Producerea materialului săditor viticol certificat,

liber de virusuri

I.Condiţii de cultură:
a.Cultura să prezinte identitate şi puritate în ceea ce priveşte soiul, respectiv clona;
b.Condiţiile de cultură trebuie să asigure verificarea identităţii şi purităţii cu privire la
soiul, respective clona, precum şi în ceea ce priveşte starea de sănătate a plantelor.
c.Solul sau substratul de cultură să fie liber de organisne dăunătoare sau vectori ai
acestora, în special nematozi.. Plantele mama şi şcolile de viţă se vor amplasa astfel încât
să prevină orice risc de îmbolnăvire.

II. Condiţii fitosanitare în spaţiile destinate menţinerii materialului initial şi

al nucleului de preînmulţire:
a.Spaţiul destinat producerii şi menţinerii materialului de preînmulţire viticol trebuie să
asigure protecţie totală faţă de organismele dăunătoare şi a vectorilor acestora.
b. Asigurarea acestor spaţii protejate de tip seră se face prin amenajarea unui spaţiu
tampon la intrarea în seră, prevăzut cu pereţi de sticlă la jumătatea inferioară, plase
antiinsecte la jumătatea superioară şi la uşa de acces, spaţiu destinat dezinfecţiei
personalului autorizat la intrarea în seră.
Amenajarea serei pentru asigurarea fitosanitară a spaţiului destinat materialului de
înmuţire:
-pregătirea terenului pentru înfiinţarea culturii;
-acoperirea cu folie de mulcire de tip agrotextil pe toată lăţimea traveei şi aşezarea
scheletelor de lemn ca suport pentru vasele de vegetaţie, în vederea evitării riscului de
contact al plantelor cu solul serei;
-dezinfecţia scheletului metalic al serei şi a inventarului serei prin tratamente
chimice,
-prepararea şi dezinfectarea amestecului nutritiv folosit pentru umplerea vaselor
de vegetaţie.

1
 II. Evaluarea fitosanitară a materialului de înmulţire.
Cercetările actuale sunt îndreptate spre identificarea materialului sănătos şi
înmulţirea acestuia pentru creşterea eficienţei culturii viţei de vie. Evaluarea fitosanitară a
materialului de înmulţire se face prin:
a .Monitorizarea virozelor pe zone/regiuni viticole şi testarea ELISA şi PCR;
b. Realizarea de observaţii privind prezenţa vectorilor potenţiali şi corelarea acestora cu
prezenţa şi răspândirea virusurilor;
c. Identificarea modului de circulaţie a virusurilor la viţa de vie de la o plantaţie infectată
la o plantaţie nouă, şi analiza unui mod de gestionare pentru a opri circulaţia vectorilor
virusurilor;
d. Identificarea şi înmulţirea materialului săditor viticol sănătos şi devirozarea
soiurilor/clonelor de importanţă economică pentru viticultura românească;.
e. Optimizarea factorilor de devirozare;
f. Aplicarea unor metode cunoscute pentru identificarea/diagnosticarea/devirozarea viţei
de vie:
-termoterapia in vivo şi in vitro,
-combinaţii de metode de devirozare a viţei de vie;
-eliminarea virusurilor la viţa de vie prin termoterapie şi cultură in vitro, prin
utilizarea diferitelor tipuri de explante: meristeme, apex, muguri axilari.
-testarea virologică a materialului amelioratorului în vederea omologării şi la
cerere devirozarea acestuia;
-utilizarea de rutină a metodei ELISA,
În România cercetările au fost îndreptate asupra virusurilor specific viţei de vie,
cu patogenitate crescută (GFLV, GLRaV 1+3, GFkV, GVA). Aceste virusuri apar
singure dar şi în combinaţii greu de eliminat datorită comportamentului diferit la
condiţiile de devirozare utilizate. Studiile arată că metoda de devirozare trebuie adaptată
fiecărui virus sau grupă de virusuri.
În situaţia unei infecţii a materialului amelioratorului şi imposibilităţii selecţiei
materialului authentic sănătos, se poate aplica una din următoarele tehnici de
insănătoşire: termoterpia, cultura de apex, cultura de meristeme, cultura in vitro

2
combinată cu termoterpia, chimioterapia in vitro, electroterpia, embriogeneza somatică,
embriogeneza somatică combinată cu termoterapia.
Cultura de meristeme şi termoterapia, individual sau în combinaţie sunt cele mai
utilizate metode pentru a obţine plante libere de virusuri.
Evaluarea stării de sănătate a materialului amelioratorului se face prin metoda TAS-
ELISA.
În urma analizei serologice prin testul ELISA la materialul amelioratorului,
genotipurile de viţă de vie infectate cu virusuri sunt introduse într-un program de
însănătoşire, metoda aplicată fiind chimioterapia in vitro.
Genotipurile sănătoase sunt înmulţite rapid pentru introducerea în sera depozitar cu
material initial.

III. Devirozarea materialului infectat.

În cazul în care materialul amelioratorului este infectat şi nu este posibilă selecţia
materialului autentic sănătos aparţinând anui anumit soi/clonă, se aplică tehnici de
devirozare cum ar fi: termoterapia, cultura de apex, cultura de meristeme, cultura în vitro
combinată cu termoterapia, chimioterapia, electroterapia, embriogeneza somatică.
Cultura de meristeme şi termoterapia, utilizate individual sau în combinaţii, sunt cele mai
folosite metode de devirozare.
Devirozarea prin chmioterapie in vitro.
Se recoltează creşteri vegetative (vârfuri de creştere de 8-10 cm) de la care se
prelevează două tipuri de explante: apexuri de 2-3 mm şi muguri axilari de 4-5 mm.
Asepsia materialului biologic se efectuează cu hipoclorit de calciu 6%. Timpul de
dezinfecţie este de 4-6 minute, după o imersie prealabilă în alcool de 80%. După
dezinfecţie se realizează spălarea materialului vegetal de agentul dezinfectant prin 3-4
clătiri cu apă distilată sterilă. Toate etapele dezinfecţiei se realizează în condiţii de
asepsie, în hota cu flux laminar.
Explantele se inoculează pe mediul M&S, specific viţei de vie şi se cultivă timp de
60-70 zile, timp în care se fac două subculturi. Începând cu a treia subcultură explantele
se cultivă pe mediu de multiplicare suplimentat cu chimioterapice cu rol în blocarea
multiplicării virale. Substanţele folosite în acest scop sunt ribavirina 20 mg/l şi

3
oseltamivir 40 mg/l. Lăstarii individualizaţi pe mediul cu viricide sunt cultivaţi pe mediu
de înrădăcinare specific viţei de vie, după care urmează etapele aclimatizării în vederea
regenerării de noi plante. Plantele regenerate sunt analizate prin testele ELISA şi selectate
plantele sănătoase.
Devirozarea prin termoterapie şi/sau cultură in vitro.
Lotul de plante mama, fortificate în vase de vegeaţie, cu lăstari de 15-20 cm, se
introduce în camera de termoterapie KTLK-20.000.
Temperatura de 38 ±10C (considerată prag de eradicare a virusurilor) se realizează
treptat, începând în primele 15-18 zile zile cu 280C şi ridicând temperatura gradual cu 2-
30C la interval de 3-4 zile; umiditatea relative a aerului se menţine la 70-80% şi se
suplimentează cu soluţii nutritive KNOP ½ + microelemente MS substraturile de
nutriţie pentru îmbunătăţirea condiţiilor pe timpul termoterapiei.
După 60-80 de zile de menţinere la de 38 ±10C a plantelor mama, în funcţie de tipul
de virus şi gradul infectării, se realizează creşteri vegetative de 35-50 cm din care se
produc explante (apexuri de 0,3-0,5 cm şi muguri axilari de de 0,5-0,6 cm), care sunt
folosite apoi ca explante pentru multiplicarea in vitro.
La multiplicarea in vitro se are în vedere capacitatea regenerativă a fiecărui genotip,
astfel încât să se obţină un număr suficient de plante/genotip pentru a se putea efectua
selecţia sanitară după perioada de aclimatizare.
Aclimatizarea materialului viticol devirozat.
Aclimatizarea reprezintă perioada de adaptare a plantei obişnuită cu anumite
condiţii de cultură, la alte condiţii de cultură. Durata procesului este proporţională cu
diferenţa dintre condiţiile iniţiale şi cele ulterioare. Pentru reuşita aclimatizării, aceasta
trebuie să se facă treptat şi este o etapă dificilă în procesul de micropropagare.
Aclimatizarea plantelor obţinute în vitro este perioada în care are loc adaptarea lor
treptată la condiţiile natural de mediu. . Plantele sunt transferate în spaţii special protejate
(izolatoare) unde se repică în substraturi absorbante şi permeabile: turbă sau perlit. În
izolatoare se asigură temperatura şi umiditatea optime pentru creşterea şi fortificarea lor.
Aclimatizarea durează circa o lună, după care plantele dobândesc capacitatea de a rezista
la condiţiile de mediu natural.

4
 Aclimatizarea cuprinde două etape: prima bde acomodare la condiţiile ex vitro şi a
doua de fortificare.
Multiplicarea materialului de înmulţire viticol liber de virusuri.
Metode de multiplicare rapidă:
1.Multiplicarea prin cultură in vitro a mugurilor preformaţi. Datorită ciclului
vegetativ scurt şi posibilităţii de multiplicare rapidă şi obţinerea unui număr mare de
plante este cea mai recomandată metodă de înmulţire rapidă a unor soiuri/clone noi.
Această tehnică se limitează la 10-12 subculturi succesive, şi durează în jur de un
an.
2.Multiplicarea vegetative prin butaşi lemnoşi. Butaşii de un singur ochi se
folosesc în practica viticolă în situaţia multiplicării rapide a unor genotipuri valoroase, cu
înrădăcinarea în condiţii de mediu controlate, în sere sau solarii.
Folosirea substanţelor bioactive de înrădăcinare stimulează procesul de rizogeneză,
cu formarea unui număr mai mare de rădăcini.

IV. Transferul materialului de înmulţire iniţial G0, în sera izolator.

Plantele aclimatizate şi fortificate, serologic negative, obţinute prin tehnologia
devirozării dar şi prin cea de multiplicare rapidă se plantează în sera isolator pe sol sau în
vase de vegetaţie, câte patru plante/soi.
Sera izolator constituie locul de stocare a materialului săditor viticol din categoria
biologică Iniţial în vederea utilizării lui pentru înmulţire. Atât în cazul culturii la sol, cât
şi în vase de vegetaţie serele se pregătesc conform cu specificaţiile prezentate anterior.
Plantarea se execută la distanţe de 30-40 cm între plante şi 50 cm între rânduri, cu
cunducerea pe verticală a creşterilor vegetative, utilizând un sistem de susţinere.
Pe plantă se rezervă în primul an 1-2 lăstari şi se ajunge până la 3-4 lăstari începând
cu anul trei de cultură.