LOGO

CURSUL III

1.3. STABILIREA
DIAGNOZEI BOLILOR LA
PLANTE
 Cuprins

1.3 Noţiuni introductive

1.3.1 Diagnosticarea virozelor

1.3.2 Diagnosticarea bacteriozelor

1.3.3. Diagnosticarea ciupercilor

 1.3. Noţiuni introductive

Sub acţiunea agenţilor fitopatogeni, plantele suferă modificări

morfologice, anatomice, citologice, biochimice şi fiziologice care
determină şi caracterizează starea de boală.

Plantele bolnave prezintă simptome mai mult sau mai puţin evidente şi
caracteristice, determinate atât de agentul fitopatogen cât şi de reacţia
plantei gazdă în corelaţie cu factorii de mediu.

În câmp, plantele bolnave se recunosc printr-o înfăţişare în general

modificată faţă deplantele sănătoase.

Unele modificări suferite de plantele atacate în primele stadii ale infecţiei

au un caracter trecător şi pot fi sesizate numai în anumite condiţii, altele
sunt persistente, tipice, evidente.
 1.3.Noţiuni introductive

Pentru determinarea precisă a bolilor, este necesar să se

urmărească:
apariţia simptomelor

analizarea un număr corespunzător de plante

o perioadă de mai multe zile,

în condiţii diferite de mediu.

Plantele bolnave se observă cu ochiul liber, comparativ cu cele

sănătoase, apoi se recoltează şi se analizează mai amănunţit
simptomele cu ajutorul lupei şi fructificaţiile cu ajutorul microscopului.
 1.3. Noţiuni introductive

Diagnosticarea corectă a bolilor numai pe baza analizelor

macroscopice, adesea nu este posibilă, fiind necesară
determinarea agenţilor fitopatogeni în laborator pe baza unei
tehnici şi aparaturi speciale.

Metodica de determinare a agenţilor fitopatogeni variază în

funcţie de natura acestora, fiind diferită pentru ciuperci, bacterii
şi virusuri.
 1.3.1. Diagnosticarea virozelor
Diagnosticarea virozelor se poate realiza prin:

a. Examenul macroscopic al simptomelor.

b. Metoda testării. În fitovirologie se foloseşte

frecvent testarea serologică şi testarea biologică.

c. Modul de transmitere, poate servi ca

bază de determinare.

d. Determinarea pe baza însuşirilor specifice ale

virusurilor.

e. Determinarea virusurilor cu ajutorul

microscopului electronic

f) Testul PCR - reacţia în lanţ a polimerazei pentru

sinteza fragmentelor de AND.
 1.3.1. Diagnosticarea virozelor
a. Examenul macroscopic al simptomelor.

Simptomele virozelor de multe ori sunt comune sau latente şi stabilirea

diagnozei numai pe baza acestora adesea este imposibilă.

Din această cauză în determinarea virozelor se folosesc diferite

metode mai simple sau mai pretenţioase, care necesită aparatură,
laboratoare şi sere special amenajate.

b. Metoda testării.
În fitovirologie se foloseşte frecvent
testarea serologică şi testarea biologică.

Testarea serologică  constă în aducerea în contact a sucului plantei

de analizat cu un antiser specific, urmărind apoi reacţia antiserului
care va fi pozitivă în cazul când planta este atacată de specia
respectivă de virus sau negativă, când planta este liberă de virus.
 1.3.1. Diagnosticarea virozelor
Metodica testării serologice.
Din organul plantei ce se analizează, se obţine cu
presa de mână, suc din care se pun două picături
mici pe o lamă de microscop

Lângă picătura din stânga se plasează o picătură de

antiser, iar lângă cea din dreapta una de ser normal.

Picăturile alăturate se amestecă cu câte un beţişor, se

aşteaptă 30-60 secunde, apoi la marginea picăturii cu
antiser se urmăreşte cu ochiul liber sau cu lupa reacţia,
care poate fi de precipitare sau aglutinare.

Picătura cu serul normal nu trebuie să prezinte

reacţia. În cazul când aglutinarea sau precipitarea
se observă şi laaceastă picătură, serul a fost
alterat. În aceste cazuri, testarea trebuie repetată.
 1.3.1. Diagnosticarea virozelor

Testarea biologică.

Stabilirea diagnozei se face cu

ajutorul plantelor test, crescute în
condiţii speciale.

Plantele test inoculate cu sucul

plantei ce urmează a fi analizată, prin
apariţia leziunilor caracteristice, indică
prezenţa sau absenţa virusului
respectiv în plante.

Inocularea unei plante folosid un

pistil. Se observă cum întraga
planta este susţinută în palmă.
 1.3.1. Diagnosticarea virozelor
c. Modul de transmitere

fiind caracteristic speciilor sau grupelor de virusuri, poate

servi ca bază de determinare.

d. Determinarea pe baza însuşirilor specifice ale virusurilor

Pentru identificarea virusurilor, frecvent se foloseşte stabilirea

următoarelor însuşiri, care sunt caracteristice speciilor:

temperatura de inactivare în 10 minute;

gradul de diluţie în care îşi păstrează capacitatea de

infecţiozitate

longevitatea păstrării capacităţii de infecţiozitate in vitro la

temperatura camerei.
 1.3.1. Diagnosticarea virozelor
e. Determinarea virusurilor cu ajutorul microscopului electronic

este o metodă modernă în studierea virusurilor, care însă necesită

aparatură şi tehnică specială.

la microscopul electronic se stabileşte forma, mărimea şi alte caractere ale

particulelor virale.

cea mai rapidă, modernă şi precisă metodă de diagnostic a virusurilor este

testul imunoenzimatic ELISA, care presupune dotarea laboratoarelor cu
aparatură specifică performantă.

f. Testul PCR - reacţia în lanţ a polimerazei pentru sinteza

fragmentelor de AND.

Tehnica de amplificare enzimatică in vitro, cunoscută sub numele de

PCR (Polymerase chain reaction) permite creşterea într-o manieră
considerabilă a cantităţii de ADN de care se dispune iniţial.
1.3.1. Diagnosticarea virozelor
 1.3.1. Diagnosticarea virozelor
În practică, amplificarea are loc într-un microtub în care sunt plasate împreună
elementele necesare reacţiei.

Etapele procesului:

denaturarea permite separarea celor două tipuri de ADN (1 minut/95°C);

durează aproximativ două minute, cu trecere de la

hibridarea temperatura de 37°C la 50°C, în funcţie de compoziţia şi
lungimea seg mentelor, în timpul căreia aceste
segmente apar cu frecvenţele lor complementare,
încadrând regiunea de multiplicat;

extensia (10 minute/70-72°C) conduce la sinteza unor secvenţe

complementare a fratelui matrice, în prezenţa enzimei
recopiind ADN-ul pornind de la precursori.

Repetarea mai multor cicluri denaturare-hibridare-replicare (în medie 20-

40 cicluri) conduce a acumularea exponenţială a ADN-ului.
 1.3.2. Diagnosticarea bacteriozelor
Cele mai multe şi cele mai recente sisteme de clasificare bacteriană grupează
bacteriile numai în familii sistematice, în cadrul încrengăturii Bacteriophyta.
Conform acestor sisteme, bacteriile fitopatogene sunt grupate în diferite
familii precum: Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Enterobacteriaceae,
Corynebacteriaceae şi Streptomycetaceae

a. Examenul macroscopic al simptomelor.

b. Examenul microscopic al bacteriilor.

Diagnosticarea
c. Determinarea in vitro a bacteriilor.
bacteriozelor

d. Determinarea temperaturii letale.

e. Infecţii artificiale.
 1.3.2. Diagnosticarea bacteriozelor
a. Examenul macroscopic al simptomelor.

Examinarea simptomelor este prima treaptă în diagnosticarea bacteriilor.

Stabilirea precisă a diagnozei numai pe baza simptomelor, adesea nu este
posibilă, ea trebuie să fie completată cu examinarea agentului patogen.
În acest scop, o serie de metode de determinare, folosite în bacteriologia
generală sau numai în fitobacteriologie, ne stau la dispoziţie.

b. Examenul microscopic al bacteriilor.

Bacteriile se examinează în preparate native sau fixe, colorate.

Preparatele se pot executa fie direct din leziune, folosind o cantitate
mică de ţesut atacat sau exsudat, fie din culturi pure.
Prin examenul microscopic se stabileşte: forma bacteriilor; mărimea
bacteriilor, prin măsurători micrometrice; prezenţa sau absenţa cililor;
numărul şi poziţia cililor; prezenţa sau absenţa capsulei; reacţia Gram a
bacteriilor.
 1.3.2. Diagnosticarea bacteriozelor

c. Determinarea in vitro a bacteriilor.

În acest scop se izolează bacteriile din leziuni, apoi se cultivă pe

medii, realizând culturi pure.

În studierea bacteriilor fitopatogene se folosesc medii naturale sau

artificiale, lichide sau solide.

Ca medii naturale solide se folosesc frecvent felii de cartof, bucăţi

de morcov, iar ca medii lichide, laptele sau extractul de porumb.

Mediile artificiale pot fi organice, preparate din decocturi vegetale,

extracte din plante, bulion de carne sau pot fi sintetice.

Pentru obţinerea mediilor solide se folosesc agarul sau gelatina.

 1.3.2. Diagnosticarea bacteriozelor
d. Determinarea temperaturii letale.

 Bacteriile izolate în suspensii apoase, se supun la diferite

trepte de temperatură, apoi se repică pe mediu agarizat,
stabilind temperatura maximă la care au rezistat şi care este
caracteristică speciilor.

e. Infecţii artificiale.

Prin executarea infecţiilor artificiale la plante se urmăreşte

obţinerea aceloraşi simptome care erau prezente pe planta de
pe care s-a izolat bacteria.
1.3.3. Diagnosticarea ciupercilor fitopatogene
Studiul ciupercilor fitopatogene se face cu ajutorul lupei şi
microscopului direct pe substratul pe care se dezvoltă
acestea în natură sau în culturi artificiale pe medii.

Examinarea cu lupa de mână sau binoculară permite

obţinerea unor date orientative asupra aparatului vegetativ
şi fructificaţiilor ciupercii.

Cu ajutorul microscopului se fac cercetări amănunţite

privind structura, forma, mărimea, culoarea şi alte caractere
anatomo-morfologice ale aparatului vegetativ şi
fructificaţiilor ciupercilor. În acest scop se pregătesc
preparate microscopice, native, simple, prin recoltarea
fructificaţiilor sau miceliului ciupercilor sau prin executarea
secţiunilor organelor atacate ale plantelor.