MICROBIOLOGIE

LP 7
DEFINITIE : metoda de testare a sensibilitatii/ rezistentei la antibiotice si substante
chimioterapice, a unei tulpini bacteriene izolate si identificate, dintr-un prelevat
patologic.
INDICATIILE antibiogramei :
- in infectii cu etiologie bacteriana, determinate de germeni cu sensibilitate
variabila la antibiotice,
- in infectii bacteriene severe, sistemice (septicemii, endocardite, meningite,
peritonite etc) care necesita spitalizare si tratament de lunga durata,
- in infectii bacteriene localizate, cu tendinta la cronicizare (infectii urinare,
biliare, otice, osteomielite, escare etc) in care exista riscul selectarii de tulpini
rezistente la antibiotice, datorita persistentei indelungate in organism si supuse
permanent presiunii selective a diverselor scheme de administrare a antibioticelor,
- in infectii intraspitalicesti : determinate de tulpini bacteriene (Staphylococcus
aureus meticilino- rezistent/ MRSA ; Enterococcus faecium rezistent la
vancomicina/ VRE ; E. coli, Klebsiella pneumoniae producatoare de beta
lactamaze cu spectru extins/ ESBL ; Acinetobacter baumanni, Pseudomonas
aeruginosa multultidrog rezistenti etc,) selectate in sectii de terapie intensiva sau
diverse profile chirurgicale, datorita tratamentelor cu antibiotice cu spectru larg si
de lunga durata,
CONTRAINDICATIILE antibiogramei:
- agentul etiologic microbian are o sensibilitate cunoscuta si deocamdata
constanta : Ex : sensibilitate la penicilina a tulpinilor de Streptococcus pyogenes
(Str. beta hemolitic grup A),
in infectii cu evolutie clinica usoara, tendinta de vindecare spontana, in care
tratamentul antibiotic este standard, conform protocoalelor de tratament,
Conditii pentru obtinerea unor informatii corecte:
- stabilirea cu exactitate ca germenul izolat este agentul etiologic real (corelarea
rezultatelor microscopiei/ morfologia si colorabilitatea bacteriilor intra- si
extraleucocitare, cu caracterele culturale si manifestarile clinice),
* bacteriile izolate din situsuri anatomice normal sterile (LCR, sange, lichid pleural,
peritoneal, colectii inchise etc) sunt de cele mai multe ori, agentul cauzal al infectiei,
* bacteriile patogene izolate in culturi mixte, cu flora de asociatie saprofita, trebuie
diferentiate, identificate si testate pentru cunosterea sensibilitatii la antibiotice,
- germenul testat pentru aprecierea sensibilitatii la antibiotice si chimioterapice, trebuie sa
fie obligatoriu, in cultura pura,

METODE:
1. METODE DIFUZIMETRICE (KIRBY BAUER)
2. METODE CANTITATIVE: tehnica dilutiilor in medii de cultura solide sau
lichide, tehnica E- test, metode cu citire automata (Microscan, Vitek, ATB
Expression/bio Merieux etc)
1.

Tehnica difuzimetrica Kirby Bauer:

* Materiale necesare:
germenul de studiat (inocul),
- geloza Mueller Hinton (valoarea nutritiva permite dezvoltarea majoritatii
germenilor, nu contine inhibitori ai actiunii substantelor antimicrobiene),
- substante antimicrobiene: antibiotice si chimioterapice (microcomprimate de 6
mm, impregnate cu anumite cantitati, diferite, de substanta antibacteriana activa,

* Principiul metodei : consecutiv depunerii de microcomprimate impregnate cu

antibiotic pe suprafata unui mediu solid insamantat cu cultura bacteriana, au loc
urmatoarele procese fizico chimice :
- microcomprimatul absoarbe apa din mediu- necesara dizolvarii substantei
antimicrobiene active, care, ajunsa in solutie, va difuza in mediu conform legilor fizice ce
conditioneaza difuziunea moleculelor in gelul de agar, prezentand o scadere constanta a
gradientului de concentratie, de la marginea discului spre periferie. Sensibilitatea
bacteriei la un anumit antibiotic este apreciata dupa marimea diametrului zonei de
inhibitie a cresterii, din jurul microcomprimatului impregnat cu antibioticul de testat.
Cu tehnica difuzimetrica nu se pot testa decat germenii cu crestere rapida si
constanta.
* Standardizarea conditiilor tehnice si a reactivilor de lucru :
Fiecare din componentele ce concura la efectuarea antibiogramei pot influenta
diametrul zonei de inhibitie si, deci, criteriile de interpretare.
1. Mediul de cultura : geloza Mueller - Hinton
- asigura o dezvoltare buna a majoritatii germenilor patogeni cu crestere rapida,
- nu exercita antagonism fata de agentii antimicrobieni,
- contine concentratii adecvate de Ca si Mg,
- este izotonic pentru sangele care trebuie adaugat in anumite situatii (testarea
sensibilitatii streptococilor beta hemolitici, pneumococilor, neisseriilor, geloza
Mueller- Hinton se suplimenteaza cu sange berbec 5- 10%),
- pentru testarea sensibilitatii hemofililor, se utilizeaza pentru antibiograma un
mediu special, care contine factori de crestere, X, V,
- compozitie definita,
- asigura reproductibilitate de la lot la lot,
- compozitie standard si consistenta corespunzatoare,
- pH : 7,2 7,4,
- grosimea stratului de geloza : 4 mm (25 ml mediu pentru diametrul placii de 90
mm),
2. Germenul de testat :

agentul etiologic de testat sa fie in cultura pura,

contraindicata efectuarea antibiogramei din flora bacteriana mixta,
efectuarea antibiogramei indicata pentru acele specii bacteriene a caror CMI nu e
o constanta dinainte previzibila,
se testeaza numai bacteriile cu dezvoltare rapida, uniforma, si indeosebi, acelea
care au tendinta de a castiga rapid rezistenta fata de medicamentele de uz clinic,
antibiograma direct din produs se face in cazul produselor biologice normal sterile
si contaminate cu un singur germen ( LCR, hemocultura, lichid pleural, urina),
antibiograma efectuata imediat ce se izoleaza si identifica germenul ; stocarea
indelungata duce la aparitia determinantilor de rezistenta.

* Inoculul : - sa fie reprezentativ, preparat din 4 6 colonii identice,

- marimea inoculului riguros standardizata nefelometric (turbiditate standard : 0,5
unitati MacFarland),
- insamantarea inoculului pe placi se face la max 15 min de la momentul prepararii,
- cu ajutorul unui tampon steril de vata se inoculeaza placa, prin rotare in 3 directii
diferite, pana la acoperirea uniforma a suprafetei mediului,
- placile insamantate se lasa la temperatura camerei pentru uscarea inoculului
inainte de depunerea microcomprimatelor,
- daca inoculul si insamantarea placilor s-a efectuat corect, se obtine o cultura
bacteriana uniform confluenta.
3. Substante antimicrobiene :
- sunt comprimate cu diametrul de 6 mm, iar pe fata este imprimat simbolul
respectiv (simbolul denumirii antibioticului: A, TE, CIP, NOR etc, eventual
incarcatura de antibiotic pe microcomprimat : 1g, 5g30 g),
- conservarea microcomprimatelor : la adapost de lumina, caldura, umiditate,
- inainte de utilizare, se mentin la temperatura camerei 30 min pentru echilibrare
termica,
- interzisa folosirea comprimatelor cu termen de valabilitate depasit,
- selectionarea setului de microcomprimate pentru antibiograma :
- 2 sau 3 seturi prin combinarea truselor de microcomprimate distribuite :
- unul pentru germeni Gram pozitivi,
- unul pentru germeni Gram negativi,
- unul pentru infectii urinare,
- set de microcomprimate pentru bacili Gram (-) izolati din infectii digestive,
- asezarea spatiala a microcomprimatelor se face pe grupe de agenti antimicrobieni,
- depunerea microcomprimatelor se face cu pensa oftalmologica, tip Iris, presand
usor fiecare microcomprimat, pentru a ajunge toata suprafata lui in contact cu
cultura sau cu ajutorul unui dispozitiv numit dispencer ,
- se va respecta o distanta de 15 mm de la marginea placii si aprox. 24 mm intre
marginile comprimatelor sau 30 mm distanta intre centrele lor,
- pe o placa de 90 mm diametru se pot pozitiona 8 comprimate.
Placile de antibiograma se incubeaza la 37C, timp de 18- 20 ore, in aerobioza,
dupa care se efectueaza citirea.

Placile cu mediu Mueller Hinton cu 5- 10 % sange de berbec, folosite pentru

testarea sensibilitatii streptococilor, pneumocilor, meningococului etc, se incubeaza in
atmosfera aeroba, suplimentata cu 5% CO2 (exicator cu lumanare sau plicuri
geeneratoare de CO2).
In Laboratorul de Microbiologie Clinica se folosesc seturile mentionate, ale
caror antibiotice sunt strict necesare, in functie de felul germenilor si localizarea
infectiei.
* Citirea, exprimarea si interpretarea rezultatelor :
- se supun citirii numai placile care prezinta o cultura corespunzatoare dpdv al
puritatii si densitatii,
- citirea se efectueaza cu ochiul liber, masurand diametrul zonei de inhibitie, in
mm, de 2-3 ori, in diferite directii, cu o rigla,
- pe mediile fara sange masurarea diametrului se face direct pe fundul placii, in
lumina reflectata,
- daca s-a adaugat sange, zona de inhibitie se determina prin masurarea la suprafata,
in lumina reflectata, dupa indepartarea capacului cutiei Petri.
- exprimarea rezultatelor se face in acord cu standardul CLSI, prin incadrarea
marimii diametrului de inhibitie a cresterii culturii, in categoriile: sensibil/ S,
intermediar/ I, rezistent/ R.
se foloseste programul WHONET de interpretare si raportare a rezistentei
germenilor la antibiotice, bazat pe interpretarea conform Standardului CLSI 2008.
* Se iau in consideratie :
- colonii mari, bine dezvoltate, aparute in zona de inhibitie, colonii ce reprezinta
mutante rezistente in cadrul unei populatii microbiene, predominant sensibile.
- astfel de colonii se vor rerepica, identifica, retesta sensibilitatea la antibiotice.
Control de calitate : tulpini de referinta Staphylococcus aureus ATCC
25923, E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
-

* Surse de eroare :
alt mediu decat geloza Mueller Hinton,
mediu necontrolat din punct de vedere al pH ului,
folosirea microcomprimatelor cu termen de valabilitate depasit,
inocul nestandardizat,
depasirea intervalelor de timp intre prepararea inoculului si insamantare, intre
insamantare si aplicarea comprimatelor, intre aplicarea lor si incubare,
perioada de incubare prea scurta,
testarea pe culturi mixte, produse pluricontaminate, pe germeni cu dezvoltare
lenta,
citire inexacta a diametrelor zonelor de inhibitie sau transcrierea lor eronata,
lipsa controlului de calitate, cu tulpini de referinta.

2. Metode cantitative :
- antibiogramele cantitative exprima valoarea CMI si CMB:
* CMI: concentratia minima inhibitorie (cantitatea cea mai mica de antibiotic, capabila
sa inhibe dezvoltarea bacteriilor),
* CMB: concentratia minima bactericida (cantitatea cea mai mica de antibiotic care
determina efect bactericid).,
- CMI si CMB se exprima in mg/ L sau g/ mL
a)
Tehnica dilutiilor in mediu lichid:
- se prepara in bulion Mueller Hinton dilutii binare, de antibiotic (concentratii
descrescande de substanta antibacteriana),
- se adauga in fiecare tub cantitate fixa, standardizata ca densitate a inoculului, de tulpina
bacteriana de testat,
- se folosesc martori:
* Martor (+) de crestere a culturii/ bulion MH cu tulpina de testat, fara antibiotic
* Martor (-): bulion cu antibiotic, fara cultura bacteriana,
- incubare 18-20 ore la 37C,
! Ultima dilutie care a inhibat cresterea bacteriana corespunde valorii CMI (ultimul tub
ramas limpede)
Pentru determinare CMB se fac subculturi (treceri) pe medii solide, din tuburile
ramase vizibil limpezi (fara crestere bacteriana).
! CMB corespunde ultimei concentratii de antibiotic care a determinat distrugerea
completa a bacteriilor (efect bactericid).
* Interpretare:
- germenii care au un CMI <= 3 mg/L se considera ca sunt influentati de tratamentul cu
antibioticul respectiv si procesul inflamator are o evolutie favorabila,
* Indicatiile determinarii CMI:
- infectii sistemice, grave: septicemii, endocardite, meningite purulente, osteomielite etc.
b)
Tehnica dilutiilor in mediu solid:
- dilutiile de antibiotic se realizeaza in geloza Mueller Hinton,
- placa se imparte in cadrane, sub forma de sectoare de cerc: in fiecare sector se descarca
o ansa calibrata incarcata cu inocul standardizat (0,5 MacFarland), din tulpina de testat,
- incubare 18- 20 ore la 37C,
- CMI: sectorul de placa care contine ultima dilutie de antibiotic, ce inhiba cresterea
bacteriana,
* Curbele de concordanta: evidentiaza relatia existenta intre diametrul zonei de
inhibitie a cresterii si CMI.
c)

Tehnica E- test se bazeaz pe combinarea celor dou principii: de diluie i difuzie

a diferitelor gradiente de concentraii de antibiotic, n acelai timp. Ca n orice alt

metod bazat pe diluii, metoda E- test exprim direct, cantitativ, prin valori CMI, gradul
de sensibilitate microbian.
Stripurile de plastic E- test sunt marcate cu scala valorilor MIC n g/mL, iar gradientul
de antibiotic predefinit exponenial este fixat i stabilizat pe suprafaa stripului.
Cnd stripul este aplicat pe suprafaa mediului de cultur inoculat cu suspensia
bacterian standardizat nefelometric (0,5 1) are loc un transfer imediat al antibioticului
de pe suportul inert, de plastic, n mediul agarizat. Dup incubare, creterea bacterian a
devenit vizibil, mai puin n jurul unei elipse.