Lp. 15: Testarea sensibilităţii bacteriilor la antibiotice. Metoda difuzimetrică.

Tehnici
cantitative; fenotipuri de rezistență si importanța în practica medicală

Obiective:

1. Cunoaşterea celor 3 categorii de sensibilitate la antibiotice ale tulpinilor

bacteriene în vederea alegerii celei mai adecvate terapii

2. Cunoaşterea şi utilitatea practică a antibiogramei difuzimetrice – principiu,

indicaţii, necesar, procedură, citirea şi interpretarea, control de calitate,
avantaje şi dezavantaje.

3. Cunoaşterea şi utilitatea practică a metodelor cantitative de testare a

sensibilităţii bacteriilor la antibiotice.

1. Categorii de sensibilitate la antibiotice ale tulpinilor bacteriene:

 S – Sensibil la doze standard (expunere normala) – exista o probabilitate mare

de succes terapeutic la administrarea de antibiotic in doze standard

 I – Sensibil la expunere crescuta – exista o probabilitate mare de succes

terapeutic cand expunerea la antibiotic este crescuta, fie prin ajustarea
regimului de administrare a antibioticului, fie prin concentrarea antibioticului
la locul infectiei.

 R – Rezistent - exista o probabilitate mare de esec terapeutic chiar si in cazul

expunerii crescute la antibiotic.

Expunerea defineste influenta pe care modul de administrare, doza, intervalul dintre doze,
distributia si eliminarea antibioticului din organism o au asupra agentului etiologic la locul
infectiei.

2. Metoda difuzimetrică

Principiu: pe suprafaţa mediului Mueller-Hinton însămânţat uniform cu tulpina de testat

depunem microcomprimate cu diferite antibiotice; antibioticul difuzează circular în mediu,
realizând concentraţii descrescătoare; cultura este inhibată în zona în care antibioticul
realizează concentraţii ≥ concentratia minimă inhibitorie (CMI)

CMI = concentratia minimă de antibiotic care inhibă cresterea vizibila a unei tulpini
bacteriene.

Indicaţii: testarea uzuală a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor cu creştere rapidă.

Necesar şi procedură:

- realizarea unei suspensii a tulpinii de testat (folosind cultura pură) cu densitatea de

108 UFC/ml, apreciată cu standardul de 0,5 McFarland;

1
 - impregnarea cu această suspensie a unui tampon de vată steril cu ajutorul căruia se
însămânţează uniform suprafaţa mediului Mueller-Hinton;

- depunerea microcomprimatelor cu antibiotice;

- incubare la 35º ± 1° C, timp de 18 ± 2 ore;

- în cursul incubării, antibioticul difuzează circular în mediu, realizând concentraţii

descrescătoare în raport cu distanţa faţă de microcomprimat; cultura este inhibată în
zona în care antibioticul realizează concentraţii ≥ CMI.

Control de calitate: în paralel procedăm asemănător cu o tulpină de referinţă (ATCC –

American Type Culture Collection) cu sensibilitate cunoscuta la antibioticele testate, cu
ajutorul căreia verificăm respectarea condiţiilor standardizate de lucru (tehnica de lucru
si calitatea materialelor).

 Citire şi interpretare: diametrul zonei de inhibiţie a creşterii (mm), se compară cu

cele două diametre critice superior (D) si inferior (d) pentru definirea tulpinii ca
“S”, “I” sau “R”.

 Daca “D” si “d” au aceeasi valoare, categoria “I” nu se aplica in acel caz.

≥D ≤d

S I R
Rezistent
Sensibil la Sensibil la
expunere expunere
normala crescuta

Avantaje: posibilitatea testării simultane a sensibilităţii faţă de mai multe antibiotice

Dezavantaje: concordanţa redusa a rezultatelor obţinute prin metoda difuzimetrica cu
rezultatele testarii cantitative.
Notă: de subliniat timpul necesar pentru obtinerea unui rezultat final (primocultură, cultură
pură etc)
3. Metode cantitative

Principiu: un inocul standardizat al tulpinii testate este însămânţat într-un gradient

discontinuu de concentraţii de antibiotic; după incubare este urmărită CMI.

Indicaţii:

- precizarea categoriei de sensibilitate a unei tulpini clasificate in categoria “I” prin

antibiograma difuzimetrică;

2
 - determinarea sensibilităţii bacteriilor fastidioase;
- testarea sensibilitatii S. aureus faţă de vancomicină si teicoplanina
- testarea sensibilitatii bacililor Gram-negativi la colistin.

a. Metoda microdiluţiilor în mediu lichid

Necesar şi procedură:

- realizarea de diluţii duble succesive de antibiotic în bulion Mueller-Hinton;

- se adaugă un volum fix din suspensia de 5x105UFC/ml a tulpinii de testat;
- se utilizează un martor cultivare şi un martor sterilitate mediu;
- incubarea mediilor la 35 ± 1° C, timp de 18 ± 2 ore.

Control de calitate: în paralel procedăm asemănător cu o tulpină de referinţă (ATCC), cu

ajutorul căreia verificăm respectarea condiţiilor standardizate de lucru

Citire şi interpretare:
 CMI corespunde celei mai mici concentraţii de antibiotic (µg/mL), care determină
inhibarea vizibilă a creşterii, comparativ cu martorii pentru cultivarea tulpinii şi
sterilitatea mediului;
 raportăm această valoare la cele două concentraţii critice, maximă (C) şi minimă (c)
pentru definirea tulpinii ca S, I sau R.
Rezultatul este formulat după ce am verificat dacă, CMI a tulpinii de referinţă se
încadrează între valorile recunoscute de standard.

≤c ≥C

S I R
Sensibil la Sensibil la Rezistent
expunere expunere
normala crescuta

Avantaje: determinarea cu exactitate a CMI.

Dezavantaje: realizarea testării faţă de un singur antibiotic, cu un consum mai mare de

materiale.

3
 https://www.sciencedirect.com/topics/immunology-and-microbiology/broth-dilution
Fig 1. Metoda microdilutiilor in bulion

b. Testul E
 îmbină acuratețea testării cantitative și simplitatea testării difuzimetrice cu mare
economie de timp;
 pe o suprafață a unei benzi inguste din plastic inert este fixat un gradient
exponențial de antibiotic, cu marcarea scalei de lectură corespunzătoare CMI (în
µg/ml);
 benzile cu antibiotic sunt depuse radiar pe suprafața unei plăci cu mediu agar
Mueller Hinton, preînsămânțată cu tulpina testată în condiții standardizate. După
incubarea corespunzătoare, CMI este indicată de intersecția dintre zona elipitică
de inhibiție a culturii și scala de gradiente a benzii;
 testul este fiabil, reproductibil și permite determinarea concomitentă, a CMI
pentru mai multe antibiotice.

http://austinpublishinggroup.com/microbiology/fulltext/ajm-v1-id1002.php

Fig 2. Determinarea CMI prin metoda E test

Bibliografie:
http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/

4
Buiuc D, Microbiologie Medicală, Ghid pentru studiul şi practica medicinei, ed. a VI-a,
Editura “Gr. T. Popa” Iasi, 2003. cap 7.

In sala se gasesc:
- placi cu antibiograma difuzimetrica pentru S. aureus si E. coli (tulpini izolate de la
pacienti si tulpini ATCC)
- stripuri microdilutie
- placi cu E-teste
- rigle,
- tabele interpretare conform EUCAST 2019 (pentru metoda difuzimetrica si pentru
metoda microdilutiilor)
- flacon cu mediu Mueller Hinton deshidratat
- pentru demonstrarea tehnicii de lucru: cultura in patru cadrane a unei tulpini de
testat, placi cu mediu Mueller Hinton neinsamantate, standard 0.5 McFarland, ser
fiziologic steril, eprubete, microcomprimate cu antibiotice, anse, tampoane de vata,
pensa, spirtiera, recipient cu dezinfectant.