.
 Absenta NH4NO3 pt culturile de Lactuca sativa genereaza doar calus,
fara sa se produca diferentierea mugurasilor.
 Tesuturile senescente sau ameliorate cer medii cu continut de Ca
suplimentar.
 COMPOZIȚIE

COMPUȘII ANORGANICI
MICROELEMENTE

Rolul microelementelor in
. compozitia mediului

Exemple:
 Fe intervine in metabolizarea intranucleara, sinteza ARN si sinteza
proteica; necesita a fi administrat sub forme chelatizate, deoarece este
greu de asimilat.
 Lipsa Zn modifica sinteza auxinei.
 Mn participa la proteosinteza si formarea ARN-ului in celulele
radacinilor de mazare
 B are rol in procesele de diviziune si crestere celulara
 Al este catalizator al multor reactii chimice.

OMITEREA totala a microelementelor din mediile de cutura conduce la

reducerea cresterii celulare cu 40% → in final, dupa a 3-a repasare la
decesul culturii.
 MEDIILE RECOMANDATE

 WHITE (1943) recomandat pentru culturile de tesuturi tumorale.

 HELER (1953) recomandat pentru multe culturi, mai putin tutun.
 KNUDSON (1925) recomandat pentru orhidee si ferigi.
 MURASHIGE-SKOOG (1962) recomandat pt culturi de calus la
tutun si culturi de celule la majoritatea speciilor. Numit mediu
universal.
 GAMBORG (1968) recomandat in germinarea in conditii aseptice a
semintelor.

AGARUL

Produs natural extras din alegele marine aduce un procent

suplimentar de elemente chimice (Ca si Mn).
Influenteaza potentialul osmotic si difuzia nutrientilor.
 pH-ul mediului de cultura MS

Ph-ul si precipitarea mediilor de cultura

Mediul MS standard → autoclavare → turbiditate in urma precipitarii si

scaderii pH-ului cu 0,2-0,5 unitati.

Cauza: ionii bivalenti de Fe, in precipitare oxideaza in Fe trivalent ce

precipita sub forma de ion fosfat feric.

Corectiile se fac cu citrat de Na ( variatia este limitata la 0.15 unitati

pH).

Cercetarile continua.
 COMPUȘII ORGANICI

COMPUȘII ORGANICI
ROL

 1934 WHITE - zaharoza si extractul neautolizat de drojdie

(contine glicina/aminoacizi si tiamina/vitamine) aduc
superioritate nutritionala mediilor de cultura.

 1934 – s-a descoperit pricipiul de actiune al AUXINELOR.

 1938 ROBBINS SI SCHMIDT – piridoxina si acidul nicotinic sunt

adaugate in mediu.
 COMPUȘII ORGANICI

CARBONUL ORGANIC
ZAHAROZA

Culturile vegetale evolueaza optim la o concentratie a zaharozei de

2-3% (3% glucoza doar pentru culturi de meristeme la unele specii
lemnoase).Variatiile intre 1,2% - 8% (cartof): in functie de natura
explantului, tipul de cultura, specie si scopul culturii.

 Mediul de cultura contine adaos de carbon glucidic, ceea ce

asigura substrat respirator pentru culturi ( prin degradarea
glucidelor se obtine energia necasara proceselor vitale,
multiplicarii, cresterii si diferentierii celulare).
 Polimerizarea glucozei duce la celuloza, compus de baza al
peretelui celular.
 Zaharoza prezinta eficienta maxima in procesele metabolice la
nivelul culturilor in vitro (alte surse: glucoza, fructoza, maltoza,
rafinoza, amidonul).
 Excesul de zaharoza: celulele plasmolizeaza din cauza presiunii
osmotice
 COMPUȘII ORGANICI

CARBONUL ORGANIC
ALCOOLI
GLICEROLUL poate fi folosit ca sursa energetica, potentand efectul
glucidelor.
MONOALCOOLII (metanol, etanol, propanol, butanol) nu pot fi
utilizati, fiind toxici (chiar si la dilutii mari).

AZOTUL ORGANIC
Tesuturile vegetale sunt autotrofe fata de azot, preluandu-l din
substantele anorganice.
1939, WHITE --- GLICINA imbunatateste cresterea radacinilor la
tomate.
UREEA si UNELE BAZE AZOTATE ----surse eficiente de azot organic.
1981, BIONDI si THORPE --- utilizarea aminoacizilor in mediile de
cultura are efecte bune in conditiile in care urmarim formarea
calusului; atentioneaza asupra faptului ca sursele de azot organic in
culturi pot fi toxice.
 COMPUȘII ORGANICI

VITAMINELE
 Avantajele vitaminelor in cultura explantelor s-au descoperit
intamplator (1922-1940) – dupa WHITE.
 Orice mediu de cultura contine vitamine la aceasta data, fiind
considerate indispensabile.
VITAMINA B1 VITAMINA H ACIDUL FOLIC
(TIAMINA) (BIOTINA)  Efect stimulant asupra
 Valoare biologica  Utilizata inca din tesuturilor tumorale
importanta. 1946 (Morel). dar si efect toxic
 Stimuleaza cresterea  Exercita efect urmare a
celuleor si tesuturilor. stimulator asupra descompunerii in acid
culturilor de celule. p-aminobenzoic (factor
de crestere insa).
ACIDUL
NICOTINIC
 Utilizat inca din VITAMINA B6 INOZITOL
1938; indispensabil. (PIRIDOXINA) (glucid/vitamina)
 Precursor al  Obligatoriu in mediul
VITAMINA C enzimelor. de cultura dar nu se
(ACIDUL ASCORBIC) cunoaste clar rolul
 Actiune antioxidanta. fiziologic.
 COMPUȘII ORGANICI

FITOHORMONII/FITOREGULATORII
 Stimuelaza, inhiba sau modifica calitativ si cantitativ cresterea si
dezvoltarea explantelor.
 Concentratii foarte mici, de ordinul 1mM sau μM.

FITOHORMONII ►produc modificari la nivelul proceselor de

morfogeneza, organogeneza, embriogeneza, cu urmari in dezvoltarea
celulara, tisulara, organica, diferentierea celulara sau la nivelul intregii
plante.
FITOREGULATORII ► regulatori chimici, organici, compusi de sinteza
care ―imita‖ efectele hormonilor naturali, devenind indispensabili in
biotehnologiile vegetale.

INFLUENTA FITOHORMONILOR (raspunsul imediat sau intarziat

al plantei) depinde de starea fiziologica a centrilor receptori (celule,
tesuturi, organe), stadiul de dezvoltare al organelor plantei, natura si
nivelul semnalului, interactiile acestuia cu alti fithormoni, conditiile de
mediu s.a.m.d.
 COMPUȘII ORGANICI

FITOHORMONII/FITOREGULATORII
 Multiplicarea si cresterea celulara - fenomene complexe- pot produce
reactii particulare urmare a interactiunii dintre fitohormonii explantei si
fitoregulatorii administrati in mediul de cultura.
CINCI MARI CATEGORII DE FITOHORMONI
AUXINE, CITOCHININE, GIBERELINE, ACIDUL ABSCISIC, ETILENA.
DARWIN 1880
Intuieste existenta fitohormonilor.
Peste un secol, inca nu se cunosc mecanismele de interactiune si toate
procesele implicate.
WENT 1928
Descoperirea care a lansat fitotehnologia: identifica ―auxina A‖ in
urina umana.
ANII 30
Se descopera actiunea giberelinelor, acidului abscisic si etilenei.
SKOOG 1955-1956
Izoleaza din sperma de heringi ―chinetina‖ (6 –furfurilaminopurina).
STEWARD 1956
Citochininele native din laptele de cocos.
 COMPUȘII ORGANICI
AUXINELE

 In plante, auxinele se gasesc libere (AIA) fie legate -sub multiple forme,
sau combinatii ale AIA cu acid aspartic, glutamic sau acid ascorbic
TIPURI DE AUXINE
AIA (auxina nativa), AIB (acidul 3-indolilbutiric-nu se gaseste in toate speciile
vegetale), ANA (acidul 1-naftilacetic), 2,4-D (acidul 2,4-diclorfenoxiacetic),
4ACFA SAU ACPA (acidul 4- clorfenoxiacetic), ANOA (acidul 2-naftoxiacetic),
2,4,5-T (acidul 2,4,5-triclorfenoxiacetic), DICAMBA (acidul 3,6-dicloro-2-
metoxibenzoic), PICLORAM (acidul 4 amino-3,5,6-tricloro-2-piridincarboxilic) ,
AMCA (acidul 2-metic-4-clorfenoxiacetic).
ACTIUNEA FIZIOLOGICA A AUXINELOR
1. Cresterea in lungime a celuleor (marirea plasticitatii peretilor celulari);
2. Permeabilizarea membranelor plasmatice;
3. Influente pozitive asupra sintezei ARN ribozomal;
4. Stimuleaza diviziunea celulara (alaturi de citochinine);
5. Influenteaza sinteza de etilena;
6. Influenteaza cresterea celulelor in tropisme;
7. Implicate in fenomenul de dominanta apicala, caulinara;
8. Actiune inhibitoare asupra caderii frunzelor si fructelor;
9. Actiune rizogena—stimularea butasilor in inmultirea vegetativa;
10. Inhiba formarea embrionilor somatici.
 COMPUȘII ORGANICI

AUXINELE

 La concentratii mici: actiune benefica asupra cresterii;

 La concentratii mai mari: actiune inhibitoare sau chiar toxica (dicamba

sau 2,4-D) ► auxinele de sinteza devin erbicide.

Auxinele de sinteza

 ANA SI 2,4-D sunt cele mai stabile;

 Viteza de degradare si capacitatea de actiune depinde de multi

factori: tipul tesutului, natura si concentratia auxinei, fenofaza
plantei, organul supus tratamentului.

 Radacinile sunt mai receptive la concentrati scazute de auxine;

 Tulpinile, frunzele si fructele (in formare) cer concentratii mai

ridicate de auxine.
 COMPUȘII ORGANICI
CITOCHININELE

 In absenta citochininelor, CELULELE NU SE DIVID.

 1955: la 3 luni de la izolarea citochininei, de sintetizaza benzil-adenina/
benzilanimopurina/BA/BAP)
 Citochininele native se regasesc in multe extracte vegetale (drojdie de
bere, germeni de porumb, lapte din nuca de cocos)
TIPURI DE CITOCHININE
K sau KIN(CHINETINA sau KINETINA), Z (ZEATINA), BA sau BAP
(BENZILADENINA sau BENZILAMINOPURINA), 2iP
(IZOPENTENILADENINA), TDZ (TIDIAZURON)
PARTICULARITATI
Biosinteza citochininelor se realizeaza in radacini si embrioni, in meristeme.
Se folosesc, de regula, in dilutii mari si suporta bine autoclavarea.
AUXINE + CITOCHININE = BALANTA HORMONALA
Concentratii sporite de auxine ►potenteaza rizogeneza.
Concentratiile sporite de citochinine ► potenteaza formarea de muguri si
generarea de tulpinite.
Concentratii sporite din ambele ►potenteaza morfogeneza si procesele de
calusare.
 COMPUȘII ORGANICI

CITOCHININELE

ACTIUNEA FIZIOLOGICA A CITOCHININELOR

1. Impulsioneaza diviziunea celulara;

2. Stimuleaza formarea de mugurasi si tulpinite, in functie de
concentratie si balanta;
3. Stimuleaza proteosinteza (au fost gasite citochinine legate de ARN
transfer);
4. Rol in preventia senescentei;
5. Efect antagonic auxinelor, anihiland dominanta apicala a mugurelui
terminal;
6. Sustine capacitatea de supravietuire a inoculilor;
7. Favorizeaza si sustine multiplicarea celulara;
 COMPUȘII ORGANICI

GIBERELINE

 Descoperite in 1926 de KUROSAWA si izolata abia in 1935, cea mai

activa giberelina fiind acidul giberelic (AG3);
 Importanta mai mica decat auxine si citochinine.

ACTIUNEA FIZIOLOGICA A GIBERELINELOR

 Produc alungirea internodiilor tulpinilor si a rahisului

inflorescentelor;
 Ajuta la inlaturarea fenomenului de nanism;
 Rol in reglarea nivelului endogen de auxina;
 Suprimarea latentei la nivelul semintelor, mugurilor sau
organelor de rezerva;
 Actiune complexa in anteza;
 Rol in formarea fructelor partenocarpice;
 Rol in germinarea semintelor;
 AG3 nu exercita vreo actiune asupra rizogenezei.
 COMPUȘII ORGANICI

GIBERELINE
Particularitati

 Biogeneza este localizata in extremitatile radacinilor ,

embrionilor, frunzelor foarte tinere si mugurilor activi;

 Semintele contin cea mai mare cantitate de gibereline,

cele imature fiind cele mai bogate in fitohormoni;

 Folosirea giberelinelor in culturi in vitro se face cand se

urmareste favorizarea alungirii meristemelor
caulinare, apicale;

 Absenta giberelinelor in mediul de cultura poate

genera un fenomen de crestere globuloasa.
 COMPUȘII ORGANICI
ETILENA

 Fitohormon recent recunoscut, identificat insa din 1901 de

NELJUBOV;
 Hidrocarbura nesaturata gazoasa, a fost greu de identificat in
celule deoarece fructele verzi au un continut mic de etilena (mai
mare in fructele in coacere);
 Auxinele naturale stimuleaza biogeneza de etilena.
---------------
 Mai putin utilizata in culturi in vitro, fiind gazoasa; se foloseste
sub forma de acid 2-cloroetilfosfonic (ACEP);

 Etilena este insa prezenta in recipientele de cultura;

 ! Explantele care sufera de fenomenul de vitrificare (hiperhidrie)

au o productie de etilena care duce la lignificarea vaselor
lemnoase si rigidizarea peretilor celulari parenchimatici.
 COMPUȘII ORGANICI
ETILENA

ACTIUNEA FIZIOLOGICA A ETILENEI

-cercetarile continua-

 Control asupra cresterii permeabilitatii membranelor plasmatice;

 Stimuleaza caderea frunzelor, coacerea si caderea fructelor;
 Influenteaza deschiderea florilor, ofilirea si decolorarea;
 Induce senescenta tesuturilor;
 Intervine in transportul auxinei;
 Celulele supuse traumelor produc si emana etilena;
 Stimuleaza rizogeneza adventiva;
 Inhiba cresterea in lungime a radacinilor;
 Influenteaza geotropismul radacinilor;
 Stimuleaza cresterea izodiametrica a celulelor.
 COMPUȘII ORGANICI

ACIDUL ABSCISIC (AAB)

 ROL important in viata cormofitelor;

ACTIUNEA FIZIOLOGICA A ACIDULUI ABSCISIC

 Produce inhibitie asupra cresterii si dezvoltarii embrionilor,

mugurilor si meristemelor;
 Implicat in procese de latenta a organelor de rezerva, mugurilor
si semintelor;
 In concentratii scazute AAB inhiba efectele AIA si ale
giberelinei;
 BIOSINTEZA AAB se afla in frunze (in toate etapele dezvoltarii
plantei);
 Utilizat in mica masura in culturile de tesuturi.
 COMPUȘII FENOLICI

 Compusi toxici, eliberati in special de speciile lemnoase, in conditii

de stres, care prin actiunea lor antagonica substantelor de crestere,
inhiba reactiile metabolice, oprind cresterea si potentand fenomenul
de dormanta indus de AAB, senescenta si necroza.

 Eliminarea lor in mediul de cultura se face atata de celulele agresate

cat si explantul in general, de celulele din profunzime.

Fenolii se elimina → oxideazarea → brunifcarea mediului →

necrozarea celulelor → moartea inoculilor.

 PREVENTIA se realizeaza:
1. Operarea a 2-3 culturi succesive, repasari, mediu nou;
2. Precultivarea meristemelor pe medii de cultura lichide, 3 zile,
15°C, lumina continua la 500 lucsi, mediu solid;
3. Adaugarea in mediul de cultura a unor substante antioxidante:
cisteina HCl, acid ascorbic, acid citric, DDT(ditiotreitol);
4. Adaugarea in mediul de cultura de carbune vegetal;
5. Pastrarea in intuneric a explantelor inoculate pentru o perioada
scurta de timp.
 EXTRACTELE VEGETALE

 Extract drojdie de bere, hidrolizat de cazeina, suc de portocale, suc

de tomate, lapte din nuca de cocos, extract de malt, extract de
endosperm imatur de porumb etc.

 Se utilizeaza in concentratii scazute (de 0,1-1 g.l).

 Exista reactii necunoscute ale acestora urmare a necunoasterii

complete a compozitiei chimice.
 COMPUSI ANTIVIRALI

 Scop: obtinere de culturi libere de viroze;

 Procedura este putin folosita in practica curenta;

 Exemple: ribavirina, DHT (2,4-dioxohexahydro - 1,2,5-triazina);

 Studii facute pe Cymbidium, Prunus sp., Malus sp.;

 Prezinta fitotoxicitate iar eficacitatea este conditionata de tipul de

virus, specia virusata si chiar cultivar (BOXUX 1995).
 PREPARAREA MEDIULUI DE
CULTURA

Tehnologia de preparare a fost evidentiata in cadrul lucrarilor practice.

Atentionare: folosirea substantelor termolabile a caror sterilizare nu se

pate face prin autoclavare, acestea se adauga in mediu ulterior
autoclavarii, cand temperatura mediului are 35-37°C.

Se tine cont de toate informatiile referitoare la manipularea

substantelor chimice intr-un laborator, se lucreaza in curatenie si cu
atentie.

PROBLEME:
 Precipitatele insolubile
 Infectiile: solutii stoc invechite, vase de cultura nespalate si
nedezinfectate, autoclavare necorespunzatoare, lipsa curateniei in
camera de preparare a mediului
Nesolidificarea mediului dupa racire: prea putin agar (sub 5-
6g/l),pH prea mic (sub 5,5),temperatura de autoclavare prea mare
 MEDIULUI DE CULTURA

CATEGORII DE INFECTII DIN MEDIILE DE CULTURA:

1. origine micotica: fructificatii de diferite culori (negru – Aspergillus
sp., verde-albastru – Penicillium)
2. origine bacteriana: in mediu si la suprafata lui, in zona de contact cu
planta, halou translucid, de culopare alb galbuie
3. brunificarea mediului: provocat de oxidarea fenolilor emisi de
planta
4. vitrificarea/sticlozitatea
5. deshidratarea mediului: umiditate defectuoasa.
 Conf.univ.dr. Adrian Peticilă

MICROÎNMULŢIREA
PLANTELOR HORTICOLE

@2013
 FAZELE PROPAGĂRII
IN VITRO

ETAPE:
1. PREGĂTIREA MATERIALULUI VEGETAL
2. INIȚIEREA ȘI STABILIZAREA CULTURII
3. MULTIPLICAREA
4. ÎNRĂDĂCINAREA
5. ACLIMATIZAREA
 FAZELE PROPAGĂRII
IN VITRO

1. PREGĂTIREA MATERIALULUI VEGETAL

ÎN VEDEREA PRELEVĂRII EXPLANTULUI

Etapa documentară ►crucială pentru desfășurarea cu succes a

procesului

Ce informații stocam?
Tipul de cultură dorit;
Natura, mărimea și numărul de inoculi;
Natura și proveniența explantului, gradul de dezvoltare a plantei
mamă, fenofaza, condițiile de creștere;
Mediul de cultură ales și compoziția acestuia; variațiile.
Tipul de instrumentar necesar procedurii ce urmează a se desfășura în
etape repetitive;
Regimul culturii: factorii reglabili ca temperatură, umiditate, lumină –
fotoperioadă;
Particularități tehnice.
 FAZELE PROPAGĂRII
IN VITRO
continuare

MORFOLOGIA EXPLANTULUI

Explantul trebuie să fie VIU, ideal să conțină meristeme, să nu fie

necrozat, modificat sau cu țesuturile mecanice distruse.

Se notează:
 Originea explantelor, specia, varietatea, clona, linia;
 Determinarea ecologică a provenienței plantei donor: câmp deschis,
sere, solarii, camere de creștere, depozite sau culturi primare;
 Expoziția pe planta donor;

Se știe că:
 Se recomandă ca explantele să fie recoltate din porțiunile tinere ale
plantei donor.

Plantele din spațiile închise au șanse de infestare mai mică.

Există o corelare între localizarea explantului pe planta mamă și

contaminarea cu germeni daunători (distanța față de sistemul radicular).
 FAZELE PROPAGĂRII
IN VITRO
continuare

Se știe că:
 Variabilitate mare de reacție: în funcție de biotipurile unei specii, de
soiurile alese sau varietăți precum și de originea sa biologică
(morfologică, funcțională sau de fenofază și sezon)

Variabilitate mare de reacție la explante din considerente morfo

funcționale:
Vârful, mijlocul sau baza ramurii;
Ramură umbrită sau nu, solarizată sau nu;
La plante lemnoase: zonele mai apropiate de polul radicular sunt
cele mai bine aprovizionate cu apă, hrană și hormoni;
Prezența meristemelor: vârfuri rădăcini, noduri, bractee,
inflorescențe, apexuri.

Variabilitate în funcție de condițiile ecologice.

 GENERALITĂȚI
NATURA ȚESUTURILOR

Natura țesuturilor componente:

∑
Variabilitate structurală și funcțională mare
≡
Totipotența celulară

↓
Regenerare la nivelul inoculilor

↓
Diferențiere celulară
 GENERALITĂȚI
VÂRSTA PLANTEI DONOR/PLANTEI MAMĂ SAU A
ORGANULUI DIN CARE SE PRELEVEAZĂ

Cea mai ridicată capacitate regenerativă o au: cotiledoanele,

hipocotilele și mugurașii.
 GENERALITĂȚI

VÂRSTA PLANTEI DONOR/PLANTEI MAMĂ SAU A

ORGANULUI DIN CARE SE PRELEVEAZĂ

Metode care pot ajuta prelevarea din

plante donor mature/bătrâne:

 Tratamente termice
 Stimularea drajonarii (juvenilizarea)
 Regulatori de creștere
 Regim special de iluminare
 Culturi de plantă mamă în regim de
termoterapie

Riscul prelevării din plante

bătrâne: infecții și viroze mult mai
agresive

Arachis Hypogea
 GENERALITĂȚI

MOMENTUL DE RECOLTARE
Crucial și LIMITAT, chiar și la o unică fenofază.
Recoltarea se poate face:
 În cursul germinației semințelor
 Un anumit moment din formarea celulelor generative la nivelul
inflorescenței
 Punctual, la un moment dat în timpul creșterii frunzelor, fructelor sau
semințelor
 În perioada de latență a mugurilor

RECOMANDARE
Recolatarea explantelor se face conform recomandărilor manualelor de
specialitate cu respectarea condițiilor menționate pentru specia, genul,
familia sau cultivarul respectiv, în funcție de sezon.

Plantele lemnoase din climat temperat pun probleme mari ref. la perioada
de recoltare a materialului vegetal pentru inoculare, reușita depinzând de
sezon, momentul recoltării și condițiile pedoclimatice.
 GENERALITĂȚI

MĂRIMEA EXPLANTELOR

Cunoștinte de anatomie vegetală și cunoașterea

amplasării țesuturilor care se vor preleva.

INDUSTRIAL:
se preferă apexuri, meristeme apicale.

Dimensiunea explantului se cere a fi minimă, la limită, dar să se

asigure totipotența celulară; standardizată pentru fiecare specie, soi, în
funcție de natura explantului, fenofaza plantei donor sau a organului
din care se prelevează.
DAR
Explant mare► pericolul de infecție crește; deshidratarea accentuată.
▼
Regenerare mai rapidă în mediu de cultură.

Suprafața de contact a explantului cu mediul de cultură trebuie să fie

suficient de mare pentru a se asigura schimburile gazoase și absorbția
hranei și a apei.
 GENERALITĂȚI

STERILIZAREA MATERIALULUI VEGETAL

Succesul asepsizării depinde de:

 selectarea corectă a metodei de asepsizare;

 substanţele alese pentru sterilizare;
 concentraţia acestora;
durata de timp alocată asepsizării.

FACTORII care influenţează DE RETINUT

tipul de asepsizare: 1. acţiune suficient de puternică;
2. toxicitatea nu trebuie să distrugă
1. specia; ţesuturi/necroze;
2. condiţiile ecologice; 3. trebuie să poată fi îndepărat cu
3. organul; uşurinţă;
4. ţesutul; 4. sterilizarea este doar de
5. poziţia în plantă; suprafaţă → pot să apară infecţii la
6. vârsta; a 2-3 repasare (bacterii, virusuri,
7. fenofaza plantei. micoplasme sau fungi aflate în
ţesuturile din organe)
 GENERALITĂȚI

STERILIZAREA MATERIALULUI VEGETAL

Se face cu scopul de a elibera plantele de agentiipatogeni .

Se folosesc agenti chimici, in diferite concentratii in functie de natura

explantului, de tipul lui.

Caracteristici importante pentru un dezintectant:

•sa distruga agentii patogeni;
•sa nu afecteze tesuturile;
•sa se curete usor de pe materialul vegetal.

Tipuri de agenti de sterilizare: alcool, hipoclorit sodiu, hipoclorit

de calciu, apa oxigenata, apa bromata, azotat de argint, clorura
mercurica, antibiotice.
 FAZELE PROPAGĂRII
IN VITRO

2. INIȚIEREA ȘI STABILIZAREA CULTURII

INOCULAREA
Def. = introducerea explantului sterilizat, aseptic, în medii de cultură sterile.
De reținut:
 Pornirea hotei se face cu 20 de minute înainte de demararea activității, cu
sterilizarea prealabilă a suprafeței de lucru;
Echipament steril (halat, manuși, măști);

 Dezinfecția permanentă a mâinilor și

brațelor;
Activitatea în camera sterilă începe la
15-30 minute de la oprirea UV;
 Pe perioada activității, se evită
mișcările inutile, formarea curenților
de aer iar conversația se limitează la
maxim;
 INIȚIEREA ȘI
STABILIZAREA CULTURII

 STERILIZAREA MATERIALULUI BIOLOGIC

 Se face la hotă, conform

procedurilor stabilite;
 Îndepărtarea agentului
sterilizant se face tot la hotă, cu
apă sterilă, conform
procedurilor agreate inițial;
 Se recomandă evitarea
păstrării explantului în stare
submersă, prevenind astfel
necroza (anaerobioza)
 Explantul sterilizat se
păstrează în capsule Petri
sterile sau pe hârtie de filtru
sterilă umectată cu apă
sterilă;
 INIȚIEREA ȘI
STABILIZAREA CULTURII

INOCULAREA

! ! În momentul inoculării, mâinile vor trebui să tină simultan recipientul

cu mediu, dopul (capacul sau bușoanele speciale), penseta (bisturiul sau ansa)!!
 Etanșeizarea recipientului se face cu folie polietilenă sau aluminiu;
 Periodic, masa de lucru se eliberează, pentru a nu încărca spațiul steril;
 Fluxul operațiunilor trebuie să se desfășoare constant, ritmic, ordonat;

REȚINEM
!!Instrumentarul, recipientul sau
dopul cazute pe suprafața de lucru
se îndepărtează imediat, fără a mai
fi refolosite.
 INIȚIEREA ȘI
STABILIZAREA CULTURII

INOCULAREA

 Manipularea explantului se face cu grijă, cu instrumentar sterilizat și RĂCIT

în prealabil;
 Se va respecta polaritatea: polul caulinar se plasează în afara mediului;
 Se plasează orizontal sau ușor oblic (la inoculi meristematici – apicali sau
axilari , se va căuta a se pune în contact mediul cu suprafața secționată);
 Explantul se introduce ușor în mediul de cultură, cât să prezinte stabilitate și
să nu se răstoarne;
Recipientele se etanșeizează, se etichetează și se trimit în camera de creștere.

REȚINEM
!! Explantul scapat din pensetă pe
suprafața de lucru sau care, în
timpul manipulării, atinge alte
suprafețe în afara hârtiei de filtru
sterilă pe care se lucrează, se
îndepărtează imediat, fără a mai fi
refolosit.
 INIȚIEREA ȘI
STABILIZAREA CULTURII

STABILIZAREA CULTURII

 perioada de incubare și creștere a culturilor variază în funcție de tipul

culturii, specia și natura explantului folosit, condițiile din camera de creștere și
protocolul folosit;
!! INFECȚIILE!! CATEGORII DE INFECȚII DIN MEDIILE DE CULTURĂ:
1. origine micotică: fructificații de diferite culori (negru – Aspergillus sp., verde-
albastru – Penicillium)
2. origine bacteriană: în mediu și la suprafața lui, în zona de contact cu planta,
halou translucid, de culoare alb galbuie;
3. brunificarea mediului: provocat de oxidarea fenolilor emiși de plantă;
4. vitrificarea/sticlozitatea;
5. deshidratarea mediului: umiditate defectuoasă.

 Culturile se stabilizează, de regulă, în primele 14

zile de la inoculare;
 infecțiile latente – virusurile.
 INIȚIEREA ȘI
STABILIZAREA CULTURII

STABILIZAREA CULTURII

 Eliminarea recipientelor infectate din camera de creștere se face imediat

cum acestea apar;
 Se urmăresc condițiile de mediu din camera de creștere conform cu
protocolul de lucru stabilit inițial;
 Se fac notări zilnice asupra evenimentelor care suvin asupra culturii, pentru
evidențierea succesului sau eșecului inițierii și validității protocolului de lucru;

PARTICULARITĂȚI
o Explantele generate
de plante ierboase au
primele manifestări
vegetative la 14 zile
maxim de la inoculare;
o Explantele provenind
de la plantele lemnoase
manifestă vegetativ la
40-60 de zile.

Allium cepa - esalota

 FAZELE PROPAGĂRII
IN VITRO

3. MULTIPLICAREA.
SUBCULTIVAREA SAU REPICAREA
Multiplicarea: transferul sau pasarea inoculilor pe medii proaspete
sau alte medii, cu compozitie diferita (hormoni), prin realizarea de
subculturi; operațiune indispensabilă în toate ramurile biotehnologiei.

Meristemele apicale și apexurile caulinare → tulpinițe cu

rădăcinuțe → vitroplantule (similar înmulțire vegetativă butași);
Nod, internod și alte segmente de organe → mugurași → tulpinițe;
 MULTIPLICAREA.
SUBCULTIVAREA SAU REPICAREA

Subculturile se realizează prin:

 Despărțirea culturii generale

 Transformarea tulpinițelor în noi inoculi prin microsecționare
 Separarea glomerulelor (orhidee)

Multiplicare clonală: se detașează material biologic din cultura inițială și

se multiplică de câte ori este nevoie, pe medii cu aport de citochinine.

Culturile de calus: se repică periodic, fragmentate, pe medii proaspete cu adaus

de auxine.

Culturile de rădăcini: multiplicarea se operează periodic, obligatoriu, prin tăieri în

masa radiculară și transferarea apexurilor pe medii lichide; în caz contrar, cultura
moare.
 MULTIPLICAREA.
SUBCULTIVAREA SAU REPICAREA

Senescenta culturii. Cauze posibile:

• Carențe provenite din hrănirea neadecvată a celulelor din mediul de
cultură
• Epuizarea proprietăților mediilor de cultură
• Toxicizarea mediului de cultură.
MOMENTUL multiplicării: se alege în funcție de scopul culturii, de natura și
tipul culturii și de particularitățile de reacție ale explantelor.

Semne ale unei culturi care necesită multiplicare:

 calusul devine brun, cenușiu sau se usucă,
 frunzulițele bazale se îngălbenesc,
 crește gradul de vâscozitate al suspensiilor celulare.
 MULTIPLICAREA
SUBCULTIVAREA SAU REPICAREA

Tehnologie:
 se realizează în condiții aseptice
 !! Atenție deosebită acordată sterilizării instrumentarului, recipientelor
și condițiilor igienice din camera de inoculare;
 etichetare cu păstrarea datelor importante pentru identificarea
culturilor.
 FAZELE PROPAGĂRII
IN VITRO

4. ÎNRĂDĂCINAREA
Reprezintă etapa de pregătire a materialului vegetal pentru trecerea
in vivo, în spații protejate întâi și apoi în câmp prin stimularea
aparitiei sistemului radicular.
Mediul de înrădăcinare folosit: auxine în concentrații mari și
gibereline cu adaos de cărbune vegetal.
Se produc: limitarea lăstăririi axilare, stimularea alungirii lăstarilor,
inducerea rizogenezei și formarea rădăcinilor.

PROBELEME: mediul cu auxine poate produce inhibiția plantelor; se

temperează printr-un tratament inductiv cu auxine cencentrate și apoi
introducerea în mediul de înrădăcinare.

ATENȚIONARE: plantele înrădăcinate in vitro au

rădăcini glabre, fără perișori absorbanți și foarte
sensibile.
 FAZELE PROPAGĂRII
IN VITRO

5. ACLIMATIZAREA
Cea mai dificilă etapă în producerea materialului prin micropropagare.
.
PROCEDURĂ:
1. Lăstarii înrădăcinați se plasează în substraturi.
2. Se depozitează în spații cu umiditate ridicată și temperatură controlată.
3. Fortificare și creștere în câmp, pentru câteva luni.
4. Livrare materialului săditor.

 Durează aproximativ 2 săptămâni;

 La plasarea în substrat, plantele se
spală de agar- sursă de infecții;
 Ghivecele și substratul se
sterilizează;
 Plantele pot intra în repaus →
tratament cu gibereline 200ppm.
DISCUȚII
 Conf.univ. dr. Adrian Peticilă

MICROÎNMULŢIREA
PLANTELOR HORTICOLE

@2013
 ORGANOGENEZA

ORGANOGENEZA

Def.:
Capacitatea ţesuturilor vegetale de a forma organe de novo, bazată pe înşuşirea
celulelor somatice specializate de a dediferenţia şi a se reîntoarce la stadiul de celule
meristematice, capabile de diviziune activă cu generare de primordii de organe,
lăstari, frunze, flori sau părţi floarale.

MICROPROPAGAREA se bazează pe regenerarea de

LĂSTARI ( CALUGOGENEZĂ) şi
RĂDĂCINI (RIZOGENEZĂ)

MERISTEMOIZII
Def.:
Celule cu caracteristici meristematice, rezultate în urma diviziunii celulare
repetate, cu plasticitate morfogenetică mare (diferite medii de cultură şi diferiţi
factori climatici generează diferite primordii de organe)
 ORGANOGENEZA

ORGANOGENEZA DIRECTĂ/ADVENTIVĂ
Primordiile se dezvoltă direct din meristemoizii derivaţi direct din explantul iniţial.

ORGANOGENEZA INDIRECTĂ
Celulele explantului iniţial se divid şi generează ţesut calusal, în care apar
meristemoizii, din care, ulterior dau rădăcini adventive.

Explant iniţial ► meristemoid ► primordii de organe

(organogeneză directă)

Explant iniţial ► calus ► meristemoid ► primordii de organe (organogeneză

indirectă)
 CULTURILE DE
APEXURI

Cea mai răspândită cultură in vitro, aplicabilă la toate speciile, soiurile şi cultivarurile,
cu excepţia plantelor reticente la acest procedeu.

APEX: vârf de creştere al unui lăstar; întâlnit la plantele ierboase cât şi la lemnoase.

Asociată cu termoterapia, se utilizează pentru devirozarea portaltoilor şi

soiurilor:
• t°: 37-39 grade;
• Apexurile au rata de creştere mai rapidă decât viteza de propagare a
celuleor virusurilor.

Reacţia speciilor la acest tip de cultură este diferita.

Ex: Standardi şi Catalano (1985): Actinidia chinensis – culturile de apexuri sunt
greu de dezinfectat şi recomandă culturi de meristeme.
 CULTURILE DE
APEXURI

Exemplu: 1952, Morel si Martin: cultivarea varfurilor de crestere la Orhidee

pe medii de cultura artificiale au o rata de multiplicare de 1: 1.000.000 pe an,
uniforme genetic si libere de virusuri.

Apexurile au crestere nedeterminată in vitro ►cu modificarea balanţei

hormonale ►neogeneza de lăstari (capacitatea de proliferare este nelimitată)
 CULTURILE DE
MINIBUTASI

Sunt specifice şi se recomandă speciilor/soiurilor/cultivarurilor care au

dominanţa apicală pronunţată (au internodii lungi)

MICROBUTAŞIREA: procedeu sau tehnică prin care cultivarea

minibutaşilor se face orizontal în mediul de cultură

Procedura: defolierea pentru stimularea pornirii in

vegetatie a mugurilor axilari
 CULTURILE DE
MERISTEME

MERISTEMELE
Def.: ţesuturi tinere, cu activitate celulară intensă în plantă, formate din celule
nespecializate funcţional, cu diviziune continuă şi care asigură creşterea în lungime şi
grosime, fiind dispuse de obicei terminal, atât în partea hipogee cât şi în partea epigee.
Tipuri de meristeme
(după tipul structurilor pe care le generează)
1. PRIMARE (caracter embrionar):
Terminale - vârful rădăcinilor şi tulpinilor, în muguri ☺ de mare
importanţă la pomii fructiferi;
Laterale – cambiu
Intercalare - la baza internodiilor de la monocotiledonate;
Foliare – în frunzele aflate în curs de dezvoltare (rol major în
organogeneză)
Adventive – în rădăcini şi parte aeriană.
2. SECUNDARE (influenţează creşterea în grosime)
Cambiu şi felogen;
3. SPECIALE (localizate la nivelul explantelor cultivate in vitro):
Promeristemul – faza timpurie de formare a meristemului cu
importanţă în embriogeneza somatică;
Meristemoidul – aglomerare meristematică nestructurată care poate da
naştere la diferite organe;
Embrioidul – grup de celule meristematice care generează embrioni
somatici.
 CULTURILE DE
MERISTEME

Tipuri de meristeme
(după zona în care se găsesc meristemele)

1. RADICULARE
Structura mai simplă
Funcţii limitate
Categorii: apicale, laterale, adventive.

2. CAULINARE
Mult mai complexe funcţional şi morfologic;
 CULTURILE DE
MERISTEME

Epoca optimă de prelevare a meristemelor: a se evita perioadele de dormanţă

sau latenţă a speciilor vizate.

Tehnologia de prelevare şi cultivare:

se prelevează din material vegetal sterilizat;
sub lupa binocular;
pH-ul mediului se recomandă a fi la 5.5 – 5.8;
concentraţia în macroelemente să fie redusă la jumătate;
la unele specii se recomandă ţinerea meristemelor timp de 3-7 zile la întuneric,
pentru limitarea oxidarii;
temperatura variază în funcţie de specie: 22, 25 sau şi mai mult (viţa de vie);
Intensitatea luminoasă: variază de la 2.400- 10.000 lucsi (conifere).

Avantajele culturii de meristeme:

1.Înmulţirea clonală a materialului biologic valoros
2. Eliminarea bolilor şi daunătorilor
3. Material nou, juvenilizat, cu capacitate mare de multiplicare
4. Băncile de gene.
 CULTURILE DE
MERISTEME

Tip de cultură in vitro larg utilizată care generează material săditor liber de
viroze şi micoplasmoze.

Dimensiune meristem: 0.1 – 0.3 mm

☺ şanse mari de devirozare;
☻ slaba rată de supravieţuire în faza de stabilizare.

Teorii privind acţiunea antivirală: competiţie între celulele gazdă şi parazit sau
faptul că celulele agresate sunt capabile să elimine virusurile.

Condiţii preliminare pentru o cultură

de meristeme reuşită:
1. muguri prelevaţi de pe ramuri
(pomi) sau alte organe care şi-au
satisfăcut nevoia de frig.
2. adăugarea de gibereline în mediul
de cultură pentru stimularea creşterii şi
elongatiei meristemelor.
 CULTURILE DE CALUS

CALUS

Def.: masă neorganizată de celule, mai mult sau mai puţin diferenţiate, cu
capacitate variabilă de proliferare, apărută în urma unei răniri mecanice
suferită de plantă, ca formă de apărare şi regenerare celulară.

Generalităţi pentru iniţierea culturii:

 Fază intermediară a organogenezei indirecte;

pH optim: 5.6 – 6.0 (7 la culturile de Actinidia sp. ) înainte de
autoclavare
Balanţa corectă între concentraţiile de auxine şi citochinine
Se recomandă utilizarea auxinelor şi citochininelor numai în mediu
(2.4 –D sau ANA).
Sursele de carbon (zaharoză, glucoză, maltoză, galactoză) pot induce
modificări la nivelul diferenţierii, precum şi în creşterea şi morfologia
calusurilor

A fost prima sursa a culturilor in vitro pentru mulţi ani

 CULTURILE DE CALUS

Trei etape în cultura de calus:

1. Inducerea formării calusului/inducţie

2. Proliferarea calusului/diviziune
3. Regenerarea organică/diferenţiere

1. Inducerea formării calusului

Tipul de material vegetal folosit: orice tip de organe – rădăcini, tulpini, frunze,
flori, ţesuturi.
Pentru juvenilizare – se folosesc cotiledoane, puiet sau embrioni imaturi.

Reacţia explantului la cultura de calus este

variabilă în funcţie de tipul morfologic al
explantului, putând varia capacitatea
proliferativă, textura, culoarea sau morfologia
celulelor componente.

Stimularea formării calusului se face prin

hormonii specifici, auxine, citochinine sau
auxine si citochinine (variază în funcţie de
specie)
 CULTURILE DE CALUS
1. Inducerea formarii calusului,
continuare

În faza de inducere de calus, ţesuturile parenchimatice - care sunt masa

calusului - intră intr-un proces de dediferenţiere celulară.

Ţesuturile meristematice nu au nevoie de procese de diferenţiere, fiind

capabile de diviziune rapidă şi formarea de calus.

!! Centrii alcatuiţi din celule cu

activitate mitotica pot fi numiti
MERISTEMOIZI;
Celulele lor evolueaza in diferite
organe: lăstari, rădăcini sau
embrioni somatici.
 CULTURILE DE CALUS

2. Înmulţirea calusului
Procesul de înmulţire al calusului este direct gestionat de balanţa hormonilor;

Precesul în urma căruia calusul se divide nu este pe deplin cunoscut,

presupunându-se că se formează în urma interacţiunii hormonilor eliberaţi de
celulele rănite.;

Celulele din alcătuirea calusului devin meristematice, se divid activ, rapid şi

scad în volum.
 CULTURILE DE CALUS

3. Diferenţierea/regenerarea de organe
adventive din calus

Aceasta fază este controversată; rata creşterii calusului scade; se ajunge

la un echilibru între creşterea în volum şi diviziune.

!! De reţinut:

1. Generarea de organe are la baza principiul totipotenţei celulare (câteva

grame de calus pot genera mii de neoplantule);

2. Culturile de calus au instabilitate genetică şi fiziologica mare, ceea ce

limitează cultivarea în scopul conservării germoplasmei sau pentru
multiplicare clonală (variabilitatea somaclonală, intens studiată în acest
moment în ameliorare)
 MICROALTOIREA

1. Apărută recent, urmare a descoperirii incompatibilităţii dintre portaltoi

şi altoi la multe specii.

2. Generează plante mamă libere de virusuri şi alte boli care ulterior pot
fi utilizate ca sursă de ramuri altoi pentru altoirea tradiţională.

Primul pom liber de virusuri obtinut prin microaltoire a fost obţinut în 1970,
prin microaltoirea la Citrus (Murashige şi colab.)

Folosit pentru:

1. multiplicarea unor specii care răspund dificil la cultura de

meristeme (cireş, cais);
2. aproape exclusiv pentru producerea de pomi liberi de virusuri la
speciile: piersic, măr, cais, cireş, prun.
MICROALTOIREA
 MICROALTOIREA

TEHNOLOGIE

Presupune altoire in vitro, în condiţii ASEPTICE a unui apex meristematic pe

un portaltoi obţinut din seminţe sau din minibutaţi cultivaţi tot in vitro.

1. OBŢINEREA PORTALTOIULUI
 se poate obţine din seminţe, din minibutaşi sau meristeme apicale şi
laterale, toate in vitro.
 ieşirea din dormans (stratificare, tratamente cu citochinine,
gibereline, frig)
 înlăturarea endocarpului cu menţinerea tegumentelor seminale
 verificarea viabilităţii seminţelor
 sterilizarea seminţelor în etanol 70% 1 min, hipoclorit de sodiu 0.7%
clor activ şi Tween 20 cu 0.3%, 20 minute
 clătiri apă distilată sterilă
 inoculare pe mediu MS ( - ) pentru germinare; 20°C şi intuneric
 MICROALTOIREA

2. PREGĂTIREA ALTOIULUI
 Se poate extrage dintr-un apex meristematic de la lăstari crescuţi în
vitro, sau de la ramuri sau lăstari obţinuţi in vivo
 Sterilizare - dacă provine de la plante cultivate in vivo

3. ALTOIREA PROPRIU ZISĂ

 Se înlătură cotiledoanele de la
portaltoii obţinuţi in vitro
 Se secţionează transversal portaltoiul
 Apexul meristematic al altoiului se
detaşează şi se plasează pe zona inciziei
 Se trece într-o eprubeta sterilă, pe
mediu de cultură steril LICHID
 Atmosfera este saturată în umiditate
(asigură limitarea atacului bolilor şi favorizează
calusarea)

4. ACLIMATIZAREA
 Când mini altoiul atinge 1.5 -2 cm lungime
 Se trece gradual in vivo, printr-o umiditate relativă a aerului ridicată.
 MICROALTOIREA

AVANTAJE:

1. plante altoite în timp relativ scurt;

2. condiţii de creştere (mediul de cultură şi

camerele de creştere) controlate eficient;

3. util în devirozarea materialului genetic virozat

pentru cazurile în care specia nu suportă
termoterapia din cauza riscului de apariţie a
mutaţiilor genetice sau la speciile care se
înmulţesc greu in vitro;

4. aplicabil speciilor care se înmulţesc uşor in

vitro, dar care nu înrădăcinează

5. avantaj pentru cercetarea ştiinţifică privind

compatibilitaţile între altoi şi portaltoi.

DEZAVANTAJ

Tehnică pretenţioasă şi preţioasă, necesită

personal înalt calificat.
 CULTURA DE EMBRIONI SI
ENDOSPERM

UTILITATE

 Latenta semintelor la unele specii

 Imposibilitatea germinarii semintelor unelor specii, chiar in conditii
favorizante de lumina, temperatura si umiditate.

EMBRIOGENEZA SOMATICA
 procesul de formare a embrionului fie dintr-un zigot, fie dintr-o celula somatica -
vegetativa sau generativa –
 care se bazeaza pe capacitatea regenerativa a fiecarei celule vegetale,
 urmare a principiului totipotentei celulare
 si a faptului ca nu numai embrionul zigotic genereaza embrion, ci fiecare celula
vegetala, chiar haploida fiind.
 este proprietatea generala a celulelor cormofite

Lansata incepand cu 1958, de Steward si Reinert prin studii pe Daucus carota si

suspensii de celule, completat in 1979 de Thomas si colab., pe studii la Umbelifere.

Au fost puse in evidenta peste 135 de specii cu capacitate embriogenara, din 81 de

genuri si 32 de familii.
 CULTURA DE EMBRIONI SI
ENDOSPERM
Embriogeneza somatica se
intalneste la nivelul:
 Calusului
 In culturile de celule derivate
din calus sau din culturile de
protoplasti
 La nivelul epidermei,
 La explante din fragmente de
tulpini, segmente uninodale
 Fragmente de pistil,
hipocotile sau cotiledoane.

Fig. 1. Mature zygotic embryo of Norway

spruce (Picea abies) (explant) Fig. 2 a,b.
Initiation of embryogenic callus on mature
zygotic embryo of Norway spruce (Picea
abies). Fig. 3 a,b. Proembryo of Norway
spruce (Picea abies). Fig. 4. Embryogenic
callus multiplication: (a) silver fir (Abies
alba), (b) Norway spruce (Picea abies) on
solid medium, c) Norway spruce (Picea
abies) on filter paper placed on solid
medium Fig. 5. Cotyledonary somatic
embryos of (a) European larch (Larix
decidua), and (b) Norway spruce (Picea
abies).
 CULTURA DE EMBRIONI SI
ENDOSPERM

EMBRIOGENEZA SOMATICA DIRECTA

Embrionii iau nastere din celulele aprtinand tesuturilor plantelor care au servit la
initierea culturii

Embrioni somatici se gasesc in celule nucelare (Citrus sp.), celule

epidermice, hipocotil (Daucus carota) sau in celulele somatice.

MOMENT OPTIM
pentru recoltarea izolarea si inocularea embrionilor:
14 zile dupa polnizare.

MEDIUL DE CULTURA: regulatorii de crestere au o importanta vitala in

culturile de embrioni somatici.
 CULTURA DE EMBRIONI SI
ENDOSPERM

DE RETINUT:
 Lipsa AUXINELOR impiedica formarea embrionilor somatici;
 In faza de maturare, prezenta auxinelor in mediul de cultura perturba maturarea
acestora, recomandandu-se rducerea sau eliminarea completa a auxinelor din
mediu.
 Pentru unele specii, este importanta prezenta in mediu a unui raport
auxine/citochinine (2,4-D).
 Natura si concentratia glucidelor: marirea concentratiei de zaharoza poate
preveni GERMINATIA PRECOCE a embrionilor somatici.
 Temperatura, lumina si compozitia aerului din vasele de cultura influenteaza
embriogeneza somatica.

PROCEDURA
1. Sterilizarea materialului donor;
2. Excizarea embrionului imatur;
3. Inoculare pe mediu;
4. Diferentierea embrionilor somatici in diferite stadii de dezvoltare (globulara,
cordiforma, torpila, cotiledonara) si suprapunerea diferitelor stadii de
evolutie ► imposibilitatea automatizarii culturilor (costuri mari de
manopera)
 CULTURA DE EMBRIONI SI
ENDOSPERM

EMBRIOGENEZA SOMATICA INDIRECTA

Inseamna regenerarea embrionilor somatici din calus.

DE RETINUT
 Capacitatea de regenarare depinde de specie (unele specii regenereaza
numai organe, altele numai embrioni somatici si altele din ambele
categorii) si felul explantului;
 Conteaza varsta explantului si a plantei donor;
 Calitatea depinde de numarul de multiplicari;

PROCEDURA
1. Initierea culturii de calus;
2. Multiplicarea calusului si identificarea calusului EMBRIOGEN
(ridica probleme la nivel global, deoarece nu sunt inca date certe
despre criteriile de identificare si proceduri);
3. Inductia pe un mediu nou de cultura;
4. Formarea embrionilor somatici.
 CULTURA DE EMBRIONI SI
ENDOSPERM

CONDITIONARI ALE EMBRIOGENEZEI SOMATICE

1. Auxine in concentratie mare inseamna inductia embrionilor somatici;
2. Acidul abscisic stimuleaza formarea embrionilor in culturile de calus
si celule in suspensie;
3. Giberelinele si etilena inhiba procesele de inductie;
4. Tesuturile juvenile favorizeaza sansele formarii embrionilor somatici;
5. Temperatura ridicata stimuleaza formarea embrionilor somatici;
6. Laptele de cocos, foarte bogat in citochinine, are un rol important in
inductia procesului de embriogeneza somatica.

LIMITARI ALE EMBRIOGENEZEI

 Materialul genetic este relativ instabil in procesele embriogenezei
 Risc aparitie mutatii;
 Nerecomandat pentru multiplicarea clonala;
 Nu se poate aplica tuturor speciilor urmare a faptului ca nu toate speciile
formeaza embrioni somatici;
 Culturile repetate duc la deprecierea calusului;
 Aparitia fenomenului de dormans.
 CULTURA DE EMBRIONI SI
ENDOSPERM

IMPORTANTA EMBRIOGENEZEI SOMATICE

 Embrionul, ca material inmultitor, este structurat morfofunctional

(radacinita, tulpinita, muguras);
 Viteza uluitoare de propagare, ceea ce permite la o singura
inoculare producerea unui numar foarte mare de plante;
 Plantele derivate din embriogeneza somatica sunt identice genetic
cu donorul;
 Cresterea plantelor este uniforma;
 Plantele sunt robuste;
 Embrionii pot fi stocati pentru o lunga perioada de timp in banci de
gene;
 Prezinta material important de studiu pentru mutageneza
 CULTURA EMBRIONILOR
ZIGOTICI

Presupune separarea embrionilor zigorici de tesutul ovular, cultivarea

acestora in condiii aseptice, pe medii decultura speciale care
potenteaza dezvoltarea ovulului, in conditii speciale care asigura
cresterea si diferentierea embrionara normala.

PROBLEMA: avortarea embrionilor intalnita in

ameliorarea plantelor.
CAUZA: dereglari fiziologice in procesul de
crestere al semintei si fructului.
REZOLVAREA: embriocultura/cultura de
embrioni zigorici.

Rapid and high efficiency regeneration system (organogenesis and somatic

embryogenesis) from isolated shoot apices in vitro. (A) One day old isolated shoot
apices with primordial leaves LP = leaf primordia; SM = shoot meristem. (B) One- week
old explant showing bulged meristem portion and expanded primordial leaves. (C)
Three- week old meristematic mass showing multiple buds and leaf initials. (D)
Individual buds (shown in Fig.1C) producing 2-8 translucent tissue strata. (E) Each of
the tissue stratum giving rise to many somatic embryos. (F) Meristematic clumps
showing differentiating buds. (G) Germinating somatic embryo’s showing shoot apex
(SA) surrounded by a pair of primary leaves (PL). (H) Differentiation of somatic embryos
into platelets. (I) Plantlets with well formed roots in magenta box. (J) Acclimatization of
plantlets in the growth chamber. (K) Regenerated plants in greenhouse
 CULTURA EMBRIONILOR
ZIGOTICI

POMICULTURA: cultivarea unor embrioni imaturi proveniti de la

incrucisarile soiurilor extratimpurii si timpurii de samburoase.
VITICULTURA: imposibilitatea obtinerii unor descendenti hibrizi cand
genitorul matern este un soi apiren► embrionul avorteaza.

Ce OFERA EMBRIOCULTURA?:

extragerea embrioniului abia format cu o

portiune de tesut nuclear sau cultivarea
ovulului fecundat, depasindu-se astfel
barierele incompatibilitatii.

Figs. 15–22. Anthurium embryos at 16–24 wk postpollination. Sections stained with

PAS (carbohydrates stain pink) and aniline blue-black (proteins stain blue). 15. Overview
of an intact embryo 16 wk postpollination ∼2 mm in length. 16. Shoot apex and leaf
primordium in embryo 20 wk postpollination surrounded by the single cotyledon. 17.
Procambium from cotyledon connecting to shoot apex region of embryo 20 wk
postpollination. 18. Root apex of embryo 20 wk postpollination. 19. Base of embryo with
suspensor 20 wk postpollination. 20. Starch and protein storage products of the cotyledon
and endosperm 20 wk postpollination. 21. Calcium oxalate crystal deposits (raphides) in
the cotyledon of an embryo 20 wk postpollination. 22. Tracheary protoxylem in cotyledon
24 wk postpollination. In Figs. 16, 17, 18, and 20, bar = 125 μm; in Fig. 18, bar = 100 μm;
and in Figs. 19, 21, and 22, bar = 25 μm. Figure Abbreviations: c, cotyledon; em, embryo;
en, endosperm; ep, protoderm, lp, leaf primordium; pc, procambium; r, raphides; ra, root
apex, s, suspensor; sa, shoot apex; x, xylem
 CULTURA EMBRIONILOR
ZIGOTICI

Initierea culturii:
a) variaza de la specie la specie:
cires – 28/35 de zile de la inflorire, sau dupa intarirea samburelui
visin – 29/41 de zile
piersic – 81/97 de zile.
b) depinde si este determinat de marimea cotiledoanelor

MEDIUL DE CULTURA: are formula cu atat mai complexa cu cat

stadiul de dezvoltare al embrionului in momentul prelevarii este mai
incipient si se recomanda chiar si extracte naturale de endosperm →
concentratii mai mari de zaharoza pentru presiunea osmotica este
ridicata.

STERILIZAREA: se poate realiza la

concentratii mari, deoarece endocarpul si
tegumentul permit aceasta.

CONDITIILE culturii: mult mai stricte, cu

pH, lumina si temperatura mult mai
riguros controlate
 SAMANTA SINTETICA

Creata in folosul embriogenezei somatice, prin generarea unui endosperm

artificial care sa protejeze si sa hraneasca embrionul.

Embrionii somatici isi pierd repede valabilitatea → se folosesc:

1. Gelurile de incapsulare cu substante chimice nutritive, regulatori osmotici si
pesticide;
2. Semanarea embrionilor in flux lichid cu ajutorul tehnologiilor puse la punct
pentru culturile in vivo.
AVANTAJE:
1. Permite folosirea si producerea de seminte la speciile care nu produc de obicei
seminte;
2. Inlocuiesc semintele hibride;
3. Folosirea unor genotipuri speciale;
4. Importanta maxima in ameliorare;
DEZAVANTAJE:
1. Se deshidrateaza repede si necesita sisteme de invelisuri care sa le pastreze
umiditatea relativa;
2. Embrionul este mentinut in stare de repaus cu ajutorul unor substante chimice;
3. Semanatul presupune scoaterea embrionului din repaus;
4. Procent variabil spre mic de plante viabile obtinute;
5. Pesticizarea semintei trebuie limitata, deoarece la dezvoltarea embrionului,
acestea impiedica micorizarea.
 SAMANTA SINTETICA

PROCEDURA DE REALIZARE:

 Incapsularea embrionilor in alginat de sodiu 2-4%.

 Scufundarea embrionilor in alginat de sodiu 2-4%
 Imbaierea individuala in clorura de calciu 50 μM, cu pH 7.
 La max 30 de minute distanta, capsulele se intaresc si pot fi manipulate
 Se pastreaza in conditii de refrigerare, la 3-6 °C, in conditii aseptice.

Dezavantajele tehnicii:
Alginatul de calciu are permeabilitate mare pentru elemente solubile;
Radacinile lastarilor cresc mai lent;
Capsulele sunt lipicioase si de manipuleaza greu la semanare.

Incapsularea organelor, extensie a semintei sintetice

Se pot incapsula bulbi proveniti din culturi in vitro, minibutasi si rozete
de frunze de la diverse specii: kiwi, zmeur, mar, crin etc.

AVANTAJELE metodei:
 Materialul vegetal se poate pastra cu cheltuieli mult reduse;
 Economie de spatiu;
 Economie de forta de munca.
 CULTURA DE ANTERE, POLEN, OVARE,
OVULE SI ŢESUT NUCELAR

CULTURA DE ANTERE ŞI POLEN

Apărută odată cu stabilizarea tehnologiei de micropropagare.

Tehnologie:
 recoltarea şi desprinderea anterelor când florile se află în faza de boboc;
 sterilizare
 inoculare pe mediu lichid sau solid.

Cultura de polen: se recomandă transferarea periodică a anterelor pe mediu proaspăt

pentru a ―coloniza‖ cât mai multe vase de cultură.

CULTURA DE OVARE, OVULE ŞI ŢESUT NUCELAR

Folosită în cazul incompatibilităţilor dintre soiuri sau specii, în condiţiile în care mare parte
din incompatibilităţi provin din disfuncţii ale polenului sau organelor sexuale.

 Inocularea OVARELOR – se face înainte sau după polenizare în funcţie de compatibilitatea

existentă.
 Se poate efectua şi fecundare in vitro.
 Cultura de ţesut nucelar induce poliembrionia sau tetraploidizarea.
 Cultura de ovar şi ovuli nu este aplicabilă direct în microînmulţire.
 CULTURA DE PROTOPLAŞTI

CULTURA DE PROTOPLAŞTI

Tehnică de micropropagare relativ recentă, cu aplicabilitate în pomicultură, care permite,

teoretic, producerea de hibrizi între specii şi soiuri de orice fel.

Procedura: unirea în condiţii specifice a două celule cărora li se dezagregă enzimatic (sau
mecanic) structura peretelui celular, obţinându-se astfel hibrizi somatici.

Se bazează pe ingineria genetică, iar intervenţiile la nivelul celulei fac posibile transferul
de gene, selecţia de plante rezistente la agenţii patogeni şi boli.

Tehnica:
 Explantele se
tratează enzimatic
pentru a li se
distruge peretele
celular, proces care
se petrece pe baza
presiunii osmotice;
 CULTURA DE PROTOPLAŞTI

Regenerarea membranei celulare/cultura de protoplaşti

DINTRE AVANTAJE:
 obţinerea de hibrizi între speciile incompatibile natural;
 hibrizi între speciile care nu înfloresc sau care nu au timp să îşi matureze organele.

DEZAVANTAJE:
 Lipsa tehnologiilor de selecţie a plantelor;
 Descendenţi instabili genetic, sterili sau chiar cu mutaţii fizice;
 Calusul himeric;
 Nu se asigură transmiterea caracterelor utile;
 Număr de specii care răspund la această metodă limitat.
 MICORIZA

Definitie
este simbioza existenta intre radacinile plantelor si unele microorganisme
reprezentate de bacterii sau ciuperci.

AVANTAJELE RECIPROCE
din punct de vedere nutritional

In urma micropropagarii, plantele obtinute nu prezinta micoriza in

schimb au productivitate ridicata, sunt uniforme si libere de virusi. Ideea
micorizarii materialului obtinut in urma micropropagarii a aparut din
necesitatea de a imbunatati capacitatea de absorbtie a sistemului radicular.

TIPURI DE MICORIZE:
 ectomicoriza
 endomicoriza
 ectoendomicoriza
 MICORIZA

ECTOMICORIZA
 se prezinta sub forma unor radacini scurte, acoperite total
cu hifele ciupercii sub forma unei pasle care patrunde in
parenchimul radacinilor
 are rol in marirea zonei de contact dintre radacina si sol.
 este intalnita mai putin la speciile pomicole si anume
castanul comestibil, alunul.
 MICORIZA

ENDOMICORIZA

 apare pe radacina sub forma unor ingrosari fara modificari

esentiale la suprafata radacinilor
 ciuperca este localizata la nivelul parenchimului cortica
 in cazul endomicorizei celulele afectate se comporta ca
celule tinere cu activitate foarte intensa.
 se intalnesc la peste 80% din plantele de cultura .
 MICORIZA

Absorbitia azotului

Studiile facute au scos in evidenta faptul ca micoriza asigura o absorbtie de

doua ori mai mare a azotului iar pentru fosfor se absoarbe de 50-80 de ori mai
mult prin micoriza.

Avantaje

Micorizele au rol in asigurarea rezistentei plantelor la concentratii mai mari de

calcar, asigura o mai buna absorbtie a apei, pot elimina auxine stimuland
procesul de inradacinare a butasilor si au efect favorabil asupra
microorgansmelor prezente in sol.
 MICORIZA

Inducerea micorizarii este o lucrare complexa si necesita trei faze:

1.selectia plantei gazda care trebuie micorizata

2.cultura in vitro a microorganismelor (ciupercilor)

3.asigurarea conditiilor de asociere intre parteneri

Asarum canadense roots and mycorrhizal fungi