Modificarea Genetica A Plantelor

Modificarea genetic a plantelor: Principii generale de realizare.
Aplicaii i controverse
C. P. Cornea Facultatea de Biotehnologii, Universitatea de tiine Agronomice i Medicin Veterinar Bucureti, B-dul Mrti 59, Romnia Intr-o lume n care creterea populaiei este accelerat (se preconizeaz c pn n anul 2050 populaia globului va numra aproximativ 10 miliarde de locuitori), iar producia agricol crete ntr-un ritm mai lent este necesar gsirea unor soluii moderne prin care agricultura s asigure cantiti suficiente de hran, cu o calitate corespunztoare. Agricultura tradiional se confrunt n prezent cu o serie de limitri extrem de serioase: - limitri ce in de pia: n condiiile globalizrii, regulile unei piee libere ngrdesc politicile locale de preuri, acestea fiind dictate de tendinele i politicile internaionale - resursele naturale devin, din ce n ce mai mult, factori limitativi ai dezvoltrii agriculturii tradiionale datorit modificrilor climatice, a industrializrii i urbanizrii care determin deteriorri ale solului, apei i a calitii aerului. - resursele biologice (genetice) sunt, n mod inevitabil, limitate. Astfel, dei considerat la nceput foarte eficient, obinerea i eliberarea n mediu a plantelor ameliorate prin metode tradiionale a devenit extrem de nceat, nu fac fa cerinelor, iar numrul de nsuiri naturale care pot fi mbuntite prin aceste metode este foarte mic. Specialitii consider c pentru depirea acestor probleme, pe lng mbuntirea continu a practicii agricole, exist dou soluii: gsirea unor surse alternative de hran (de exemplu, valorificarea resurselor marine) sau ameliorarea plantelor prin metode biotehnologice (Altman, 1999). Cu toate c pentru unii oameni biotehnologia reprezint un domeniu oarecum controversat, prin integrarea metodelor biotehnologice cu metodele clasice de ameliorare (att la plante ct i la animale) se pot obine rezultate care s mulumeasc pe toat lumea, declanndu-se o adevrat revoluie verde n agricultur. Prima generaie de cercetri n domeniul biotehnologiei vegetale a fost axat pe transferul de gene n plante de interes economic care s permit obinerea unor beneficii mai mari n urma cultivrii lor. De exemplu, au fost obinute plante rezistente la atacul unor insecte sau la aciunea unor erbicide ceea ce a condus la reducerea pierderilor datorate buruienilor sau duntorilor precum i a cantitilor de compui chimici aplicai culturilor de plante. Utilizarea plantelor transgenice, limitat iniial doar la loturi experimentale, s-a extins n ultimii ani la suprafee semnificative mai ales n SUA, Canada, Argentina, China i mai puin n Europa. Dei cercetrile privind introducerea de noi gene de interes la plante va continua, este de ateptat ca noua generaie de cercetri n domeniul biotehnologiilor vegetale s aib drept principal scop obinerea de plante transgenice sigure pentru utilizarea lor n alimentaia omului, cu rezisten la atacul fungilor astfel nct s nu se acumuleze compui toxici pentru om (compui de tipul aflatoxinelor), cu valoare nutritiv superioar (cum ar fi
83
C. P. Cornea
mbogirea lor n vitamine, n uleiuri sau proteine care nu s nu determine reacii alergice la persoanele sensibile) sau capabile s produc substane de interes medical (de exemplu vaccinuri comestibile). De asemenea, cercetrile privind obinerea i utilizarea plantelor transgenice trebuie s fie corelate cu studii care s lmureasc opinia public asupra beneficiilor i eventual a riscurilor pe care aceste plante i mai ales produsele alimentare derivate de la ele le presupun. 1. Principii
generale privind obinerea plantelor transgenice
Aa cum se cunoate, plantele transgenice sunt obinute n urma experimentelor in vitro de transfer de material genetic exogen: la nivelul lor s-au integrat n mod stabil secvene de ADN provenite de la alte organisme, care le confer anumite nsui fenotipice noi sau modificate. Obinerea plantelor transgenice presupune o metodologie specific, cu etape distincte, care prezint elemente comune pentru toate tipurile de plante cu care se lucreaz. In cazul anumitor specii vegetale metodologia utilizat este modificat conform particularitilor acestora astfel nct rezultatul s fie cel dorit. Transferul de gene la plante a devenit posibil datorit descoperirii i a utilizrii sistemului de transformare genetic prin intermediul bacteriilor din genul Agrobacterium (A.tumefaciens i A.rhizogenes). Rezultatele cercetrilor din domeniul geneticii vegetale, bazate n primul rnd pe folosirea plasmidelor Ti de la Agrobacterium tumefaciens, se constituie ntr-un material faptic deosebit de bogat. Vectorii de clonare derivai de la plasmidele Ti, tehnicile de transformare genetic, structura i exprimarea genelor n plantele transgenice au determinat obinerea unor noi cunotine importante att pentru cercetarea fundamental, ct i pentru mbuntirea nsuirilor unor plante de cultur. 1.1. Clonarea genelor n celulele vegetale prin utilizarea bacteriilor din genul Agrobacterium Pentru evidenierea particularitilor procesului de clonare n celulele vegetale vor fi prezentate n continuare unele aspecte legate de sistemul natural de transfer de gene prin intermediul bacteriilor din genul Agrobacterium precum i elementele specifice ale vectorilor de clonare i a markerilor de selecie pentru celulele vegetale. 1.1.1. Particularitile bacteriilor din genul Agrobacterium A.tumefaciens i A.rhizogenes sunt bacterii ce triesc n sol, ele fiind capabile de a produce boli unor specii de plante dicotiledonate i gimnosperme. S-a dovedit c tulpinile de A.tumefaciens determin apariia unor tumori de tip "crown gall" pe tulpinile rnite ale unor plante (n special la nivelul coletului), n timp ce tulpinile de A.rhizogenes induc formarea de rdcini adventive (de tip "hairy") la nivelul esuturilor vegetale rnite (Figura 1).
Figura 1. Tumori induse experimental la plante test prin infecie cu Agrobacterium tumefaciens. 84
Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse
Modificrile morfogenetice determinate de infectarea plantelor cu tulpini de A.tumefaciens sau A.rhizogenes se datoreaz transferului unor gene de origine bacterian n celulele vegetale. Bacteriile din genul Agrobacterium prezint un sistem genetic organizat care permite introducerea de gene noi n celula vegetal, graie prezenei n celula lor a unei plasmide Ti ("tumor inducing") sau Ri ("root inducing"), ce reprezint factorul determinant al producerii tumorilor, respectiv rdcinilor anormale, la plante. Transferul unei poriuni din aceste plasmide n genomul celulei vegetale determin modificri funcionale, ce se concretizeaz prin apariia fenomenului tumoral. Aceste plasmide constituie, aadar, un sistem organizat i complex de transfer de informaie genetic natural n celula vegetal, fr influen asupra echilibrului ecologic. Cele mai multe studii referitoare la structura plasmidelor de la Agrobacterium au fost realizate cu plasmidele Ti, izolate din tulpini de A.tumefaciens. Acestea sunt de dimensiuni mari (peste 200 kb)(Van Larebecke i col., 1974), cu numr mic de copii/celul bacterian, transferabile dintr-o celul n alta, dar numai n condiii speciale. n principiu, plasmidele Ti conin mai multe regiuni, cu funcii distincte: regiunea ADN-T (coninnd genele de tumorigenez), regiunea de virulen (genele vir), regiunea de incompatibilitate (genele inc), regiunea ce controleaz transferul conjugativ al plasmidei (genele tra) etc, primele dou fiind ns cele mai importante pentru procesul de transformare a celulelor vegetale. Regiunea de virulen cuprinde gene eseniale pentru transferul de ADN bacterian n celulele vegetale, fr a fi ns ele nsele transferate. Regiunea vir cuprinde un segment de aproximativ 30-40 kb (n funcie de tulpina bacterian), fiind format din mai mult de 20 gene organizate n cel puin 6 uniti transcripionale (operoni): virA (o gen), virB (11 gene), virC (2 gene), virD (4 gene), virE (2 gene) i virG (o gen)(Weising i Kahl, 1996). Dintre aceste uniti transcripionale, virA, virB, virD i virG sunt eseniale pentru transferul ADN-T, iar virC i virE asigur o cretere a eficienei transferului (de la Riva i colab., 1998). Toi aceti operoni sunt indui n prezena celulelor vegetale rnite (care produc o serie de compui fenolici cu rol inductor), funciile lor fiind urmtoarele: - virA i virG codific proteine responsabile de recunoaterea celulelor vegetale rnite i de inducerea celorlalte funcii vir; - virC i vir D codific proteine ce asigur formarea unei copii de ADN-T monocatenar, transferabil n celula vegetal; - virD i virE codific proteine ce formeaz un complex mpreun cu ADN-T ghidndu-l spre nucleul celulei vegetale; ele se pare c sunt implicate i n procesul de integrare al ADN-T n genomul noii gazde; - virB codific proteine care rspund de transportul complexului ADN-T-proteine prin membrana plasmatic bacterian. Studiile efectuate prin analiza heteroduplexurilor ADN ale regiunilor vir provenite de la diferite tipuri de plasmide Ti au evideniat o omologie extins a acestei regiuni, dei apar i unele mici zone neomoloage (care s-ar putea datora inseriilor sau deleiilor aprute n structura plasmidelor n cursul evoluiei). Spre exemplu, prin compararea regiunii vir a unei plasmide Ti nopalinice cu cea a uneia octopinice s-a observat ca exist unele deosebiri: prima nu prezint locusul virF, coninnd n schimb gena tsz, ceea ce d posibilitatea bacteriei s produc fitohormonul transzeatin. Aceast gen este localizat n cazul plasmidei Ti octopinice la nivelul extremitii stngi a regiunii, alturi de virA. Exprimarea genelor localizate n regiunea de virulen a plasmidelor Ti este inductibil, fiind reglat de aciunea unor factori din exterior. Experimental s-a demonstrat c, sub aciunea unor molecule semnal din exudatele plantelor sau la nivelul rnilor produse la plante, are loc o puternic activare a acestor gene. Aceste molecule semnal sunt compui fenolici, de tipul acetosiringonei sau a -hidroxiacetosiringonei, care au aciune asupra
85
C. P. Cornea
genelor reglatoare virA i virG. Produii acestor gene sunt asemntori cu alte proteine membranare bacteriene cu rol n reglare (Env Z, Omp R etc). Alturi de genele vir plasmidiale au mai fost identificate unele gene, localizate la nivelul cromosomului bacterian, implicate, se pare, ntr-o mai mic msur n procesul de transformare genetic. Dintre aceste gene menionm: genele chvA i chvB implicate n sinteza i secreia 1,2 glucanului; gena chvE necesar pentru inducerea regiunii vir i pentru chemotactismul bacterian; locusul cel responsabil de sinteza fibrilelor de celuloz implicate n ataarea bacteriilor la celulele vegetale; gena pscA (exoC) implicat n sinteza glucanului ciclic i a acidului succinoglicanic; locusul att implicat n sinteza unor proteine celulare de suprafa (Matthysse, 1987; Cangelosi i colab.,1991) Funciile de recunoatere i ataare a bacteriilor la peretele celulei vegetale nu sunt codificate de gene plasmidiale ci de gene cromosomale. Aceste gene determin, ntre altele, structura exopolizaharidelor de la suprafaa bacteriilor, implicate n procesele de recunoatere. Regiunea ADN-T reprezint o poriune din plasmida Ti (sau Ri) care este transferat n celula vegetal, integrndu-se stabil n genomul celular. Aceast regiune ADN-T (de la ADN transferat) are aproximativ 20-25 kb lungime (n funcie de tulpina bacterian gazd) i conine toate genele (oncogenele) care transferate n celula vegetal vor determina fenotipul caracteristic al celulelor transformate. Genele localizate pe ADN-T determin dou proprieti caracteristice pentru celulele vegetale tumorale: creterea pe medii de cultur n absena fitohormonilor; sinteza i secreia de opine, substane specifice pentru aceste tipuri de celule. Nester i colab. (1984) au reuit identificarea i cartarea a opt gene aflate la nivelul ADN-T: aux1, aux2, iaaM, iaaH, toate fiind implicate n codificarea sintezei de auxine, ipt ce codific sinteza de citochinine, ops ce determin sinteza opinelor de ctre celulele transformate (de exemplu, gene ocs sau nos, n funcie de tipul de plasmid Ti) i o a opta gen ce interacioneaz cu celelalte, mrind se pare, sensibilitatea celulelor transformate la auxin. De remarcat c, ADN-T coninut de toate plasmidele Ti naturale este flancat de scurte secvene de nucleotide, de aproximativ 25 pb, repetate direct, eseniale pentru procesul de transfer n celulele vegetale. Analiza acestor secvene terminale a artat c acestea sunt conservate la diferitele tulpini de Agrobacterium, ele fiind recunoscute de echipamentul enzimatic implicat n transferul ADN-T din celula bacterian n celula vegetal. n cazul plasmidelor Ri, analiza regiunii ADN-T a dovedit c aceasta conine o serie de gene, responsabile de fenotipul de tip "hairy" al esuturilor vegetale transformate. De remarcat c, genele ce se transfer n celulele vegetale sunt grupate la marginile regiunii ADN-T. Astfel, n partea stng a ADN-T sunt localizate genele rolA, B, C i D care sensibilizeaz celulele vegetale la aciunea auxinelor. S-a dovedit c, la anumite specii vegetale, simpla prezen a genelor rol, chiar n absena celorlalte gene din ADN-T, determin apariia fenotipului caracteristic ("hairy root"). n partea dreapt a ADN-T din plasmidele Ri se afl dou gene ce codific sinteza de auxine (acid indolilacetic) n celulele transformate; de asemenea, alturi de aceste gene se afl cele responsabile de sinteza unor opine (manopina i agropina)(Tepfer i Casse-Delbart, 1987). Plantele regenerate din esut vegetal transformat cu acest bacterie prezint un aspect modificat, comparativ cu plantele regenerate dinesut normal (figura 2). 1.1.2. Mecanismul transferului ADN-T n celula vegetal Mecanismul mobilizrii i transferului ADN-T din celula bacterian n celula vegetal a fost intens studiat n ultimii ani fiind clarificate multe dintre etapele acestui proces. Cu toate acestea rmn de elucidat unele aspecte ale sale, mai ales cele ce au loc n celula vegetal.
86
Figura 2. Aspectul plantelor de tutun regenerate din esut vegetal transformat cu A. rhizogenes (poziiile 2 i 3) comparativ cu plantele normale (poziia 1).
Primele etape ale interaciunii dintre plante i celulele de Agrobacterium sunt urmtoarele: - celulele vegetale rnite elibereaz o serie de compui fenolici (cum este acetosiringona), aminoacizi sau glucide (acid D-galacturonic sau acid D-glucuronic), care servesc drept chemoatractani pentru agrobacterii; - recunoaterea celulelor rnite i ataarea bacteriilor la nivelul acestora ca urmare a exprimrii constitutive a genelor vir cromosomale, procesul fiind denumit colonizare bacterian; - inducerea funciilor vir plasmidiale i nceperea procesului de transfer al ADN-T. Procesul de transfer al ADN-T poate fi mprit n dou etape: una ce se desfoar n celula bacterian i o alta ce are loc n celula vegetal (Figura 3).
Figura 3. Etapele transferului natural ADN-T din celulele bacteriene n celulele vegetale rnite (adaptare dup Weising i Kahl, 1996). 87
C. P. Cornea
Etapa bacterian include toate evenimentele ce conduc la producerea i exportul ADNT, ncepnd cu activarea funciilor vir plasmidiale de ctre compuii fenolici sau glucidici eliberai din celulele vegetale rnite. Primele gene vir ce intr n aciune sunt cele din operonii virA i virG, fiind sintetizate proteinele corespunztoare, VirA i VirG. Se pare c proteina VirA este produs ntr-o form inactiv ce este activat (fosforilat) de inductorii vegetali (compuii fenolici sau glucidici), ea prezentnd trei domenii funcionale: un domeniu periplasmic important pentru detectarea monoglucidelor inductoare i dou domenii transmembranare care recepioneaz i transmit semnalele inductoare. (Parkinson, 1993). La rndul su, proteina VirG este activat (fosforilat) de proteina VirA (Zambryski, 1988). Cele dou proteine interacioneaz i determin activarea celorlali operoni vir (virB, virC, virD, virE). De remarcat c, ADN-T conine toate genele onc necesare transformrii celulelor vegetale dar nici una dintre aceste gene nu este implicat n excizia i transferul ADN-T. In esen, pentru ca ADN-T s fie transferat este necesar prezena secvenelor marginale de 25 pb (notate de obicei TL sau TR) i, cel puin n cazul unor anumite plasmide Ti, existena unui element suplimentar localizat n afara ADN-T (n partea dreapt). Acest element, denumit n limba englez "overdrive", stimuleaz procesul de transformare (are funcie de "enhancer"). Excizia ADN-T este iniiat de aciunea combinat a proteinelor VirD1 i VirD2, codificate de operonul virD precum i a proteinelor VirC1 i VirC2, codificate de operonul virC (Lessl i Lanka, 1994). Dintre aceste proteine, rolul cel mai important l are proteina VirD2 care este o endonucleaz de restricie (situs-specific). Ea recunoate marginile ADN-T i le cliveaz (de obicei are loc mai nti secionarea uneia dintre catenele ADN-T la nivelul marginii din dreapta) genernd un segment de ADN monocatenar lung de aproximativ 20kb, simultan avnd loc sinteza catenei lips. Proteina VirD2 rmne ataat la nivelul captului 5' al ADNT monocatenar protejndu-l, probabil, de aciunea exonucleazelor. De asemenea, la ADN-T se ataeaz proteina VirE2 (aproximativ 600 molecule per ADN-T de 20kb) care, nu numai c protejeaz segmentul monocatenar ci l i convertete la o form corespunztoare pentru transport (Figura 4).
Figura 4. Reprezentarea schematic a etapelor formrii complexului ADN-T-proteine (dup Weising i Kahl, 1996). 88
Pentru a ajunge n nucleul celulei vegetale, complexul ADN-T-proteine (complex T de 2nm n diametru i aproximativ 3 m n lungime) trebuie s traverseze cinci bariere majore: membrana plasmatic i spaiul periplasmic bacterian, peretele celular vegetal, plasmalema celulei vegetale i membrana nuclear. In etapa transportului prin membrana plasmatic bacterian sunt implicate cele 11 gene ale operonului virB dar mecanismul exact al acestui proces nu este nc elucidat. Rolul proteinelor este complex: pe de o parte, protejeaz ADN-T de atacul exonucleazelor i asigur transportul ntr-o form corespunztoare. De asemenea, se pare c proteinele Vir particip i la formarea unor pori la nivelul membranei plasmatice i a membranei externe a bacteriei. n ceea ce privete translocarea prin membrana plasmatic vegetal nu exist o explicaie satisfctoare. Se pare c proteina bacterian virE2 care nsoete complexul virD2ADN-T conine dou semnale pentru localizare nuclear (NLS = nuclear location signals), iar proteina virD2 prezint doar un singur asemenea semnal. La procesul de translocare ar mai participa i proteinele codificate de operonii suplimentari virF i virH al cror rol ar fi legat de direcionarea complexului ADN-T spre nucleul celulei vegetale i de specificitatea de gazd a tulpinilor bacteriene implicate n procesul de transfer de ADN. Se consider doar c, odat ptruns n citoplasma celulelor vegetale, complexul T (ADN i proteine) este preluat de proteinele vegetale i transportat n nucleu, unde ADN-T este integrat n genom. 1.1.3. Integrarea ADN-T n genomul celulei vegetale Ultima etap a procesului de transformare genetic a plantelor este integrarea ADN-T n genomul celulei vegetale. Analiza genetic a plantelor transformate cu ajutorul bacteriilor din genul Agrobacterium a evideniat prezena uneia sau a mai multor copii ale ADN-T la nivelul unor cromosomi diferii. S-a dovedit c, cel puin pentru speciile studiate Crepis capillaris, Lycopersicon esculentum, Petunia hybrida, Nicotiana tabacum), nu exist o preferin pentru un anumit cromosom, procesul de integrare realizndu-se randomic. Spre exemplu, la Crepis capilaris s-a evideniat posibilitatea integrrii ADN-T n oricare dintre cele trei perechi de cromosomi, n timp ce la tomate au fost cartate apte segmente de ADN-T pe cinci cromosomi diferii. Date recente au evideniat c, dup integrare, ADN-T adopt trsturile cromatinei eucariote: formarea de nucleosomi i sensibilitatea la aciunea DN-azei I. Acest din urm aspect sugereaz o integrare preferenial la nivelul regiunilor din genomul vegetal care sunt transcrise (Kahl i col., 1987). Aceast observaie este susinut i de alte date experimentale. Astfel, prin clonarea la nivelul ADN-T a unei gene marker (pentru -glucuronidaz) lipsit de promotor, linkat cu o gen selectabil i utilizarea pentru transformare a acestui "construct" s-a reuit exprimarea eficient (n 30% din cazuri) a genelor clonate, dei acestea nu aveau promotor propriu. Explicaia acestor rezultate este aceea c integrarea a avut loc la nivelul unor regiuni active ale genomului vegetal (care sunt transcrise)(Cucu i colab., 1998). De asemenea, o serie de date experimentale au condus la concluzia c integrarea ADN-T are loc att la nivelul exonilor ct i la nivelul intronilor fr a fi observat vreo preferin pentru una sau alta dintre secvene. Mai mult, cercetri recente au artat c integrarea ADN-T s-ar realiza la nivelul unor "puncte fierbini" din genomul vegetal: la nivelul zonelor unde ADN a suferit unele modificri i unde este necesar intervenia enzimelor implicate n procesul reparator (Tinland, 1996). n ceea ce privete mecanismul molecular al integrrii ADN-T n genomul vegetal au fost elaborate mai multe modele. Spre deosebire de alte elemente genetice mobile cum sunt transpozonii sau retrovirusurile animale, ADN-T nu codific nici o protein care s fie
89
C. P. Cornea
implicat n integrarea sa n cromosomii vegetali. n acest fel, singurele proteine bacteriene care pot ajuta procesul de integrare sunt proteinele VirD2 i Vir E2. Deoarece proteina Vir D2 este ataat covalent la captul 5' al ADN-T monocatenar, rolul su ar putea fi acela al protejrii secvenei terminale de 25 pb (marginea dreapt a ADN-T), necesar procesului de recunoatere i integrare. Este posibil ca legtura fosfotirozinic prin care Vir D2 este ataat la ADN-T s fie preferat de enzimele gazdei (cum ar fi ligaza) implicate n integrare. Proteina Vir E2 (posibil i alte proteine) "acoper" molecula de ADN-T monocatenar dar eficiena procesului de integrare pare s fie independent de proteina Vir E2. Analizndu-se structura ADN-T integrat s-a evideniat faptul c, n prezena proteinei Vir E2, captul 3' al secvenei de interes prezint scurte deleii; n absena acestei proteine ADN-T sufer deleii majore. Aceste rezultate sugereaz faptul c proteina Vir E2 protejeaz ADN-T de aciunea nucleazelor plantei, ea nefiind implicat direct n procesul de integrare. n acest fel, se poate concluziona c, majoritatea enzimelor implicate n integrare sunt furnizate de ctre celula vegetal (ADN-polimeraza, ligaza, topoizomeraza, helicaza). Spre exemplu, pe baza experimentelor efectuate cu mutante de Arabidopsis thaliana hipersensibile la radiaii care erau incapabile de a realiza integrarea ADN-T, s-a putut evidenia rolul n integrare a proteinelor implicate n procesul reparator. Aa cum s-a menionat deja, ptrunderea complexului ADN-T n nucleu este facilitat de proteinele nsoitoare Vir D2 i VirE2 (prin intermediul regiunilor NLS ce interacioneaz cu proteine vegetale de legare) la care se adaug i proteina VirF, cu rol mai mic n acest proces. Mecanismul exact al integrrii ADN-T n genomul vegetal nu a fost clarificat dar se consider c integrarea se realizeaz prin recombinare nelegitim (Finberg i colab., 1995; Puchta, 1998). Observaiile discutate sugereaz faptul c asocierea dintre ADN vegetal i ADN-T este iniiat la captul 3' al ADN-T monocatenar. Conform acestui model, exist zone foarte restrnse de omologie (microomologie)(secvenele terminale de 25 pb) ntre ADN-T i ADN vegetal care asigur un minim de specificitate pentru procesul de recombinare prin poziionarea VirD2 pentru legare. Extremitatea 3 a ADN-T sau secvenele adiacente prezint o slab omologie cu ADN al plantei, consecina fiind formarea unei sinapse ntre catena transferat i ADN al plantei i a unei deschizturi la nivelul catenei 3-5 a ADN vegetal. ADN vegetal nlocuit este clivat la extremitatea sa 3 cu ajutorul unei endonucleaze, iar prima nucleotid de la captul 5 al complexului VirD2-ADN-T se mperecheaz cu o nucleotid corespunztoare de la nivelul catenei 5-3 din ADN vegetal. Are loc apoi degradarea fragmentului din catena de ADN vegetal ndeprtat de la nivelul crestturii (cu ajutorul unor endonucleaze sau exonucleaze cu aciune 3-5), iar ADN-T monocatenar i ia locul (Figura 5). Procesul este nsoit de crestarea catenei opuse i, n plus activeaz mecanismele reparatorii ale celulei vegetale astfel c, n final este sintetizat o caten complementar prin folosirea ADN-T inserat drept matri (Tinland, 1995).
Figura 5. Model ipotetic al integrrii ADN-T n genomul vegetal (dup Tinland, 1995) 90
Sintetiznd datele de pn acum se pot enuna cteva concluzii referitoare la procesul de integrare: - integrarea ADN-T nu este situs-specific i nu necesit prezena n ADN vegetal a unor secvene omoloage, fiind deci vorba de un proces de recombinare "nelegitim"; - integrarea ADN-T conduce la apariia unor mici deleii (13-73 pb) ale ADN vegetal, la nivelul situsului de inserie; - captul 3' al ADN-T este mai puin conservat, el suferind unele scurtri cu 3-100 nucleotide. Acest capt are o scurt regiune de omologie (cel puin 5 nucleotide) cu situsul la care va avea loc integrarea; - captul 5' al ADN-T monocatenar este mai puternic conservat n genomul celulei vegetale, iar regiunea de omologie cu situsul de inserie se reduce la o singur nucleotid; - asimetria dintre capetele ADN-T sugereaz c integrarea implic procese diferite. Recombinarea captului 3' presupune implicarea unei foarte scurte regiuni de omologie fiind asemntoare recombinrii plasmidiale din celulele animale, fiind n acest fel un exemplu de recombinare nelegitim tipic. n cazul captului 5', recombinarea sa presupune existena unui mecanism mult mai specific. 1.2. Vectori de clonare pentru celula vegetal Pentru realizarea transferului eficient de gene n celulele vegetale int au fost construii vectori de clonare specifici, de obicei derivai de la plasmidele Ti sau Ri sau de la unele virusuri caracteristice unor specii vegetale. 1.2.1. Vectori plasmidiali Sistemul natural de transfer descris mai sus este impropriu pentru a fi utilizat, ca atare, n scopul ameliorrii plantelor. Pentru a putea fi aplicat, plasmidele Ti au fost modificate drastic, prin eliminarea genelor ce determin producerea tumorilor, prin meninerea i clonarea n alte plasmide, mai mici, doar a regiunilor marginale i a unor promotori ce sunt recunoscui de echipamentul de transcriere al celulelor vegetale. De asemenea, ntre extremitile ADN-T prelucrat, au fost introduse gene marker specifice (nptII, gus, cat, gfp) sub controlul unor promotori corespunztori (Pnos, P35S), obinndu-se vectori de clonare foarte eficieni. Pornindu-se de la constatarea c, pentru a se realiza transferul de material genetic n celula vegetal este suficient s existe extremitile de 25 pb ale ADN-T, au fost fcute diferite ncercri de nlocuire a genelor din interiorul ADN-T cu alte gene, de provenien strin. Primele realizri n acest sens au fost cele privind obinerea unor vectori co-integrai. Acetia conin la nivelul regiunii ADN-T modificate a unei plasmide Ti o plasmid de la E.coli ce conine, la rndul ei, mai multe elemente genetice: originea replicrii (nefuncional n Agrobacterium), un marker de selecie pentru celulele bacteriene purttoare (de obicei rezistena la un anumit antibiotic) i gena (genele) strin clonat. Un asemenea vector de clonare duce ns la obinerea unui esut tumoral deoarece genele implicate n producerea fitohormonilor nu sunt inactivate. Existena acestor gene n stare activ mpiedic regenerarea de plante ntregi, sau dac ea se realizeaz eficiena este foarte redus iar plantele obinute prezint unele anomalii (Vatafu i colab., 1989). Pentru depirea acestui inconvenient s-au realizat plasmide Ti "dezarmate" (cum este, de exemplu, plasmida pGV3850) la nivelul crora regiunile interne ale ADN-T rspunztoare de oncogenez au fost eliminate. In plus, n locul acestora pot fi inserate alte secvene de ADN. De exemplu, clonarea la nivelul regiunii ADN91
C. P. Cornea
T dezarmate a plasmidei pBR322 permite, ulterior, co-integrarea la acest nivel a celor mai multe plasmide folosite n tehnicile de clonare n E.coli, printr-o singur treapt de recombinare (Figura 6).
Figura 6. Obinerea unei plasmide co-integrate, n care gena clonat iniial n pBR322 este introdus n pGV3850 (dup Schell i colab., 1985).
O problem mai dificil este selecia celulelor vegetale transformate cu un asemenea tip de vectori. Genele de rezisten la antibiotice, provenite din transpozoni bacterieni, nu sunt exprimate prin mecanismul de transcriere al celulelor vegetale. Pentru depirea acestui impas s-au construit gene himerice care combin un promotor al unei gene care este funcional n celula vegetal (cum ar fi promotorii genelor pentru sinteza nopalin-sintetazei sau octopinsintetazei, promotori virali de la CaMV etc) cu regiunea ce codific un marker de rezisten la un antibiotic i o secven de terminare a mesajului genetic, tot din ADN-T. Integrarea i exprimarea acestor gene himerice, dup transferul lor mediat de vectorii derivai de la plasmidele Ti, au permis selecia celulelor vegetale transformate pe medii de cultur ce conin antibioticul respectiv (de exemplu, kanamicin). Prin inserarea unor asemenea gene "marker" n vectori dezarmai a fost posibil transformarea celulelor vegetale, urmat de regenerarea unor plante n care se exprim gena respectiv. O alt strategie n transferul de gene n celula vegetal o constituie utilizarea vectorilor "binari", n care regiunile vir i ADN-T (respectiv extremitile de 25 pb repetate direct) sunt separate fizic pe plasmide diferite. S-au obinut astfel sisteme de vectori binari ce constau dintr-o pereche de plasmide, ambele capabile de replicare n Agrobacterium: - o plasmid Ti modificat, dezarmat total (fr ADN-T) ce conine genele vir; - o plasmid cu spectru larg de gazd (o plasmid de tip "navet", capabil de replicare n E.coli i n A.tumefaciens), ce conine gena ce trebuie introdus n celula vegetal, mpreun cu un marker de selecie pentru celulele vegetale transformate (Figura 7).
92
Figura 7. Tehnica utilizrii vectorilor binari (dup Tourte, 1998).
Toate aceste gene sunt situate ntre extremitile unui ADN-T, sub controlul unor secvene promotor i terminator adecvate (Figura 8). De asemenea, aceasta plasmid mai conine un marker de selecie bacterian, funcii de replicare i, eventual, mobilizare prin conjugare.
Figura 8. Reprezentarea schematic a vectorului binar Bin19 (dup Tourte, 1998).
1.2.2. Vectori virali Dei se cunoate c Agrobacterium tumefaciens nu infecteaz monocotiledonatele (cu foarte rare excepii), prin prelucrarea plasmidei Ti a ADN-T, n sensul introducerii ntre marginile acestei regiuni a genomului virusului variegrii porumbului, sau a CaMV, s-a reuit transferul respectivelor gene la cereale. Acest tip de infecie a primit denumirea de agroinfecie. n ultimii ani, pentru obinerea de plante transgenice au fost testai i vectori derivai de la diferite virusuri specifice plantelor. Dei la animale cei mai utilizai vectori sunt cei derivai de la retrovirusuri, la plante acest lucru nu s-a realizat pentru c virusurile ce infecteaz plantele sunt mai puin cunoscute la nivel molecular. Printre cele mai studiate virusuri vegetale se numr: virusul mozaicului conopidei (CaMV), virusul latent al maniocului (CLV), virusul piticismului la gru (WDV), virusul mozaicului galben al
93
C. P. Cornea
tomatelor (TGMV) etc. Mai mult, dintre virusurile vegetale, asemntoare ca organizare retrovirusurilor animale, cel mai cunoscut este CaMV. Cu toate acestea, dei funciile genelor CaMV sunt asemntoare celor ale retrovirusurilor, spre deosebire de acestea, ele nu se integreaz n genomul celulei vegetale. Un alt exemplu este cel al virusului mozaicului tutunului (VMT), virus cu genom ARN, a crui lungime este 6,5kb, ce codific patru polipeptide: cele dou subuniti ale replicazei, o protein de nveli i o protein important n procesul de infecie al celulelor vegetale nvecinate. Genomul viral a fost prelucrat "in vitro", nlocuindu-se genele pentru proteinele capsidale cu gene marker a cror exprimare s-a urmrit la plantele inoculate. Dezavantajul const n faptul c se pot transfera doar fragmente de ADN cu dimensiuni mici. n orice caz, chiar i n absena unor vectori derivai de la virusuri, o serie de elemente virale sunt deja utilizate pentru construirea vectorilor de exprimare pentru celula vegetal. Este cazul promotorilor genelor pentru ARN 19S i 35S de la CaMV care sunt foarte eficieni, mai ales pentru cereale. 1. 3. Modaliti de introducere a genelor de interes n celulele vegetale Pentru introducerea vectorilor de clonare recombinai n celulele vegetale int au fost elaborate numeroase metode, a cror eficien variaz n funcie de specia vegetal testat sau de tipul de esut utilizat n experimente. Dintre acestea menionm: - metoda co-cultivrii celulelor bacteriene (A.tumefaciens sau A.rhizogenes ce conin vectorii de clonare specifici) cu fragmente de esut vegetal (discuri foliare sau fragmente de tulpin), cu suspensii celulare vegetale, cu protoplati vegetali, cu lstari sau chiar cu semine; - electrotransformarea celulelor vegetale (esut intact, celule ntregi sau protoplati) folosindu-se ADN plasmidial modificat; - transformarea direct a protoplatilor vegetali cu ADN plasmidial purificat dintr-o gazd bacterian; transformarea se realizeaz n prezena CaCl2 i a polietilenglicolului (PEG); - microinjectarea ADN n celule sau n esutul conductor (macroinjectarea); - metoda biolistic (bombardarea celulelor vegetale cu microproiectile reprezentate de particule de tungsten sau aur coloidal acoperite cu ADN de interes); - utilizarea lipozomilor care s asigure protejarea ADN de interes fa de aciunea nucleazelor celulelor transformate. 1.4. Markeri genetici pentru selecia i caracterizarea celulelor vegetale transformate Pentru a se putea evalua rapid transferul i, mai ales, integrarea genelor clonate n celulele vegetale, este absolut necesar ca, odat cu gena de interes, n celulele vegetale s se integreze i anumite gene marker specifice. In prezent, genele utilizate drept markeri pentru celulele vegetale transformate sunt de dou tipuri: markeri de selecie care asigur doar diferenierea ntre celulele vegetale normale i cele modificate genetic i markeri cuantificabili care permit i determinarea nivelului exprimrii genelor clonate. Dintre cele mai utilizate gene marker de selecie pentru celulele vegetale transformate menionm: gena pentru neomicin fosfotransferaz (gena nptII ce determin rezisten la kanamicin, gena pentru cloramfenicol-acetiltransferaz (gena cat ce confer rezisten la cloramfenicol); gena pentru sinteza nopalinei (gena nos) sau octopinei (gena ocs); gena pentru luciferaz (gena lux ce determin sinteza luciferazei care, n prezena substratului specific, luciferina, produce lumin; plantele transgenice ce conin o asemenea gen au primit denumirea de plante "lampion"); gena pentru -glucuronidaza bacterian (gena gus); gena pentru proteina cu fluorescen verde (gena gfp = "green fluorescence protein")(Jefferson,
94
1988, Niedz i colab., 1995), n timp ce drept markeri cuantificabili pot fi utilizai: activitatea NPT II, producerea de opine; activitaea -glucuronidazic; activitatea cloramfenicol-acetiltransferazei; activitatea luciferazic; nivelul proteinei GFP (McClean, 1998). Selecia celulelor vegetale transformate se poate realiza, fie prin cultivarea acestora pe medii de cultur specifice ce conin antibioticele corespunztoare (kanamicin, cloramfenicol, higromicin), prin teste histochimice aplicate celulelor vegetale (pentru evidenierea, de exemplu, a produsului genei gus sau a genei lux) (Figura 8) sau prin teste fluorimetrice (pentru produsul genelor gus sau gfp). De remarcat c, vectorii de clonare cel mai recent construii conin cel puin dou gene marker.
Figura 8. Lstar de vi de vie transformat cu un vector de clonare specific ce conine gena pentru glucuronidaz i evidenierea activitii enzimatice cu ajutorul unui test histochimic (dup Martinelli i Mandolino, 1994).
Vectorii de clonare n celulele vegetale sunt derivai de la plasmide naturale (plasmidele Ti sau Ri de la Agrobacterium tumefaciens, respectiv A.rhizogenes) sau de la virusuri specifice celulelor vegetale, ce asigur funcionarea unor anumite secvene de ADN dup integrarea lor n genomul celulelor vegetale. Ca i n cazul vectorilor pentru alte tipuri de organisme, vectorii pentru celulele vegetale sunt, de obicei, vectori de tip navet, ceea ce nseamn c ei pot funciona n dou gazde diferite: E.coli i Agrobacterium sp., iar anumite poriuni ale lor se exprim n celulele eucariote. Un exemplu de asemenea vector, mult utilizat n experimentele de transfer de gene n celulele vegetale, este pBI121 (Figura 9).
Figura 9. Harta genetic a plasmidei pBI121. 95
C. P. Cornea
Plasmida pBI121 este un derivat al plasmidei pBin19 construit de Bevan n 1984. Ea are 13 kb i conine o serie de elemente genetice ce i permit meninerea n E.coli i n diferite tulpini de Agrobacterium (ori, gena de rezisten la kanamicin). De asemenea, vectorul pBI121 conine i secvene ce sunt transferate n genomul celulelor vegetale. Acestea sunt: secvenele marginale de 25pb (derivate de la ADN-T din plasmida Ti de la A.tumefaciens) eseniale pentru transfer, ntre care au fost clonate dou gene marker: gena de rezisten la kanamicin (nptII) i gena ce codific sinteza -glucuronidazei (gus). Cele dou gene marker au fost clonate sub controlul unor regiuni promotor sau terminator specifice: gena nptII este controlat de promotorul NOS (de la gena pentru nopalin-sintetaz)(P1) i de terminatorul NOS, iar gena gus se afl sub controlul promotorului 35S de la virusul CaMV (virusul mozaicului conopidei)(P2) i a secvenei terminatoare NOS. Acest tip de vector permite sinteza de proteine de fuziune prin clonarea genei de interes la nivelul MCS localizat dup promotorul 35S. Interesul deosebit al cercettorilor pentru introducerea de gene heterologe n celulele vegetale i pentru studiul funcionrii lor, a condus la construirea unor vectori din ce n ce mai perfecionai. Unii dintre asemenea vectori permit exprimarea difereniat a unor gene clonate: la nivelul unor organe specifice ale plantei sau n diferite momente ale dezvoltrii acesteia. 2. Aplicaii
ale transgenezei la plante
Speciile vegetale prezint o mare diversitate genetic, iar cele slbatice constituie un mare rezervor genetic, din care se pot obine gene importante din punct de vedere practic. Cercetrile de inginerie genetic la plante prezint o semnificaie teoretic deosebit, facilitnd cunoaterea modului de aciune a genelor acestor organisme, a efectelor fitohormonilor asupra dezvoltrii plantelor, a mecanismelor de inactivare a genelor etc. (Meyer, 1995). De asemenea, prin aplicarea tehnicilor de biologie molecular se pot obine informaii utile asupra particularitilor genomului plantelor folosite n ameliorare, a localizrii unor gene de interes, a gradului de nrudire dintre diferite specii etc (Gresshoff, 1994; Edwards i Karp, 1997). n ceea ce privete aplicaiile practice, pn n prezent au fost obinute o serie de rezultate semnificative, unele aplicate deja n practic aa cum sunt: plante transgenice rezistente la viroze; plante transgenice rezistente la atacul unor duntori, plante transgenice rezistente la erbicide (figura 10); plante transgenice de interes horticol (plante ornamentale cu fenotipuri noi, plante care produc fructe rezistente la nmuiere); plante transgenice capabile s sintetizeze metabolii secundari n cantiti crescute; plante transgenice productoare de anticorpi comestibili etc.
Figura 10. Comparaie ntre aspectul unor plante transgenice de tutun rezistente la aciunea erbicidelor i cel al unor plante normale (dup Tarano, 1993) 96
Pe lng aceste reuite, cercetrile efectuate n prezent vizeaz, pe de o parte extinderea numrului de specii de plante la care transferul de gene utile s fie eficient i, pe de alt parte, studii asupra controlului dezvoltrii plantelor i a exprimrii genelor (activarea i silenierea genelor) (Chua i Sundaresan, 2000). Aa cum se poate vedea din cele spuse mai sus, aplicaiile plantelor transgenice sunt extrem de diverse astfel c abordarea tuturor direciilor ntr-o singur lucrare nu este posibil. Din acest motiv, n continuare vor fi prezentate doar cteva dintre aceste tipuri de aplicaii, insistndu-se pe cele care fie au potenial aplicativ spectaculos, fie nu au fost pe deplin rezolvate, fie pot aduce nouti n plan fundamental i practic. 2.1. Protecia plantelor fa de atacul insectelor Pierderile nregistrate anual de producia agricol global datorit atacului insectelor duntoare sunt estimate la aproximativ 14%, n timp ce raportat la anumite specii vegetale n parte pierderile sunt mult mai mari: 52% la gru, 83% la orez, 59% la porumb, 74% la cartof, 58% la soia i 84% la bumbac (Oerke i colab., 1994). Insectele determin scderea produciei agricole att prin aciune direct ct i prin aciune indirect, ca vectori ai unor fitopatogeni variai. Limitarea aciunii acestora se realizeaz prin folosirea pesticidelor, estimate la un cost de aproximativ 10 miliarde de USD anual. Tehnologia ADN recombinant ofer n prezent posibilitatea obinerii de noi insecticide biologice care pstreaz avantajele agenilor biologici clasici de control avnd n plus unele caracteristici noi. Cu toate acestea, din considerente comerciale, tehnologiile respective nu sunt accesibile tuturor utilizatorilor posibili, mai ales dac acetia sunt sraci i, n plus au generat o serie de dezbateri publice asupra utilitii lor, a efectelor asupra altor organisme dect cele int sau asupra mediului. Obinerea de plante rezistente la duntori reprezint poate domeniul cel mai spectaculos al ingineriei genetice aplicate la plante, deoarece a permis regenerarea de plante transgenice care conin gene de origine bacterian ce le asigura protecie fa de anumite insecte duntoare. Aceasta asigur, pe de o parte, obinerea de recolte mai bogate i, pe de alt parte, reducerea cheltuielilor fermierilor pentru pesticide. In ultimii ani, au fost descoperite o serie de noi gene pentru rezistena la atacul insectelor, transferabile la plante. Dintre acestea sunt de amintit: genele ce codific producerea -endotoxinei de la Bacillus thuringiensis; gene pentru sinteza unor enzime sau a unor inhibitori enzimatici; gene de la plante ce codific sinteza unor lectine specifice; gene care determin inducerea sintezei unor compui vegetali de tipul fitoalexinelor etc. 2.1.1. Genele pentru -endotoxina de la Bacillus thuringiensis Dup descoperirea sa n 1901 de ctre Ishiwata, aceast bacterie a fost supus unor cercetri asupra producerii unor substane inhibitorii pentru insecte astfel c n 1951 a fost elaborat un biopesticid care a stat la baza obinerii unor produse cunoscute sub numele de Thuricid i Dipel. n elaborarea metodologiei de clonare s-a pornit de la observaia c exist un grup de bacterii Gram pozitive, aparinnd speciei Bacillus thuringiensis, care produc o toxin, numit delta-endotoxina sau proteina cristal, capabil s omoare o gam foarte larg de insecte (coleoptere, lepidoptere, diptere), n funcie de tulpina bacterian. De mare interes este tulpina B.thuringiensis var. tenebrionis care sintetizeaz o -endotoxin eficient mpotriva gndacului de Colorado. Genele implicate n sinteza acestei proteine sunt localizate, la majoritatea tulpinilor bacteriene, pe plasmide de dimensiuni mari (75 kb), producerea toxinei fcndu-se n cursul sporulrii. De asemenea, s-a dovedit c proteina cristal (-endotoxina) este exprimat, n mod normal, ca o pro-toxin inactiv, de dimensiuni mari, care sufer o
97
C. P. Cornea
prelucrare proteolitic n intestinul insectei sensibile, devenind toxin activ. Aceasta recunoate receptorii specifici de la nivelul celulelor intestinale i blocheaz funciile acestor celule, ceea ce conduce la moartea insectelor. Studiile asupra genelor ce codific proteinele inhibitoare produse de B.thuringiensis au condus la gruparea acestora n patru tipuri pe baza specificitii de aciune (de tipul de insect int) i a secvenei de nucleotide: - genele cry de tipul I codific proteine de 130 kDa specifice pentru larvele de lepidoptere - genele cry de tipul II codific proteine de 70 kDa active asupra larvelor de diptere i lepidoptere - genele cry de tipul III codific proteine de 70 kDa cu aciune specific asupra larvelor de coleoptere - genele cry de tipul IV codific proteine inhibitorii pentru larvele de diptere. Trebuie precizat ns faptul c numrul de gene identificate c sunt codificatoare pentru proteine de tip - endotoxine este foarte mare: 140 de gene cu specificitate pentru lepidoptere, coleoptere i diptere (Crickmore i colb., 1998). S-a reuit obinerea genelor pentru proteina cristal de la mai multe tulpini de B.thuringiensis prin amplificare genetic (PCR). Deoarece s-a dovedit c gena ntreag pentru proteina cristal se exprim foarte slab n celulele vegetale transformate, s-a realizat o gen modificat, ce conine doar informaia pentru poriunea N-terminal a proteinei (aminoacizii 1-645) (Figura 11). Mai mult, pentru a mri exprimarea genei n plante, secvena natural pentru aminoacizii 1-415 bogat n AT a fost nlocuit de o secven sintetic, bogat n GC, ce conine codonii preferai de celulele vegetale. Aceste gene recombinate au fost introduse n vectori derivai de la plasmida Ti (vectori binari ce conin promotorul CaMV duplicat, fapt ce mrete de 5 ori procesul de transcriere i gene marker de selecie pentru rezistena la antibiotice sau la erbicidul fosfinotricin), transferate n celule de A.tumefaciens ce conin plasmide Ti dezarmate.
Figura 11. Reprezentarea schematic a plasmidelor recombinate ce conin gena cry A(b) de la Bacillus thuringiensis, folosite pentru obinerea de plante transgenice rezistente la atacul unor duntori (dup Carozzi i colab., 1992). 98
Mrimea plasmidelor recombinate obinute variaz ntre 5000 i 10.000 pb, n funcie de dimensiunea genei bacteriene i a secvenei promotor integrate n vector (Koziel i colab., 1993). Tulpinile bacteriene recombinate au fost apoi utilizate pentru infectarea plantelor test (cartof, tutun, bumbac). Selecia s-a realizat mai nti n funcie de markerii de selecie purtai de vectori (rezistena la antibiotice, testul GUS, rezistena la erbicid etc), iar n final, plantele regenerate au fost supuse atacului insectelor. Plantele transgenice regenerate au manifestat rezisten la atacul insectelor duntoare, caracterul meninndu-se i exprimndu-se i n cazul experimentelor n cmp. Prima plant transgenic obinut care manisfest rezisten la atacul insectelor aparine speciei Nicotiana tabacum (Vaeck i colab., 1987), ea exprimnd gena cry 1A, ntreag sau trunchiat, clonat sub controlul unui promotor constitutiv astfel nct proteina inhibitoare reprezint 0,02% din totalul de proteine vegetale (din frunze).Civa ani mai trziu (1992) au fost obinute plante de bumbac n care a fost introdus gena cry 1A(c) modificat, clonat sub controlul promotorul CaMV 35S sau sub controlul unui promotor i a unei secvene pentru o peptid de tranzit prin cloroplaste izolate de la Arabidopsis, astfel c nivelul exprimrii genei de interes a condus la obinerea unui nivel ridicat al toxinei: 0,1% din proteina total, respectiv 1%. O alt variant de clonare a genei pentru toxina bacterian a fost aceea a utilizrii unor elemente genetice care asigur exprimarea genei de interes exclusiv n poriunile verzi ale plantei (promotorul deriv de la gena pentru PEPC)(Hudspeth i Grula, 1989) sau n polen (prin folosirea unui promotor derivat de la gena pentru o protein kinaz dependent de calciu = CDPK)(Estruch i colab., 1994). Fujimoto i colab. (1993) au utilizat o metodologie asemntoare pentru a transforma plante de orez, iar Perlak i colb.(1993), prin clonarea unei gene cry III sintetic au obinut plante transgenice de tutun i cartof rezistente la atacul gndacului de Colorado. Mai recent, Arencibia i colab.(1997) au utilizat pentru clonare o gen modificat cry 1A(b) sub controlul promotorului CaMV i au obinut plante transgenice de trestie de zahr cu rezisten la larvele de Diatraea saccharalis. Dat fiind semnificaia practic a rezistenei plantelor la insectele duntoare cercetrile au fost extinse i la alte specii de plante, obinndu-se plante de vinete rezistente la atacul unor coleoptere (Arpaia i colab., 1997), brocoli cu rezisten la anumite specii de lepidoptere (Selvapandian i colab., 1998), porumb cu rezisten la Busseola fusca (Rensburg i colab., 1999) etc precum i o serie de progrese la plante leguminoase (Ortiz i colab., 2000). Studiile de toxicitate efectuate asupra plantelor transgenice ce exprim gena pentru endotoxin au dovedit c existena transgenei nu modific particularitile normale ale respectivelor plante, cu excepia rezistenei la atacul insectelor. Pe lng endotoxina produs de tulpini de B.thuringiensis, au mai fost identificate i alte specii de bacterii care produc proteine cu efect insecticid. Acesta este cazul unor tulpini de Bacillus cereus care produc dou proteine, VIP 1 i VIP2 cu efect asupra unor insecte, modul lor de aciune fiind asemntor cu al endotoxinei (Estruch i colb., 1997). 2.1.2. Gene pentru sinteza unor enzime sau a unor inhibitori enzimatici cu efect insecticid Exprimarea de ctre plantele transgenice a unor enzime cum ar fi chitinaza, colesterol oxidaza, lipoxigenaza, fenol-oxidaza, peroxidaza sau izopentenil transferaza (ipt) ar putea constitui o alternativ la utilizarea genei pentru endotoxin (Sharma i colab., 2000). Dintre enzimele care pot asigura protecie plantelor transgenice fa de atacul insectelor, un loc aparte este ocupat de chitinaze, enzime care acioneaz asupra chitinei, component de baz al nveliurilor insectelor. Astfel, plantele transgenice de tutun care
99
C. P. Cornea
exprim gene pentru chitinaz izolate de la insecte (Ding i colab., 1998) sau de la fasole (Gatehouse i colab., 1993) manifest o rezisten crescut la lepidoptere. Mai mult, s-a observat faptul c prin clonarea genei pentru chitinaz izolat de la bacteria Serratia marcescens s-a evideniat un efect sinergic al endochitinazei produse de plantele transgenice ce conin suplimentar gena pentru -endotoxin fa de larvele de Spodoptera litoralis (Rigev i colab., 1996). O alt enzim de origine bacterian care manifest aciune insecticid este colesterol oxidaza. Spre exemplu, introducerea i exprimarea genei cho A pentru colesterol oxidaz de la Streptomyces sp. n plante de tutun a condus la o rezisten crescut a plantelor transgenice obinute fa de larve de Anthonomus grandis (Cho i colab.,1995). Utilizarea pentru clonare a genei pentru enzima izopentenil transferaza (ipt) bacterian (implicat n biosinteza citochinelor) prin fuziune cu promotorul genei pentru inhibitorul proteazic II (PI-IIK) a determinat obinerea unor plante transgenice de Nicotiana plumbaginifolia rezistente la aciunea larvelor unor lepidoptere specifice (Manduca sexta sau M.persicae)(Smigocki i colab., 1993). O alt realizare important a fost aceea a introducerii n celulele vegetale a genei cpt2 ce codific o protein inhibitoare pentru tripsina, izolat de la Vicia faba. Aceast protein are efect antimetabolic, protejnd n felul acesta plantele transgenice de atacul unor duntori. n mod similar au fost clonate n diferite gazde i alte gene ce codific inhibitori proteazici (Kunitz trypsin inhibitor, Bowman Birk proteinase inhibitor) sau lectine, proteinele codificate putnd constitui adevrate "arme de aprare" pentru plantele transgenice ce le conin (Foard i colab., 1983). Astfel, este cunoscut faptul c numeroase insecte, cum ar fi lepidopterele, depind de serin-proteaze (tripsin, chemotripsin sau elastaz), acestea fiind primele enzime ce realizeaz procesul de digestie. O serie de gene ce codific diferii inhibitori pentru serin-proteaze au fost izolate din diferite surse (plante, microorganisme) i clonate n diferite specii vegetale, cum ar fi Medicago sativa, tutun, porumb etc; plantele transgenice obinute au manifestat o rezisten crescut fa de diferite insecte duntoare comparativ cu plantele normale, nemodificate genetic (Edmonds i colab., 1996; Yeh i colab., 1997). De asemenea, n anumite cazuri s-a remarcat faptul c introducerea n plante a unor gene suplimentare pentru inhibitori proteazici care s se alture celor endogene determin un nivel crescut al rezistenei la patogeni a plantelor transformate. Cu toate acestea, utilizarea inhibitorilor proteazici pentru controlul insectelor duntoare necesit studii amnunite asupra interaciunilor dintre plante i insecte deoarece s-a observat c, n cazul anumitor inhibitori, cum sunt cei pentru serin-proteaze, efectul insecticid se manifest i asupra unor insecte utile (asupra albinelor, de exemplu)(Malone i colab., 1995). Metabolismul glucidelor de la insecte reprezint o alt int pentru agenii inhibitori testai n numeroase studii. Astfel, au fost izolate i caracterizate genele pentru diferii inhibitori pentru -amilaz (de la gru i fasole); dup clonarea n plante de tutun a genei izolate de la gru n tutun s-a observat o cretere a mortalitii larvelor de lepidoptere de pn la 40%. In cazul clonrii n plante de mazre a genei pentru inhibitorul -amilazei de la fasole sub controlul promotorului genei pha 1 s-a obinut o exprimare crescut a genei strine la nivelul seminelor, ceea ce a condus la o rezisten mai mare fa de Collasobruchus sp. (Schroeder i colab., 1995). Lectinele vegetale reprezint un grup special de glicoproteine care au funcii protectoare fa de o serie de organisme duntoare. Studiile asupra acestor glicoproteine au dovedit c acestea produc efecte puternice asupra dezvoltrii unor tipuri variate de insecte. Primul exemplu de plante transgenice ce conin gene pentru lectine nespecifice i care manifest toxicitate pentru duntori este reprezentat de plante tutun la nivelul crora au fost clonate genele pentru lectina de la mazre (Boulter i colab., 1990). Cu toate acestea, multe
100
dintre lectinele vegetale au efect toxic i asupra mamiferelor, ceea ce limiteaz utilizarea lor ca ageni de mrire a rezistenei plantelor la duntori. O atenie special a fost acordat, de muli specialiti, lectinei cu specificitate pentru manoz de la ghiocel i concanavalinei A: genele pentru aceste lectine au fost clonate n diferite specii de plante (tutun, tomate, cartof, trestie de zahr, orez, gru) iar proteinele heterologe sintetizate de acestea au determinat o sensibilitate redus fa de atacul unor insecte duntoare (larve de lepidoptere, afide, coleoptere)(Nutt i colab., 1999; Stoger i colab., 1999). Rezultatele obinute sugereaz c utilizarea plantelor transgenice ce conin gene insecticide (cum ar fi cea pentru lectina din ghiocel) mpreun cu un management integrat reprezint posibiliti promitoare pentru controlul duntorilor de la multe specii vegetale, inclusiv la gru sau orez (Rao i colab., 1998). Ca o concluzie se poate spune c, n ciuda rezultatelor remarcabile obinute pn acum, genele utilizate pentru transformarea plantelor de cultur sunt fie prea specifice fie sunt doar parial efective asupra intelor reprezentate de insectele duntoare. De aceea, pentru a folosi plantele transgenice ca adevrate arme pentru controlul duntorilor ar fi necesar ca la nivelul lor s existe transgene care s determine sinteza unor compui cu aciuni diferite asupra aceleiai inte. Cercetrile efectuate sunt de dat relativ recent i vizeaz, n principal combinarea n aceeai gazd a genelor pentru o -endotoxin de la B.thuringiensis cu o alt gen cu efect inhibitor: de exemplu, gena pentru inhibitorul tripsinei de la Vicia faba (CpTI) sau pentru serin-proteaze (Cornu i colab., 1996, Zhao i colab., 1998); gena pentru proteina din nveliul virusului Y de la cartof (Li i colab., 1999). O alt abordare interesant este aceea prezentat de Herrera i colab.(1997) care au introdus gena cry1A(c) ntr-o tulpin de Pseudomonas fluorescens capabil s colonizeze trestia de zahr prin intermediul a dou plasmide, pDER405 i pKT240 la nivelul crora gena se gsete n 13, respectiv 28 de copii. Testarea tulpinilor bacteriene recombinate asupra unor insecte duntoare specifice trestiei de zahr a evideniat o rezisten mai mare a plantelor tratate cu bacteriile respective dect cele netratate. De asemenea, dei s-au obinute plante transgenice cu rezisten la insecte duntoare n cazul mai multor specii de plante cultivate, mai puine rezultate au fost raportate n cazul cerealelor, a legumelor i a plantelor oleaginoase. Mai mult, n cazul acestor plante sunt necesare studii suplimentare referitoare la sigurana lor, la posibila toxicitate pentru om i animale, a implicaiilor ecologice ale utilizrii lor i, nu n ultimul rnd la preul de cost care trebuie s fie accesibil fermierilor i rilor srace(Riva i colab., 2000). 2.2. Gene de rezisten la fitopatogeni microbieni, virali i la nematode Rezistena plantelor la diferite boli a constituit un subiect pentru studii efectuate de mult vreme, reuindu-se identificarea unui numr relativ mare de gene de rezisten. Dei s-a crezut c genele endogene de rezisten ar asigura un efect durabil pentru plantele corespunztoare, doar n foarte puine cazuri acest lucru a fost adevrat. De exemplu, n cazul cartofului, programul de control al anumitor boli, cum este putregaiul provocat de Phytophtora infestans a trebuit abandonat deoarece rezistena la aceast boal a plantelor de cartof obinute prin transferul celor 11 gene de rezisten pe baza ncrucirilor cu specia slbatic Solanum demissum s-a dovedit a fi de scurt durat (Landeo i colab., 1995). De asemenea, identificarea eventualelor gene de rezisten n genomul diferitelor specii vegetale i transferul lor la alte plante de cultur este extrem de dificil i consumatoare de timp dac se utilizeaz metodele tradiionale (hibridrile intra- i interspecifice). Procesul este considerabil accelerat prin utilizarea markerilor moleculari generai prin aplicarea tehnicilor RFLP (restriction fragment lenght polymorphism), RAPD (random amplified polymorphic DNA), SSR (single sequence repeat) sau SNP (single nucleotide polymorphism)
101
C. P. Cornea
(Schneider i colab., 1997; Gold i colab., 1999). Aplicarea markerilor moleculari a permis izolarea a aproape 20 de gene de rezisten (gene R) de la specii de plante bine caracterizate din punct de vedere genetic, dovedindu-se c multe dintre ele sunt grupate la nivelul unor regiuni cromosomale specifice (formeaz clusteri). Dintre aceste gene de rezisten, unele au fost transferate altor specii de plante dect cele de origine, prin tehnici de clonare molecular, cu ajutorul unor vectori specifici care asigur transferul unor fragmente de dimensiuni mari (Hamilton, 1997), evideniindu-se faptul c n acest fel c genele R acioneaz sinergic i asigur o rezisten durabil la unele boli. Aa cum s-a menionat deja, puine gene R s-au dovedit a asigura un control durabil al bolilor la plante. Aa este cazul genelor Bs2 de la ardei i Xa21 de la orez care asigur rezistena la diferite tulpini fitopatogene de Xanthomonas campestris sau X.oryzae n cazul unor specii n care genele respective au fost clonate (de exemplu, la tomate)(Wang i colab., 1996). Rezistena n cazul acestor gene se datoreaz faptului c ele asigur recunoaterea unor proteine pe care le produc bacteriile sau fungii fitopatogeni, rezultatul fiind declanarea unui fenomen de hipersensibilitate al plantei i necroza esuturilor afectate (Lauge i colab., 1998). Un alt exemplu de gen R cu aciune durabil este gena recesiv mlo de la orz care asigur rezistena plantelor ce o conin la toate tulpinile de Erysiphe graminis, prin acumularea n celulele vegetale a unui compus antifungic de tip fenolic denumit p-cumaroilhidroxiagmatina. Se preconizeaz ca aceast gen s fie utilizat pentru supresia prin tehnica antisens a genei dominante Mlo de la gru sau de la alte specii de plante sensibile la Erysiphe sp.(Rommens i Kishore, 2000). Prelucrarea in vitro a numitor gene R i apoi introducerea lor n noi gazde confer posibiliti noi de rezisten. Acestea este cazul genei avrPto de la tomate care, dup clonarea sa sub controlul unui promotor puternic cum este cel de 35S la CaMV determin rezistena plantelor de tomate transformate att la tulpinile de Pseudomonas syringae pv.tomato ct i la patogeni nenrudii, cum ar fi Xanthomonas campestris i Cladosporium fulvum (Tang i colab., 1999). Eforturile cercettorilor de a obine sisteme de rezisten aplicabile la un numr ct mai mare de specii vegetale nu se limiteaz doar la genele R ci includ i mecanismele sistemice de aprare pe care le declaneaz infecia cu un anumit patogen (systemic acquired resistance = SAR). Au fost izolate i caracterizate mai multe gene implicate n SAR, dintre care, gena Npr1 care codific un reglator transcripional constituie o gen cheie n acest sistem. Supraexprimarea acestei gene mrete rezistena plantelor de Arabidopsis thaliana sau de orez la o mare varietate de patogeni (Cao i Dong, 1998). Un comportament interesant a fost observat n cazul genei Myb1 care este indus prin infecia cu VMT a plantelor de tutun rezistente i care determin sinteza unui factor de transcriere care se leag la nivelul promotorului unei gene implicate n patogenez (gena PR1a). Modificarea nivelului de exprimare a genei Myb1 n plantele transgenice de tutun conduce la o rezisten crescut fa de infecia viral (cu VMT) ca i fa de fungul patogen Rhizoctonia solani(Klessig i Yang, 1999). Alturi de aceasta, o alt gen recent clonat, Pad4, izolat de la Arabidopsis thaliana, se dovedete extrem de interesant pentru dezvoltarea rezistenei cu spectru larg.: supraexprimarea genei respective n plante transgenice sporete i rezistena fa de fitopatogeni (Jirage i colab., 1999). In ultimii ani, numeroase companii biotehnologice i universiti au nceput s evalueze performanele plantelor transgenice ce exprim proteine antifungice att prin experimente in vitro ct i n cmp. Au fost examinate att plante ce conin gene R sau gene implicate n SAR, ct i gene de tipul celor ce codific glucooxidaza (AGO) de la Aspergillus sp, a defensinelor, a enzimelor generatoare de H2O2, a glucanazelor sau chitinazelor (Broekaert i colab., 1999). Spre exemplu, dei la nivel de laborator plantele transgenice de cartof ce conineau gena fungic pentru glucozoxidaz au manifestat o rezisten crescut fa
102
de fitopatogeni, atunci cnd au fost trecute n cmp rezultatele au fost neconcludente. In cazul altor gene, cum ar fi cele pentru chitinaz i pentru -1,3-glucanaza intracelular, supraexprimarea acestora n plante transgenice de tomate a determinat o rezisten semnificativ fa de Fusarium oxysporum (Cornelissen i colab., 1997) 2.3. Plante transgenice productoare de vaccinuri comestibile sau de anticorpi Progresele nregistrate n ultimii 10 ani n biologia molecular i n domeniul imunologiei au permis o mai bun nelegere a numeroase boli i au condus la dezvoltarea unor strategii noi pentru vaccinare. Una dintre direciile promitoare n acest sens este obinerea de plante transgenice n care s se exprime gene pentru diferii antigeni. Proteinele antigenice derivate de la plantele transgenice elimin sau previn unele boli la animale, iar n testele clinice n cazul oamenilor ele s-au dovedit a fi sigure i funcionale (Walmsley i Arntzen, 2000). S-a dovedit c rspunsul imun al unui organism fa de un anumit patogen poate fi indus prin utilizarea unor polipeptide similare celor din structura epitopilor agenilor etiologici (Vior, 2000). In acest sens au fost elaborate tehnologii de obinere a vaccinurilor subunitare care au avantajul c elimin utilizarea de virusuri vii sau de microorganisme patogene active, dar dezavantajul c sunt termosensibile i foarte scumpe. Producerea unor asemenea vaccinuri n plante elimin unele impedimente curente: preul de cost ar fi mic, se elimin riscul contaminrii de patogeni animali, se asigur o stabilitate pentru produsul obinut, iar administrarea se poate face pe cale oral i nu prin injectare. Primele testri clinice ale unui vaccin produs de plante au fost realizate n 1998, prin demonstrarea caracterului imunogen al unui antigen bacterian recombinat produs de plante transgenice de cartof: administrarea vaccinului comestibil a condus la inducerea unui rspuns imun la nivelul mucoaselor (Tacket i colab., 1998). Metodologia de transfer a genelor de interes n plante se bazeaz att pe sistemele ce utilizeaz vectorii de clonare derivai de la plasmidele Ti de la A.tumefaciens ct i pe folosirea unor virusuri vegetale recombinate drept vectori ai genelor. Primele ncercri de a obine vaccinuri produse de plante dateaz din anul 1990 cnd Curtiss i Cardineau au determinat exprimarea unei proteine antigenice de la Streptococcus mutans (proteina SpaA) dup clonarea genei codificatoare n plante de tutun. Dup incorporarea de esut vegetal transformat n dieta oarecilor, s-a obinut un rspuns imun la nivelul mucoaselor fa de proteina Spa A. Cercetri ulterioare au permis exprimarea antigenului de suprafa de la virusul hepatitei B n plante transgenice de tutun i salat, a unei glicoproteine antigenice de la virusul turbrii n plante transgenice de tomate, a subunitilor toxinei holerice n plante transgenice de tutun sau cartof sau a glicoproteinei B de la citomegalovirusul uman n plante transgenice i semine de tutun (Mason i colab., 1992; McGravey i colab., 1995; Arakawa i colab., 1997; Tackberry i colab., 1999). Cele mai recente studii referitoare la vaccinurile comestibile produse de plante transgenice in de stabilirea metodelor optime de administrare i dozare, a tipului de rspuns imun i a duratei sale n cazul patogenilor de tipul Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, HIV sau virusul hepatitei murine. De asemenea, sunt examinate posibilitile de a mbunti exprimarea unor antigeni prin realizarea unor gene sintetice, ca n cazul subunitii B a enterotoxinei termolabile de la Escherichia coli: prin ndeprtarea din gena natural a unei secvene de nucleotide care determin prelucrarea ineficient sau degradarea prematur a proteinei heterologe n plant, s-a reuit o cretere de 3-14 ori a acumulrii antigenului n frunzele sau tuberculii de cartof transgenic, iar efectul antigenic s-a dovedit prin hrnirea oarecilor (Mason i colab., 1998). Experimente recente efectuate de Brennan i colab. (1999) au evideniat posibilitatea folosirii unor proteine antigenice derivate de la Staphylococcus sureus produse de plante
103
C. P. Cornea
transgenice ca vaccinuri orale sau nazale: prin administrarea la oareci a probelor respective i examinarea ulterioar a unor fluide recoltate de la animalele tratate (de la nivelul bronhiilor sau a intestinului) au fost detectate imunogloguline de tipul IgA i IgG specifice pentru antigenul folosit n toate fluidele testate. In paralel se realizeaz teste pe voluntari umani, pentru anumite tipuri de vaccinuri produse de plante: vaccin antidiareic ce conine o protein sintetic derivar de la subunitatea B a toxinei termolabile de E.coli, produs de plante de cartof transgenic; vaccin oral obinut din cartof care conine antigenul de suprafa al virusului hepatitei B (HbsAg); vaccin antidiareic (pentru formele de boal de origine viral) ((Walmsey i Arntzen, 2000). O a doua strategie interesant este clonarea n plante a genelor ce codific sinteza unor anticorpi specifici, pentru obinerea de anticorpi monoclonali vegetali. Producerea primului tip de anticorp recombinat sintetizat de plante a fost descris de Hiatt i colab.(1989). Experimentele realizate la tutun au presupus dou etape, urmrind clonarea separat, n plante diferite, a genelor ce codific lanul greu (catena H), respectiv uor (catena L), ce alctuiesc anticorpii (de exemplu, IgG1). Plantele transgenice au fost obinute prin utilizarea sistemului de transformare mediat de Agrobacterium tumefaciens. Cele dou tipuri de plante transgenice regenerate, una exprimnd catena H iar cealalt caten L, au fost ncruciate ntre ele i s-a examinat producerea de anticorpi funcionali (asamblai) de ctre plantele aprute n descenden (Figura 12).
Figura12. Prezentarea schematic a procedeului de obinere de anticorpi prin clonarea genelor codificatoare n celulele vegetale (adaptare dup Watson i colab. 1992).
Rezultatele obinute au fost ncurajatoare, n plantele transgenice descendente detectndu-se prezena anticorpilor funcionali, ei reprezentnd aproximativ 1-1,5% din totalul proteinelor celulare extrase din frunze. Mai mult, s-a dovedit c anticorpii funcionali au fost produi doar atunci cnd moleculele de ADNc ce codific cele dou tipuri de catene
104
ale unui anticorp conin o secven semnal derivat de la genele pentru anticorpi de oarece. Acest fapt sugereaz c echipamentul enzimatic al celulelor vegetale recunoate secvene leader heterologe, permind exprimarea genelor clonate sub controlul lor. Dei promitoare, aceste experimente sunt abia la nceput, fiind necesare studii suplimentare n vederea optimizrii producerii unor asemenea compui de ctre celulele vegetale, la nivel de bioreactor sau direct n cmp, la un pre de cost convenabil (Whitelam i colab., 1994). 2.4. Plante transgenice folosite pentru cercetri asupra unor procese fiziologice fundamentale Formarea esuturilor tumorale ca urmare a introducerii unor gene bacteriene n genomul vegetal prin transformarea realizat de bacteriile din genul Agrobacterium constituie un exemplu de modificare genetic natural a procesului de biosintez a fitohormonilor. Astfel, prin integrarea n genomul plantelor gazd a genelor bacteriene care induc sinteza anormal a acidului indolilacetic (IAA) i a citokininelor (CK) determin proliferarea necontrolat a celulelor vegetale. Pornind de la aceast observaie, au fost examinate cile de biosintez ale fitohormonilor vegetali precum i posibilitile de modificare controlat a lor n scopuri aplicative. Studiile efectuate asupra biosintezei de auxine au dovedit c aceasta este crescut n cazul plantelor transgenice ce conin gene bacteriene cum ar fi: tms de la A.tumefaciens genele aux de la A.rhizogenes sau genele iaaM i iaaH de la Pseudomonas syringae pv.savastanoi. Utilizarea drept plante test a speciilor Arabidopsis thaliana i Nicotiana tabacum a evideniat faptul c exist mai multe ci posibile de biosintez ale IAA, unele implicnd triptofanul ca intermediar iar altele presupunnd implicarea indolului sau a unor ali precursori timpurii. In cazul examinrii biosintezei citokininelor au fost nregistrate niveluri crescute n cazul plantelor transgenice ce conin gena ipt (pentru isopentenil transferaza) de la A.tumefaciens. Clonarea genei ipt sub controlul unor promotori variai (constitutivi, esutspecifici sau inductibili cum sunt cei indui prin oc termic sau prin aciunea cuprului) determin exprimarea variat a acesteia, consecina acumulrii CK fiind formarea de muguri laterali, pierderea dominanei apicale i reducerea formrii de rdcini (Hedden i Phillips, 2000). De asemenea, prin clonarea genei tzs de la A.tumefaciens (ce codific un fitohormon cu aciune similar produsului genei ipt) sub controlul unui promotor inductibil prin cldur, s-a obinut o secven notat hsp70-tzs care, introdus n plante de rapi, a determinat o cretere a nivelului transzeatinei i a condus la creterea numrului de semine per silicv (Roeckel i colb., 1998). O atenie special a fost acordat giberelinelor (GA) al cror nivel n plante poate fi controlat cu ajutorul unor substane chimice: prin inhibarea biosintezei GA este stimulat creterea unor plante, proces cu implicaii practice deosebite. De aceea, modularea exprimrii genelor ce codific biosinteza GA prin utilizarea plantelor transgenice asigur aplicaii importante n agricultur. Spre exemplu, supraexprimarea n plante transgenice de A.thaliana a uneia dintre genele pentru GA 20-oxidaza (enzim cheie n procesul de biosintez a GA) determin stimularea creterii plantelor, alungirea tulpinii i o nflorire precoce, fenomene asociate cu o acumulare de gibereline. De asemenea, s-a dovedit c sinteza enzimei GA 20oxidaza este codificat de cel puin trei gene diferite, care prezint variaii n ceea ce privete exprimarea. Astfel, plantele transgenice ce conin o gen antisens pentru gena normal At20ox1 prezint o reducere a alungirii tulpinii, fenotipul este de semi-piticism, iar nivelul GA este la o treime fa de normal; n schimb, plantele transgenice ce conin gena antisens pentru gena At20ox2 prezint o cretere normal dei internodiile sunt mai scurte iar plantele produc mai puine silicule. In cazul utilizrii genei antisens pentru At20ox3, are loc o reducere a lungimii hipocotilelor n cursul dezvoltrii rsadului dar, ulterior, planta se dezvolt normal.
105
C. P. Cornea
Concluzia acestor observaii este aceea c produii genelor menionate prezint inte tisulare diferite sau c influeneaz etape diferite ale procesului de dezvoltare fr a necesita promotori specifici (Coles i colab., 1999). Reducerea nivelului giberelinelor la diferite plante de interes se poate realiza i pe alte ci, utilizndu-se tot plante transgenice. Astfel, clonarea n planta test A.thaliana a genei pentru o GA 20-oxiadaz de la fasole i asigurarea condiiilor de supraexprimare determin producerea de plante pitice. Fenomene similare au fost evideniate i n cazul plantelor transgenice de Solamun dulcamara ce exprim gena pentru aceeai enzim izolat de la pepene (Hedden i colab., 1999). O alt substan produs de plante care, prin controlul biosintezei sale, determin aplicaii practice deosebite este etilena. Astfel, plante transgenice de tomate, pepene, brocoli sau de Torenia fournieri (plant ornamental) n care a fost introdus o gen antisens care blocheaz funcionarea genei pentru ACCS (1-aminociclopropan-1-carboxilat sintetaza) sau ACCO (1-aminociclopropan-1-carboxilat oxidaza) prezint modificri legate de procesul de nflorire i de coacere (Hedden i Phillips, 2000). Studii genetice recente asupra unor plante transgenice au permis realizarea unor progrese semnificative legate de rolul brasinosteroizilor i de identificarea genelor ce i codific (Chory, 1999). Astfel, clonarea genei BAS1 de la Arabidopsis i asigurarea condiiilor de supraexprimare a acesteia n plante de tutun determin reducerea nivelului de brasinosteroizi i producerea de plante pitice (Nef i colab, 1999). De asemenea. cercetrile complexe efectuate asupra biosintezei diferiilor hormoni produi de plante i a interaciunilor dintre acetia pentru controlul proceselor fiziologice normale au condus la o serie de observaii interesante: modificarea nivelului de exprimare a unui hormon afecteaz i nivelul altora, astfel c influenele fiziologice sunt greu de estimat. De exemplu, IAA i CK i inhib reciproc sinteza, iar IAA stimuleaz sinteza de etilen. La plantele transgenice de tutun s-a evideniat c auxina induce prelucrarea post-transcripional a enzimei o-xilosiltransferaza care determin blocarea citokininelor. In concluzie, prelucrarea genelor ce codific enzimele implicate n biosinteza fitohormonilor demonstreaz posibilitatea obinerii de plante transgenice care s prezinte niveluri mai ridicate sau mai sczute ale acestor hormoni, n funcie de scopul urmrit cu aceste plante. Plantele rezultate, ce prezint modificri ale procesului de dezvoltare sau ale rspunsurilor fa de condiiile de mediu, pot avea aplicaii comerciale astfel c pentru o reglare mai eficient a proceselor respective genele de interes sunt clonate sub controlul unor promotori inductibili sau esut-specifici. Cu toate acestea, deoarece interaciunile dintre fitohormoni determin efecte pleiotropice neateptate n plantele transgenice, sunt necesare studii suplimentare pentru nelegerea i controlul acestor procese. De asemenea, reglarea exprimrii transgenelor reprezint un element de baz att pentru cercetrile fundamentale de biologie molecular vegetal ct i pentru aplicaiile biotehnologice. Modalitile de reglare sunt variate, un loc aparte fiind deinut de sistemele inductoare reprezentate de diferite substane chimice care acioneaz asupra genei de interes (int), activnd-o sau inactivnd exprimarea sa. Utilitatea promotorilor inductibili a fost deja demonstrat prin elaborarea unui sistem de transformare genetic fr a folosi gene marker de selecie i prin utilizarea unui numr variat de transgene. In plus, aplicaiile practice par a fi promitoare prin utilizarea ca inductori a unor compui agrochimici nregistrai. Aceasta ar permite activarea n cmp a funcionrii anumitor gene de interes prin folosirea unei substane specifice ceea ce ar elimina pierderile firmelor productoare de semine transgenice datorate fermierilor care pstreaz o parte din recolt pentru nsmnrile din anul urmtor (Gatz, 1998). Sistemele inductoare de acest tip pot aciona n sensul activrii unor recombinaze specifice care s determine anumite remodelri ale ADN nuclear al plantelor transgenice.:
106
n funcie de conformaia situsul de legare pentru recombinaz, ADN int (inclusiv transgena) poate fi activat sau inactivat. In mod similar, ele pot aciona asupra unor organe specifice activnd transgenele doar la nivelul esutului tratat (prin intermediul unor factori de transcriere particulari). In acest caz, exprimarea genelor este temporar (Zuo i Chua, 2000). 3. Da
sau nu plantelor transgenice?
In cadrul biotehnologiilor vegetale, obinerea i mai ales utilizarea practic a plantelor transgenice constituie subiectul unor controverse att ntre diveri membri ai comunitii tiinifice ct i ntre acetia i o serie de organizaii neguvernamentale din diverse ri. Adversarii plantelor transgenice s-au concentrat asupra a dou direcii principale: impactul asupra omului a consumului de produse alimentare rezultate din organisme modificate genetic (deci i din plante transgenice) i consecinele eliberrii organismelor vegetale modificate genetic asupra mediului. Testarea n cmp n 1986 a primelor plante transgenice i apoi extinderea i diversificarea experimentelor cu alte tipuri de asemenea plante modificate genetic, a fost considerat de unii specialiti i de o parte a publicului larg (mai mult sau mai puin instruit n ceea ce privete principiile tehnologiei ADN recombinant utilizat pentru obinerea acestor organisme) drept o adevrat deschidere a unei noi cutii a Pandorei. Ceea ce se reproeaz deseori cercettorilor care lucreaz n domeniul tehnologiei ADN recombinant aplicat plantelor este c modific natura n mod artificial, nclcnd astfel regulile naturale. Dovedirea, ns, a faptului c depirea barierelor interspecifice prin transferul de gene ntre organisme nenrudite (transfer pe orizontal) nu este invenia omului ci este un fenomen care este ntlnit n natur (a se vedea transformarea celulelor vegetale de ctre bacteriile din speciile Agrobacterium tumefaciens i A.rhizogenes) vine s contrazic acuzaia menionat. Ceea ce st ns n picioare este faptul c, cel puin teoretic exist posibilitatea transferrii transgenelor din plantele modificate genetic la plante nrudite din flora spontan. Se cunoate c multe plante de interes agronomic sunt, n plan reproductiv, izolate de restul plantelor din flora spontan deoarece ele provin din alte regiuni dect cele n care se cultiv (de exemplu, porumbul sau cartoful pentru Europa), astfel c poluarea genetic de care se face caz nu este posibil (Tourte, 1998). Un scenariu mai recent, elaborat de unii cercettori, care ns nu se bazeaz pe dovezi concrete ci doar pe supoziii, consider c folosirea vectorilor virali pentru transferul de gene ar face posibil diseminarea transgenelor n natur nu numai la plante variate ci chiar i la alte organisme (de exemplu, microorganisme patogene), acestea dobndind caractere noi (Ho, 2001). Cu toate acestea, pn n prezent nu au fost obinute date concludente asupra existenei transferului pe orizontal a genelor exogene de la plantele cultivate la cele de tip slbatic. Absena dovezilor din prezent nu nseamn c fenomenul trebuie exclus; din contr, este necesar o permanent monitorizare a posibilitii diseminrii pentru a se putea lua msurile corespunztoare dac acest lucru s-ar produce. O alt problem care este pus frecvent se refer la influena transgenelor asupra omului. Dou ntrebri apar mai frecvent n mass media: sunt plantele transgenice toxice pentru om i animale? sau, exist posibilitatea transferului transgenelor din esuturile vegetale transformate la om? Rspunsul la aceste ntrebri nu este att de simplu ct ar prea la prima vedere. nc din Antichitate nelepii i-au pus deseori problema de ce, de exemplu, iepurele care mnnc n principal morcovi nu se transform n morcov, sau omul care se hrnete cu o gam variat de alimente nu mprumut din nsuirile acestora. In prezent, la aceast dilem se adaug i genele de interes introduse n diferite plante de cultur care sunt utilizate n alimentaie. Explicaia absenei dovezilor referitoare la acest transfer (genom vegetal genom
107
C. P. Cornea
uman) se datoreaz proceselor de prelucrare la care sunt supuse alimentele n corpul uman, n urma crora ADN este i el degradat pierzndu-i nsuirile transformate. In ceea ce privete posibilitatea toxicitii unor produse alimentare obinute din organisme modificate genetic, aici lucrurile nu sunt excluse, date fiind unele accidente aprute n urma consumului unor alimente provenite din materii prime insuficient controlate, fiind necesare studii extrem de laborioase asupra clarificrii acestor aspecte. De altfel, att pe plan internaional ct i naional au fost elaborate o serie de documente legislative care reglementeaz utilizarea organismelor modificate genetic pentru obinerea de alimente de uz uman, fiind unanim acceptat ideea etichetrii obligatorii a produselor de acest tip. Se ofer consumatorului, n acest fel, posibilitatea de opiune n vederea utilizrii sau nu a produselor obinute din materii prime de origine transgenic. Spre exemplu, recent s-a aprobat utilizarea plantelor de porumb transgenic ce conin gena pentru proteina insecticid Cry (derivat de la B.thuringiensis) dar numai pentru hrana animalelor i pentru prelucrare industrial, nu i pentru consumul uman deoarece exist posibilitatea ca proteina respectiv s fie alergen (Hileman, 2002). De asemenea, pentru a elimina posibilitatea ca anumite substane produse de organismele modificate genetic s produc alergii dar, n acelai timp s nu se exclud utilizarea acestora, multe instituii naionale sau internaionale iau msuri pentru elaborarea de teste rapide i eficiente de identificare a posibililor compui alergeni sau duntori. Cu toate acestea, indiferent de curentele de opinie potrivnice obinerii i utilizrii plantelor transgenice, avantajele oferite de aceast tehnologie modern sunt certe. Aa cum s-a prezentat pe parcursul acestui material, transgeneza la plante joac un rol esenial n cunoaterea i analiza genomului vegetal, n controlul procesului de dezvoltare, n nelegerea metabolismului plantelor. De asemenea, aplicarea tehnologiei ADN recombinant plantelor de cultur n vederea obinerii de noi soiuri cu caracteristici utile din punct de vedere economic constituie un demers economic cu implicaii deosebite, benefice. De altfel, perfecionarea permanent a tehnicilor moleculare aplicate, a diversificrii cunotinelor asupra structurii i funcionrii materialului genetic constituie argumente convingtoare pentru continuarea i aprofundarea experimentelor de inginerie genetic la plante, astfel c noile generaii de plante transgenice obinute vor fi sigure att pentru mediul nconjurtor ct i pentru om.
Bibliografie selectiv
1. Altman, A., 1999, Plant biotechnology in the 21st century: the challenges ahead, EJB, 2, 2. 2. Carozzi,N., WarrenW., Rice,D.A., Evola,S., Koziel,M.G., 1992, Expression of chimeric CaMV 35S Bacillus thuringiensis insecticidal protein gene in transgenic tobacco, Plant Molec.Biol., 20, p.539-548. 3. Cucu, N., Stefan, M., Mitru, M, Gavril, L., 1998, Modification of plant genome by genetic transformation: interaction of alogenes with the host genome, n Implicaii tiinifice i bioetice n analiza i manipularea genomului, Edit.Ars Docendi, p.161-169 4. Gatz,C., 1997, Chemical control of gene expression, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol., 48, p.89-108. 5. Gold, J., Harder, D., Smith, F., Aung, T, Procunier, J., 1999, Development of a molecular marker for rust resistance genes Sr39 and Lr35 in wheat breeding lines, EJB., 2, nr.1. 6. Hedden, P., Phillips, A. L., 2000, Manipulation of hormone biosynthetic genes in transgenic plants, Current Opinion in Biotechnology, 11, p.130-137. 7. Hileman, B., 2002, Whats hiding in transgenic foods? Chemical Eng. news, ian. 2002, p. 20-2.
108
8. Ho, M. W., 2001, Horizontal gene transfer the hidden hazards of genetic engineering, Institute of Science in Society. 9. Martinelli, L., Mandolino, G., 1994, Genetic transformation and regeneration of transgenic plants in grapevine (Vitis rupestris), Theor. Appl. Geneti., 88, p.621-628 10. Riva, G. A., Cabrera, J. G., Padron, C. A., 1998, Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation, EJB, 1, nr.2. 11. Robinson,J., 1999, Ethics and transgenic crops, Electronic Journal of Biotechnology, 2, nr.2. 12. Sharma, H. C., Sharma, K. K., Seetharama, N., Ortiz, R., 2000, Prospects for usig transgenic resistance to insects in crop improvement, EJB, 3, nr.2. 13. Tinland, B., 1996, The integration of T-DNA into plant genomes, Trends in Plant Science, 1., nr.6.p.178-183. 14. Tourte, Y., 1998, Genie genetique et biotechnologie: concepts et methodes, Edit.Dunod 15. Walmsley, A. M., Arntzen, C. J., 2000, Plants for delivery of edible vaccines, Current Opinion in Biotechnology, 11, p.121-129. 16. Watson, J. D., Gilman, M., Witkowski, J., Zoller, M., 1992, Recombinant DNA, Scientific Academic Books. 17. Weising, K., Kahl., G., 1996, Natural genetic engineering of plant cells: the molecular biology of crown gall and hairy root disease, World J. Microbiol.Biotechnol., 12, p.327351. 18. Whitelam, G. C., Cockburn,W., Owen, M. R. L., 1994, Antibody production in transgenic plants, Biochem. Society Transact., 22., p.940-943. 19. Zuo, J., Chua, N. H., 2000, Chemical inducible systems for regulated expression of plant genes, Current Opinion in Biotechnology, 11, p.146-151.
109

Modificarea Genetica A Plantelor

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Modificarea Genetica A Plantelor

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Modificarea genetic a plantelor: Principii generale de realizare.

generale privind obinerea plantelor transgenice

Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse

Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse

Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse

Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse

Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse

Figura 7. Tehnica utilizrii vectorilor binari (dup Tourte, 1998).

Figura 8. Reprezentarea schematic a vectorului binar Bin19 (dup Tourte, 1998).

Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse

Figura 9. Harta genetic a plasmidei pBI121. 95

ale transgenezei la plante

Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse

Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse

Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse

Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse

Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse

Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse

sau nu plantelor transgenice?

Modificarea genetic a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaii; Controverse

S-ar putea să vă placă și