TESTAREA SENSIBILITATII LA SUBSTANTELE ANTI-

TESTAREA SENSIBILITATII
TUBERCULOASE. LA
METODE FENOTIPICE
SUBSTANTELE ANTI-TUBERCULOASE.
METODE FENOTIPICE- mediul solid
Daniela Homorodean

Daniela Homorodean
Întrebări la începutul sesiunii de curs:
Care din următoarele afirmații privind testarea sensibilitatii
micobacteriilor nu este adevărată?
1. Antibiograma este obligatorie pentru toate cazurile noi si recidive, cu culturi
pozitive > de 10 col.
2. In mod natural tulpinile de M.tuberculosis sunt tulpini sensibile „in vitro” la
concentratiile critice folosite pentru toate subst anti-tb.
3. Tehnica directa foloseste ca inocul cultura bacteriana
4. Acuratetea rezultatelor ABG variaza in functie de substanta testata si mediul
de cultura.
 Plan de prezenrtare
• Istoric
• Principiul ABG
• Necesitatea efectuarii ABG
• Metode de testare
• Citirea si interpretarea rezultatelor
• Asigurarea calitatii
• Surse de eroare
 ABG- istoric
• 1945-1962: medicamente anti-TB

• 1963/1969: standardizarea ABG: Canetti G, Meissner G,

Fox W, Komenko A, Mahler HT, Menon NK, Mitchison DA,
Rist N, Smelev NA, Froman S., Grosset J., Hauduroy P.,
Miloslava L, Sula L.

• 1983: Roberts si col- ABG metoda radiometrica

Principiu

Compararea cresterii bacteriene de pe tuburile cu mediu care

contine substante antituberculoase cu cresterea bacteriana de pe
tuburile fara substante anti-TB (tuburi martor, control)

In mod natural tulpinile de M.tuberculosis sunt tulpini sensibile „in

vitro” la concentratiile critice folosite pentru toate subst anti-tb.

Populatiile micobacteriene din tulpinile de M.tuberculosis sunt

heterogene, alcatuite din diverse sub-populatii, cu mutanti rezistenti la
substantele anti-tb.
 Remarci
• ABG necesara pentru confirmarea/ excluderea rezistentei

• Necesare conditii de biosiguranta nivel 3.

• ABG linia 1 - pentru toate cazurileTB cu > de 10 colonii in cultura primara

• ABG linia 2 - pentru toate cazurile MDR > de 10 colonii in cultura primara

• Se testeaza prin metodele prezentate doar MTBC

• Nu se testeaza NTM pe trusele pentru testarea MTBC!!!!

 Tulpini sensibile

• Inhibate de concentratiile critice de anti-tb, similare cu concentratiile

realizate in corpul pacientului prin administrarea tratamentului.

Tulpini rezistente

• Cresc in prezenta concentratiilor critice de anti-tb, depasind proportia

critica

Conc critice de subst anti-TB si proportia critica a mutantilor rezistenti

trebuie sa permita discriminarea intre probabil sensibil si predominant
rezistent
Tehnici de testare

directa – foloseste ca inocul produsul patologic cu continut

mare de BAAR, dupa ce produsul a fost decontaminat.

indirecta – foloseste ca inocul cultura micobacteriana.

 METODE CONVENTIONALE-fenotipice
• Metoda proportiilor

• Metoda ratiei de rezistenta

• Metoda concentratiilor absolute

• BACTEC 460 radiometric/MGIT

 METODE CONVENTIONALE-fenotipice
• Metoda proportiilor

• Metoda ratiei de rezistenta

• Metoda concentratiilor absolute

• BACTEC 460 radiometric/MGIT

Tulpina MDR: rezistenta la INH si RMP

M M INH RMP

0,2 40
 METODE CONVENTIONALE-fenotipice
• Metoda proportiilor

• Metoda ratiei de rezistenta

• Metoda concentratiilor absolute

• BACTEC-MGIT
 Metoda de testare
• Sa permita discriminarea intre culturi Probabil sensibile- inainte de tratament
(putem intalni rezistenta primara!!!!) si Predominant rezistente- care contin o
proportie mare de mutanti cu rezistenta.

• Realizarea inoculului este etapa critica (mai ales pt met proportiilor!)

 Metoda proportiilor
• Trebuie folosita de personal instruit si experimentat

• Timpul necesar este mult mai mare decat pentru met conc abs prin realizarea
suspensiei initiale, dilutii seriale, insamantare, citire cu numararea coloniilor,
calcularea %.

• Proportia critica este stabilita arbitrar, prin consens, considerand relevanta

clinica pentru stabilirea punctului de ruptura (CMI).
 Metoda proportiilor
Importanta realizarii suspensiei bacreriene corecte

Dispersare corecta Grunji nedispersati

Martor 1 colonie Martor 1 colonie

10 col=10 UFC = 10% 10 bacilli in 5 UFC = 20%
Limitari

• Acuratetea rezultatelor ABG variaza in functie de substanta

testata si mediul de cultura

• Predictia rezultatelor depinde de actiunea bactericida a

medicamentelor din regimul terapeutic folosit pentru pacient.

• Este necesara legatura oficiala intre LNR si LSR pt asigurarea

expertizei organizarii lab, prelucrarea produselor, bio-siguranta,
POS, echipament si CEC.
RMP & INH rezultate cu cea mai buna acuratete si reproductibilitate.
Reproductibilitate slaba pentru SM, EMB, PZM ETM.

RMPr este indicator pentru MDR- monorezistenta intalnita la < de 0,5% din cazuri

ABG rapida (in mediul lichid - necesara pt identificarea pacientilor cu risc MDR,
ca prima prioritate a PNCT.
• Complexa si scumpa.
ABG linia 2-a
• Complexa si scumpa

• Analizate rezultatele obtinute cu met comerciale in mediul lichid si MP in

mediul LJ.
• MCA si MRR in mediul solid nu au fost validate de OMS pentru ABG L 2.

• ABG in mediu lichid in sisteme automate este standardul de aur

recomandat pentru ABG L 2 in acest moment.

• ABG pentru linia 2 nu este recomandata de rutina daca nu sunt

realizate conditii de infrastructura si capacitate a laboratorului, CEC
riguros, cu rezultate bune demonstrate.
• Se recomanda ca ABG linia 2 sa fie efectuata numai daca
se efectueaza anual cel putin 200 teste pentru bolnavii la
mare risc de MDR- pentru mentinerea calitatii rezultatelor.

• Pt AG, polypeptidele si FQ se obtin rezultate relativ bune ca

reproductibilitate si incredere, permitand un diagnostic de
calitate pentru XDR-TB.

• Nu pot fi garantate rezultate de calitate pentru ETM, PTM,

CS, terizidone, Pas, clofazimine, AMC, CLM, LZ, de aceea
nu este recomandata ABG de rutina pentru acestea.
 ABG- met concentratiilor absolute- practic
Fiecare lot de mediu testat de control cu tulpina de referinta H37Ra

Suspensia bacteriana se face in 2ml ADS sau SFS racland cu ansa un

numar cat mai mare de colonii. (DE CE?)

Suspensia se etaloneaza prin comparare cu un etalon turbidimetric ce

corespunde la McFarland 1

Din suspensia corect etalonata se face dilutia 1/200 (o picatura= 0,05ml)

în 10 ml ADS

Din dilutia1/200 se insamanteaza 2 tuburi martor si tuburile RMP & INH cu

cate 0,2ml
Dupa inoculare, tuburile se aseaza in termostat in pozitie inclinata cu
capacul semi-insurubat pentru evaporarea partii lichide din inocul

Dupa 48-72 ore tuburile se ridica in pozitie verticala

Planifica data citirii

Citirea se face la 21 zile (28 zile) apreciind rezistenta sau sensibilitatea

prin compararea cresterii din tubul test cu cea din tuburile martor

Citirea, finalizarea si Comunicarea rezultatelor se face numai daca pe

tuburile martor sunt cel putin 50 colonii (sub-etalonat) si nu mai mult de
200 colonii (inocul supra-etalonat).
 Aspecte de verificat inainte de test

• Culturi de 21-30 zile de la insamantare sau 10 zile dupa observarea

cresterii

• Culturile imbatranite necesita subcultivare. (CUM PROCEDAM ?)

• Se analizeaza caracterele morfologice macroscopice ale culturii (LJ)

• Din fiecare cultura de testat se face frotiu colorat Ziehl-Neelsen (DE CE?

• Daca in frotiul din cultura nu se observa morfologia tipica microscopica se

repeta testul de identificare ( AgMPT64). Nu se insamanteaza daca frotiul
indica prezenta de microbi de contaminare.
Interpretarea rezultatelor, met conc absolute

Sensibilitate – absenta cresterii sau mai putin de 20 colonii pe tuburile

cu anti-TB

Rezistenta – crestere pe tubul cu anti-TB asemanatoare cu cea de pe

martor.

Neinterpretabil - pe tubul martor cresc <50 col. sau >200 col.

Contaminare - au crescut microbi de contaminare care altereaza

rezultatele (denota deficienta de tehnica)
 Surse de eroare
• tulpini mai vechi de 21-30 zile

• etalonarea incorecta

• concentratii necorespunzatoare a subst anti TB

• Inactivarea/inomogenitatea subs anti-TB

• insamantare incorecta

• temperatura de incubare cu variatii

Metoda proportiilor- etape
Pregătirea materialelor
Prepararea şi etalonarea suspensiei bacteriene- etapa critica
Diluarea suspensiei bacteriene- etapa critica
Citirea şi interpretarea rezultatelor – etapa critica
Citirea antibiogramei

• Prima citire se face după 28 de zile de la însămânțare. Se începe cu

citirea rezultatelor pentru tulpina M. tuberculosis ATCC 25177, H37 Ra
pusă în lucru pentru fiecare lot nou de mediu.
• La interpretarea rezultatelor tuturor ABG care folosesc același lot se va
face referire la această citire.
• numără coloniile crescute pe tuburile de control corespunzătoare
diluțiilor 10-3 şi 10-5 notând media numărului de colonii.
• numără coloniile crescute pe tuburile test corespunzătoare diluțiilor 10 -3
şi 10-5.
• scrie numărul exact de colonii în registru și calculează proporția dintre
numărul coloniilor crescute pe tuburile test și pe tuburile de control cu
aceleași diluții. Scrie proporția calculată. În cadrul aceleiași diluții: nr
colonii de pe tubul test x 100/ media numărului de colonii de pe tuburile
martor.
Interpretarea rezultatelor – 28 zile
•Dacă pe tuburile test la nici una din diluțiile bacteriene nu este creștere
bacteriană, se consideră tulpina SENSIBILĂ și se poate elibera rezultatul -
Sensibil

•Dacă creșterea pe tuburile test este mai mare decât 1% din media numărului
coloniilor de pe tuburile martor se consideră că tulpina este REZISTENTĂ la acea
substanță antituberculoasă.

•Daca cresterea de pe tuburile test este < de 1% fata de control, se prelungeste

incubarea, cu titire la 42 zile
Interpretarea rezultatelor – 42 zile
•Dacă pe tuburile test cresterea este mai mica < de 1% fata de control, se
consideră tulpina SENSIBILĂ și se elibereaza rezultatul - Sensibil

• Atentie – pentru rezultat interpretabil, numarul de colonii de pe tuburile control

cu inoculul cel mai bogat (10 -3) trebuie sa fie mai mare de 50, ideal peste 100.

•Dacă creșterea pe tuburile test este mai mare decât 1% din media numărului
coloniilor de pe tuburile martor se consideră că tulpina este REZISTENTĂ la acea
substanță antituberculoasă.
 Asigurarea calitatii ABG
1. CIC
• acopera toate procedurile de laborator
• permite monitorizarea acuratetei si reproductibilitatii rezultatelor

2. CEC
• apreciaza capacitatea lab de a oferi rezultate de incredere prin
comparare cu rezultatele altor lab
• necesara concordanta de cel putin 90% pentru fiecare subst la
tulpinile de control in cel putin 2 din ultimele 3 runde.

3. Imbunatatirea calitatii
 Asigurarea calitatii - CEC
CEC - retestarea oarba, periodica a unui panel de tulpini codificate

LNR - sustinute de reteaua LSR

LAB nu ar trebui sa efectueze proceduri pentru care nu au realizat

conditii de calitate cu ocazia CEC (PT)

In cazul ABG MTB - mai importanta acuratetea rezult decat rapiditatea

 ASIGURAREA calitatii, practic
CIC
• obligatoriu pentru fiecare lot nou de mediu
• tulpina de referinta H37Ra (managementul tulpinii!)
• evidenta data prepararii, expirarii mediului

CEC- national
• obligatoriu pentru toate lab care fac ABG
• efectuat de lab supraordonat-LNR

CEC- international
• efectuat de LSR Stockholm pentru Romania

IMBUNATATIREA CALITATII
Factorii care influenteaza rezultatele ABG-1
• Cultura primara- Varsta culturii, Numarul de colonii, Numarul de pasaje-
(subcultura repetata distorsioneaza profilul tulpinilor comparativ cu al culturii primare)

• Metoda folosita - Metodele actuale au predictie slaba asociata cu relevanta

clinica si reproductibilitatea scazuta a rezultatelor, totusi MP este considerata
standardul de aur.

• Viabilitatea bacteriilor : Suspensia bacteriana, Etalonarea inoculului, Diluarea

suspensiei bacteriene

• Calitatea mediilor: pH, stabilitatea substantelor in mediu

• Concentratiile critice de substante anti-TB in mediu, substante pure, solvent si

diluent adecvat, dilutii corecte

• Temperatura de coagulare/ stocare a mediului, incubarea ABG- strict controlate

Factorii care influenteaza rezultatele ABG-2

Conditiile de transport si pastrare a mediului ABG dupa receptia in lab

Insamantarea mediilor

Conditiile de incubare (stabilitatea temperaturii din termostat)

Citirea/interpretarea rezultatelor