Înmulţirea prin micropropagare (in vitro)

Însuşirea de regenerare naturală a plantelor prin organe nespecializate a

determinat multiple preocupări privind înmulţirea, fără a se pierde capacitatea generativă.
La începutul secolului al XX-lea metoda reprezenta o simplă ipoteză. Confirmarea
pozitivă s-a produs mai târziu, când s-a realizat reproducerea de plante dintr-un grup de
celule (meristeme) sau o celulă. Astfel, s-a conturat sistemul de înmulţire "in vitro",
metodă modernă, rapidă, cu randament foarte ridicat, comparativ cu cea clasică de
înmulţire vegetativă.
La viţa de vie primele începuturi privind micropropagarea "in vitro" s-au
înregistrat cu aproximativ cinci decenii în urmă (Morel G., 1944). Reţinerile privind
folosirea acestei metode au fost datorate potenţialului de rod mai redus în primii ani,
determinat de fenomenul de " juvenilizare " (Mullins M. G. şi colab., 1979). Acest
dezavantaj poate fi eliminat prin unele tratamente care favorizează trecerea mai rapidă de
la starea fiziologică " juvenilă " la cea adultă (Nazeron R. şi colab., 1983). Un alt
inconvenient al clonării "in vitro" la viţa de vie îl reprezintă faptul că plantele obţinute nu
pot fi folosite la înfiinţarea plantaţiilor viticole pe terenurile unde se impune utilizarea
viţelor altoite.

Fig.2 Laborator de cultură “in vitro”

Micropropagarea (cultura "in vitro"), ca metodă de înmulţire vegetativă, se
bazează pe următoarele principii fiziologice : totipotenţa celulară, independenţa

1
fiziologică temporară şi aparentă a explantelor, posibilitatea de stimulare a proliferării
ţesuturilor şi de înmulţire a plantelor neoformate.
Totipotenţa celulară este deţinută de fiecare celulă, dar exprimarea se produce
numai la unele tipuri de celule sau grupe de celule. Acestea sunt restructurate
morfogenetic şi pot răspunde anumitor stimuli meniţi să regenereze, în anumite condiţii
specifice, formaţiuni de embrioni cu rădăcină, tulpină şi coroană, până la plante noi
(Murashige S., 1984).
Independenţa temporară şi aparentă exprimă posibilitatea de menţinere în viaţă a
explantelor, inoculate pe mediu de cultură, până la emiterea de neoformaţiuni.
Posibilitatea de stimulare a proliferării ţesuturilor se materializează prin
inocularea explantelor pe medii de cultură în vederea transformării lor în formaţiuni
tisulare autonome.
Multiplicarea plantelor neoformate are la bază posibilitatea de înrădăcinare a
minibutaşilor pe medii de cultură asemănătoare celor din faza iniţială, însă cu corectarea
conţinutului în substanţe hormonale - prin reducerea citokininelor în favoarea auxinelor.
Înmulţirea in vitro a plantelor sau micropropagarea are toate şansele să devină
tehnologia viitorului întrucât conduce la obținerea unui număr foarte mare de plante
sănătoase, care cresc mult mai repede. În România, această tehnică este implementată şi
perfecţionată permanent de către specialiştii în domeniu.
Preţul plantelor obţinute prin înmulţirea in vitro este de uneori mult mai mic decât
al celor din magazinele de specialitate iar plantele şi lăstarii crescuţi ”la borcan” sunt
mult mai rezistenţi la boli şi cresc mai repede decât cei obţinuţi prin metode de înmulţire
convenţionale.
Ce este cel mai interesant la micropropagare este că dintr-un individ, într-un
singur an, prin multiplicări în cicluri succesive se pot obţine peste un milion de plante,
ceea ce înseamnă un potenţial de producţie imens.

2
 Fig. 1 Aspect privind multiplicarea “in vitro”

Înmulţirea in vitro se realizează în condiţii sterile, controlate artificial, în

recipiente din sticlă sau material plastic închise etanş, pe medii nutritive artificiale care
conţin apă şi toţi nutrienţii necesari creşterii plantei.

Fig 3 Recipiente pentru cultura “in vitro”

3
 Acest tip de înmulţire are trei etape principale: iniţierea culturii in vitro, fază în
care fragmente de plante din câmp sunt sterilizate şi introduse în vitro, multiplicarea (fază
în care se fac cicluri succesive de culturi pentru a obţine numărul dorit de plante) şi în
final aclimatizarea când plantele se scot din vitro şi are loc adaptarea lor la condiţiile
iniţiale din sere şi câmp.

Fig.4 Seră pentru aclimatizarea plantelor onţinute “in vitro”

Principalele avantaje și dezavantaje ale acestei metode.

Principalul avantaj al micropropagării îl reprezintă rata de multiplicare foarte
mare, apoi faptul că este independentă de sezon, deoarece se realizează în condiţii
controlate de lumină şi temperatură, în camere de creştere climatizate iar plantele se află
într-un proces de creştere şi multiplicare activă indiferent de anotimp, fără să existe timpi
morţi în procesul de producţie.
De asemenea, sortimentul de soiuri sau specii de plante care se înmultesc poate fi
schimbat mult mai repede utilizând această metodă. În plus, înmulţirea “in vitro” permite
obţinerea plantelor pe rădăcini proprii, înlăturând altoirea cu toate dezavantajele pe care
le are, mai ales cel legat de transmiterea bolilor.
Materialul produs in vitro poate fi conservat prin diferite metode şi folosit în
momentul în care este nevoie şi se realizează importante economii de teren, spaţiu,
energie şi combustibil.

4
 Materialul săditor sub formă de culturi in vitro poate fi transportat şi distribuit cu
uşurinţă atât în ţară cât şi peste hotare. Culturile in vitro sunt modul cel mai uşor, ieftin şi
eficient de a stoca, manipula şi transporta materialul vegetal.
Dezavantajele acestei metode de înmulţire sunt mult mai mici în comparaţie cu
avantajele sale şi ţin în special de costurile iniţiale pentru realizarea unei unităţi de
micropropagare şi de faptul că micropropagarea este eficientă economic doar la obţinerea
unor zeci de mii, sute de mii sau milioane de plante, nu pentru producerea de zeci, sute
sau mii de plante anual.
Acest tip de înmulţire se poate realiza numai în laboratoare specializate,
laboratoare care pot fi realizate şi de către fermieri în fermele proprii.

Fazele operaţionale ale înmulţirii “in vitro”

Procesul de micropropagare cuprinde, în ansamblu, mai multe faze (etape)
derulate într-o anumită succesiune, însă fără o accepţiune unitară. Astfel, Murashige S.
(1974) distinge pentru prima dată în practica de micropropagare în sistem industrial trei
etape, şi anume:
- etapa I-a, care cuprinde înfiinţarea culturilor cu plante selecţionate şi o stare
fitosanitară îmbunătăţită, de la care se recoltează material vegetal donator de explante;
- etapa a II-a, care include iniţierea, multiplicarea şi propagarea "in vitro" a materialului
vegetal;
- etapa a III- a, ce constă în pregătirea şi trecerea plantelor regenerate "in vitro" pe
substrat natural.
După ultimele cercetări ştiinţifice sunt acceptate cinci etape :
-etapa I. Înfiinţarea culturii de plantă mamă.
-etapa a II-a. Înfiinţarea culturii "in vitro" . Aceasta cuprinde iniţierea şi creşterea de
plante noi pe medii artificiale din fragmente vegetale (culturi de organe cu capacitate
regenerativă şi explante de dimensiuni microscopice, ţesuturi, celule, protoplaşti).
Materialul vegetal folosit provine de la plante mamă sănătoase obţinute anterior sau de la
plante elită alese pentru înmulţire. În funcţie de tipul de explant şi faza sezonală se
recoltează în perioada de repaus relativ porţiuni de coarde care nu au mugurii bine

5
exteriorizaţi şi în faza de creştere intensă din perioada de viaţă activă, lăstari cu frunze şi
vârful intact.
-etapa a III-a. Formarea şi multiplicarea plantulelor neoformate. Recipientele cu medii
nutritive, în care s-au inoculat explante, se depun în camera de creştere cu condiţii de
mediu controlat, în rândul cărora temperatura, lumina, umiditatea şi aerul ocupă un loc
important.
-etapa a IV-a. Înrădăcinarea neoplantulelor. Multiplicarea şi înrădăcinarea se realizează
prin subculturi repetate de minibutaşi. Operaţiunea poate fi favorizată, în prealabil, şi pe
calea alungirii lăstarilor prin transferul culturii iniţiale pe timp limitat pe un mediu
adecvat.
Fluxul tehnologic de multiplicare constă în detaşarea, începând de la bază, a
lăstarilor neoformaţi în faza iniţială, urmată de fragmentarea lor sub formă de minibutaşi
de câte un nod cu ochi. Aceştia sunt trecuţi în subcultură pe un mediu de cultură proaspăt,
asemănător celui iniţial, însă, cu corecţia conţinutului în substanţe hormonale, respectiv
de reducere a citokininelor (zeatină sub 0,1 mg/l) şi de asigurat preponderenţa auxinelor
în favoarea înrădăcinării.
Multiplicarea se continuă prin subculturi repetate de până la 10 -12 etape
succesive, cu intervale de 35 - 45 zile pentru fiecare din acestea. În felul acesta se poate
ajunge la o rată posibilă de multiplicare de până la 2 x 10 6 (Nazeran, R., 1972). Plantele
obţinute prin subculturi repetate şi cele individualizate încă din faza iniţială se
înrădăcinează "in vitro".
-etapa a V-a. Transferul în mediul natural, verificarea şi livrarea materialului. Rolul
important în transferul plantelor din mediul controlat aseptic în cel natural îl are
aclimatizarea.. În faza de început, pentru diminuarea stresului hidric, se acoperă fiecare
plantă cu ghivece din material plastic. În vederea certificării valorii biologice a
materialului produs, plantele aclimatizate în mediul natural se supun unui control
citogenetic şi fitosanitar adecvat .

6
 Factorii care influenţează capacitatea regenerativă a meristemului
aplicat în cultura in vitro la viţa-de-vie
Exprimarea capacităţii regenerative a explantelor condiţionată atât de factorii
biotici, cât şi de factorii abiotici este o realitate în general acceptată. Inoculul constituie o
unitate vie, independentă de locul de origine, care deţine integral informaţia genetică
preluată de la planta donatoare, precum şi toate funcţiunile pe care le îndeplinesc
ţesuturile la locul de origine. De regulă, cu cât nivelul de organizare al inoculului este
mai simplu, cu atât necesităţile nutriţionale şi cele privind condiţiile de cultură sunt mai
pretenţioase, iar substratul nutritiv trebuie să fie mai complex şi să conţină o gamă mai
largă de substanţe organice. Prin urmare, este posibilă regenerarea plantelor de viţă-de-
vie aparţinând unor genotipuri foarte diferite, prin aplicarea aceluiaşi protocol de lucru,
ba chiar mai mult, este posibilă realizarea etapei de multiplicare pe acelaşi mediu utilizat
în faza de iniţiere (organogeneză). Totuşi, cel mai adesea, protocoalele de regenerare din
meristem apical la viţa-de-vie sunt valabile pentru anumite genotipuri şi în condiţii
specifice de cultură. În acest context, se apreciază că o bună cunoaştere a factorilor care,
secvenţial sau pe toată durata culturii, pot influenţa declanşarea sau desfăşurarea
proceselor de organogeneză reprezintă o cerinţă importantă pentru aplicaţiile practice ale
tehnicilor de regenerare in vitro de plante la speciile Vitis.
Factori biotici După rezultate obţinute la viţa-de-vie, pornind de la meristeme
apicale (Morel şi Martin), pe parcursul a circa 48 de ani această tehnică a atras mult
atenţia cercetătorilor şi a practicienilor, calificându-se în multe cazuri drept mijloc sigur
de înmulţire. Numeroşi autori au semnalat însă pe parcursul cercetărilor dependenţa
foarte strânsă a capacităţii de regenerare de plante pornind de la explante meristematice,
faţă de genotip. Astfel, au fost descrise metode de regenerare pornind de la apexuri
meristematice întregi sau fragmentate, cu specific pentru anumite genotipuri, existând
reţineri privind generalizarea acestora la întregul gen Vitis. Rezultatele obţinute de
diferiţi autori în ceea ce priveşte capacitatea de regenerare a unor specii şi soiuri de Vitis
sunt adesea aparent contradictorii. De cele mai multe ori, reactivitatea diferită a plantelor
a fost corelată cu potenţialul regenerativ nativ al genotipurilor studiate şi mai puţin cu alţi
factori fiziologici (dimensiunea explantului, momentul recoltării etc.). Un exemplu
elocvent îl constituie investigaţiile întreprinse de Mirancea şi colaboratorii asupra

7
capacităţii de regenerare a mai multor soiuri de Vitis vinifera, în scopul de a identifica
genotipuri cu potenţial regenerativ in vitro ridicat. Referindu-se la numărul mediu de
lăstari detaşaţi de pe un meristem într-un ciclu de experimentare (6-8 luni), s-a apreciat
superioritatea soiurilor Cabernet Saugvignon şi Tiesling, care au realizat peste 250 de
lăstari. Este, de asemenea, interesant de menţionat faptul că în urma comparării speciilor
Vitis vinifera şi Vitis cinerea, Vitis labrusca şi Vitis argentifolia, Cher şi Pool au ajuns la
concluzia că soiurile ce aparţin speciei Vitis vinifera au o capacitate regenerativă mult
mai mare (75%) decât celelalte specii (5-50%). De altfel, în ansamblul său acest
experiment a demonstrat că influenţa genotipului se reflectă nu numai prin capacitatea de
regenerare, ci şi prin momentul declanşării lăstăririi multiple după stabilizarea culturii (55
de zile). Se apreciază că prin experimentarea potenţialului regenerativ al meristemelor
apicale, care corespunde unui caracter ce urmează modelul eredităţii simple, este
necesară şi corelaţia cu starea fiziologică a explantului. Acest factor este considerat critic,
deoarece s-a explicat că variaţia în timp a intensităţii procesului de regenerare depinde şi
de modificările sezoniere ale concentraţiei regulatorilor de creştere esenţiali (auxine şi
citochinine). În acelaşi sens, Clong şi colaboratorii au demonstrat că explantele recoltate
de la plantule din in vitro se comportă mult mai bine decât cele excizate de la plante
crescute în seră. Rolul important al stării fiziologice a plantelor mamă, donatoare de
explante, a fost justificat prin rezultatele experimentale obţinute cu diferite genotipuri de
viţă-de-vie. De altfel, şi alţi cercetători recomandă recoltarea explantelor de la butaşi
fortificaţi în seră (faza de creştere activă) sau de la plantele obţinute de la butaşi fortificaţi
în seră (faza de creştere activă) sau de la plantele obţinute prin cultură in vitro a
mugurilor axilari.
Factori abiotici. Capacitatea regenerativă a meristemelor la viţa-de-vie, odată
desprinse de planta- mamă, a fost evidenţiată în numeroase studii prin experienţe
efectuate în scopul relevării faptului, că aceste explante pot fi utilizate pentru regenerarea
unui nou organism. Diferenţierea celulelor merismatice, ca rezultat al multiplicărilor
repetate, prin exteriorizarea completă a totipotenţei celulare, este manifestată în funcţie
de numeroşi factori endogeni şi exogeni. Analizând ansmblul acestor factori care intervin
în exprimarea potenţialului regenerativ al acestor explante, s-a stabilit că realizarea unor
amestecuri nutritive care să corespundă necesitaţilor vitale ale ţesuturilor inoculare este

8
indispensabilă. Astfel, mediile sintetice utilizate în cultura in vitro a meristemelor
caulinare la viţa-de-vie au fost lichide. La aprecierea rolului şi importanţei diferitelor
elemente chimice au existat puncte de vedere variate desprinse din contextul anumitor
condiţii de experimentare. Astfel, mediul Murashige Skoog, concept pentru creşterea
calusului la tutun, este recomandat şi la viţa-de-vie, deoarece concentraţia ridicată de
potasiu stimulează diviziunea celulară. Foarte frecvent, s-au iniţiat culturi de meristeme
la unele genotipuri de viţă-de-vie, pe variante de mediu MS, în care s-au redus
concentraţiile de macro- şi microelemente, sau chiar au fost excluse unele săruri (Badea
şi colaboratorii), obţinându-se totuşi rezultate spectaculoase. Investigaţiile privind rolul
îndeplinit de vitamine asupra plantelor s-a dovedit a fi deosebit de important,
constatându-se că prezenţa lor este indispensabilă în obţinerea unei creşteri celulare
optime. Dacă se are în vedere complexitatea mediilor de cultură şi a condiţiilor în care
sunt cultivate explantele, acţiunea vitaminelor se cumulează cu a celorlalte substanţe,
exercitând o influenţă sinergică. Unele contradicţii existente în literatura de specialitate,
privind utilitatea sau ineficienţa unor vitamine în mediile de cultură specifice
meristemelor la viţa-de-vie, au fost înlăturate în urma cercetărilor întreprinse de Gonsales
şi colaboratorii. Comparând rezultatele obţinute de aceştia, s-a demonstrat că regenerarea
de plante din meristeme este relativ asemănătoare şi în cazul utilizării unor formule ale
complexului vitaminic diferite. De regulă, cu cât nivelul de organizare al inoculilor este
mai simplu, cu atât necesităţile nutriţionale sunt mai pretenţioase, iar substratul nutritiv
trebuie să fie mai complex şi să conţină o gamă mai largă de substanţe organice. S-a
demonstrat că potenţialul de regenerare al meristemelor apicale la viţa-de-vie poate fi
influenţat în mare măsură de un complex hormonal variat, care compensează lipsa celor
mai importanţi compuşi endogeni. Rezultatele experimentale întreprinse în scopul
regenerării de plante din meristeme apicale la viţa-de-vie au evidenţiat faptul că aportul
exogen al unui complex hormonal (auxine şi citochinine) reprezintă o cerinţă esenţială
pentru stimularea proceselor de diferenţiere. Cu toate că modul de acţiune al
citochininelor este insuficient elucidat, Houssa şi colabortorii afirmă, prin cercetările
întreprinse, că acest grup de regulatori de creştere sunt promotori ai diviziunii celulare
din meristeme. Barlass şi Skene au subliniat faptul că proliferarea de muguri adventivi
din fragmentele apicale ale lăstarilor de viţă-de-vie este intens stimulată de 6-

9
benzilaminopurina. De asemenea, Pool şi Powel au stabilit că zeatinribozida este cea mai
importantă citochinină din exudatul xilemic al viţei-de-vie, care intensifică proliferarea şi
elogarea lăstarilor de Vitis labrusca obţinuţi din meristeme aplicale cultivate in vitro.
Existenţa în mediul de cultură a benzilaminopurinei în concentraţie de 0,5-2 mg/l şi a
zeatinei de 1-5 mg au determinat o creştere moderată a elongării lăstarilor şi o uşoară
scădere a fenomenului în cazul combinaţiei de 10 mg/l zeatină şi 0,5-2 mg de
benzilaminopurină, în aceleaşi condiţii experimentale. Utilizarea benzilaminopurinei în
concentraţii mai ridicate (peste 3 mg) s-a dovedit a avea frecvente efecte nefavorabile,
concretizate prin blocarea proceselor de regenerare. Goussard a sesizat efectul inhibitor al
benzilaminopurinei (5 mg/l), care nu poate fi compensat de suplimentarea cu zeatină (1-
10 mg/l). Deşi s-a raportat că regenerarea din explante meristematice la viţa-de-vie este
posibilă în cazul folosirii exclusive a unei citochinine sau a unui complex de citochinine,
rezultatele experimentale obţinute de Cheen şi Pool au indicat că răspunsul organogenetic
este superior şi în cazul când în mediul de cultură se află şi o auxină (acid b-indolilacetic
sau a-naftilacetic). Analiza datelor obţinute la diferite genotipuri de viţă-de-vie indică
faptul că regenerarea din meristeme apicale este dependentă de concentraţia de
citochinină în mediul de cultură, dar mai ales de raportul citochinină/auxină. Gama
concentraţiilor celor două categorii de hormoni este relativ restrânsă, iar eficienţa unei
concentraţii sau a raportului citochinină/auxină este influenţată într-o mare măsură şi de
genotip în exprimarea potenţialului regenerativ al explantelor. Din categoria factorilor
exogeni, care reglează procesele regenerative ale celulelor meristematice inoculate pe
medii sintetice, un rol esenţial îl joacă condiţiile de mediu. Deşi în majoritatea condiţiilor
de cultură in vitro cerute de experimentele ce au ca scop prioritar regenerarea de plante
din meristeme, fotoperiodismul de 16/8 ore (lumină/întuneric) este generalizat, rezultatele
unor cercetări au indicat faptul că o perioadă de lumină de 10 ore a favorizat o mai bună
proliferare de lăstari la unele genotipuri luate în studiu de Chee şi Pool. Rezultatele
experimentale obţinute la un număr variabil de specii şi soiuri ale genului Vitis au arătat
că nivelul de temperatură nu influenţează în mod semnificativ evoluţia culturilor de
meristem în diferitele etape ale procesului de regenerare.

10