Testarea sensibilitatii bacteriilor

la antibiotice

 Testarea sensibilitatii bacteriilor la antibiotice.

Metoda difuzimetrica.
Determinarea CMI, CMB, metoda dilutiilor, Etest.
Metode automate de determinare a
sensibilitatii bacteriilor la antibiotice.
Supravegherea tratamentului cu antibiotice.
Determinarea NEI, NEB

Terapia antibacteriana
Este necesara?
Infectie bacteriana vs virala (prot C reactiva, leucograma,
formula leucocitara, VSH etc)

Este identificat microorg infectant?

Etiologie probabila, pe baza datelor clinico-epidemiol: terapie
aleasa in functie de profilul actual de sensibilitate a microorg
la atb, in zona respectiva
Etiologie stabilita prin tehnici rapide de diagn (microscopie,
detectie Ag/ acizi nucleici): idem
Etiologie cunoscuta: terapie in functie de rezultatele
antibiogramei si rationamentul clinic

Rezistenta la Antibiotice
A. Naturala caracter de specie

Permeabilitate redusa a peretelui bact

Absenta tintei (micoplasme vs lactamine, anaerobi vs aztreonam)
Inactivarea prin enzime constitutive (Klebsiella vs aminopeniciline)

B. Dobandita caracter de tulpina

Scaderea permeabilitatii peretelui celular

Eliminarea rapida a Atb
Modificarea structurii tintei
Inlocuirea tintei cu o alta molecula
Inactivarea enzimatica a Atb

Relatia antibiotic - bacterie

Definita
in vitro
CMI
CMB

in vivo tulpini
Sensibile
Rezistente
Intermediare

Criterii de evaluare a necesitatii

testarii sensibilitatii la atb
Relevanta clinica a izolatului
Selectia Atb de testat - atb care realizeaza
concentratii active in focarul infectios si fata de care
izolatul nu prezinta rezistenta naturala
Utilizarea unor metode standardizate de testare
Mediu de cultura
Inocul (reprezentativ, puritate, densitate de bact viabile)
Conditii de incubare (timp, temperatura, atmosfera)

Relatia antibiotic bacterie in vitro

concentratia minima inhibitorie (CMI)
cantitatea minima de antibiotic care inhiba
cultivarea unei tulpini bacteriene in conditii
standardizate
concentratia minima bactericida (CMB)
cantitatea minima de antibiotic care omoara
cel putin 99,9% din bacteriile unei tulpini in
conditii standardizate

Relatia antibiotic - bacterie

Atb bactericide CMB/CMI < 4
Atb bacteriostatice CMB/CMI 4
Tulpini tolerante CMB >> CMI

Testarea sensibilitatii la Atb a unei

tulpini bacteriene metode cantitative
Determinarea CMI
Metoda de referinta
Principiu: un inocul standardizat al tulpinii testate este
insamantat intr-un gradient discontinuu de concentratii
cunoscute de atb
Indicatii
Infectii severe cu tulpini cu rezistenta intermediara la unele
Atb
Sensibilitatea la penicilina a pneumococilor izolati din
sange sau LCR
Rezistenta S aureus la vancomicina

Testarea sensibilitatii la Atb a unei

tulpini bacteriene metode cantitative
Determinarea CMB
Indicatii
Infectii severe , atunci cand este necesar efect bactericid
Depistarea tolerantei la atb

Testarea sensibilitatii la Atb a unei

tulpini bacteriene metode cantitative
a. Metoda dilutiilor in mediu lichid
Necesar
bulion Mueller Hinton
Solutii stoc atb
Cultura in faza exponentiala a tulpinii de testat
Cultura in faza exponentiala a tulpinii de referinta
Etalon 0,5 McFarland (BaSO4)

Testarea sensibilitatii la Atb a unei

tulpini bacteriene metode cantitative
a. Metoda dilutiilor in mediu lichid
Procedura
Realizarea dilutiilor binare succesive ale Atb in bulion Mueller
Hinton
Prepararea inoculului pentru tulpina de testat si cea de referinta
Insamantarea tuburilor
incubare la 35 C, 16-24 ore
Control de calitate
Cultivare
Controlul sterilitatii mediului
Tulpina de referinta
Citire CMI (dupa verificarea martorilor) concentratia cea mai mica
de Atb care inhiba vizibil cresterea bacteriana

Testarea sensibilitatii la Atb a unei

tulpini bacteriene metode cantitative
a. Metoda dilutiilor in mediu lichid determinarea CMB

Procedura
Realizarea dilutiilor binare succesive ale Atb in bulion Mueller Hinton
Prepararea inoculului pentru tulpina de testat si cea de referinta
Insamantarea tuburilor
incubare la 35 C, 16-24 ore
Cuantificarea bacteriilor viabile din
inoculul initial
tuburile fara crestere vizibila (>CMI) inoculare placi cu agar M-H,

Control de calitate
Cultivare
Controlul sterilitatii mediului
Tulpina de referinta
Citire CMB (dupa verificarea martorilor) concentratia cea mai mica de
Atb care omoara 99,9% din bacteriile inoculate

Testarea sensibilitatii la Atb a unei

tulpini bacteriene metode cantitative
b. Metoda dilutiilor in mediu solid
Necesar
Cultura in faza exponentiala a tulpinii de testat
Cultura in faza exponentiala a tulpinii de referinta
Dilutii succesive ale Atb in agar Mueller - Hinton
Incubare la 35 C, 18-24 ore
Control de calitate
Cultivare
Controlul sterilitatii mediului
Tulpina de referinta
Citire CMI (dupa verificarea martorilor) concentratia cea mai mica
de Atb care inhiba vizibil cresterea bacteriana, comparativ cu
martorii

Testarea sensibilitatii la Atb a unei

tulpini bacteriene metode cantitative
c. E-test
- banda care contine un gradient exponential de atb si scala de
citire (g/ml)
- Placa cu mediu solid insamantata cu inoculul standardizat al
tulpinii de testat

Testarea sensibilitatii la Atb a unei

tulpini bacteriene metode cantitative
d. Metode automate
- galerii comerciale cu gradiente exponentiale de concentratii
de atb (diferentiate pentru variate categorii de bact)
- Insamantare automata cu inoculul standardizat al tulpinii de
testat ; incubare
- Citire automata (4-5 ore) si vizuala (24 ore)
- Interpretare automata sisteme expert

Relatia antibiotic - bacterie

in vivo tulpini
Sensibile la un Atb administrarea Atb in doze
uzuale asigura cu mare probabilitate succes
terapeutic
Rezistente la un Atb administrarea Atb in doze
uzuale se asociaza cu mare probabilitate cu esec
terapeutic
Intermediare efectul terapeutic se obtine numai
in anumite conditii (cresterea dozelor,
administrare/ concentrare locala a Atb)

Relatia antibiotic - bacterie

in vivo tulpini
Sensibile CMI < 2-4 ori mai mic decat nivelul mediu
de Atb in ser
Rezistente CMI > nivelul mediu de Atb in ser
Intermediare CMI apropiat de nivelul mediu de Atb
in ser
categorii definite de concentratii critice (puncte de
ruptura);
Ex.: concentratiile critice ale penicilinei pentru infectii
pneumococice (non-meningite): 0.06 g/ml si 2 g/ml; tulpinile S
au CMI< 0.06 g/ml , cele R 2 g/ml

Testarea sensibilitatii la Atb a unei

tulpini bacteriene metode calitative
Antibiograma difuzimetrica
Principiu: o cantitate precisa de atb (microcomprimat) este
depusa pe suprafata unui mediu de cultura solid preinsamantat
cu un inocul standardizat al tulpinii de testat; in cursul incubarii
au loc concomitent doua fenomene
Cresterea bacteriilor
Difuzarea atb in mediu, cu realizarea unor concentratii
descrescatoare proportionale cu distanta fata de microcompr
Bacteriile nu cresc in zonele unde concentratia de atb > CMI
(diametrul zonei de inhibitie este invers proportional cu CMI)

Testarea sensibilitatii la Atb a unei

tulpini bacteriene metode calitative
Antibiograma difuzimetrica
Indicatii: Metoda uzuala de testare a unui nr redus de tulpini
bact aerobe sau facultativ anaerobe cu crestere rapida
Necesar
Cultura in faza exponentiala a tulpinii de testat
Cultura in faza exponentiala a tulpinii de referinta
Agar Mueller - Hinton
Microcomprimate cu concentratii standardizate de Atb
Etalon 0,5 McFarland

Testarea sensibilitatii la Atb a unei

tulpini bacteriene metode calitative
Antibiograma difuzimetrica
Procedura
Prepararea inoculului tulpinii de testat ; idem pentru
tulpina de referinta
Insamantarea pe agar Mueller - Hinton
Depunerea microcomprimatelor cu concentratii
standardizate de Atb
Incubare la 35 C, 16-24 ore
Control de calitate
Tulpina de referinta

Testarea sensibilitatii la Atb a unei

tulpini bacteriene
Antibiograma difuzimetrica
Cultura - inhibata in zona in care concentratia Atb CMI
Citire masurarea diametrului zonei de inhibitie
Interpretare comparare cu valorile diametrelor critice din
tabele interpretative; incadrare intr-una din categoriile
Sensibil, Intermediar, Rezistent

Antibiograma pe cultura primara

Principiu ca la atb-grama difuzimetrica, dar inoculul este un
prelevat patologic normal necontaminat (LCR, exsudate din
cavitati inchise)
Indicatii: testare preliminara in meningita purulente, ITU
Procedura: ca la atb-grama difuzimetrica pe subcultura
standardizata, dar se insamanteaza 0,1 ml din prelevatul
patologic omogenizat
Control de calitate: tulpina de referinta

Criterii in initierea si conducerea

terapiei cu Atb
1. Aprecierea necesitatii tratamentului Atb

Infectii bacteriene vs virale vs stari febrile de cauze neinfectioase

2. Recoltarea probelor biologice pentru ex microbiologic,

inainte de initierea terapiei cu Atb
3. Testarea sensibilitatii in vitro la antibiotice
4. Alegerea Atb

Sensibilitatea agentului etiologic (criterii clinice, epidemiol,

laborator)
Localizarea infectiei
Particularitati individuale: varsta, stari fiziologice (sarcina), boli
asociate ( insuf renala, hepatica etc), reactii de sensibilizare,
status imun (imunodepresii)
Criterii ecologice
Cost

Criterii de utilizare a asocierilor Atb

Terapie de prima intentie a unor infectii severe
Infectii mixte
Obtinerea unui efect sinergic (ef antibacterian mai
mare decat suma efectelor atb asociate)
Prevenirea selectarii de mutante rezistente (Rif, ac
fusidic etc)

Teste de monitorizare a
tratamentului antimicrobian
Metode rapide
Dozare prot C reactiva, procalcitonina
Dozare Atb in ser/ umori

Metode microbiologice determinarea activitatii

antibacteriene a serului sangvin: NEI si NEB

Teste microbiologice de monitorizare a

tratamentului antimicrobian
Determinarea nivelului de eficienta inhibitorie (NEI) sau
bactericida (NEB) a serului
Principiu: masurarea efectului dilutiilor de ser asupra
tulpinii izolate de la pacient
Indicatii: monitorizarea tratamentului atb in infectii
severe, cand este urmarit efectul bactericid
(meningite, endocardite, osteomielite, septicemii)
Proba de ser (dupa 2-3 adm): NEB minim si NEB
maxim