Diagnosticul de laborator

Infeciile pot fi diagnosticate fie direct, prin detectarea patogenului, fie indirect prin punerea n eviden a anticorpilor. Domeniul
microbiologiei care se ocup cu diagnosticarea de laborator a infeciilor se numete microbiologie clinic.
Materialul analizat n laborator este recoltat, n funcie de aparatul n care se localizeaz infecia. Poate fi recoltat de la nivelul
aparatului respirator (de pe amigdale, fluid din sinusuri, secreii pulmonare), urogenital (urin, secreii genitale), snge, rni, abcese,
tractul gastro-intestinal, LCR, exudate, transudate.
Bacteriile au dimensiuni de ordinul micrometrilor, astfel nct este nevoie de amplificarea imaginii de 1000 ori (limita maxim
a microsocopului optic). Examinarea microscopic a unui astfel de material necesit realizarea unor preparate:
Preparate native: cu sau fr colorani vitali, sunt utilizate pentru observarea bacteriilor vii. Contrastul redus al unor astfel de
preparate face necesar utlizarea unui microscop cu cmp ntunecat sau cu contrast de faz.
Preparate colorate: au un contrast mai bun, astfel nct pot fi observate bine la microscopul optic. Bacteriile sunt n prealabil
aplicate pe lam, uscate la temperatura camerei i fixate prin cldur sau alcool metilic. Dup fixare se aplic colorantul. Metodele
de colorare pot fi:
simple: utilizeaz un singur tip de colorant: albastru de metilen, fucsin fenicat etc.
compuse: coloraia Gram , coloraia Ziehl-Neelsen
coloraii speciale: utilizate pentru a pune n eviden unele elemente structurale ale bacteriilor (spori, incluziuni cu glicogen,
nucleoidul)
Microscopia fluorescent: o alt tehnic special. O substan fluorocrom absoarbe lumin cu lungime de und mic i
emite lumin cu o lungime de und mai mare. Preparatele colorate cu fluorocromi sunt expuse la lumini cu o anumit lungime de
und. Prile colorate apar clare pe un fond ntunecat. Aceast tehnic necesit un echipament special. Se utilizeaz pentru
observarea micobacteriilor (bacilul Koch, leprei). Fluorocromul (izotiocianatul de fluorescein) este legat de un anticorp care, la
rndul lui, se va cupla cu antigene prezente la nivelul celulei bacteriene.
Pentru a putea fi studiate i identificate, bacteriile pot fi cultivate n laborator.

Etapele coloraiei compuse Gram

Medii de cultur
Microorganismele se pot dezvolta i n afara mediului lor natural pe medii de cultur artificiale, care reprezint substraturi nutritive
(lichide sau solide, organice sau anorganice) ce pot asigura dezvoltarea i multiplicarea lor. Mediile se folosesc pentru izolarea i pstrarea sub
form de culturi pure a microorganismelor, precum i pentru identificarea speciilor n funcie de proprietile lor fiziologice. De aceea, ele
trebuie s fie ct mai asemntoare cu substraturile naturale.
Mediile de cultur trebuie s ndeplineasc anumite condiii pentru ca specia microbian s se poat dezvolta:
s conin substanele necesare microorganismului precum i ingredientele care s condiioneze creterea sa;
substanele trebuie s corespund indicaiilor tehnice, s fie cntrite exact i s fie introduse n recipient n ordinea strict indicat;
s aib gradul de alcalinitate sau aciditate (pH) corespunztor dezvoltrii microorganismului respectiv i s-i asigure meninerea n limite
compatibile cu creterea lui (prin sisteme tampon);
s fie stabil, adic s-i pstreze toate calitile iniiale pe toat durata incubrii;
sterilizarea nu trebuie s altereze mediul; acesta trebuie s rmn steril pn n momentul nsmnrii;
s asigure condiiile de aerobioz/ anaerobioz corespunztoare microorganismului respectiv;
s fie repartizate n recipiente care s mpiedice contaminarea culturii care se dezvolt n ele, att nainte ct i dup nsmnare;
s asigure un anumit grad de umiditate.
Clasificarea mediilor de cultur
Diversitatea extrem a compoziiei chimice a mediilor de cultur nu permite o clasificare propriu-zis, deoarece suprapunerile apar foarte
frecvent. Criteriile de clasificare sunt urmtoarele:
Dup provenien:
medii naturale:
de origine vegetal: must de mal, cartof glicerinat etc.
de origine animal: lapte, bil, etc
medii artificiale:
o lichide: bulionul, apa peptonat
o solide: geloza, gelatin
b. Dup compoziie:
- medii uzuale: folosite curent n laborator, pentru cultivarea unui numr mare de microorganisme (bulionul, apa peptonat,
geloza, gelatina)
- medii complexe (compuse): folosite pentru izolarea i creterea unor microorganisme care se dezvolt slab sau nu se
dezvolt pe medii simple (geloz-ser, geloz-snge, bulion-ser etc.)
- medii speciale: prin compoziia lor permit creerea preferenial a anumitor specii dintr-un amestec heterogen de
microorganisme (dintr-o prob natural). Aceste medii conin un indicator de pH, un zahr fermentescibil, antiseptice
3

selective, antibiotice. Aceste medii speciale pot fi: medii de mbogire, medii selective, medii elective, medii de
conservare, medii de identificare.
Prepararea mediilor de cultur se face dup reete, respectnd cu strictee ordinea ingredientelor i condiiile de sterilitate.

Mediu de cultur geloz-snge

Culturi i colonii microbiene

Cultivarea microorganismelor se face n medii lichide i pe medii solide:
Culivate n medii lichide, microorganismele formeaz culturi al cror aspect este diferit n funcie de grup, de specie
i de proprietile fizico-chimice ale mediului. Culturile prezint o serie de caracteristici care pot fi utile pentru identificarea
speciilor cultivate i pentru eventualele forme de variabilitate:
gradul de tulburare a mediului;
mirosul
pigmentarea culturii
Cultivate pe medii solide, microorganismele se dezvolt sub form de colonii. Colonia reprezint o populaie
celular rezultat din creterea i multiplicarea uneia sau mai multor celule aparinnd aceleai specii sau tulpini.
Caracterizarea coloniilor implic precizarea urmtoarelor aspecte:
dimensiunile
aspectul marginilor
profilul coloniei
consistena
transparena sau opacitatea
culoarea i aderena.
Identificarea bacteriilor
Principiul de baz al identificrii bacteriilor este acela de asocia o cultur necunoscut cu locul ei n sistemul de
clasificare bazndu-ne pe cat mai multe caracteristici posibile:
morfologice: forma, mrimea, coloraia, spori, flageli, capsul
fiziologice: determinate cu indicatori din mediu. Sunt disponibile n prezent sisteme miniaturale de cultivare a
bacteriilor. Ex. de caractere: enzime ale lanului respirator, heolizine, lipaze, lecitinaze, enzime ale diverselor ci
metabolice (glucidice, proteice etc), produi finali de metabolism,
chimice: ADN, structura peretelui celular, structura antigenic.

Creterea bacteriilor n culturi diverse moduri de dezvoltare a culturii

Colonii bacteriene criterii de identificare a bacteriilor (forma, profil, aspectul marginilor)

Metodele de genetic molecular sunt extrem de importante i n plin ascensiune. Obiectivul principal al acestor
metode este identificarea direct a secvenelor de nucleotide din materialul analizat. Aceste metode sunt utilizate, mai ales,
n cazul bacteriilor care nu pot fi cultivate, sunt greu cultivabile sau prezint un timp de nmulire foarte lung. Sunt utilizate
urmtoarele metode:
probe de ADN. Din moment ce ADN-ul este dublu catenar, este posibil detectarea secvenelor monocatenare cu
tehnici de hibridizare ce utilizeaz lanuri monocatenare marcate radioactiv sau nu.
Amplificarea. Obiectivul principal este creterea sensibilitii pentru detectarea mai uoar a ADN-ului, din moment
ce acesta se gsete natural, n cantiti extrem de mici. Cea mai utilizat metod este PCR-ul.
Prezena genelor ce dau rezisten la antibiotice poate fi msurat i ea astfel.
Detecia direct a antigenelor bacteriene
Antigenele specifice pentru anumite specii sau genuri pot fi detectate direct, utiliznd anticorpi. Exemplele includ
detectarea antigenelor bacteriene din LCR n meningitele acute purulente, detecia antigenelor gonococice din secreiile
tractului urogenital.

Utilizarea de animale de laborator

Testarea pe animale este o tehnic utilizat mai ales n trecut. Pn nu demult, toxinele bacteriene (difteric, tetanic,
botulinic) puteau fi confirmate doar pe animale de laborator. n prezent, sunt utilizate metode genetice care evideniaz
genele codificatoare de toxine.

 Terapia cu antibiotice
Terapia antibacterian specific se bazeaz pe tratarea infeciilor cu ageni specifici mpotriva respectivului patogen. O trstur a acestor
farmaceutice este toxicitatea selectiv, ce se refer la aciunea n doze mici asupra bacteriilor, ce nu provoac ru macroorganismului infectat.
Cel mai important grup de ageni antiinfecioi este reprezentat de antibiotice. Aceste substane sunt produse de fungi sau bacterii (de obicei
Streptomycetes).
Fiecare agent antiinfecios are un anumit spectru de aciune, ceea ce nseamn c acioneaz asupra unei nie de bacterii care prezint
sensibilitate natural la respectiva substan. Unele antibiotice au un spectru limitat de aciune (vancomicina). Majoritatea au un spectru mai larg,
cum sunt tetraciclinele care afecteaz toate bacteriile.
Eficacitatea unui agent antiinfecios definete modul n care acesta afecteaz populaia bacterian. Se disting dou efecte de baz: efectul
bacteriostatic (reversibilitatea inhibiiei creterii) i efectul bactericid. Multe substane pot dezvolta ambele efecte, n funcie de concentraie,
tipul de organism i faza de cretere. Multe dintre aceste antibiotice au i un efect postantibiotic. Acesta const n leziunile pe care le provoac
la nivelul populaiei bacteriene, acesteia trebuindu-i o anumit perioad pentru a se recupera i a-i putea relua activitatea. Acest efect poate dura
cteva ore. Un agent bacteriostatic singur nu poate elimina total agentul infecios. Vindecarea rezult prin efectul combinat al agenilor
antiinfecioi i al sistemului imunitar. n esuturile n care sistemul imunitar este ineficient (endocard), n mijlocul unei infecii purulente, n care
nu mai exist fagocite funcionale sau la pacienii imunosupresivi, este nevoie de substane bactericide. Astfel, este important de tiut dac un
antibiotic este bactericid sau bacteriostatic. O populaie bacterian care infecteaz un organism va conine ntotdeauna cteva celule rezistente.
Dac tratamentul este realizat discontinuu, aceste celule duc la posbile recderi

Tratamentul cu antibiotice poate avea efecte secundare:

Efectul toxic se datoreaz lezrii celulelor sau esuturilor gazdei. Trebuie verificat concentraia sanguin a unor substane, n timpul
tratamentului, n special n cazul substanelor care se elimin dificil (vancomicina).
Reaciile alergice
Efecte secundare biologice. Ex. nlocuirea sau ndeprtarea florei normale a organismului.
Bacterii problematice. Tulpinile cu rezisten dobndit sunt ntlnite printre enterobacteriacee, stafilococi. Tratamenul acestor infecii
ntmpin adesea dificulti. Aceste bacterii sunt responsabile de majoritatea infeciilor nosocomiale. Cauza incidenei ridicate n ceea ce privete
rezistena la antibiotice este variabilitatea genetic pronunat. Cu ct sunt administrate mai des tratamente cu antbiotice, cu att mai mult crete
numrul de tulpini care dobndesc rezisten.
Exist dou teste standard de verificare a nivelului rezistenei bacteriei la antibiotice:
Testul seriei diluiilor: se determin minimul concentraiei substanei inhibitoare pentru blocarea proliferrii celulelor bacteriene.
Antibiograma const n inocularea bacteriei pe mediu i aplicarea unor discuri mbibate n diferite tipuri de antibiotice. Cu ct raza
cercului format n jurul discului respectiv, unde nu se mai dezvolt bacterii, este mai mare, cu att microrganismul respectiv este mai
sensibil la antibiotic.

Antibiograma
10