Schema minimala de identificare

fenotipica a Complexului
M tuberculosis

Daniela Homorodean
Întrebări la începutul sesiunii de curs:
Care din următoarele afirmații privind identificarea micobacteriilor nu
este adevărată?
1. Examenul microscopic este obligatoriu pentru identificarea micobacteriilor
2. Coloratia de electie pentru identficare din culturi este auramina-rhodamina
3. Identificarea apartenentei la Complexul M tuberculosis este obligatorie doar
pentru prima cultura pozitiva
4. Culturile cu rezultat negativ la testul AgMPT64 se trimit imediat la LNR pentru
identificare
5. Testul Ag MPT64 are sensibilitate si specificitate de 100%
 Planul prezentarii

• Etapele identificarii
• Examenul macroscopic al culturii
• Examenul microscopic- preparare, citire, interpretare
• Formularea rezultatului
Examen morfologic macroscopic al culturilor
Mediul LJ
M.tuberculosis – colonii R (Rough)- rugoase- conopidiforme,
eugonice sau disgonice colorate crem- galbui

M.bovis/M. canetti – colonii S (Smooth) disgonice alb-galbui

NTM – colonii S sau R, albe, galbui, portocalii, gri, roz.

Examen morfologic macroscopic al culturilor
Mediul lichid Middlebrook

• Grunji resuspendati prin agitare usoara- MTB, streptococi, uneori fungi

• Tulbure unifrom- NTM, coci, bacili , uneori fungi

 Prepararea frotiurilor pentru identificare

a. Cultură pe mediul LJ

1. marchează lama cu nr culturii

2. pune o pic. de ADS sau albumină adezivă pe lamă folosind pipetă
3. ia cu ansa din 1 colonie și amestecă blând în lichidul de pe lamă,
fără a stropi
4. usucă la aer, pe plita cu termostatare (65-700C) și așteaptă c.p 2 h
5. coloreaza ZN
6. examineaza la microscop optic (ob 10x apoi 100x)
 Prepararea frotiurilor pentru identificare
Cultură din mediul lichid Middlebrook

1. marchează lama cu numărul culturii

2. agită manual tubul cu cultură. Lasa 5` să sedimenteze aerosolii infecţioşi.
3. pune o picătură mica de albumină adezivă pe lama folosind pipetă
4. ia cu pipeta cca 100 μl din cultură și amestecă blând în albumina adezivă
depusă pe lamă, fără barbotare.
5. usucă la aer, pe plita cu termostatare (65-750C) și așteaptă cp 2 h
5. coloreaza ZN
6. examineaza la microscop (ob 10x apoi 100x)
 Examen morfologic microscopic din culturi
(frotiu colorat Ziehl-Neelsen)

M.tuberculosis – PC, PG

M.bovis, M. canetti – gramezi BAAR

NTM – BAAR, cocoizi sau bacili lungi,

cianofili, dispersati, asezati
nesistematizat sau uneori corzi laxe
 Identificarea culturilor- de retinut
Frotiurile din culturi se colorează exclusiv ZN.

Culturile pentru care frotiul indică prezenţa BAAR se testează obligatoriu

pentru confirmarea apartenenţei la complexul M. tuberculosis

Se foloseste test rapid imunocromatografic Ag MPT64.

Culturile cu rezultat negativ Ag MPT64 se trimit imediat la LNR pentru

identificare de specie.
 De retinut -1
• Indiferent de metoda de preparare a frotiurilor, ele se lasa la aer pentru
uscare, ferite de raze UV, pe plita cu termostatare din interiorul CPM

• Toate materialele folosite (pipete, anse, tuburi) se colectează în recipente

pentru materiale infecțioase și se autoclavează.
• După colorare usucă frotiurile în poziție înclinată pe suport de lame la
temperatura camerei.
• Nu încălzi lamele pentru grăbirea uscării pentru că frotiul se poate crăpa şi
se dezlipeşte de pe lama.
 ATENTIONARI - 2
La prepararea frotiurilor din culturi se pot genera o cantitate
mare de aerosoli infecţioşi.
• Se respectă obligatoriu precauţiile de prevenire a
generării şi răspândirii aerosolilor infecţioşi.
• Chiar dacă se prepară mai multe spoturi pe aceeaşi lamă,
acestea trebuie să fie din aceeaşi cultură, nu din culturi
diferite, pentru a nu se contamina încrucişat în etapele de
colorare, prin prelingere de pe un spot pe altul, cu rezultat
fals pozitiv.
 Testul imunocromatografic - AgMPT64

Principiul testului
Caracterizarea biochimică, imunologică și moleculară a MTB a dus la
evidențierea mai multor antigene utile în identificarea bacteriilor
aparținând complexului M. tuberculosis

Testul de identificare a Ag MPT64, pus în evidență în lichidul culturilor

bacteriene de MTB, foloseste anticorpi monoclonali anti-MPT64
proveniți de la șoareci, în test de tip sandwich
 Testul imunocromatografic - AgMPT64

Descrierea testului

Testul conține un godeu pentru probă și o porțiune absorbantă cu liniile T

= test și C = control

Linia control este utila pentru validarea reacției, fiind colorată în roșu doar
dacă tehnica a fost corect aplicată și reactanții sunt funcționali

Linia test se colorează în roșu daca este prezent Ag MPT64 în suspensia

bacteriană
 Testul imunocromatografic - AgMPT64
Păstrare

La temperatura camerei, între 1-300C (nu se congelează)

Nu se ține la lumină directă, este sensibil la căldură și umiditate

Testul se va folosi imediat după scoaterea din pachet

Nu se va utiliza după expirarea valabilității

 Prepararea suspensiei bacteriene

Culturile în mediul lichid pot fi folosite ca atare, depunând 100 μl din

cultura pozitiva BAAR în godeul pentru probă

Culturile în mediul solid se prepară astfel:

• se suspendă 3-4 colonii în 200 μl soluție de extracție, sau
• 100 μ lichid de condens de la baza pantei mediului solid
 Procedura de lucru
• Scoate caseta din pachet și se așează pe o suprafață netedă, uscată

• Marchează caseta cu numărul culturii de cercetat

• Depune 100 μl în godeul pentru probă

• Urmărește colorarea în roșu-violet a benzilor C si T

• Interpreteaza rezultatul la 15 minute de la depunerea probei

 Interpretare
Rezultat negativ : se colorează doar linia control C.
-Pot fi NTM (frotiul ZN prezenti BAAR) sau microbi de contaminare
(colorați albastru).
- 1-2% posibil sa apartina Complexului MTB (deletie gena care regleaza sinteza
Ag),mai ales M bovis
- Culturi tinere MTBC
- Culturi mixte
- Cantitate mica de cultura

Rezultat pozitiv : complexul M. tuberculosis, se colorează ambele linii, T și C.

extrem de rar, M. kansasii, M. avium, M. chelonae, M. gordonae

Test invalid, neinterpretabil: nu se colorează linia C.

Necesită repetare pe o altă casetă.
 Testul imunocromatografic - AgMPT64

Complexul M tuberculosis – pozitiv

NTM- negativ
 Înregistrări

Rezultatele testului se înregistrează în caietul de lucru pentru identificare.

În registrul lab şi în buletinul de rezultate se scrie doar concluzia: MTB sau

Alte micobacterii, sau/şi cultură în curs de identificare, dacă cultura a fost
trimisă la LNR pentru identificare de specie.
Identificare: macroscopic, microscopic, Ag MPT64 si teste biochimice