Sunteți pe pagina 1din 18

http://www.sfatulmedicului.

ro/profile-analize/metode-utilizate-in-microbiologie-78
Metode utilizate in microbiologie
Pentru probarea diagnosticului, se recomanda urmatoarele analize si investigatii:
Frotiul
Depistarea rapida a microorganismelor si studiul morfologiei necesare unui diagnostic
microbiologic corect se realizeaza prin examen microscopic.
Examenul microscopic poate fi proaspat, intre lama si lamela sau fixat si colorat. Prin frotiu se
intelege material microbian (produs patologic sau cultura microbiana) etalat in strat subtire pe
suprafata unei lame de microscop. Pentru efectuarea unui frotiu se folosesc lame de microscop
curate si degresate care se marcheaza la una din extremitati cu numele pacientului si materialul
microbian ce urmeaza a fi etalat.
Pentru fiecare produs patologic obisnuit se efectueaza 2 frotiuri (exceptie fac lichidele de punctie
din care se fac 4 frotiuri), unul se coloreaza Gram (pentru evidentierea bacteriilor), iar al doilea
Giemsa (pentru celularitate).
Frotiul din produs patologic poarta denumirea de examen microscopic colorat si are un rol
deosebit in bacteriologia medicala. El ajuta in:
- orientarea catre un diagnostic rapid in caz de urgenta medicala (ex.meningita bacteriana);
- orientarea microbiologului in respingerea unor produse patologice necorespunzatoare
(ex.saliva, in loc de sputa);
- corelarea dintre acesta si cultura, ce permite trecerea de la diagnosticul prezumtiv la
diagnosticul de certitudine.
Aproape toate bacteriile cu importanta clinica pot fi detectate la examenul microscopic colorat,
exceptie facand: acele bacterii care traiesc aproape exclusiv intracelular e.g. Chlamydia, cele
care se gasesc in peretele celular (ex.Mycoplasma si Ureaplasma) si cele care au dimensiuni
insuficiente pentru a fi vizualizate la microscop (ex.spirochetele).

Coloratiile folosite in bacteriologie sunt:
1. Coloratiile simple - utilizeaza un singur colorant si evidentiaza doar morfologia microbilor:
dimensiune, forma, gruparea celulelor, prezenta capsulei. Dintre coloratiile simple, uzuala si
rapida este coloratia cu albastru de metilen care coloreaza in albastru toate elementele celulare:
bacterii, leucocite, celule epiteliale.
2. Coloratiile diferentiale - evidentiaza in afara caracterelor morfologice si reactiile de culoare
ale microbilor.
Coloratia Gram si coloratia Ziehl-Neelsen (Z.N.) sunt cele mai utilizate in
bacteriologie.Comportarea diferita a bacteriilor in coloratia Gram tine de diferentele structurale
ale peretelui bacterian. Bacteriile Gram-pozitive apar colorate in violet, iar cele Gram-negative
in rosu. Leucocitele si celulele epiteliale apar cu citoplasma colorata in roz si nucleul in rosu.
Coloratia Ziehl-Neelsen este folosita pentru identificarea urmatoarelor grupe de bacterii:
Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella si oochistii de Cryptosporidium,
Isopora, Sarcocystis si Cyclospora.Uzual in bacteriologie coloratia Z.N. este folosita pentru
decelarea Mycobacteriilor. Acestea, spre deosebire de alte bacterii, datorita prezentei in peretele
bacterian a unor substante ceroase, se coloreaza la cald cu fucsina bazica si rezista la decolorarea
cu acizi minerali diluati si cu alcool. Bacilii acido-alcoolo-rezistenti apar colorati in rosu, iar
bacteriile neacido-rezistente apar colorate in albastru la fel ca leucocitele si celulele tisulare, a
caror citoplasma se coloreaza in albastru deschis cu nucleul albastru inchis.
In timp s-au dezvoltat numeroase modificari de la metoda originala descrisa de Ziehl in 1882 si
Neelsen in 1883, cea mai utilizata fiind cea descrisa de Kinyoun.
3. Coloratii speciale pentru structuri particulare ale unor bacterii (capsula - tus India; granulatii
metacromatice - Del Vecchio, spori-verde malachit).
Controlul intern de calitate al frotiurilor este obligatoriu si se face cu martor pozitiv si negativ.In
cazul coloratiei Gram folosim urmatorii martori:
- martor pozitiv: Staphylococcus aureus ATCC 25923;
- martor negativ: Escherichia coli ATCC 25922.

Cultura
Bacteriile apartinand unor specii diferite pot avea caractere microscopice asemanatoare, de aceea
identificarea lor presupune si studiul caracterelor fiziologice care sunt cercetate "in vitro" pe
medii de cultura.
Cultura bacteriana reprezinta rezultatul cresterii si multiplicarii bacteriilor intr-un mediu nutritiv
si are ca scop:- izolarea microorganismelor patogene din prelevatele patologice;
- identificarea agentilor patogeni;
- testarea sensibilitatii la antibiotice in vederea initierii si monitorizarii terapiei antimicrobiene.

Clasificarea mediilor de cultura poate fi in functie de:
1. Tolerabilitate:
- medii uzuale, care permit cresterea unui numar mare de specii bacteriene;
- medii speciale, care permit cresterea unei game restranse de specii, uneori chiar tintit pentru o
singura specie.
2. Scopul utilizarii:
- medii de imbogatire (intotdeauna lichide) pentru anumite grupe de bacterii;
- medii de izolare: uzuale, nediferentiale, diferentiale, care diferentiaza printr-un singur caracter
grupe taxonomice sau tulpini;
- medii selective, care inhiba unele grupe bacteriene favorizand multiplicarea altora.
3. Identificare:- medii test - conventionale sau microtest;
- medii multitest - asociate sau combinate.
Pentru fiecare categorie de prelevate patologice se utilizeaza uzual un mediu sau un set de medii
care permit izolarea bacteriilor cel mai frecvent implicate in infectiile zonei respective. Acest set
de medii uzuale poate fi suplimentat cu alte medii in raport cu datele clinico-epidemiologice.
Pentru izolarea germenilor patogeni din produse pluricontaminate, este obligatorie insamantarea
pe medii diferentiale.
In cazul in care se apreciaza ca prelevatul contine un numar redus de germeni, se vor folosi
medii lichide de imbogatire (bulion BHI pentru germeni aerobi, bulion thioglycolat cu resazurina
pentru anaerobi, bulion selenit pentru coprocultura etc).

Incubarea mediilor insamantate se face tinand cont de exigentele bacteriilor suspectate:
- bacteriile aerobe se cultiva in atmosfera obisnuita;
- bacteriile carboxifile necesita incubarea in atmosfera de CO2, aceasta realizandu-se in exicator
cu ajutorul unei lumanari;
- bacteriile strict anaerobe sunt cultivate cu ajutorul sistemelor Gaspak.
Majoritatea bacteriilor de interes medical cresc adecvat la 37C, spre deosebire de fungi a caror
crestere este optima la 30C. Urmarirea placilor incubate se face 24 - 48 de ore pentru bacteriile
obisnuite; 2-5 zile pentru fungi.

Examinarea culturilor
Aspectul culturii este dependent de specie si de compozitia mediului.
In mediu lichid cresterea poate fi: uniforma, cu depozit, granule, pelicula, inel, degajare gaz,
formare de pigment. Pe mediile solide bacteriile formeaza colonii, caracterul acestora (forma,
marime, suprafata, opacitate, consistenta, miros) si cantitatea in care s-au dezvoltat
(+,++,+++,++++) orientand microbiologul catre diagnostic.
Un aspect important il reprezinta absenta cresterii bacteriene in cazul produselor de obicei
pluricontaminate (ex. exsudat nazofaringian, coprocultura, secretie vaginala). Acest lucru
sugereaza faptul ca pacientul se afla sub tratament cu antibiotic sistemic sau local (ovule,
antiseptice orofaringiene).
Semnificatia clinica a unor izolate poate fi stabilita inca din primocultura, in cazul izolatelor din
prelevate necontaminate (lichide de punctie) sau bacilii Gram-negativi izolati dincolo de un
anumit prag in urocultura cantitativa.
In cazul culturilor monobacteriene izolate din prelevate normal sterile (hemocultura, lichide de
punctie) se trece direct la identificare si antibiograma. Din culturile pluribacteriene sunt repicate
colonii, apoi sunt identificate pana la nivel de specie si este testata sensibilitatea la antibiotice.
Selectionarea acestora se face in functie de aspectul coloniei, natura prelevatului, diagnosticul
clinic si rezultatele examenului microscopic colorat.

I dentificarea serologica
Reactiile antigen-anticorp (aglutinare pe lama si latexaglutinare) isi gasesc aplicatia in
laboratoarele Synevo in identificarea antigenica a unor izolate cu semnificatie clinica-prin
confirmarea genului si speciei.
Tulpinile de E.coli care produc diaree sunt clasificate pe baza mecanismelor patogene in: E.coli
enteropatogen (EPEC), E.coli enteroinvaziv (EIEC), E.coli enterotoxigen (ETEC), E.coli
enterohemoragic (EHEC), E.coli enteroagregativ (EAEC).
Identificarea biochimica nu diferentiza tulpinile de E.coli patogene de cele nepatogene, de aceea
se recomanda testul de serotipare.
Medicul clinician, pe baza semnelor clinice trebuie sa precizeze in biletul de trimitere serotipul
pentru care trebuie testata proba pacientului.
EHEC - medicul curant recomanda coprocultura in primele cinci zile de boala. E.coli O157:H7
este cel mai frecvent serotip asociat colitei hemoragice. Izolarea EHEC O157H7 se comunica
imediat medicului.
Examinarea culturilor: se repica 8 - 10 colonii lactozo-pozitive si se identifica prin teste
biochimice.
Aglutinare: se testeaza cu ser anti O157 si anti H7.
Gastroenteritele sau toxiinfectiile alimentare produse de bacteriile din genul Salmonella se
datoreaza ingerarii de alimente contaminate cu aceste bacterii.
Cele mai frecvente salmonele izolate in Romania, in gastroenterite, sunt S.typhimurium,
S.choleresuis, S.enteritidis, S.panama. Sansele de a izola agentul patogen in coprocultura sunt in
prima saptamana de boala.
Examinare microscopica - la examenul intre lama si lamela cu albastru de metilen se observa
numeroase PMN sau monocite care sunt asociate cu infectia produsa de S.typhi.
Insamantarea pe medii de imbogatire (e.g. bulion selenit de sodiu) si pe medii selective
favorizeaza cresterea salmonelelor si permite diferentierea de alte specii de enterobacterii.
EPEC si EIEC
Examinarea culturilor: se repica 8 - 10 colonii lactozo-pozitive (nu se pot diferentia coloniile de
E.coli patogene de cele nepatogene) si se identifica prin teste biochimice.
Aglutinare: cu seruri polivalente EPEC, EIEC.
Identificarea se realizeaza prin probe biochimice caracteristice urmata de aglutinare cu seruri
specifice de grup si de tip.
Se cunosc pana in prezent patru grupe de Shigella: S.dysenteriae, S.flexneri, S.boydii, S.sonnei.
La noi in tara cele mai frecvente cazuri de dizenterie bacilara sunt produse de S.flexneri, intr-un
procent mai redus se izoleaza S.sonnei si numai incidental S.boydii; S.dysenterie nu s-a mai
izolat din 1950.
Examinarea microscopica evidentiaza leucocite si hematii.
Identificarea: prin teste biochimice si aglutinare cu seruri specifice anti-Shigella.
Streptococii beta-hemolitici cu importanta medicala sunt:
- Str.pyogenes (grup A) care produce faringinte, infectii cutanate, genitale, sechele
poststreptococice;
- Streptococcus agalactiae (grup B) care face parte din flora normala a tractului genital la femeie,
tractului respirator superior, tractului digestiv inferior; la nou nascutul infectat de la mama
produce meningita, septicemie, la adult infectii cu diferite localizari, iar la femeia gravida avort
si septicemie post-partum;
- Grupul C si G produc infectii asemanatoare cu Streptococul de grup A, dar mai putin frecvente.
Apartenenta la un anume serogrup se poate face prin reactii de latexaglutinare.

Antibiograma
Laboratorul de microbiologie are un rol esential in tratamentul infectiilor prin identificarea
bacteriilor si testarea sensibilitatii la antibiotice.
Scopul esential este de a ajuta decizia terapeutica.
Antibiograma este utila in:
- instituirea unui tratament tintit de catre medicul clinician;
- evidentierea acelor tulpini ce poseda enzime capabile sa inactiveze actiunea antibioticului in
vivo;
- supravegherea epidemiologica a rezistentei bacteriene;
- compararea fenotipurilor de rezistenta a tulpinilor responsabile de infectii nosocomiale.

In laboratoarele Synevo, testarea sensibilitatii la antibiotice a tulpinilor cu implicatie clinica se
realizeaza prin metoda difuzimetrica Kirby Bauer.
Etapele efectuarii antibiogramei sunt standardizate: compozitia mediului, pH-ul mediului,
densitatea inoculului, durata si temperatura de incubare, stabilitatea si concentratia substantei
microbiene.
Interpretarea rezultatului antibiogramei respecta standardul CLSI 2006 (NCCLS) Clinical and
Laboratory Standards Institute.
Laboratorul detine un cititor automat de antibiograme (efectuate prin metoda difuzimetrica), care
are incorporat in soft un program expert ce respecta acest standard, cu capacitatea de a detecta
tulpinile secretoare de penicilinaza si beta lactamaza cu spectru extins, precum si alte fenotipuri
de rezistenta.
Pe langa metoda clasica utilizata de toate laboratoarele, in laboratorul Synevo Bucuresti se
efectueaza si antibiograma automata. Analizorul automat aflat in dotare are posibilitatea de a
identifica microorganismul si de a testa sensibilitatea lui la antibiotice in cateva ore (2 - 12 ore).
Durata de timp este variabila in functie de familia din care face parte germenele studiat. Tipurile
de microorganisme identificate sunt multiple si cuprind atat bacterii Gram pozitive, cat si bacterii
Gram negative.
Izolarea unui germene patogen in cultura pura (conditie esentiala pentru obtinerea unui rezultat
corect) permite identificarea si testarea simultana a sensibilitatii la antibiotice pe acest analizor
automat. Se efectueaza in prealabil un frotiu colorat Gram pentru verificarea puritatii tulpinii
izolate si pentru alegerea cardurilor (bacterii Gram pozitive sau Gram negative).
Seturile de antibiotice continute de aceste carduri sunt special alese, ele cuprinzand
atat antibiotice uzuale, cat si antibiotice de ultima generatie pentru a putea institui un tratament
optim pentru fiecare caz.
Interpretarea se efectueaza conform standardului CLSI 2006. Astfel, exista posibilitatea
detectarii de enzime care inhiba actiunea antibioticului in vivo (ESBL, penicilinaza etc) si
interpretarea automata a rezultatului antibiogramei in functie de prezenta/absenta acestor enzime.
Prin urmare, laboratorul Synevo poate efectua in urgenta identificari de germeni din diverse
produse patologice si testarea sensibilitatii acestora la antibiotice (dupa obtinerea culturii pure).
Avantajele celor doua analizoare sunt acelea de comunicare corecta a sensibilitatii
microorganismelor (in functie de CMI concentratia minima inhibitorie si fenotipuri de
rezistenta), precum si de transmitere automata a datelor catre sistemul informatic, eliminand
astfel posibilitatea de aparitie a erorilor datorate introducerii manuale a rezultatelor in sistem.
Controlul calitatii antibiogramelor se realizeaza cu tulpini de referinta recomandate de CLSI
2006:
- Escherichia coli ATCC 25922;
- Staphylococcus aureus ATCC 25923;
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853;
- Enterococcus faecalis ATCC 29212;
- Streptococcus pneumoniae ATCC 49619;
- Haemophilus influenzae ATCC 49247.

http://www.creeaza.com/referate/biologie/LOCUL-IMPORTANTA-SI-PERSPECTIV861.php
LOCUL, IMPORTANTA SI PERSPECTIVELE
DOMENIULUI CULTURII DE CELULE ANIMALE IN
CADRUL BIOTEHNOLOGIILOR MODERNE
LOCUL, I MPORTANTA SI PERSPECTI VELE DOMENI ULUI CULTURI I
DE CELULE ANI MALE I N CADRUL BI OTEHNOLOGI I LOR MODERNE
Ross Granville Harrison (1907) este primul cercetator care a propus o tematica de studiu
in acest domeniu, fiind considerat parintele si fondatorul unei noi stiinte, cea a culturii de celule
animale. El este cel care a propus tehnica de cultura in picatura in suspensie (fig.1).

Fig. 1. Schema culturii de tesut animal in suspensie (Harrison, 1907)
Majoritatea cercetarilor au fost realizate pe explante din tesutul embrionar de broasca
(animal cu sange rece, deci care nu necesita conditii de incubare). Scopul acestor demersuri l-a
reprezentat studiul celulelor in absenta variatiilor sistemice determinate de unitatea tisulara atat
in conditii normale cat si in conditii de stres. Tehnica presupunea de fapt cultura unor tesuturi
nedisociate si avea ca rezultat migrarea unui numar redus de celule din cadrul fragmentului
tisular pe de o parte si aparitia unor noi mitoze ocazionale, pe de alta parte.
Timp de peste 50 de ani s-a vorbit despre culturi de tesuturi si nu despre culturi de celule,
cu toate ca dezvoltarea domeniului a fost expansiva, iar utilizarea celulelor dispersate devenise
uzuala inca din deceniul al VI-lea. In timp, s-a ajuns la definirea unor termeni si implicit la
delimitarea unor subdomenii:
cultura de celule este notiunea care defineste mentinerea si/sau multiplicarea in vitro a
celulelor dispersate care intra in contact direct cu mediul de cultura;
cultura de tesuturi se refera la mentinerea in vitro a structurilor tridimensionale a unui
tesut nedezagregat; implica insa in contextul cursului si notiunea de culturi de
organe (organe integre sau fragmente reprezentative mentinute in cultura, pastrandu-se

astfel distributia numerica si spatiala a celulelor componente), cultura
histotipica (reasocierea spontana a celulelor cultivate in structuri tridimensionale), cultura
organotipica (recombinarea in vitro a liniilor celulare specifice unui organ in vederea
recrearii acestuia numeric si spatial sau a functiilor lui).
Burrows a adus imbunatatiri acestei tehnici prin introducerea culturilor in plasma
sangvina, mai eficienta pentru cultura in vitroa celulelor provenite de la animale cu sange cald.
Dificultatea majora a constat insa in evitarea contaminarii (sau chiar a cros-contaminarii).
Scurt istoric al culturilor de celule animale
- un secol de fundamentari -
in 1885, Roux reuseste mentinerea in cultura (in mediu salin) a celulelor deviate din
embrion de pasare.
in 1897, Loeb demonstreaza capacitatea celulelor sangvine de a supravietui in ser sau
plasma in vitro.
in 1907, se naste ca stiinta cultura de celule animale prin experientele lui Harrison, iar
Burrows ii perfectioneaza tehnica.
in 1913, Carrel defineste si utilizeaza tehnici strict aseptice, reusind astfel sa
prelungeasca viata celulelor in culturi, iar in 1923apar si primele flacoane destinate
special culturilor celulare care ii poarta numele.
in anii `40, descoperirea si apoi utilizarea penicilinei si streptomicinei conduce la
cresterea eficientei culturilor de celule animale prin reducerea contaminarii.
in 1948, Earle izoleaza fibroblaste L de soarece care in cultura au format clone clare
pornind de la o singura celula.
in 1949, Enders cultiva si studiaza in vitro virusul polio-uman pe culturi de celule
embrionare umane.
in 1952, Gey izoleaza prima linie celulara continua dintr-o tumora (carcinom) cervicala
cunoscuta azi sub numele de HeLa (de la pacienta Henrietta Lach).
in 1955, Eagle promoveaza primul mediu definit chimic in functie de necesarul de
nutrienti pentru culturile de celule.
in 1965, Ham introduce pentru prima data un mediu de cultura fara ser, capabil sa
sustina cresterea unor tipuri de celule in vitro.
in 1970, Sato stabileste bazele obtinerii unor medii lipsite de ser din cocktailuri de
hormoni si factori de crestere.
in 1975, Kohler si Milstein produc pentru prima data hibridoma (celule hibride din
culturi celulare B), capabila de a secreta anticorpi monoclonali(produs al clonelor
celulare B).
in 1982, se produce pe cale biotehnologica insulina umana.
in 1985, hormonul uman al cresterii (STH) produs de bacterii recombinate este acceptat
in scop terapeutic.
Studiile fundamentale realizabile prin utilizarea culturilor celulare la diferite nivele de
organizare
1. Activitatea intracelulara
Sinteza proteinelor
Transcriptia si replicarea ADN-ului
Metabolismul energetic
Maturarea gametilor
Diviziunea celulara
2. Fluxul intracelular
Migrarea ARNm in citoplasma
Translocatia si functionarea complexelor de receptori hormonali
Fluctuatia continutului in metaboliti
3. Ecologie
Nutritia si excretia celulara
Mecanismul infectiilor
Transformari induse viral sau chimic
Actiunea substantelor medicamentoase
Raspunsul la stimuli externi
Secretia de produsi specializati
4. Interactiunea intercelulara
Inducerea embriogenezei
Cinetica populatiei celulare
Aderenta intercelulara
Domenii si discipline ce beneficiaza de dezvoltarea stiintei culturilor de celule animale
1. Oncologia prin studiul dezvoltarii tumorilor maligne in linii celulare maligne stabile (ex. HeLa); prin studiul
efectelor agentilor fizici, chimici, etc., asupra tumorilor.
2. Microbiologia prin posibilitatea obtinerii anticorpilor monoclonali; cultivarea virusurilor.
3. Genetica moleculara si ingineria genetica prin posibilitatea analizei genetice a celulelor somatice animale
si umane; prin aplicarea manipularilor genetice in vederea obtinerii unor produse (insulina, hormoni de
crestere, etc.).
4. Imunologia prin studiul in linii celulare a componentelor tesutului hematopoetic; prin studiul mecanismului
de actiune al anticorpilor.
5. Medicina prin studiul arterosclerozei prin culturi de celule endoteliale din capilare; prin analiza celulelor
obtinute prin amniocenteza in vederea evidentierii problemelor genetice sau virale la fetusi; terapia celulara.


http://www.scrigroup.com/educatie/botanica/FENOMENE-LEGATE-DE-CRESTEREA-P71598.php
FENOMENE LEGATE DE CRESTEREA PLANTELOR
Regenerarea
Regenerarea este procesul fiziologic prin care organismul se reface din parti izolate (tulpini cu muguri,
radacini, frunze, calus, celule individualizate). Se formeaza tesuturi si organe noi, cu functii bine definite.
Regenerarea sta la baza inmultirii vegetative prin frunze, stoloni, marcote, butasi de tulpini, butasi de frunze. Altoirile
au la baza tot un proces de regenerare a calusului dintre altoi si portaltoi.
Cultura de tesuturi sau cu suspensii de celule este o forma noua de inmultire vegetativa pe baza regenerarii , pornind
de la meristeme, maduva tulpinii, floem, calus sau chiar dintr-o singura celula somatica.
Microinmultirea plantelor prin tehnica culturii de tesuturi 'in vitro'
Principiul metodei. Tehnica culturii de tesuturi 'in vitro' face parte din biotehnologiile moderne ce prezinta largi
aplicatii in agricultura, industria alimentara, farmaceutica, chimica si energetica, medicina si combaterea poluarii
mediului. Principalele directii aplicative in agricultura sunt: inmultirea plantelor prin tehnici 'in vitro', obtinerea
materialului de plantat liber de agenti patogeni, obtinerea de indivizi haploizi prin antogeneza si ginogeneza, crearea
de noi genotipuri de plante, selectarea si cultivarea unor linii cu randament sporit de produsi secundari, conservarea
fondului genetic in banci de gene etc.
Prin culturi de tesuturi vegetale 'in vitro' se intelege cultivarea pe medii nutritive artificiale, aseptice, a oricarei parti
componente a unei plante, numite explant, sub forma de celule, tesuturi sau organe. Aceasta tehnologie se bazeaza
pe faptul ca celula vegetala se supune principiului totipotentei si anume ca nucleul sau contine totalitatea informatiei
genetice necesare dezvoltarii unui organism complet. Inmultirea plantelor 'in vitro' este o forma de inmultire
vegetativa care asigura obtinerea unui randament sporit in comparatie cu alte procedee folosite, in special, in
horticultura.
Materiale necesare: etuva, autoclav pentru sterilizarea mediilor si a instrumentarului, pH-metru, agitator mecanic,
microscop stereoscopic, frigider, distilator de apa, sticlarie si instrumentar de laborator, boxe cu flux laminar steril sau
nisa sterila cu instalatie de radiatii ultraviolete, tuburi fluorescente, termostat, umidometru, instalatii de aer
conditionat.
Modul de lucru.
a). Organizarea laboratorului de culturi de tesuturi.
Organizarea laboratorului de culturi de tesuturi necesita folosirea urmatoarelor incaperi:
- incaperile pentru mediile de cultura;
- incapere pentru spalarea si sterilizarea sticlariei, instrumentarului si a materialului vegetal;
- incapere aseptica, in care se izoleaza explantele si se fac inoculari;
- camera de crestere, in care au loc incubarea, cresterea si intretinerea culturilor;
- sera, in care se face aclimatizarea plantelor obtinute 'in vitro' in mediul septic.
b). Prepararea mediilor de cultura.
Mediile de cultura trebuie sa contina saruri minerale (macro si microelemente) compusi organici cu azot si carbon si
substante de crestere (hormoni si vitamine). Unul dintre cele mai utilizate medii de cultura este mediul Murashige-
Skoog (1962).
Prepararea mediului Muraschige-Skoog se face dupa urmatoarea schema:
A Solutii de MACROELEMENTE si MICROELEMENTE
Microelemente Macroelemente
Ingrediente
Solutia STOC
de 10 x conc.
(g/l)
Ingrediente
Solutia STOC
de 10 x conc.
(g/l)
NH
4
NO
3
16,5 H
3
BO
3
6,200
KNO
3
19,0 MnSO
4
x 4H
2
O 22,300
CaCl
2
x 2H
2
O 150,0 ZnSO
4
x 7H
2
O 8,600
MgSO
4
x 7H
2
O 3,7 Na
2
MoO
4
x
2H
2
O
0,250
KH
2
PO
4
1,7 CuSO
4
x 5H
2
O 0,025

CoCl
2
x 6H
2
O 0,025

KI 0,750
B. Solutii de FeEDTA si AMINOACIZI
FeEDTA Aminoacizi
Ingrediente
Solutie STOC
(g/l)
Ingrediente
Solutie STOC
(mg/l)
FeSO4 x 7H2O 5,57 Glicina 2
Na2EDTA 7,45

C. Solutii de VITAMINE si FITOHORMONI
Vitamine Fitohormoni
Ingrediente
Solutia STOC
de 10 x conc.
(g/l)
Ingrediente
Solutie STOC
(g/l)
Acid nicotinic 0,5 AIA 0,500
Piridoxina HCl 0,5 Chinetina 0,215
Tiamina HCl 0,5

Mezo-inozitol 100,0

D. Zaharoza 30 g/l
E. Difco Bacto-agar 10 g/l
Prepararea solutiei finale Muraschige-Skoog (ingredientele necesare prepararii unui litru de mediu) este urmatoarea:
NH4NO3 1,650 mg
KNO3 1,900 mg
MgSO4 x 7 H2O 370 mg
KH2PO4 170 mg
Fe EDTA 40 mg 5 ml solutie stoc
CaCl2 x 2 H2O 2,9 ml solutie stoc
microelemente 1 ml solutie stoc
KI 1 ml solutie stoc
vitamine 1 ml solutie stoc
zaharoza 30 g
A.I.A 1-30 mg
chinetina 0,04-10 mg
ajustarea pH-ului la 5,8 cu o,2 N KOH si 0,2 N NaOH
adaugarea Agarului..10 g (pentru mediile solide)
completarea mediului final la 100% ml cu apa distilata.
c). Sterilizarea si sterilitatea
O conditie exentiala in reusita culturilor 'in vitro' este asigurarea sterilitatii sticlariei si instrumentarului cu care se
lucreaza, a mediilor de cultura, a materialului biologic din care se recolteaza explantele si a incintei in care se
inoculeaza. Obiectele solide se sterilizeaza prin uscarea la etuva la 100
0
C, timp de 1-3 ore, urmata de autoclavare
sau flambare. Mediile de cultura si apa distilata necesara spalarii se sterilizeaza prin autoclavare la 121
0
C, timp de
15-40 minute. Materialul vegetal se dezinfecteaza cu hipoclorit de Na sau Ca (2-10%) timp de 15-30 minute, alcool
etilic, apa oxigenata, la care se adauga detergent lichid sau antibiotice, apoi se spala cu apa distilata de 3-5 ori.
Camera de inoculare se sterilizeaza in instalatii de gaz si ultraviolete sau prin dotare cu boxe cu flux laminar steril.
d). Initierea unei culturi de tesuturi 'in vitro'
Alegerea materialului vegetal depinde de scopul urmarit si are la baza urmatoarele obiective:
- multiplicarea clonala rapida a unor exemplare valoroase folosind meristeme, componente florale sau organe
vegetale;
- obtinerea de material saditor devirozat se face prin cultura de meristeme apicale sau laterale de dimensiuni foarte
mici (0,20-0,25 mm);
- obtinerea de plante haploide se face prin culturi de antere, polen sau celule ale sacului embrionar;
- sporirea continutului de biomasa ce elaboreaza substantele bioactive se face prin culturi de celule;
- selectionarea unor linii rezistente la factori de stress, folosind explante provenite de la plantele rezistente la factorul
stresant;
- producerea de hibrizi folosind culturi de protoplasti.
Izolarea explantelor. Pentru multiplicarea clonala se recolteaza de obicei explante din apexul tulpinii de 0,5-1 mm
care sa contina meristeme apicale si cateva primordii foliare. Dimensionarea uniforma a explantelor se face cu un
dispozitiv de inox tip ghilotina. Materialul vegetal utilizat este in prealabil sterilizat. Operatia se executa in boxa sterila,
la microscopul stereoscopic.
Inocularea explantelor se face imediat dupa dimensionarea in medii lichide sau solide, in conditii de sterilitate
perfecta. Culturile pe mediul lichid asigura accesibilitatea elementelor nutritive si aeratia, nu necesita respectarea
polaritatii, dar se integreaza mult mai usor. Culturile pe mediul solid necesita respectarea orientarii polare, si anume
bazala radiculara si superioara apicala, regenerarea facandu-se dupa modul clasic al butasirii.
Initierea culturii de tesuturi. Dupa inoculare, flacoanele cu mediul inoculat sunt trecute in camere de crestere si
tinute intr-un regim climatizat, programat si controlat timp de 1-2 saptamani la plantele ierboase si de 6-8 saptamani
la cele lemnoase. }esuturile inoculate pe medii nutritive sterile se vor difentia; mai intai formeaza calus, care apoi se
transforma in meristem generativ de radacini si tulpini. Apexul tulpinii constituie astfel un microbutas, deoarece conul
vegetativ inoculat 'in vitro' formeaza un sistem radicular propriu. Din aceasta cauza este frecvent folosit in
microinmultirea accelerata a plantelor.
Explantul inoculat pe
mediul aseptic este supus
mai intai incubarii. Prin
incubare se asigura
conditii optime de
supravietuire: intuneric,
buna aeratie, regim termic
de 25-27
0
C si umiditatea
de 90-100%. Dupa
inoculare explantul este
introdus in conditii de
crestere si dezvoltare. In
aceasta faza lumina
prezinta o importanta
deosebita. Morfogeneza
organelor este asigurata
de intensitati luminoase
scazute (cca 1000 lucsi),
iar cresterea necesita
intensitati luminoase mai
ridicate (4000-10000
lucsi). Transferul pe
mediul natural septic, in
sera, necesita calirea materialului vegetal, care se realizeaza prin ridicarea intensitatii luminii sau prin tratamente cu
temperaturi scazute (-2
0
C timp de 4-6 saptamani). Transferul se face pe pamant steril umectat cu solutie nutritiva.
Plantele sunt protejate de stresul hidric prin acoperire cu recipiente transparente, la umiditatea de 100% (fig.127).
Interpretare. Prin tehnica culturii de tesuturi 'in vitro' se obtin rezultate foarte importante, de interes practic in
horticultura, genetica, ameliorare, industria farmaceutica etc.
Durata experientei: pana la 4-6 saptamani.
Punerea in evidenta a regenerarii la butasii de tulpini si de frunze
Materiale necesare: butasi de tulpini de Ampelopsis, Salix sau Pelargonium, butasi de frunze de Begonia, vas de
apa si vase cu nisip umed, lama de ras.
Modul de lucru. Fragmente de ramuri desprinse de planta
se introduc in nisip umed si se mentin cateva zile intr-o
camera umeda, la regim temic optim. In acest interval de
timp se va forma un strat de calus pe suprafata sectionata a
butasului din care apar radacini adventive. La partea
superioara, din mugurii axilari vor porni lastari cu frunze.
Pentru regenerarea butasilor de frunze, se ia o frunza de
Begonia, care se asaza cu fata inferioara pe nisip umed,
implantandu-se cu petiolul in nisip. In cateve locuri pe
nervura centrala se fac taieturi cu lama de ras pe care se va
forma calus, pe baza unei diviziuni a celulelor epidermice de
pe fata superioara. Ulterior apar radacini adventive, apoi
muguri care dau lastari si astfel intreaga planta este
regenerata (fig. 128).
Durata experientei: observarea 5 minute 2-3 saptamani.
Polaritatea
Polaritatea este insusirea plantelor de a forma la capetele opuse, organe diferite ca structura anatomo-morfologica.
La polul inferior se vor forma radacini (pol rizogen), iar la polul superior apar muguri cu frunze (pol caulinar). Aceasta
polaritate in repartitia organelor este o expresie a diferentierii functiilor si a specializarii organelor cu anumite functii.
Polaritatea ramurilor de Salix.
Materiale necesare: ramuri de salcie, camera umeda.
Modul de lucru. Doua ramuri de salcie, lungi de 20-30 cm si cu
diametrul de 10-12 mm, care poarta muguri sanatosi pe toata
lungimea, se suspenda in atmosfera saturata cu vapori de apa
dintr-o camera umeda. Unul din butasi se aseaza in pozitia normala
(cu polul bazal in jos), iar celalalt butas se aseaza in pozitie inversa
(cu polul bazal in sus).
Dupa pastrare timp de 3-4 saptamani, la intuneric in camera umeda
si la regim termic optim, se constata ca mugurii adormiti de la polul
bazal (rizogen) formeaza radacini, iar mugurii adventivi de la polul
apical (caulinar) formeaza lastari cu frunze (fig. 1289.
Interpretare. Indiferent de pozitia butasilor (normala sau inversa),
nu se schimba functiile fiziologice ale celor doi poli ai butasilor, din
care se vor forma noile organe ale plantei, in functie de
specializarea acestora, imprimata genetic in insusirea de polaritate.
Corelatia si dominanta apicala.
Intre organele si tesuturile plantelor exista interactiuni fiziologice
care conduc la cresterea armonioasa a tuturor partilor plantei,
mentinand o rezerva de muguri pentru ciclurile urmatoare de
vegetatie. Pornirea in crestere a acestor muguri dorminzi este
declansata prin taierea mugurelui terminal, a varfului tulpinii sau a
lastarului principal care exercita rolul de dominanta apicala.
Eliminarea dominantei apicale la plante.
Materiale necesare: ghivece cu plante de fasole, lama de ras.
Modul de lucru. O parte din plantulele de fasole dintr-un ghiveci se lasa
intacte (control), iar la o alta parte din plante se indeparteaza varful de
crestere (mugurele terminal). Dupa 1-2 saptamani se constata la plantele
de control, o continuare a cresterii in lungime a tulpinii, iar cotiledoanele
se zbarcesc pana se usuca. La plantele cu mugurele terminal taiat
cresterea in lungime inceteaza ,iar din mugurii dorminzi de la baza
cotiledoanelor iau nastere doi lastari noi, care tind sa ia pozitie
verticala (fig. 130).
Interpretare. La planta control, mugurele terminal exercita o actiune de
inhibare a mugurilor axilari, numita dominanta apicala. In cazul
indepartarii varfului de crestere, dispare dominanta apicala iar mugurii
axilari pot porni in vegetatie, preluand rolul de crestere in lungime a
lastarului sau a plantei.
Rolul inhibitor exercitat de mugurele terminal se datoreste cantitatii foarte
mari de auxina naturala care provine din varf si circula descendent,
mentinand in stare de repaus mugurii axilari. Pe acest fenomen se
bazeaza tehnica taierii arborilor si arbustilor.
Durata experientei: observarea timp de 10 minute la interval de 1-2
saptamani.


http://www.tgw1916.net/notedecurs/microbiologie/medii.html
Medii de cultivare a bacteriilor
Mediul de cultura reprezinta orice amestec de substante lichide sau solide . de la cele mai
simple pana la
cele mai complexe care permit dezvoltarea si studierea unui microb in afara nisei ecologice
naturale.
Un mediu trebuie sa indeplineasca anumite conditii :
Sa contina substante nutritive necesare metabolismului bacreian, sa aiba pH cuprins intre
anumite limite in
care sa se poata dezvolta bacteria, sa corespunda particularitatilor fiziologice ale bacteriei si sa
fie steril
Mediile uzuale constituie suportul, la care se adauga diferite componente ca sange, ser, lichid
de ascita etc.

Clasificarea mediilor de cultura
1.Consistenta lichide, solide, semisolide
2.Din punct de vedere al tipului respirator al bacteriilor cultivate: medii pentru aerobi si anaerobi.
(mediile
pentru anaerobi pot fi la fel ca cele pentru aerobi la care se adauga substante reducatoare
tioglicolat de
sodiu, fragmente de organ, acid ascorbic)
3.Din punct de vedere al provenientei
- medii naturale ce se obtin prin extractie apoasa sau prin hidroliza din elementeanimale sau
vegetale.
- medii sintetice ce contin numai compusi cu structura chimica cunoscuta si pot fi simple
(solide
geloza), lichide (bulion, apa peptonata) sau complexe geloza sange, geloza ser, sau lichide
bulion ser,
bulion sange).

4.Dupa scopul utilizarii
Medii uzuale simple folosite in mod curent in laboratorul de bacteriologie pentru cultivare
unui numar
mare de bacterii bulion apa peptonata, geloza, gelatina.
Medii speciale folosite in scopuri bine precizate medii complexe care permit cresterea
preferentiala a
anumitor bacterii din amestec heterogen. Ele se impart in medii de izolare si medii de
identificare.
Medii de izolare sunt elective, selective, de imbogatire si de conservare.
Medii elective favorizeaza dezvoltarea unei specii bacteriene cautate, dar nu contin inhibitori
de crestere
prin compozitia lor satisfac necesitatile minime ale unei specii bacteriene date.
Medii selective inhiba dezvoltarea bacteriilor asociate cu microorg ce se urmareste a fi izolat.
Include unul
sau mi multi inhibitori (antibiotice, saruri biliare) ce restrang multiplicarea anumitor specii. Exp
mediu cu
cristal volet 1;500000 inhiba bacteriile Gram pozitive.
Medii de imbogatire asigura dezvoltarea unei specii bacteriene din materialele patologige in
care numarul
germenilor este foarte mic. Mediul cu ou Lowenstein dezvoltarea Mycobacteriilor.
Medii de conservare medii sarace in subst nutritive si sunt pentru pastrarea in viata a culturilor
bacteriene.
Medii de identificare contin subst ce permit punerea in evidenta a unor caractere bichimice.

Conditii pe care trebuie sa-l indeplineasca un mediu de cultura:
1.Sa ofere grad de umiditate necesar dezvoltarii bacteriilor.
2.Sa ofere subst nutritive calit si cantit
3.Sa asigure sursa de azot necesara biosintezei proteinelor si acizilor nucleici
4. Sa contina apa si saruri minerale necesare mentinerii echilibrului ionic
5.Sa aiba vitamine pentru sinteza metabolitilor esentiali
6.Sa asigure posib de aerare pt aerobe si invers.
7.Sa fie steril si protejat de lumina
8.Sa fie limpede si clar pentru studiul caracterelor culturale.

Etape
Topirea sau prepararea mediului
Corectarea pH-ului
Repartizarea in recipiente sterile
Controlul sterilitatii lor. (vezi video: Blood agar preparation)























INTRODUCERE N CULTURILE DE CELULE I ESUTURI VEGETALE
1. Introducerea
Sfritul mileniului doi se caracterizeaz printr-o puternic implicare a biotehnologiei n viaa
omului, n toate domeniile de activitate. Cu ajutorul metodelor biotehnologice s-au fcut
progrese uriae n crearea de noi genotipuri de plante i rase de animale cu nsuiri favorabile i
cu randamente sporite fa de materialul de la care s-a plecat. Ajungerea la cultura in vitro nu a
fost aa de simpl cum s-a presupus fiind necesar mult timp i multe cercetri, la nceput fr
succes, dar apoi totul s-a clarificat.
2. Scurt istroric
1882 - Sachs a fost cel care a elaborat teoria conform creia plantele i sintetizeaz substanele
ce determin formarea organelor, substane ce au o dispunere polar;
1922 - ncep s apar primele rezultate privind cultura de celule i esuturi, cnd Knudson
reuete germinarea seminelor de orhidee in vitro iar Robbins obine prima cultur de esut de
rdcin n condiii artificial;
1952 - Pe baza conceptului de totipoten celular, conform cruia fiecare celul conine
informaia genetic necesar obinerii prin regenerare a unui organism vegetal complet, Morel i
Martin au stabilit i au perfecionat o metodologie de cultivare pe medii aseptice a explantelor
meristematice caulinare, obinnd prin creterea in vitro a acestora plante sntoase, libere de
viroze, pornind de la plante mam contaminate cu diferite viroze;
1962- dup muli ani de studii i ncercri, Murashige i Skoog, au reuit s elaboreze un mediu
de cultur considerat ca fiind de baz , care cu mici modificri poate fi utilizat pentru aproape
toate tipurile de culturi de esuturi;
1966 - este considerat drept nceputul etapei moderne a cercetrilor privind cultura de explante
vegetale in vitro. Aceast etap s-a caracterizat, n primul rnd prin elaborarea de tehnici
eficiente n generarea, cultivarea i fuzionarea protoplatilor vegetali. Cu ajutorul protoplatilor,
odat cu descoperirea noilor tehnici s-au obinut plante rezistente la aciunea unor ageni stresani
cum ar fi: pesticide, linii celulare rezistente la stres hidric, termic etc.
Att pe continentul american ct i pe cel european sau asiatic, culturile in vitro sunt folosite n
special pentru multiplicarea speciilor floricole ornamentale, urmat de multiplicarea speciilor
arboricole ornamentale i fructifere, dar i pentru realizarea de noi genotipuri sau mai ales pentru
regenerarea celor create prin inginerie genetic.
3. Definiie
n sens general, prin cultura in vitro se nelege creterea pe medii artificiale, n condiii de
asepsie deplin i de factori ambientali bine controlai, a unor organe, pri de organe, esuturi
sau celule vegetale. Reuita culturii depinde de o multitudine de factori i este vizibil n
momentul n care explantul crete.
Explantul, numit i inocul, este poriunea de plant (organ, esut, celul) care se desprinde de pe
planta donor (planta mam), i se inoculeaz n condiii sterile pe un mediu artificial de cultur.
Evoluia explantului este dirijat de operator n funcie de scopul urmrit. Acesta poate evolua
formnd o nou plant (sau mai multe plante - neoplantule), prin stimularea dezvoltrii organelor
aeriene (tulpina i frunzele) i a rdcinii, sau poate forma calus, prin stimularea nmulirii
nedifereniate a celulelor.
Explantul constituie unitatea vie ce conine n celule ntreaga informaie genetic a plantei mam
i pe baza totipotenei este capabil de a regenera una sau mai multe plante identice cu planta
donor.
Totipotena, este nsuirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce i de a forma o
plant identic cu planta mam.
4. Mediile de cultur i prepararea lor
Mediul de cultur reprezint suportul fizic i chimic necesar pentru creterea i dezvoltarea
explantelor in vitro. Graie unor cercetri minuioase efectuate de-a lungul timpului un mare
numr de cercettori au formulat diferite reete de medii folosite pentru diferite tipuri de culturi
in vitro la marea majoritate a speciilor vegetale.
Condiiile pe care trebuie s le ndeplineasc un mediu de cultur sunt:
- s corespund cerinelor nutritive i hormonale ale speciei cultivate pentru faza n care se
gsete (stabilizare, proliferare, calogenez, nrdcinare, etc.);
- s asigure condiii optime de cretere i dezvoltare n ceea ce privete presiunea
osmotic, pH-ul, umiditatea, etc.
- s fie echilibrat din punct de vedere ionic;
- s nu conin ioni sau substane toxice;
- s fie uor de preparat i reproductibil;
- s fie stabil dup autoclavare (s-i menin neschimbat compoziia i caracteristicile
fizico-chimice;
- s fie ieftin i s conin ct mai puini constitueni naturali costisitori i neomogeni;
- eventual, s poat fi reciclat.
Mediile folosite la cultura in vitro a explantelor vegetale au n general o structur complex,
fiind alctuite dintr-un mare numr de constitueni de natur divers i cu rol diferit. Aceti
constitueni pot s fie grupai n:
constitueni cu rol nutritiv: elemente minerale: macro i microelemente i elemente
organice: zaharuri (ca surs de carbon), aminoacizi (ca surs de azot organic) i vitamine;
constitueni cu rol hormonal fitoregulator al creterii i dezvoltrii explantelor in vitro:
auxine, citochinine, gibereline i alte substane cu rol stimulator sau inhibitor: acid
abscisic, etilen, colchicin, paclobutrazol, etc.
constitueni cu rol n stabilizarea mediului de cultur: apa, ageni de solidificare,
stabilizatori osmotici i de pH, antioxidani i substane absorbante.
5. Caracteristicile culturilor in vitro
Spre deosebire de multiplicarea tradiional, unde se opereaz cu semine sau poriuni mari de
plant (marcote, butai, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici, de ordinul
milimetrilor sau chiar microscopice (celule, protoplati), explante care n condiii normale de
cultur nu ar reui s creasc opunnd rezisten agenilor patogeni i sintetizndu-i singure
substanele nutritive necesare.
Din acest motiv, pentru reuita culturii de celule i esuturi se cer respectate urmtoarele condiii:
- prepararea unui mediu de cretere care s asigure o bun nutriie heterotrof a
explantului, prin asigurarea sursei de carbon organic uor accesibil explantelor;
- asigurarea i controlarea factorilor de mediu (temperatur, lumin, umiditate) n limitele
optime pentru fiecare specie, soi i faz de cretere, n funcie de cerinele acestora i
scopul urmrit;
- stimularea creterii i diferenierii sau dediferenierii organelor prin utilizarea
corespunztoare a substanelor stimulatoare de cretere;
- asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de producere a plantelor in vitro, prin
dezinfecia materialului vegetal, sterilizarea mediului i a vaselor de cultur, precum i
efectuarea tuturor operaiilor n hota cu flux de aer laminar steril, folosind instrumentar
sterilizat prin flambare.

6. Domenii de aplicare a culturilor in vitro
Datorit spectrului larg de probleme la care culturile in vitro au rspuns afirmativ, sunt utilizate
n prezent n agricultur, silvicultur, farmacie, industria alimentar, industria uoar, etc. n
agricultur, n general i n horticultur n special, culturile de esuturi i celule sunt folosite
pentru multiplicarea unor specii, soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorarea speciilor
cultivate, pentru conservarea germoplasmei horticole, pentru obinerea de metabolii secundari.
Avantajele culturii in vitro sunt multiple, dintre care amintim:
asigur multiplicarea clonal rapid a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase pornind de
la cantiti mici de material vegetal. Teoretic, se asigur o multiplicare exponenial, prin
care n circa 6 luni se pot obine 1 milion de plante;
se poate produce material sditor liber de viroze i micoplasme, material mai viguros,
precoce i productiv;
necesit spaii mici de cultur i se valorific bine spaiul din laborator prin cultura pe
vertical pe 3-5 nivele suprapuse;
obinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte explante de esuturi
generative (cu n cromozomi);
d posibilitatea obinerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro, hibrizi care n
condiii normale sunt imposibil de obinut;
selecia de plante rezistente la stres, boli i duntori;
se evit efectul sezonier de pepinier;
se pot obine semine artificiale;
se pot obine plante pe rdcini proprii evitnd astfel cheltuielile de altoire;
asigur multiplicarea clonal a portaltoilor care nu nrdcineaz n condiii normale de
cultur;
asigur pstrarea materialului n faza de plantul pn la primirea unor comenzi ferme de
multiplicare.
Cu toate aceste avantaje, exist specii care nu rspund bine la cultura in vitro i care,
deocamdat rmn s fie nmulite tradiional.
Exist ns i cteva impedimente n utilizarea acestei metode pentru nmulirea n
mas a plantelor, cum ar fi (Dezavantaje):
o necesitatea unui laborator cu dotrile minime: instalaii i aparate indispensabile
activitilor de micropropagare, care sunt costisitoare;
o necesitatea unui personal specializat n multiplicarea clonal i manipularea in vitro;
o utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi i puin accesibili tuturor unitilor de
producie;
o nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu rspund la
metodele cunoscute de multiplicare;
o exist riscul apariiei i multiplicrii mutaiilor recesive, cu afectarea autenticitii
soiurilor;
o riscul apariiei germenilor genetici prin multiplicarea solitar numai a unor tipuri care se
comport bine la acest tip de cultur, cu riscul srcirii bazei de germoplasm pentru
unele specii.