ANTIBIOGRAMA

Definiție:
- reprezintă ultima etapă a diagnosticului de laborator;
- este o tehnică folosită foarte frecvent în laboratorul de microbiologie pentru testarea comportamentului
față de antibioticele folosite în practica clinică a bacteriilor implicate etiologic în infecții.
Metode:
a) cantitative: permit și determinarea CMI = concentrație minimă inhibitorie = cea mai mică cantitate de
antibiotic care poate inhiba dezvoltarea unei bacterii;
b) calitative: permit stabilirea calificativului S (sensibil), IS (intermediar sensibil), R (rezistent), referitor la o
tulpina bacteriană, în raport cu antibioticul testat.
În România este încă larg utilizată o metodă semicantitativă = metoda difuzimetrică Kirby-Bower.

Indicațiile metodei Kirby-Bauer

Se utilizează pentru testarea sensibilității la antibiotice a bacteriilor cu creștere rapidă (24-72h) și la care nu
se cunoaște cu precizie comportamentul față de antibioticele respective.
Singura situație clinică în care nu se face de rutină antibiograma este reprezentată de infecțiile cu streptococi
beta-hemolitici de grup A (Streptococcus pyogenes), la care este cunoscut faptul că au sensibilitate 100% la
penicilină. Se face antibiograma doar la solicitarea medicului în cazul pacienților alergici la penicilină.

Materiale necesare pentru antibiograma difuzimetrică

1. Mediul de cultură Müller-Hinton
- este ideal pentru antibiogramă deoarece:
• permite dezvoltarea majorității bacteriilor de importanță medicală;
• nu are efecte antagonice cu antibioticele;
• este izoton cu sângele, permițând adăugarea acestui lichid biologic pentru antibiogramele bacteriilor
pretențioase nutritiv, mai greu cultivabile;
• are o compoziție chimică stabilă, ușor reproductibilă;
- pentru majoritatea bacteriilor se utilizează mediul ca atare;
- pentru germeni fastidioși se folosește mediul Müller-Hinton cu adaus de 5% sânge de berbec  ex.: pentru
streptococii, pneumococii, enterococii;
- mediul este turnat în plăci Petri sterile cu o înălțime uniformă de 4 mm;
- plăcile turnate se păstrează în frigider la 4°C și se scot cu minimum 30 minute înainte de utilizare, pentru a
ajunge la temperatura camerei (mediile reci omoară bacteriile).
2. Cultura bacteriană de testat
Cerințe:
- să fie pură;
- să fie proaspată (de maximum 24 ore);
- să nu provină de pe un mediu de cultură cu proprietăți inhibante pentru unii germeni.
3. Microcomprimatele cu antibiotice (discuri, biodiscuri, rondele)
- se livrează laboratorului în cartușe cu câte 50 de rondele suprapuse din acelați antibiotic;
- se păstrează în frigider la 4°C, de unde sunt scoase cu minimum 30 minute înainte de utilizare;
- în laborator, rondelele pot fi grupate în truse corespunzătoare unui anumit germen sau grup de germeni
conform ghidurilor internaționale pentru antibiograme - ex.: trusa pentru stafilococi, trusa pentru streptococi,
trusa pentru Enterobacteriaceae, trusa pentru Pseudomonas aeruginosa, trusa pentru genul Acinetobacter,
trusa pentru enterococi, etc.
- în unele laboratoare se formează și truse adaptate anumitor infecții  ex.: trusa pentru infecții digestive
(boli diareice), trusa pentru infecții urinare;
- rondelele trebuie să fie in termen de valabilitate.
4. Altele: ser fiziologic steril, pipete sterile, eprubete sterile, etaloane de turbiditate / densitometru, riglă,
tabel de interpretare a antibiogramei, tulpini bacteriene de referință liofilizate.

Tehnica antibiogramei difuzimetrice

- se scot din frigider plăcile cu mediu Müller-Hinton;
- se lasă pe masă sau în termostat până ajung la temperatura camerei;
- se examinează dacă au fost turnate corect ;
- se notează cu un marker persistent numărul de înregistrare pe capacul plăcii Petri;
- se prepară inoculul (suspensia bacteriană):

1 / LP 4  M
 • se pun într-o eprubetă sterilă, cu o pipetă sterilă, 5 ml de ser fiziologic steril în care se adaugă, cu ansa
buclă sterilă, câteva colonii bacteriene identice;
• se agită ușor eprubeta pentru omogenizare;
- se standardizează inoculul prin una dintre metodele:
• prin compararea acestuia cu un etalon de turbiditate (se compară gradul de tulburare a lichidului)
McFarland 0.5;
• cu ajutorul unui densitometru;
- se însămânțează inoculul pe toată suprafața plăcii cu mediul Müller-Hinton:
• se poate folosi metoda inundării plăcii Petri cu inocul folosind o pipetă sterilă;
• se mai poate aplica inoculul cu un tampon steril, îmbibat cu acesta, cu care se trasează striuri foarte
dense pe suprafața mediului pe mai multe direcții;
- se lasă plăcile cu mediile însămânțate pe masa de lucru sau în hotă, acoperite parțial cu capacul, până când
se usucă suprafața mediului (maximum 15 minute);
- se aplică rondelele cu antibioticele din trusa corespunzătoare germenului suspectat cu o pensă flambată
după fiecare rondea sau cu un aplicator de rondele;
- se închide placa Petri și se lasă pe masă aproximativ 15 minute pentru predifuzie (antibioticele din rondele
difuzează circular în mediul din jur);
- se incubează placa Petri la termostat, la 37°C, 18-24 ore;
- a doua zi se examinează antibiogramele și se măsoară cu o riglă diametrele zonelor de inhibiție a creșterii
bacteriene din jurul fiecărei rondele;
- se notează într-un registru valorile în mm obținute pentru fiecare antibiotic testat;
- se transformă valorile în calificative cu ajutorul tabelului de interpretare:
• S = bacteria este sensibilă la antibiotic  antibioticul poate fi folosit pentru terapie în doze uzuale;
• IS = bacterie intermediar sensibilă la antibioticul respectiv  antibioticul poate fi folosit doar dacă nu
există o soluție mai bună de pe lista S și în doze mai mari decât cele uzuale;
• R = bacteria este rezistentă la antibioticul respectiv  nu se poate folosi pentru tratament.

Erorile antibiogramei
a) erori legate de mediul de cultură
- folosirea altui mediu decât Müller-Hinton;
- folosirea mediilor direct din frigider;
- folosirea unor medii prea groase, prea subțiri sau turnate înclinat;
- utilizarea unor medii nesterile;
b) erori legate de inocul
- folosirea unui inocul nestandardizat;
- preparare de inocul din cultura mixtă;
- preparare de inocul din cultură veche (de mai mult de 24 ore);
- preparare de inocul de pe mediul inhibant;
c) erori legate de microcomprimate
- folosirea de rondele expirate;
- folosirea de rondele direct din frigider;
- folosirea unor antibiotice necorespunzătoare germenului;
d) erori legate de tehnică
- nerespectarea intervalelor de timp:
• 15 minute pentru uscare
• 15 minute pentru predifuzie
• 24 ore de incubare
• folosirea inoculului după mai mult de 15 minute de la preparare;
- nerespectarea temperaturii de incubare;
- utilizarea de materiale nesterile;
- nerespectarea distanțelor standard între rondele și față de marginile plăcii;
- neverificarea mediilor și rondelelor cu tulpini de referință;
- citirea cu ochiul liber a rezultatelor fără măsurare.

Antibiograma este o metodă standardizată iar interpretarea rezultatelor se face în conformitate cu tabelele
din laborator întocmite anual pe baza unui ghid international de antibiogramă.
Se folosesc mai mult 2 ghiduri:
- american CLSI = Clinical & Laboratory Standards Institute
- european EUCAST
2 / LP 4  M