Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Plante devenite rezistente la atacurile unor dãunãtori specifici în urma includerii în genomul lor a
unor gene provenite de la subspecii de Bacillus thuringiensis care codificã proteine insecticid, denumite
plante Bt, se aflã deja în culturi comerciale. Strategia de combatere a dãunãtorilor prin intermediul
delta-endotoxinelor sintetizate de aceste plante Bt este cunoscutã sub denumirea de tehnologia Bt.
Bacillus thuringiensis - sursă de gene ce conferă plantelor transgenice rezistenţă specifică la unele
insecte dăunătoare
Bacterii gram-pozitive, Bacillus thuringiensis (Bt) produc spori cu proprietăţi entomopatogene,
care conţin o mare varietate de proteine pesticide, ce se deosebesc între ele în privinţa modului de
acţiune, a specificităţii şi a mecanismului expresiei. Proteinele cu acţiune pesticidă produse de diferitele
tulpini de B. thuringiensis includ compuşi antifungici, beta - exotoxine, proteine vegetative insecticide
(Vip), delta - endotoxine sau proteinele Cry de la „crystalline” şi proteinele Cyt (cytolytic) neînrudute
structural cu acestea.
Preparate cu izolate naturale de B. thuringiensis care conţin un amestec de pesticide
microbiene, inclusiv proteine Cry, sunt comercializate de peste 60 de ani în întreaga lume. Utlizarea
acestor insecticide microbiene este aprobată inclusiv în agricultura organică. De altfel. peste 80% dintre
pesticidele organice sunt pe bază de B.thuringiensis. Din anul 1997, pentru combaterea unor
lepidoptere dăunătoare se folosesc şi pesticide microbiene care conţin proteina himeră Cry1Ac/Cry1F,
sub denumirile comerciale Dipel®, Biobit®, Javelin®, Lepinox® şi Thuricide®.
Delta-endotoxinele au fost denumite proteine Cry deoarece sunt componente ale cristalelor
parasporale caracteristice formării sporilor în B. thuringiensis. Pentru identificarea şi diferenţierea
proteinelor Cry a fost elaborat un nomenclator care are la bază identitatea aminoacizilor şi face posibilă
asocierea în aceeaşi categorie a toxinelor strâns înrudite. Adică, a toxinelor care sunt identice între ele
într-o proporţie mai mare de 85%. De exemplu, toate proteinele Cry1 sunt strâns înrudite, iar proteinele
Cry1A (Cy1Aa, Cry1Ab şi Cry1Ac) care au secvenţele aminoacizilor identice în proporţie de peste 95%,
sunt şi mai strâns înrudite.
Toxinele Cry, sintetizate în mod natural de Bacillus thuringiensis, por fi acum utilizate pentru
combaterea unor insecte dăunătoare, fie ca produse aplicate prin stropire, fie sintetizate în plante
transgenice. Mai precis, în plante cărora li s-au transferat gene ce codifică toxina Cry de la Bacillus
thuringiensis. Proteinele insecticid sintetizate de porumbul transgenic sunt deci similare structural şi
funcţional cu proteinele Cry care intră în componenţa pesticidelor microbiene derivate din B.
thuringiensis şi este verificat şi unanim recunoscut faptul că ele nu sunt toxice pentru oameni şi pentru
1
alte specii de mamifere nici singure, nici în diverse combinaţii (de exemplu, în formulările microbiene
Bt).
Potenţialele efecte ale acestor proteine asupra organismelor nevizate de modificarea genetică,
ca şi persistenţa lor potenţială în sol, au făcut obiectul a numeroase cercetări.
2. Mecanismul activităţii insecticide a proteinelor Bt
Cunoaşterea modului de acţiune al proteinelor Cry este esenţială pentru înţelegerea siguranţei şi
a eventualelor riscuri asociate utilizării plantelor transgenice Bt. Deşi există a mare variabilitate a
secvenţei aminoacizilor şi a spectrului insectelor ţintă, mecanismul activităţii insecticide este similar în
cazul tuturor proteinelor Cry. Aceste proteine sunt toxine care formează pori printr-un mecanism ce
implică interacţiuni secvenţiale cu mai mulţi receptori specifici. În general, modul de acţiune al
proteinelor Cry include următoarele etape: ingestia protoxinei cristal de către insectă; solubilizarea
cristalului în mediul alcalin din intestinul mijlociu; procesarea proteolitică a proteinei Cry eliberate prin
digestie enzimatică pentru a produce o toxină activă, numită delta-endotoxină, de 60–70 kDa, rezistentă
la proteaze; legarea proteinei active la receptorii specifici, care au o foarte mare afinitate cu ea şi se află
la nivelul membranelor plasmatice ale celulelor epiteliului intestinal mijlociu al organismelor vizate (c);
inserarea în membrana plasmatică şi formarea porilor transmembranari (d,e). Se consideră că aceşti pori
formează canale ionice ce perturbă homeostazia celulelor, determinând liza lor osmotică. Legarea este o
etapă esenţială pentru activitatea insecticidă asupra insectelor sensibile, toxicitatea unei anumite
proteine Cry fiind corelată cu numărul receptorilor de la nivelul microvililor şi cu afinitatea lor pentru
aceste locuri de legare.
Desigur, proteinele Cry nu sunt toxice pentru speciile care nu au receptori specifici pentru ele.
De exemplu, mamiferele nu sunt afectate de proteinele Cry, nici chiar atunci când acestea le sunt
administrate în doze orale de milioane de ori mai mari decât cele pe care le-ar întâlni vreodată insectele
vizate dintr-un motiv foarte precis: la suprafaţa celulelor lor intestinale nu există locuri de legare pentru
proteinele Cry activate (Betz şi al., 2000). În concluzie, proteinele Bt au un foarte mare grad de
specificitate, care exclude posibilitatea ca ele să acţioneze asupra organismelor nevizate.
2
■ B. thuringiensis ssp.tenebrionis –Coleoptera
■ B. thuringiensis ssp.israeliensis –Diptera
■ B. thuringiensis ssp.kumamotoensis – Coleoptera
■ B. thuringiensis ssp.darmastadiensis -Nematodes
■ B. thuringiensis ssp.tolworthi – Coleoptera
■ B.thuringiensis ssp.entomocidus - Lepidoptera, Coleoptera
Proteinele Bt sunt insecticide specifice
Genele cry de la Bacillus thuringiensis au fost transferate la mai multe plante cultivate: porumb,
bumbac, cartof, tomate, orez, vinete şi rapiţă, dar în culturi comerciale, pe milioane de hectare, se află
numai porumbul şi bumbacul Bt. Prin transferul genelor ce codifică proteine Cry a fost obţinut porumb
transgenic rezistent la atacurile unor insecte dăunătoare din ordinele Lepidoptera şi Coleoptera. A fost
deja aprobată cultivarea în scop comercial a mai multor evenimente de transformare aparţinând
porumbului Bt. În Uniunea Europeană, cu excepţia porumbului MON810, nu a mai fost aprobată
cultivarea alotor evenimente de transformare, ci numai importul şi procesarea acestora în vederea
utilizării ca aliment şi/sau ca furaj (tabelul 1)
3
Tabelul 1. Evenimentele de transformare al căror import în vederea procesării a fost aprobat în
Uniunea Europeană
Evenimentul de Proteina Cry Denumirea de piaţă/Codul unic Autorizarea în UE
transformare de identificare
Bt 11 Cry1Ab Attribute SYN-BTØ11-1 19/05/2004
Reînoită la
28/07/2010
Bt11XGA21 Cry1Ab SYN-BTØ11-1 28/07/2010
MON810 Cry1Ab YieldGard MON-ØØ81Ø-6
NK 603xMON 810 X MON-00603-6X MON-ØØ81Ø- 24/10/2007
6
TC1507 Cry1F Herculex 1 DAS-Ø15Ø7-1 03/03/2006
1507x59122 Cry1F Herculex XtraDAS-Ø15Ø7-1 X 28/07/2010
DAS-59122-7
1507xNK603 Cry1F DAS-Ø15Ø7-1 X MON-00603-6 24/10/2007
59122x1507xNK60 Cry1F DAS-59122-7 X DAS-Ø15Ø7-1 X 28/07/2010
3 MON-00603-6
MIR604 Cry3A Agrisure RW SYN-IR6Ø4-5 30/11/2009
modificată
MON863 Cry3Bb1 YieldGard (RW)MON-ØØ863-5 13/01/2006
Plantele de porumb transgenice rezistente la insecte, care exprimă genele cry derivate de la
bacteria B. thuringiensis (Bt), sunt cultivate pe suprafeţe din ce în ce mai mari în 16 ţări. Sunt
comercializaţi hibrizi care sintetizează proteine Cry1, rezistenţi la atacurile unor insecte dăunătoare
lepidoptere, şi hibrizi care sintetizează proteine Cry3, rezistenţi la viermele rădăcinilor (Diabrotica sp.).
Prima generaţie de porumb Bt sintetizează proteina Cry1Ab, care este toxică pentru larvele
insectelor numite generic ”sfredelitorii porumbului” deoarece sapă galerii în tulpini şi ştiuleţi, se hrănesc
cu mătase şi panicule, determină căderea plantelor, reducerea fluxului substanţelor nutritive şi, în final,
reducerea producţiei sub potenţialul normal al culturilor. Din această categorie fac parte Ostrinia
4
nubilalis (sfredelitorul european al tulpinilor), cea mai dăunătoare dintre insectele care atacă porumbul,
Sesamia nonagrioides, Spodoptera littoralis şi Helicoverpa zea.
5
pentru chimicalele aplicate. În plus, din cauza spectrului larg de acţiune al unor chimicale sunt afectate şi
organismele nevizate din mediu, iar respectivele produse sunt mai puţin compatibile, sau chiar
incompatibile, cu metodele de combatere biologică folosite în managementul integrat al dăunătorilor.
Au fost raportate numeroase date care atestă beneficiile economice, pentru mediu şi pentru
sănătate asociate utilizării plantelor Bt. Aplicarea acestei tehnologii la porumb aduce beneficii directe
fermierilor şi consumatorilor şi indirecte mediului. Beneficiile fermierilor sunt datorate limitării
pierderilor de recoltă determinate de dăunători. Consumatorilor li se oferă un porumb ce conţine
cantităţi semnificativ mai mici de micotoxine. În sfârşit, mediul este mai puţin poluat ca urmare a
reducerii numărului de tratamente cu insecticide. Există deja o istorie de utilizare sigură a plantelor Bt.
O istorie bogată în date care dovedesc că plantele Bt aflate în culturi comerciale nu sunt invazive, nu
transferă transgenele la speciile indigene şi nu au efecte, directe sau indirecte, asupra organismelor
nevizate şi ecosistemelor. Mai mult, până acum nu a fost semnalată apariţia rezistenţei dăunătorilor
vizaţi de modificarea genetică la proteinele insecticid sintetizate de aceste plante.
Proteina Cry1A.105, strâns înrudită cu Cry1Ab şi Cry1Ac, ca şi proteina Cry2Ab2, derivă de la Bacillus
thuringiensis subsp. kurstaki, proteina Cry1F - de la Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, proteina
Cry3Bb1- de la Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, iar proteinele Cry34Ab1/Cry35Ab1-de la
6
Bacillus thuringiensis, tulpina PS149B1. Proteinele Cry1A.105, Cry2Ab2 şi Cry1F sunt toxice pentru
insectele dăunătoare din ordinul Lepidoptera, în timp ce toxinele Cry3Bb1, Cry34Ab1 şi Cry35Ab1 sunt
toxice pentru insectele din ordinul Coleoptera (viermele rădăcinilor porumbului) (tabelul 2). Combinaţia
proteinelor insecticide Cry1A.105 şi Cry2Ab2 într-o singură plantă asigură o protecţie mai eficientă şi
oferă un mijloc suplimentar de combatere integrată a insectelor.
Proteina Cry3Bb1, sintetizată de porumbul MON 88017, este o variantă a proteinei de tip sălbatic
Cry3Bb1, cu care are în comun peste 99.1% dintre aminoacizi şi de care se deosebeşte doar prin şase
dintre cele 652 de reziduuri de aminoacizi. Secvenţele aminoacizilor proteinelor Cry3Bb1 prezente în
MON 88017 şi, respectiv, în MON 863 sunt identice în proporţie de 99.8%. Mai precis, se deosebesc
printr-un singur aminoacid dintre cele 653 de reziduuri de aminoacizi. Toate proteinele Cry sintetizate de
porumbul transgenic au fost deja amplu caracterizate.
7
Se află deja în culturi comerciale hibrizi cu un eveniment de transformare şi chiar hibrizi între
două sau mai multe asemenea evenimente (Tabelul 3). Evenimentele de transformare Bt au fost
încrucişate fie între ele, fie cu evenimente tolerante la erbicide fie, într-un singur caz, cu un eveniment
cu conţinut sporit de lizină (Tabelul 3). Hibrizii care sintetizează mai multe toxine, obţinuţi prin
încrucişarea a două sau mai multe evenimente de transformare, rezistă atât unor dăunători din ordinul
Coleoptera cât şi unor dăunători din ordinul Lepidoptera. Pe de altă parte, aceşti hibrizi sunt avantajaţi
de faptul că unei insecte dăunătoare îi este mult mai dificil să se adapteze simultan la două toxine Bt, cu
moduri diferite de acţiune, decît la o singură toxină Bt. Ca urmare, cumularea a două toxine (care au ca
ţintă acelaşi dăunător, dar moduri de acţiune diferite) în plantele transgenice constituie şi o metodă de
management al riscurilor apariţiei rezistenţei în populaţia insectelor dăunătoare.
Acest dăunător este numit, sugestiv, în SUA „gândacul de 1 miliard de dolari”. Departamentul
Agriculturii al Statelor Unite (USDA) estimează că, în fiecare an, pierderile de recoltă determinate de
viermele rădăcinilor sunt de 800 milioane $, iar costul total al tratamentelor de combatere a acestuia –
de 200 milioane $. Acest dăunător extrem de păgubitor a intrat și în România, apărând frecvent în
culturile din vestul țării.
9
MANAGEMENTUL REZISTENŢEI INSECTELOR
Managementul rezistenţei insectelor este termenul folosit pentru a desemna ansamblul practicilor
folosite în scopul reducerii posibilităţii ca insectele dăunătoare să devină rezistente la un pesticid.
Managementul rezistenţei insectelor vizate în cazul plantelor Bt are foarte multe în comun cu
managementul rezistenţei insectelor la insecticidele chimice. Şi într-un caz şi în celălalt, se pleacă de la
presupunerea că frecvenţa alelelor de rezistenţă descreşte sau, cel puţin, se stabilizează atunci când
presiunea de selecţie este redusă sau discontinuă. Strategiile propuse pentru plantele Bt includ: (1)
utilizarea amestecurilor, a mozaicurilor sau practicarea rotaţiei plantelor transgenice; (2) sinteza ţesut
sau moment specifică a toxinei; (3) producerea în doze mici a toxinei, care acţionează în combinaţie cu
duşmanii naturali; (4) coexpresia diferitelor gene cry ; (5) “doză mare/refugii structurate“ (sinteza
toxinei în doze mari, asociată cu constituirea unor refugii pentru insecte, constituite din plante sensibile,
menite să reducă presiunea selectivă).
În cazul cultivării bumbacului şi porumbului în scop comercial, pentru managementul rezistenţei
insectelor vizate se practică strategia „doză mare/refugii structurate“, primul plan comprehensiv de
management elaborat pentru un produs insecticid înaintea comercializarii. În plus, refugiile au efecte
benefice pentru agroecosisteme deoarece constituie habitate pentru prădători şi paraziţi, utili culturilor
agricole.
Strategii
■ Strategia “doză mare/refugii structurate“ presupune că:
✔ rezistenţa este recesivă;
✔ însuşirea este conferită de un singur locus cu două alele care conferă trei genotipuri distincte:
RR sensibil, Rr sensibil, rr rezistent;
✔ iniţial, alelele de rezistenţă au frecvenţă foarte scăzută în populaţie ;
✔ încrucişarea indivizilor sensibili şi rezistenţi este întâmplătoare.
Insectele din refugii, sensibile la proteina insecticid (S), se încrucişează cu insectele Bt-rezistente (R) ce
ar putea să apară în populaţiile ce se hrănesc pe plantele de porumb transgenice, diluând astfel
frecvenţa genelor de rezistenţă în populaţia insectei vizate de modificarea genetică. Şi, implicit,
diminuând şansele apariţiei insectelor rezistente în populaţia dăunătorului vizat.
✔ în condiţii de câmp, numai puţinii indivizi homozigoţi rr recesivi vor supravieţui unei doze mari
de proteină insecticid sintetizate de plantele Bt (de 25x concentraţia toxinei necesară pentru a
omorâ insectele sensibile la un DL 99) ;
✔ rezistenţa poate fi “diluată” prin încrucişarea indivizilor rr cu indivizi sensibili homozigoţi din
refugiul structurat (compus din plante non Bt în care se găsesc insecte sensibile- RR);
✔ din încrucişare rezultă indivizi Rr heterozigoţi sensibili:
Rr (rezistent) x RR (sensibil) = Rr (sensibil) + Rr (sensibil)
Un refugiu structurat ar trebui să asigure un număr suficient de mare de insecte adulte care să se
împerecheze cu insectele potenţial Bt-rezistente, pentru a dilua frecvenţa genelor de rezistenţă în
populaţia insectei vizate de modificarea genetică. Refugiu trebuiă să ocupe 20% din suprafaţă
alocată porumbului Bt şi poate avea forme variate.
10
ATENŢIE!
Refugiile cu porumb pot fi tratate cu insecticide convenţionale NUMAI dacă presiunea
dăunătorului depăşeşte pragul economic de dăunare. În refugii NU se folosesc insecticide foliare
pe bază de Bt.
11