7.

Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice ( MI

Popa, Gabriela Loredana Popa)
Testarea sensibilităţii la medicamentele antimicrobiene se realizează (din punct de vedere
didactic) în ultima etapă a diagnosticului de laborator microbiologic, pentru majoritatea
microorganismelor implicate etiologic. Testarea este necesară datorită apariţiei şi extinderii
rezistenţei microorganismelor la antibiotice şi chimioterapice. Rezistenţa poate fi naturală sau
dobândită. Rezistenţa naturală este determinată genetic. Rezistenţa dobândită este
„achiziţionată” de anumite subpopulaţii dintr-o anumită specie microbiană, în circumstanţe
date, ex. prin „presiunea de selecţie” exercitată de antibiotic.
Noţiuni privind evaluarea sensibilităţii la agenţi antimicrobieni
În general, o tulpină poate fi considerată sensibilă atunci când germenii sunt în mod eficient
afectaţi de către antibiotic, iar efectul terapeutic poate fi obţinut cu doze şi pe căi de administrare
„obişnuite”. Tulpina va fi considerată moderat sensibilă dacă germenii sunt afectaţi într-o
măsură mai mică, iar efectul terapeutic nu poate fi obţinut decât în condiţii speciale (ex.
prescrierea unor doze mai mari decât cele „obişnuite”, calculate de exemplu pe kilogram/corp;
utilizarea unor căi de administrare speciale / injectare intravenoasă, intrarahidiană etc). În mod
absolut se consideră că o tulpină este rezistentă dacă rezultatul testării sensibilităţii in vitro este
negativ. Totuşi, trebuie să avem în vedere că între rezultatele „in vitro” şi efectul „in vivo” pot
exista diferenţe.

7. 1. Metode de testare a sensibilităţii bacteriilor la agenţi antimicrobieni

Deoarece între rezultatele testării „in vitro” şi efectul terapeutic „in vivo” pot exista
anumite diferenţe, metodele de testare a sensibilităţii pot fi diferenţiate în: a. metode de testare
a sensibilităţii „in vitro”;
b. metode „in vivo” (metode care ţin cont de relaţia agent terapeutic-infecţie).
7. 1. 1. Metode de testare a sensibilităţii in vitro
Antibiograma face parte din prima categorie de metode menţionate. Reprezintă metoda de
laborator prin care se apreciază sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltaţi de la bolnavii
cu infecţii bacteriene, după cultivare pe medii îmbogăţite, care să permită dezvoltarea optimă a
microorganismului pentru care se efectuează testarea (de exemplu pe agar Mueller
Hinton).
Pentru antibiograme trebuie să folosim culturi pure (reprezentând o singură tulpină
bacteriană), chiar în cazul infecţiilor multibacteriene. Cele mai frecvent utilizate tehnici sunt:
Tehnicile calitative
antibiograma difuzimetrică comună (cu discuri)
antibiograma difuzimetrică comparativă
antibiograma difuzimetrică standardizată
antibiogramele difuzimetrice rapide
Tehnicile cantitative
metoda diluţiilor în mediu lichid
metoda diluţiilor în agar
metoda microdiluţiilor în agar
metoda „punctelor de ruptură”
testul „E”
metode şi sisteme comerciale, automatizate, de testare etc.
7. 1. 1. 1. Antibiograma difuzimetrică comună
Din punct de vedere tehnic însămânţăm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar
Mueller-Hinton) turnat în plăci Petri. Însămânţarea se poate realiza de exemplu prin
„inundarea” plăcii urmată de aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul unui
tampon (există şi alte variante tehnice). După circa 20 minute (timp în care placa Petri se lasă
cu capacul întredeschis în vecinătatea becului de gaz, aprins) se aplică microcomprimatele în
care sunt încorporate antibiotice în concentraţie standardizată. Aplicarea microcomprimatelor
se poate face cu ajutorul unei pense, în condiţii aseptice, sau cu ajutorului un aplicator „automat”
(la minim 30 mm distanţă între ele şi minim 15 mm de marginea plăcii; vom utiliza 5 antibiotice
diferite pentru o placă Petri cu diametrul de 9 cm). Microcomprimatele trebuie să vină în contact
perfect cu mediul, motiv pentru care, cu ajutorul unei pense le presăm uşor (după caz). După
încă 15-20 minute, incubăm plăcile peste noapte în termostat, la 28 sau 35- 37°C, în funcţie de
temperatura optimă de multiplicare a microorganismului testat. Antibioticul eliberat din
microcomprimat difuzează în mediu, realizând zone de inhibiţie în care coloniile microbiene
nu se dezvoltă. Cu cât zona de inhibiţie este mai largă, cu atât germenul va fi considerat mai
sensibil. Dacă în interiorul zonei de inhibiţie (chiar dacă diametrul înregistrat este foarte mare)
se dezvoltă colonii, „mutanţi rezistenţi”, germenul va fi considerat rezistent.
Această metodă, cu toate că este folosită pe scară largă în laboratoare, permite de fapt numai
eliminarea antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor foarte active,
pentru că tehnica nu este standardizată.
7. 1. 1. 2. Antibiograma difuzimetrică comparativă (Stokes, Balş)
Se efectuează pentru microorganismul de testat în paralel cu un microorganism de
referinţă, din aceeaşi specie (sau o specie asemănătoare). Spre exemplu, pentru cocii Gram
pozitivi putem alege pentru comparaţie o tulpină de Staphylococcus spp. Tulpina de referinţă
are o sensibilitate cunoscută la diferitele antibiotice pe care le utilizăm.
Prin această metodă se înlătură o parte din factorii de eroare ai metodei precedente, spre ex.
calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor fi identice pentru
microorganismul de referinţă şi pentru microorganismul testat. Rezultatele se exprimă cu
termenii: „sensibil”, „intermediar”, „rezistent”, în funcţie de diametrul zonelor de inhibiţie a
multiplicării celor doi germeni, faţă de acelaşi antibiotic (jumătăţile de cerc se examinează
comparativ). În cazul în care cunoaştem CMI (concentraţia minimă inhibitorie) a
microorganismului de referinţă, putem face aprecieri cu privire la CMI pentru
microorganismul testat.
Din punct de vedere tehnic, pe o placă de forma unui pătrat („împărţită” în 3 zone egale
marcând pe partea externă a plăcii liniile de demarcaţie) se inoculează în treimea medie
microorganismul de referinţă iar în treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru care
dorim să realizăm testarea. Inoculul trebuie să fie astfel realizat încât să conducă la apariţia după
incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care să nu fie confluente. Plasăm
microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaţie dintre culturi. Incubăm peste noapte
la 35-37°C urmând ca în ziua următoare să citim şi să interpretăm rezultatele.
7. 1. 1. 3. Antibiograma difuzimetrică standardizată (Kirby-Bauer, NCCLS) Din
punct de vedere tehnic se realizează asemănător cu prima metodă prezentată, dar este
standardizată, fiind singura metodă difuzimetrică recunoscută pe plan internaţional, care
permite obţinerea unor rezultate reproductibile şi corelabile între laboratoare diferite.
Elementele necesare standardizării sunt:
mediul (în majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru că are o valoare nutritivă
corespunzătoare şi nu conţine substanţe cu acţiune inhibitoare)
există elemente minerale care trebuie adăugate în cazul testării anumitor
microorganisme (ex. Mg2+ şi Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas
aeruginosa, atunci când este testată sensibilitatea la aminoglicozide);
se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins între 7,2 şi 7,4);
există suplimente nutritive care trebuie adăugate în cazul testării unor
microorganisme pretenţioase;
grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm (25 ml de mediu / placă de 9 cm);
inoculul, care se obţine de preferat din 5 colonii izolate (cultură pură) şi trebuie să aibă o
turbiditate corespunzătoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland (circa 108unităţi
formatoare de colonii / ml) în majoritatea cazurilor;
 timpul de incubare (în majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37°C, nu mai mult de 2-3 plăci
suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare;
concentraţia substanţelor antimicrobiene din microcomprimate şi dimensiunea
microcomprimatelor (6 mm diametru);
alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea;
păstrarea plăcilor cu mediu până în momentul utilizării (maxim 7 zile, în pungi de polietilenă,
la +4°C);
utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate;
interpretarea rezultatelor (se măsoară diametrul zonei de inhibiţie şi se compară rezultatele cu
cele din tabelele puse la dispoziţie de producători şi / sau centrele de referinţă). Metodele
difuzimetrice au dezavantajul că nu permit aprecierea concentraţiilor eficace ale antibioticului
la nivelul focarului infecţios.
7. 1. 1. 4. Metoda diluţiilor în mediu lichid
Oferă informaţii cu privire la CMI ale antibioticelor studiate, faţă de microorganismul testat.
CMI = concentraţia minimă inhibitorie, reprezintă cea mai mică concentraţie de agent
antimicrobian, exprimată în micrograme / ml., care mai exercită o acţiune bacteriostatică asupra
germenului testat.
Din punct de vedere tehnic, pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe tuburi cu
bulion Mueller-Hinton în concentraţii descrescânde (diluţii binare) pornind spre ex. de la 32
micrograme / ml şi până la 0,125 micrograme / ml, în total 8 tuburi, plus 2 tuburi martor, fără
antibiotic (cantitatea finală va fi de 1 ml în fiecare tub). Preparăm un inocul standardizat
turbidimetric şi în condiţii aseptice inoculăm toate cele 10 tuburi, cu câte 1 ml de inocul. Agităm
pentru a omogeniza. Incubăm cele 8 tuburi cu antibiotice şi 1 tub martor timp de 16- 20 ore la
35-37°C iar al doilea tub martor îl menţinem pentru aceeaşi perioadă la temperatura frigiderului.
Pentru controlul de calitate utilizăm şi un şir de tuburi pe care le inoculăm cu o tulpină de
referinţă corespunzătoare. În ziua următoare citim şi interpretăm rezultatele. Deoarece am
utilizat o cantitate de inocul egală cu cantitatea de mediu, concentraţia finală de antibiotic se va
înjumătăţi (de ex. în tubul în care diluţia iniţială a fost de 32 μg / ml, diluţia finală va fi 16 μg /
ml). În tubul martor menţinut la +4°C ar trebui să nu fie prezentă creşterea, în tubul martor
menţinut la 35-37°C creşterea trebuie să fie prezentă. În tuburile inoculate cu tulpina de referinţă
trebuie să avem rezultatul corespunzător datelor pe care le cunoaştem privitor la respectiva
tulpină. În tuburile cu microorganismul testat, ultima diluţie care a inhibat dezvoltarea
microorganismului corespunde CMI. Se consideră (în general, pentru că CMI diferă în funcţie
de specia microbiană) că microorganismele în cazul cărora CMI este ≤ 3 μg / ml vor fi eficient
inhibate de către antibioticul respectiv şi in vivo.
CMI nu are aceeaşi valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. De ex. CMI la
amoxicilină în cazul unor tulpini sensibile este de 0,1 μg / ml pentru Staphylococcus aureus,
0,03 μg / ml pentru Streptococcus pneumoniae, 0,25 μg / ml pentru Haemophilus influenzae, 2
μg / ml pentru E. coli, 16 μg / ml (şi practic aceasta semnifică „rezistenţă in vivo”) pentru
Bacteroides fragilis iar în cazul Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa sau
Chlamydia trachomatis tulpinile sunt rezistente.
7. 1. 1. 5. Determinarea CMB (concentraţia minimă bactericidă)
Pornind de la rezultatul obţinut prin metoda diluţiilor în mediu lichid, se vor utiliza ca sursă
de inocul tuburile în care dezvoltarea microbiană a fost inhibată. Este necesară o placă Petri cu
agar Mueller-Hinton care va fi împărţită în sectoare, numărul de sectoare fiind corespunzător
numărului de tuburi fără creştere microbiană. Însămânţăm în condiţii aseptice din fiecare tub
fără creştere microbiană, fiecare în sectorul de placă corespunzător. Incubăm pentru 16-18 ore
la 35-37°C. CMB va corespunde ultimei concentraţii de antibiotic care a distrus
microorganismele însămânţate (sectoare de placă fără apariţia culturii). Se consideră că
antibioticul va fi eficient in vivo dacă în serul pacientului se pot atinge concentraţii de antibiotic
care să depăşească de 4-8 ori CMB.
Determinarea CMI şi CMB este extrem de importantă pentru aprecierea eficacităţii
antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. Pentru tratamentul infecţiilor
severe (de exemplu endocardite, meningite, septicemii etc), precum şi la imunodeprimaţi,
efectuarea acestei metode este indispensabilă.
7. 1. 1. 6. Metoda „punctelor de ruptură”
Metoda este practicată de multe dintre laboratoarele din Europa de Vest, mai ales dacă
volumul de muncă este mare sau foarte mare. Prin această metodă se pot testa mai multe
microorganisme, în acelaşi timp. Antibioticele sunt incorporate în mediul de cultură, la o
anumită concentraţie „limită”, în funcţie de cunoştinţele şi datele acumulate în ceea ce
priveşte activitatea „in vivo” a respectivelor medicamente. Plăcile sunt inoculate simultan cu
mai multe tulpini bacteriene, în „spot”, folosind un inoculator construit special, sunt incubate
în condiţii corespunzătoare pentru 16-18 ore. În cazul în care tulpina sau tulpinile din
diferitele specii bacteriene nu se dezvoltă la această concentraţie „limită” de antibiotic
(considerată ca fiind eficace „in vivo”), bacteria izolată este considerată sensibilă. În cazul în
care bacteria se dezvoltă (apare cultură bacteriană), bacteria izolată este considerată rezistentă.
7. 1. 1. 7. Testul E; Determinarea CMI prin „E test”
„E test” reprezintă o metodă de testare in vitro a sensibilităţii la antibiotice pentru diferite
microorganisme, inclusiv pentru bacteriile pretenţioase şi germenii anaerobi. „E test” se
aseamănă metodei diluţiei în agar combinând principiile metodei difuzimetrice cu cele de
diluţie. „E test” este uşor de utilizat şi spre deosebire de metoda difuzimetrică permite
determinarea valorii CMI. Din punct de vedere tehnic este necesară o placă Petri cu agar
Mueller-Hinton, inoculul standardizat şi langhetele din plastic pe care au fost fixate antibiotice
în gradient, de ex. la un capăt 256 μg / ml ajungând la celălalt capăt la 0,016 μg / ml (câte o
langhetă pentru fiecare antibiotic, câte 15 diluţii marcate pe fiecare langhetă).
Însămânţăm microorganismul care urmează a fi testat în condiţii standardizate şi depunem
radiar langhetele cu antibiotice.
Principiu:
Asemănător metodei difuzimetrice, „E test” necesită un inocul bacterian ajustat ca
turbiditate (standardizat), ce urmează a fi depus pe mediul de cultură potrivit microorganismului
studiat (ex. mediul Mueller-Hinton, geloză-sânge etc), în plăci Petri. Benzile „E test” conţin un
gradient de agent antimicrobian şi se aplică după însămânţare. În funcţie de antibiotic,
gradientul „acoperă” un şir continuu de concentraţii între 0,002-32 μg/ml; 0,016-256 μg/ml sau
0,064-1024 μg/ml. După incubare (timp de 16-18 ore la 35-37°C) se formează o zonă eliptică
de inhibiţie. Valoarea CMI se citeşte acolo unde creşterea bacteriană intersectează banda „E
test”.
Materiale şi reactivi necesari:
plăci Petri cu agar Mueller-Hinton (păstrate la 2-8ºC până în momentul utilizării); bulion
Mueller-Hinton (cu 20-25 mg cationi de calciu şi 10-12,5 mg cationi de magneziu / litru; se
repartizează câte 5 ml în tuburi sterile cu capac; se păstrează la 2-8ºC); medii de cultură pentru
menţinerea în stare viabilă a tulpinilor bacteriene necesare efectuării controlului de calitate ;
tulpini martor;
inocul bacterian;
- soluţie salină sterilă (0,85% NaCl) sau bulion Mueller-Hinton, pentru ajustarea inoculului
bacterian;
benzi „E test” (a. cu agenţi antimicrobieni cu nucleu β lactam, b. cu alţi agenţi
antimicrobieni); se păstrează în congelator la -20ºC până în momentul utilizării; au o durată de
utilizare de 1-2 ani (pentru prima grupă) şi respectiv de 2-3 ani; tampoane sterile;
standard de turbiditate McFarland de 0,5 şi 1,0;
pipete Pasteur sterile;
foarfece;
plăci Petri sterile cu diametrul de 90 mm şi respectiv de 150 mm;
incubator cu atmosferă obişnuită reglat la 34-35ºC; incubarea în atmosferă îmbogăţită cu CO2
este necesară în cazul testării anumitor microorganisme;
sursă de lumina;
aplicator „E test”şi bandă adezivă (opţional).
Tehnica de lucru:
A. Benzile „E test”
scoatem plăcile cu mediul de cultură şi benzile „E test”din congelator, le lăsăm la temperatura
camerei pentru echilibrare termică timp de 20 minute sau până când nu mai observăm nici
o urmă de umezeală
înainte de a deschide folia care include benzile, inspectăm pentru a observa dacă există
perforări; dacă folia respectivă nu este intactă, atunci benzile din interiorul ei nu se mai pot
folosi; dacă nu sunt probleme, pentru a deschide o folie mai întâi tăiem cu o foarfecă de-a
lungul liniei întrerupte apoi între compartimentele ce conţin benzile
scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete şi le punem în plăci Petri sterile; apoi le
putem aplica pe mediul de cultură care conţine inoculul microbian de testat păstrăm restul
benzilor în tuburi în care introducem o substanţă desicantă pentru a le proteja faţă de
umezeală; este necesară protecţia şi faţă de căldură şi expunerea directă la lumină (punem
tuburile în congelator, la -20°C)
B. Inoculul bacterian:
cu ajutorul ansei sau a unei pipete, transferăm mai multe colonii dintr-o cultură bacteriană de
18-24 de ore într-un tub cu soluţie salină sterilă sau bulion; omogenizăm (există şi varianta
să transferăm mai multe colonii în bulion, să incubăm timp de 2-8 ore până când obţinem
densitatea dorită)
ajustăm (vizual) densitatea folosind soluţie salină sterilă 0,85% sau bulion, la un standard de
turbiditate echivalent cu 0.5 McFarland; alternativ, suspensia se poate ajusta la standardul
dorit cu ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizuală a turbidităţii inoculului nu garantează
numărul corect al unităţilor formatoare de colonii).
C. Inocularea plăcilor:
introducem tamponul steril în tubul care conţine suspensia bacteriană de testat, rotim de câteva
ori, apoi eliminăm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereţii interiori ai tubului;
depunem inoculul pe suprafaţa plăcii cu mediul de cultură având grijă să acoperim complet
suprafaţa mediului (ex. inoculăm pe 3 direcţii diferite, rotind placa cu câte o treime); lăsăm
placa timp de circa 10 minute, ca să se usuce, înainte de a aplica benzile „E test”. D. Aplicarea
benzilor „E test”:
luăm cu grijă o bandă fără să atingem sau zgâriem partea pe care este depus agentul
antimicrobian; dacă folosim pensa sterilă, apucăm cu grijă de capătul benzii notat cu E
(benzile trebuie să fie complet separate una de cealaltă înainte de a le aplica pe suprafaţa
mediului de cultură inoculat cu tulpina de testat); dacă se foloseşte aplicatorul „E test”,
banda adezivă trebuie să fie în poziţia corectă (la fiecare capăt al aplicatorului);
aplicăm banda „E test”pe suprafaţa mediului de cultură, cu capătul ce conţine concentraţia cea
mai mare aproape de marginea plăcii;
dacă lucrăm cu plăci cu diametrul de 90 mm, aplicăm una sau două benzi; dacă lucrăm cu plăci
cu diametrul de 150 mm, putem aplica şase benzi „E test” (benzile se pun la distanţe egale,
radial, pornind din centrul plăcii; marginea capătului benzii notată cu E trebuie să atingă
marginea plăcii);
banda trebuie să fie în contact cu suprafaţa agarului; eliminăm eventualele bule de aer de sub
bandă cu ajutorul unei pense începând de la marginea bulei şi mutând-o în sus pe gradient
până la capătul notat cu E (prezenţa bulelor mici nu va afecta rezultatul testării);
banda aplicată pe suprafaţa agarului nu se mută în altă poziţie (luând contact cu mediul de
cultură, agentul antimicrobian de pe partea posterioară se eliberează imediat); dacă banda a
fost aplicată cu partea posterioară în sus atunci se apucă cu grijă, se întoarce şi se pune corect
pe suprafaţa mediului; dacă banda a atins suprafaţa mesei de lucru sau un alt obiect, se poate
folosi în continuare atâta timp cât nu a luat contact cu o substanţă lichidă.
E. Incubarea:
timpul şi temperatura de incubare depind de combinaţia microorganism-agent antimicrobian
ce urmează a fi testate;
incubarea în atmosferă de CO2 modifică pH-ului mediului de cultură şi poate afecta activitatea
agenţilor antimicrobieni; se foloseşte numai în cazul în care microorganismele supuse
testării necesită pentru multiplicare CO2 (Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae,
Streptococcus pneumoniae etc).
Interpretarea rezultatelor:
putem citi rezultatul în cazul în care creşterea bacteriană este confluentă sau aproape
confluentă;
ţinem placa lângă o sursă de lumină (atunci când mediul este Mueller-Hinton); citim valoarea
CMI în punctul în care creşterea bacteriană intersectează banda „E test”; dacă am utilizat
agar Mueller-Hinton suplimentat cu 5% sânge de oaie, sau geloză-chocolate Mueller
Hinton sau alt mediu opac, vom utiliza pentru citirea rezultatului o sursă de lumină
reflectantă şi o lupă;
pe geloză-sânge citim zona de inhibiţie a creşterii bacteriene nu zona de inhibiţie a hemolizei; -
în cazul în care nu apare nici o zonă de inhibiţie, raportăm valoarea CMI ca fiind mai mare
decât cea mai mare concentraţie a agentului antimicrobian de pe banda „E test”; dacă zona de
inhibiţie nu intersectează banda (zona de inhibiţie se află sub banda „E test”), valoarea CMI
se raportează ca fiind mai mică decât concentraţia cea mai scăzută a agentului antimicrobian
de pe banda „E test”;
în cazul unei valori CMI situată între două marcaje ale gradientului benzii, rezultatul pe care îl
notăm va fi valoarea cea mai mare;
raportăm rezultatul obţinut pentru tulpina studiată după ce verificăm rezultatul obţinut pentru
tulpina de referinţă (control de calitate);
rezultatele CMI se interpretează conform criteriilor stabilite de NCCLS (National Committee
for Clinical Laboratory Standards).
7. 1. 1. 8. Alte tehnici de testare clasice
Testarea sensibilităţii la antibiotice a bacteriilor anaerobe
metodele sunt utile în special din punct de vedere al supravegherii
epidemiologice, dar sunt rezervate pentru laboratoarele de referinţă
se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid, tehnici de microdiluţii
în mediu lichid, teste pentru producerea de β-lactamază etc.
Testarea sensibilităţii mycobacteriilor
se efectuează respectând prevederile Programului naţional de control al
tuberculozei (care indică situaţiile în care vor fi efectuate aceste testări)
se pot utiliza metoda concentraţiilor absolute, metoda proporţiilor, metoda
rapoartelor de rezistenţă, metode radiometrice etc.
Testarea sensibilităţii altor bacterii
există şi alte bacterii pentru care trebuie respectate condiţii particulare
spre exemplu pentru testarea sensibilităţii stafilococilor la oxacilină / meticilină
se recomandă ca mediul să conţină 4% NaCl, pentru testarea sensibilităţii la
antibiotice a streptococilor se recomandă ca mediul să conţină 5% sânge
defibrinat de berbec etc.
Testarea sensibilităţii fungilor (antifungigrama)
ţine cont de temperatura şi durata de incubare, care diferă faţă de cele pentru
bacterii, mediul utilizat fiind mediul Sabouraud
se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid
Testarea producerii de β-lactamaze
este utilă atunci când se verifică sensibilitatea la antibiotice a microorganismelor
care pot produce β-lactamază (ex. Haemophilus spp., Staphylococcus aureus
etc)
 se pot utiliza teste iodometrice, teste acidimetrice, teste cu cefalosporine
cromogene etc; există şi metode puse la punct pentru testarea sintezei de β
lactamaze cu spectru extins (BLSE)
- Există şi sisteme automate (ex. ATB şi rapid ATB) sau sisteme semiautomate (ex. ATB
Expression sau miniAPI), pentru testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice,
utilizând criteriile de interpretare NCCLS.
7. 1. 1. 8. Tehnici de biologie moleculară utilizate în testarea sensibilităţii la
antibiotice şi chimioterapice
Au fost imaginate o serie de metode semi-automatizate sau automatizate pentru a optimiza
obţinerea unor rezultate corecte şi în timp cât mai scurt, cu privire la sensibilitatea / rezistenţa
microorganismelor la antibiotice şi chimioterapice. Metodele care au la bază tehnicile de
biologie moleculară pot fi foarte utile (chiar dacă costurile sunt mai ridicate). De ex. se cunoaşte
că agentul etiologic al tuberculozei se multiplică lent pe medii de cultură şi în aceste condiţii
rezultatele vor fi obţinute în circa 2 săptămâni prin metodele clasice. Se pot utiliza diferite
tehnici şi în final hibridizarea moleculară pentru a studia diferite mutaţii care pot să dea
informaţii cu privire la sensibilitatea / rezistenţa tulpinilor studiate. Spre ex. INNO-LIPA Rif.
TB (LIPA= Line Probe Assay), se realizează cu ajutorul unei truse comerciale puse la punct în
USA. Metoda permite concomitent identificarea M. tuberculosis precum şi testarea a
sensibilităţii la rifampicină, după o amplificare genetică a unui material (ADN) provenit fie din
culturi mycobacteriene, fie chiar din produse clinice.
Principiul INNO-LIPA este hibridizarea ADN-ului rezultat dintr-o amplificare prin PCR
(Polymerase Chain Reaction) cu sonde nucleotidice specifice, imobilizate sub forma unor linii
(benzi) paralele, pe fâşii de nitroceluloză. Sondele nucleotidice (S1-S5) sunt biotinilate (cuplate
cu biotină). După hibridizare se adaugă steptavidină conjugată cu fosfatază alcalină, acest
conjugat ataşându-se de produşii de hibridizare rezultaţi anterior. Incubarea în prezenţa unui
reactiv cromogen conduce, în cazul existenţei hibridizării, la apariţia unor benzi colorate,
vizibile. În cazul testării rezistenţei la rifampicină, se urmăreşte apariţia unei / unor mutaţii la
nivelul genei care codifică pentru subunitatea β a ARN polimerazei (gena rpoB).
Identificarea apartenenţei tulpinii testate la specia M. tuberculosis, este certificată cu
ajutorul unei oligonucleotide specifice, situată în poziţia a 3-a, după linia care marchează fiecare
fâşie-test şi respectiv linia care permite verificarea calităţii conjugatului (conjugate control).
Produsul unei tulpini sensibile la rifampicină deţine fragmente amplificate, care hibridizează
cu sondele specifice S1, S2, S3, S4 şi respectiv S5. Absenţa uneia sau a mai multor benzi
demonstrează că tulpina este rezistentă la rifampicină.
Pentru tulpinile rezistente la rifampicină, trusa comercială INNO-LIPA permite suplimentar
aprecierea locusului mutaţiei. De exemplu, o tulpină poate prezenta o mutaţie în regiunea R5
(serină- leucină) în timp ce altă tulpină prezintă o mutaţie în regiunea R4a
(histidină), aceste mutaţii apărute la nivelul genei rpoB fiind dintre cele mai frecvente şi pot fi
identificate prin această metodă.
7. 1. 2. Metode de testare a sensibilităţii in vivo şi de apreciere a eficienţei terapeutice
Eficienţa terapeutică poate fi apreciată clinic, paraclinic şi prin teste de laborator. Există unele
criterii nespecifice de laborator care sunt utile în aprecierea eficienţei terapeutice, precum
leucograma, examenul sedimentului urinar, examenul citologic al LCR, VSH, proteina C
reactivă etc.
Dintre metodele specifice utilizate pentru aprecierea eficacităţii terapeutice sau pentru
evaluarea eventualei nocivităţi a medicamentelor folosite, vom enumera: determinarea NEI
(nivel de eficienţă inhibitorie) pentru ser, LCR sau alte umori; determinarea NEB (nivel de
eficienţă bactericidă) pentru ser, LCR sau alte umori; puterea
bactericidă a serului celor trataţi (NEB) măsoară capacitatea diluţiilor din serul unui bolnav
tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul conţinând germenul infectant; se determină
diluţia cea mai înaltă de ser care mai manifestă capacitate bactericidă; a fost indicată
utilizarea acestor metode în cazul endocarditelor bacteriene, osteomielitelor, fibrozei
chistice sau a sepsisului la pacienţi cu variate grade de imunodepresie; produsele se
recoltează de obicei la o oră după administrarea unei doze şi cu câteva minute înainte de
administrarea următoarei doze de antibiotic;
determinarea nivelul de antibiotic realizat în sânge, LCR sau în alte umori (prin metode
microbiologice, enzimatice, HPLC etc).

7. 2. Povestiri adevărate
Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de S. aureus în România, comparativ cu EU În statele
Uniunii Europene, serviciile de sănătate publică şi-au îndreptat atenţia în ultimii ani către
stafilococul auriu meticilino-rezistent (MRSA), incidenţa acestei specii microbiene fiind într-
o permanentă creştere atât în infecţiile nosocomiale, cât şi în cele comunitare. Alături de alţi
agenţi patogeni care stau la baza declanşării de infecţii nosocomiale (Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp., Aspergillus spp. etc.),
MRSA este agentul etiologic izolat în aproximativ 5% din totalul acestor infecţii. În vederea
monitorizării în timp şi spaţiu a susceptibilităţii, dar şi a rezistenţei la antibiotice a diferitelor
specii bacteriene cu potenţial patogen crescut, s-a pus la punct EARSS (European
Antimicrobial Resistance Surveillance System) - un program de supraveghere a sensibilităţii
la antibioticele folosite în practica medicală curentă a tulpinilor izolate de Streptococcus
pneumoniae, Staphylococcus aureus, E. coli, Enterococcus faecalis / faecium,
K. pneumoniae şi P. aeruginosa). Supravegherea tulpinilor de S. aureus şi implicit a MRSA
este realizată începând cu anul 1999.
În anul 2006, 31 de state din Europa au raportat către EARSS efectuarea testării sensibilităţii
la antibiotice pentru un număr de 29.552 de tulpini de S. aureus izolate. Dintre acestea, 7.037
(23.81%) au fost identificate ca fiind MRSA. Dintre cele 31 de state, 15 au raportat o incidenţă
a infecţiilor cu MRSA mai mare de 25%. În ţări precum Croaţia, Grecia, Islanda, Malta, Turcia,
MRSA s-a izolat cu precădere în unităţile de terapie intensivă (peste 60% din totalul tulpinilor
de MRSA).
Din raportul pe 2006 al EARSS reiese faptul că în statele din Europa Centrală, rata infecţiilor
nosocomiale şi comunitare cu MRSA se situează între 7-22%, comparativ cu partea de nord a
continentului, unde rata este sub 4%. Marea Britanie a raportat între 1.500 şi 4.000 de tulpini
de MRSA pe an, Franţa între 1.700 şi 3.900 de tulpini pe an, Suedia între 1.300 şi 2.000 de
tulpini pe an, Germania între 800 şi 1.300 de tulpini pe an, Slovenia între 150 şi 365 de tulpini
pe an, iar Bulgaria a raportat între 100 şi 170 de tulpini pe an.
În comparaţie cu aceste state, în raportările cărora numărul tulpinilor de MRSA izolate a
avut valori crescute, România a raportat în perioada 2002 - 2006 un număr foarte scăzut de
tulpini, variind între 78 şi 92 de tulpini pe an (circa jumătate din numărul de tulpini raportate de
Slovenia şi de circa 16 ori mai puţine decât Suedia, situaţia nefiind justificată de un număr real
mai mic al tulpinilor izolate ci probabil, de o mai scăzută preocupare cu privire la acest subiect).
În anul 2005 s-a efectuat în ţara noastră, la Institutul de Boli Infecţioase „Matei Balş”, un
studiu al cărui obiectiv principal a fost stabilirea spectrului de sensibilitate la antibiotice pentru
un număr de 589 de tulpini de S. aureus izolate. Peste jumătate din tulpini au fost izolate de la
nivel faringian, dar s-au izolat tulpini şi din leziuni cutanat, prin hemocultură etc. Testarea
sensibilităţii la antibiotice a fost efectuată prin E-test, evidenţiindu-se 92 (15.61%) tulpini de
MRSA. Acest nivel redus al meticilino-rezistenţei poate fi corelat, printre altele, cu numărul
mare de tulpini izolate din exsudat faringian, la care nivelul de meticilino-rezistenţă este mai
mic de 10%. Studiul a relevat faptul că macrolidele, ciclinele şi cotrimoxazolul constituie în
prezent alternative terapeutice compromise, rămânând active (pentru tulpinile identificate în
institut) în antibioterapie clindamicina, rifampicina şi aminoglicozidele. Procentul de tulpini de
S. aureus penicilino-rezistente raportat a fost de 26% (şi nu de 100% cum ar putea părea că este
sugerat atunci când, în relaţie cu o tulpină de S. aureus, penicilina este „uitată” complet).
Tulpinile de MRSA constituie o problemă de sănătate publică pe tot cuprinsul Europei.
Totuşi, faptul că în unele ţări (cum ar fi Cipru sau Turcia) incidenţa infecţiilor cu MRSA este în
scădere, reprezintă o speranţă în încercarea de a controla rata infecţiilor nosocomiale şi respectiv
a celor comunitare în care sunt implicate tulpinile de MRSA.