Antibiograma difuzimetrică:

tehnica de realizare şi
interpretare.
 Definitii

⚫ Antibiograma: testarea sensibilităţii in vitro

a microorganismelor faţă de antibiotice .
 Definitii

⚫ Termenii de antibiotic si chimioterapic se folosesc ca

sinonimi.
⚫ Introducerea unui antibiotic in terapie este o mare
responsabilitate medicala, cerind respectarea unor
conditii.
 Conditii

o Antibiograma se face dupa stabilirea

diagnosticului etiologic, prin izolarea in cultura
pura si prin identificarea agentului patogen.
o In cazuri de extrema urgenta, se poate
administra un antibiotic (inainte de efectuarea
antibiogramei) dar numai dupa recoltarea
produselor patologice.
 Conditii
o Tratamentul se realizeaza in functie de rezultatele
date de antibiograma, alegand antibioticul cel mai
eficace, adica fata de care bacteria izolata are cea mai
mare sensibilitate.
 Conditii

o Antibiograma trebuie repetata daca tratamentul cu

antibiotice este de durata mai lunga; aceasta deoarece
agentul patogen poate sa cistige rezistenta fata de
antibioticul utilizat.

o Apoi in cursul tratamentului datorita dezechilibrului

din populatiile microbiocenozelor, poate sa se produca o
infectie supraadaugata cu o bacterie din aceste
microbiocenoze.
 Metode folosite pentru testarea
sensibilitatii in vitro la antibiotice

metode calitative
⚫ metoda difuzimetrica Kirby Bauer - clasica
⚫ metoda cu antibiotic incorporat in mediu semisolid -
moderna
metode cantitative
⚫ metoda dilutiilor in mediu lichid - clasica
⚫ metoda E test – moderna
 Principiu

⚫ se bazeaza pe efectul bactericid sau bacteriostatic al

antibioticelor fata de microorganism.
 Indicaţiile efectuării antibiogramei
⚫ în cazul tuturor bacteriilor semnificative clinic a
căror susceptibilitate nu este predictibilă
(condiţie:existenţa standardizării privind specia,
antibioticul de testat)
 Necesitatea efectuării antibiogramei

⚫ se decide de către microbiolog în funcţie de:

⚫ - felul produsului din care s-a izolat germenul,
⚫ - specia bacteriană
⚫ Când relevanţa unui izolat este incertă, medicul
microbiolog se consultă cu medicul
curant si se ia o decizie în comun pe baza datelor
clinice.
 Metode calitative
Metoda difuzimetrică Kirby-Bauer

⚫ Se testează sensibilitatea unei tulpini bacteriene izolate

în cultură pură si identificate.
⚫ Este metoda utilizată de rutină pentru testarea
susceptibilităţii izolatelor clinice.
⚫ Fiind o metodă calitativă, nu permite cuantificarea
nivelului de rezistenţă, rezultatele fiind exprimate
in:sensibil,intermediar si rezistent.
Metoda difuzimetrică Kirby-Bauer

⚫ Aceasta se efectueaza pe medii solide, in placi

Petri, pe care s-a insamintat in panza cultura
bacteriana; apoi pe suprafata mediului se dispun
discuri cu antibiotice astfel ca in jurul acestora se
va realiza un gradient de concentratie prin
difuziunea locala a antibioticului ( in imediata
vecinatate a discului realizindu-se o concentratie
mai mare de antibiotic care descreste pe masura
indepartarii de acesta ).
Metoda difuzimetrică Kirby-Bauer
⚫ Metoda difuzimetrica, cu toate ca nu stabileste
concentratia minima infibitorie (CMI), da informatii
pretioase asupra sensibilitatii speciei testate fata de
antibioticele utilizate si este folosita mai frecvent in
laboratorele clinice.
Metoda difuzimetrică Kirby-Bauer

⚫ În efectuarea si interpretarea antibiogramelor

calitative se urmăresc standarde internaţionale.
⚫ În prezent standardul acceptat în cele mai multe ţări
(inclusiv România) este cel american, elaborat de CLSI
(Clinical Laboratory Standards Institute) dar unele
laboratoare folosesc standardul european Eucast.
 Medii pentru AB
Mediul de testare universal recomandat este Muller-Hinton
agar.
⚫ Acest mediu nesuplimentat a fost ales pentru mai multe
motive:
⚫ a demonstrat o bună reproductibilitate de la un lot la altul
⚫ conţine puţini inhibitori de sulfonamide şi trimetoprim
⚫ este un bun mediu de cultură pentru majoritatea
germenilor nepretenţioşi, patogeni
⚫ este folosit cu succes de mulţi ani, demonstându-şi calităţile.
⚫ Formula mediului este:
⚫ Extract de carne……………………..300,0g
⚫ Hidrolizat de cazeină…………………17,5g
⚫ Amidon…………………………………1,5g
⚫ AD……………………………………..1000ml
 Medii pentru AB
⚫ Germenii pretenţioşi, cum sunt Haemophilus, Neisseria
şi Streptococcus nu pot creşte satisfăcător pe acest
mediu nesuplimentat, dar ei pot fi testaţi prin metoda
difuzimetrică, prin suplimentarea mediului de bază
Muller-Hinton cu factori de creştere specifici
(adăugarea de sânge defibrinat sau chocolatizat,
adăugarea de factori X şi V), incubarea în atmosferă
de CO2 şi prelungirea perioadei de incubaţie.
⚫ Pt. Mycobacterium tuberculosis se foloseste mediul
Lowenstein Jensen
 Medii pentru AB
⚫ Grosimea mediului, de 4 mm, este importantă,
deoarece AB difuzează în mediu atât în suprafaţă cât şi
în profunzime, deci, o grosime mai mare duce la false
rezistenţe (zone de inhibiţie eronat mai mici), în timp
ce o grosime mai mică de 4 mm duce la creşteri false
ale zonelor de inhibiţie, deci false sensibilităţi.
 Medii pentru AB
⚫ Fiecare lot de mediu nou preparat trebuie testat
pentru asigurarea unui pH mediu de
7,2-7,4 la temperatura camerei; valori scăzute ale
pH-ului pot altera rezultatele pentru
aminoglicozide şi macrolide (false rezistenţe), sau
ale penicilinelor (false sensibilităţi).
 Medii pentru AB

⚫ Plăcile cu mediu pot fi stocate la frigider mai multe

zile, în pungi de plastic pentru a evita
deshidratarea, iar înainte de utilizare vor fi
introduse în incubator (10-30 min) pentru
echilibrare termică şi îndepărtarea condensului
format.
 1. Prepararea inoculului
⚫ se suspensionează 2-3 colonii izolate în ser fiziologic
⚫ turbiditatea suspensiei se controlează nefelometric sau
comparând cu tuburi etalon (conţin suspensii de
particule latex/sulfat de Ba având turbiditate
determinată);
⚫ se ajustează la 0.5 McFarland (1,5x108 ufc/ml).
⚫ Inocularea gelozei Muller-Hinton cu această suspensie se va
realiza în răstimpul a 15 min. de la preparare, pentru a
preveni modificarea turbidităţii prin începerea creşterii
bacteriene.
 2. Însămânţarea

⚫ se alege un mediu corespunzător speciei bacteriene

testate
⚫ · Mueller-Hinton pentru majoritatea bacteriilor
⚫ · Mueller-Hinton cu sânge pentru pretenţiosi (de ex.
streptococi)
⚫ · medii speciale (pentru Haemophilus spp . neisserii)
⚫ se introduce un tampon în suspensia bacteriană, se
stoarce pentru îndepărtarea excesului de lichid
⚫ se sterge uniform toată suprafaţa mediului de 3x
 2. Însămânţarea

⚫ Scopul final al inoculării mediului este realizarea

unei creşteri bacteriene uniforme, sub formă de
colonii confluente (sau semiconfluente după
standardul francez, ce utilizează un inocul mai
slab).
 3. Depunerea microcomprimatelor de
antibiotice

⚫ se aleg antibioticele care trebuie testate in funcţie de

specia bacteriană testată si în funcţie delocalizarea
infecţiei –
⚫ se depun discurile de antibiotic la l .5 cm distanţă de
marginea cutiei Petri si la 2.5-3 cm distanţă unul faţă
de celălalt .
⚫ 15 min. temperatura camerei
 3. Depunerea microcomprimatelor de
antibiotice
⚫ Unele antibiotice încep să difuzeze în mediu
imediat după aplicare, astfel că odată aplicate pe
mediu ele nu mai pot fi mutate.
⚫ Aplicarea discurilor se poate face fie individual,
cu pense sterile, fie cu dispensere speciale care
permit aplicarea concomitentă a 8-16 discuri, în
funcţie de mărimea placii Petri utilizate (pe o
placă Petri rotundă de 90 mm încap 6 discuri, pe
una de 100 mm, 8 discuri, pe cea de 150 mm, 12
discuri, iar pe plăcile pătrate de 120/120 mm, 16
discuri).
Dispersor de discuri pentru antibiograme, tuburi cu discuri impregnate
cu antibiotice in diferite concentratii, placa cu agar Müller-Hinton pentru
realizarea antibiogramei difuzimetrice
 4. Incubare

⚫ în funcţie de specia bacteriană: în atmosfera obisnuită

sau in atmosferă de CO2 (de ex.
⚫ streptococi, neisserii.)
⚫ 35°C-37°C
⚫ 16-18 ore (în cazul germenilor pretenţiosi până la
20-24 de ore)
⚫ 24 de ore în cazul testării vancomicinei
 5. Citire

⚫ apare o cultură bacteriană confluentă, în jurul

microcomprimatelor apar zone de inhibiţie (lipsa
creșterii bacteriene)
⚫ se citesc diametrele zonelor de inhibiţie
⚫ se compară diametrele citite cu diametre standard in
funcţie de antibiotic, cantitatea de antibiotic din
comprimat, specia bacteriană testată
⚫ Diametrul zonei de inhibiţie completă este măsurat,
incluzând şi diametrul discului, cu ajutorul unei rigle
gradate, sau şubler.
5. Citire
5. Citire
5. Citire
 5. Citire
⚫ Aspectul zonei de inhibitie
trebuie sa fie clar si cu contur
net.
⚫ In situatia in care se observa
chiar si o singura colonie in
interiorul zonei de inhibitie,
se va considera rezistenta la
acel antibiotic, indiferent de
diametrul zonei de inhibitie .
 6. Interpretarea antibiogramelor

⚫ rezultatul se raportează:
⚫ sensibil (S),
⚫ intermediar sensibil (IS)
⚫ sau rezistent (R) la antibioticul testat
⚫ fiecare rezultat de antibiogramă se interpretează!
⚫ nu se comunică diametrele citite (metodă calitativă)
 Variabilele care influenţează
rezultatele:
⚫ compoziţia mediului (conţinut de cationi, timidină)
⚫ pH (optim: 7,2-7,4)
⚫ grosimea gelozei (standard: 4 mm)
⚫ inoculul - 0,5 McFarland
⚫ microcomprimate (valabilitate, conţinut, condiţii de
păstrare)
⚫ timpul, temperatura de incubare
⚫ citirea diametrelor (lumină refractată/reflectată, colonii
izolate, prezenţa unui văl, margini
crenelate)
⚫ loturile noi de medii de cultură se testează cu tulpini de
referinţă.
 Metoda dilutiilor in medii lichide
⚫ Urmareste derminarea limitei de sensibilitate a
germenului fata de substanta data, indicand cc. de
antibiotic necesara pentru inhibarea dezvoltarii sale.
⚫ Tehnica-la dilutii crescande de AB facute direct in
mediu de cultura lichid, se insamanteaza cantitati
egale de cultura bacteriana , stabilindu-se dilutia
maxima de antibiotic in prezenta careia tulpina este
inhibata.
⚫ -pentru fiecare AB se face o dilutie de pornire
⚫ - mediul de cultura utilizat este bulionul glucozat 2%
Metoda dilutiilor in medii lichide
⚫ Se utilizeaza 10 tuburi cu bulion glucozat 1 ml in
fiecare tub. In primul tub se adauga 1 ml din sol de
antibiotic , se omogenizeaza si se trece 1 ml in al doi-lea
tub si asa mai departe pana pana in tubul 9 din care se
arunca 1 ml.
⚫ Se insamanteaza tuburile cu cate o picatura din
cultura de testat.
⚫ Tubul 10 este martor
⚫ Incubare 18-20 h la 370C
Metoda dilutiilor in medii lichide
⚫ Citire
⚫ Ultimul tub limpede reprezinta limita sensibilitatii
germenului fata de antibioticul utilizat sau CMI=
Concentratia Minima Inhibitorie.
⚫ Daca se adauga un indicator de ph cresterea
bacteriana este pusa in evidenta in 4 h prin virarea
culorii indicatorului de ph-ului.
 Concluzii
⚫ Antibiograma este una dintre cele mai utile
determinari de laborator care aduce informatii
pretioase privind atitudinea medicului in terapia cu
antibiotice.
⚫ Antibiogramele se vor repeta ori de cite ori o dicteaza
evolutia clinica dupa tratamentul cu antibiotice si
eventual se vor utiliza asociatii de antibiotice pentru a
obtine un efect terapeutic mai promt si prevenirea
instalarii rezistentei bacteriei la antibiotice si
chimioterapice.