Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T.

Popa Iai FACULTATEA DE MEDICINA Domeniul: MEDICINA - MICROBIOLOGIE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Infectii asimptomatice cu transmitere sexual. Utilitatea clinic a determinrii cantitative prin Real Time PCR a genotipurilor cu risc nalt de HPV
Conductor doctorat Prof. Univ. Dr. Luminia Smaranda Iancu Doctorand Ramona Gabriela Ursu

IAI, 2011

Membrii refereni specialiti ai comisiei de doctorat au fost numii prin decizia nr. 15007 din 3.08.2011:

Prof. Univ. Dr. Mircea Onofriescu UMF Grigore T. Popa, Iai Prof. Univ. Dr. Simona Ru UMF Carol Davila, Bucureti Prof. Univ. Dr. Roxana Moldovan UMF Victor Babe, Timioara

Susinerea public a tezei de doctorat va avea loc n data de 10.11.2011, ora 9.00, n sala SOCIETII DE MEDICI I NATURALITI, IAI.

Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa Iai FACULTATEA DE MEDICINA Domeniul: MEDICINA - MICROBIOLOGIE

TEZ DE DOCTORAT REZUMAT

Infecii asimptomatice cu transmitere sexual. Utilitatea clinic a determinrii cantitative prin Real Time PCR a genotipurilor cu risc nalt de HPV

Conductor doctorat Prof. Univ. Dr. Luminia Smaranda Iancu

Doctorand Ramona Gabriela Ursu IAI 2011

CUPRINS
PARTEA GENERAL 1. Introducere 2. Stadiul actual al cunoaterii 2.1. Structura papillomavirusurilor 2.1.1.Componente virale i proprieti fizice 2.1.2.Genomul HPV i ciclul replicrii virale 2.2. Clasificarea papillomavirusurilor 2.3. Istoria natural a infeciei HPV 2.3.1. Caracteristicile epiteliului cervical 2.3.2. Transmiterea infeciei HPV 2.3.3. Progresia leziunilor 2.4. Mecanisme carcinogenetice 2.4.1. Capacitatea transformant a HPV 2.4.2. Interaciunea HPV cu factorii de mediu 2.5. Metode de diagnostic ale cancerului cervical i a leziunilor precanceroase 2.5.1. Metode de inspecie vizual 2.5.2. Metode citologice i histologice 2.5.3. Metode de biologie molecular 2.6. Alternative terapeutice ale leziunilor precanceroase i ale cancerului cervical 2.7. Prevalena, incidena, persistena i clearance-ul infeciei HPV 2.8. Profilaxia cancerului cervical i a leziunilor precanceroase Bibliografie PARTEA PERSONAL 3. Obiectivele studiului 4. Epidemiologia infeciei cu HPV 5. Optimizarea metodei de detecie a 37 genotipuri HPV 6. Optimizarea tehnicii Real Time PCR pentru cuantificarea HPV 16 i a HPV 18 7. Validarea tehnicii de genotipare prin participarea la HPV Proficiency Testing, WHO 8. Prevalena i distribuia genotipurilor HPV n rndul femeilor din zona Moldovei 9. Corelaii ale ncrcturii virale a HPV 16 i HPV 18 cu gradul displaziei cervicale i cu factorii de risc ai neoplaziei cervicale 10. Testarea ADN/HPV post intervenie chirurgical excisional 11. Evaluarea riscului de evoluie ctre neoplazia cervical pentru pacientelor HIV + 12. Infecii asimptomatice cu transmitere sexual 13. Concluzii generale 14. Originalitatea contribuiilor proprii 15. Perspectivele pe care le deschide teza Bibliografie

1. Introducere Cei mai frecveni ageni etiologici ai infeciilor cu transmitere sexual (ITS) sunt Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Haemoplilus ducreyi, Chlamydia trachomatis, virusul herpes simplex 2, virusul papilloma uman, Trichomonas vaginalis. Este binecunoscut faptul c cele mai multe ITS sunt simptomatice, dar nu se cunoate frecvena i importana infeciilor asimptomatice n transmiterea ITS. Pe baza prezenei simptomelor, indivizii pot fi divizai n mai multe categorii: indivizi simptomatici (simptomele sunt prezente); indivizi cu infecie inaparent (individul prezint simptome dar nu sunt recunoscute ca fiind produse de o ITS); persoane asimptomatice- aceasta categorie este important, deoarece numai pacienii simptomatici vor solicita tratament specific. Dintre infecile produse de ageni etiologici amintii, numai n cazul ancrului moale, majoritatea indivizilor sunt simptomatici, cu un numr considerabil de infecii inaparente. Studiile de istorie natural care analizeaz infeciile cu HPV, Neisseria gonorrhoeae i Chlamydia trachomatis indic faptul c aceti indivizi r mn n mod caracteristic asimptomatici, pe cnd indivizii cu herpes genital prezint n mod tipic infecie inaparent i nu asimptomatic. Dintre toi aceti ageni care produc infecii genitale, studiul din cadrul tezei de doctorat a analizat doar infeciile produse de HPV. Cancerul cervical este al treilea cancer diagnosticat ca frecven i a patra cauza de deces prin cancer n rndul femeilor din ntreaga lume, nsumnd, pentru anul 2008, 9% (530.000) din totalul neoplaziilor noi i 8% (275.000) din totalul deceselor prin cancer. Peste 85% din decesele nregistate au fost semnalate n rile n curs de dezvoltare, incidena cea mai ridicat la nivel mondial pentru cancerul cervical fiind regasit n Africa, Asia i America de Sud, iar cele mai sczute valori au fost semnalate n Asia de Est, Australia i America de Nord (1). n lipsa aplicrii unor msuri preventive susinute, se preconizeaz c decesele datorate cancerului de col uterin ar putea crete cu aproape 25% n urmtorii 10 ani (2). Pe de alt parte, majoritatea femeilor din rile n curs de dezvoltare nu au acces la programele de profilaxie a cancerului de col uterin, ceea ce explic diagnosticarea acestei forme de cancer n stadii care depesc prin severitate, capacitile terapeutice actuale (3). Romnia, cu o populaie de 9.44 milioane femei cu riscul de a dezvolta cancer de col uterin, se situeaz pe primul loc n Europa n ceea ce privete incidena (23.9 0/0000) i mortalitatea (11.6%) prin cancerul de col (iunie 2010) (4). Estimrile actuale indic faptul c n fiecare an aproximativ 3450 de femei sunt diagnosticate cu cancer de col uterin i aproape 2100 mor din cauza bolii. Dei dup formularea relaiei de cauzalitate dintre HPV i cancerul de col uterin, n majoritatea rilor au fost iniiate studii extinse n vederea cunoaterii prevalenei i distribuiei infeciei cu HPV (Human Papilloma Virus), n Romnia, studii similare au fost ntreprinse sporadic, pe loturi nesemnificative, iar datele rezultate nu au fost

sistematic raportate, motiv pentru care, despre Romnia se afirm c nu sunt date disponibile despre aceti indicatori (Raport OMS, 2009). n acest context, se justific necesitatea studiilor privind rspndirea acestei infecii, ca argument tiinific pentru eficiena vaccinrii pe scar larg, i nu n ultimul rnd, pentru instituirea programelor naionale de supraveghere i screening pentru populaia la risc (5). Harald zur Hausen a formulat, n 1976, ipoteza c HPV joac un rol important n etiologia cancerului de col uterin, identificnd mpreun cu echipa sa, n perioada 1983-1984, genotipurile HPV 16 i HPV 18 n tumori ale cervixului; descoperirea a fost rspltit cu Premiul Nobel pentru Medicin i Fiziologie (2008) (6). Rolul HPV n oncogenez este demonstrat cu certitudine nu numai pentru cancerul de col uterin ci i n etiologia altor tipuri de cancere anogenitale (anus, vulv, vagin, penis) sau cancere ale capului i gtului. Genotipurile HPV 16 i 18 sunt responsabile pentru aproximativ 70% din toate de cazurile de cancer de col uterin din ntreaga lume, fiind recunoscute ca nalt oncogene, mpreun cu alte serotipuri (e.g. 31, 35, 52 sau 58) (7). Spre deosebire de alte neoplazii, cancerul de col uterin poate fi prevenit prin programe de screening concepute pentru a identifica i trata leziunile precanceroase. Acestea presupun: metode de inspecie vizual, metode bazate pe analiza histologic i citologic a esuturilor infectate i nu n ultimul rnd, prin metode de testare a ADN/HPV. Terapia leziunilor precanceroase poate fi chirurgical, prin tehnici distructive (e.g. crioterapie, electrocauterizare, termocoagulare), sau prin tehnici de excizie, de ndeprtare chirurgical (LEEP loop electrosurgical excision procedure procedura de excizie prin diatermocauterizare i LLETZ loop electrosurgical excision of the transformation zone excizia chirurgical a zonei de transformare). Urmrirea pacientelor dup aceste proceduri chirurgicale, presupune colposcopie, eventual, testarea ADN / HPV (8). Perspectiva studiilor epidemiologice privind incidena i prevalena infeciilor cu HPV se va rsfrnge n trecerea de la profilaxia de tip secundar (screening), la profilaxia primar (prin vaccinare), n paralel cu eficientizarea programelor de promovare a sntii (9). n prezent sunt comercializate pe scar larg, la nivel mondial, dou vaccinuri HPV. Organizaia Mondial a Sntii (OMS) recunoate importana cancerului de col uterin ca problem global de sntate public i recomand vaccinarea HPV, ca vaccinare de rutin (10).

3. Obiectivele studiului Lipsa datelor ntr-o ar aflat pe primul loc n Europa n ceea ce privete incidenta si mortalitatea prin cancer cervical, necesitatea acumulrii de date tiinifice utile decidenilor politici pentru stabilirea strategiei de prevenire i control a BTS (boli cu transmitere sexual), inclusiv infeciile HPV, au condus la stabilirea urmtoarelor obiective tiinifice ale acestei teze de doctorat: 1. optimizarea i validarea metodelor de genotipare utilizate pentru diagnosticul infeciilor determinate de HPV i pentru determinarea ncrcturii virale; 2. evaluarea prevalenei i distribuiei infeciei HPV n lotul de studiu, ca argument util strategiilor de vaccinare; 3. evaluarea corelaiilor ntre nivelul ncrcturii virale a ADN HPV 16 & 18 i gradul displaziei cervicale, n vederea interveniei terapeutice n stadii incipiente; 4. evaluarea prin teste ADN HPV a pacientelor post intervenie excisional, pentru aprecierea statusului eradicrii /persistenei infeciei; 5. evaluarea prevalenei infeciei HPV n rndul pacientelor HIV pozitive; 6. evaluarea prevalenei infeciei HPV n rndul persoanelor asimptomatice; 7. aprecirea contribuiei co-factorilor implicai n oncogeneza cervical. 4. Epidemiologia infeciei cu HPV La nceputul anilor 90 studii epidemiologice bazate pe tehnici de biologie molecular i cercetri privind istoria natural a infeciei cu Human Papilloma Virus (HPV) localizat la nivelul tractului genital, au adus dovezi suficient de puternice pentru a atribui un rol cauzal determinant al HPV n inducerea cancerului cervical. Aceast asociere a fost evaluat pe baza criteriilor de cauzalitate elaborate de experi din colectivitai de cercetare, de la institute internaionale de renume. Modelul propus de aceast relaie de cauzalitate este valabil la nivel mondial i nu exist alte dovezi alternative care s explice etiologia cancerului cervical. HPV a fost astfel propus drept cauz necesar a cancerului cervical. Concret, conceptul de cauz necesar implic faptul c neoplazia cervical nu se poate dezvolta n absena persistenei AND/HPV. Stabilirea acestei relaii de cauzalitate a condus la dezvoltarea sistemelor de detecie ADN/HPV, cu

importante consecine practice pentru diagnosticul precoce al displaziilor cervicale i pentru monitorizarea ncrcturii virale a ADN-ului genotipurilor oncogene. De asemenea, aceast descoperire a dus la iniierea programelor de prevenie primar a infeciei determinate de HPV, prin descoperirea formulei vaccinale. Dovada etiologic a implicrii HPV n producerea cancerului cervical a fost demonstrat de studii populaionale n ntreaga lume. Studii de prevalen au demonstrat c, n condiii optime de testare (probe de esut adecvate i tehnici sensibile de diagnostic), ADN/HPV poate fi identificat n toate probele de cancer cervical. Fac excepie doar forme rare de limfoame cervicale, sarcoame i alte tipuri histologice rare. Studiile caz-control au demonstrat n mod constant riscul pentru femeile pozitive cu genotipuri nalt oncogene (genotipuri HR HPV High Risk HPV). De a dezvolta cancer cervical pentru femeile HR HPV pozitive, n comparaie cu loturile martor. Studiile comparative au presupus testarea femeilor care aveau caracteristici similare cu cele ale pacientele din lotul de studiu: vrst, status educaional, expunerea la factori de risc adiionali. Pacientele HPV pozitive pentru 16 sau 18 se consider a avea un risc mult mai crescut dect pacientele infectate cu alte serotipuri. Din acest motiv, serotipurile 16 i 18 fac parte din categoria HR HPV, mpreun cu genotipurile 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68. Sudiile de cohort (femei care au fost urmrite n timp prin repetarea testrii ADN/HPV i a examenelor citologice Papanicolau) au demonstrat c riscul absolut de progresie a leziunilor induse de HPV 16 sau 18 ctre neoplazia cervical intraepitelial de grad 3 (CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia) este foarte mare n comparaie cu infecia cu celelalte genotipuri nalt oncogene (1). Programele de prevenie primar (prin vaccinare) i secundar (prin screening) au demonstrat c prin reducerea expunerii la HPV este posibil reducerea incidenei CIN 2 / 3 i, prin extensie, este posibil reducerea incidenei cancerului cervical. n rile n curs de dezvoltare sunt nregistrate 80% din cazurile de cancer cervical; pentru anumite colectivitai riscul cumulativ este cuprins ntre 1,5 3 %, n timp ce n rile dezvoltate se situeaz n jurul valorii de 3,6% din totalul de cazuri noi, cu un risc cumulativ de 0,8% n rndul femeilor pn la vrsta de 65 ani. n general, cele mai sczute rate (< 15/100.000) sunt nregistrate n Europa (cu excepia rilor din Europa de Est), America de Nord i Japonia. Incidena este crescut mod deosebit n America Latin (33,5/100.000), Africa Subsaharian (31,0) i n Asia de Sud Est (18.3). Numitorul comun pentru rile n curs de dezvoltare este reprezentat de status-ul socieoeconomic sczut i

de lipsa programelor de screening indispensabile n detectarea precoce a leziunilor canceroase i precanceroase. La nivel global modalitile de diagnostic i tratament duc de multe ori la stoparea evoluiei leziunilor, rata de mortalitate fiind substanial mai sczut dect incidena, situndu-se n jurul valorii de 55%. Pe de alt parte, cancerul cervical afecteaz femei relativ tinere, ceea ce duce automat la scderea speranei de via. O estimare recent concluzioneaz c neoplazia cervical este cea mai important cauz de pierdere de ani de viata pentru rile n curs de dezvoltare. n America Latin, Caraibe i Europa Central, cancerul cervical aduce o contribuie mai mare la pierderea anilor de via, n comparaie cu boli ca tuberculoza sau SIDA.

HPV este considerat n prezent al doilea factor de risc neoplazic (dup fumat), fiind implicat n inducerea a 5% dintre cancerele umane n total, a 10% din neoplaziile la femei i nregistrnd 15% dintre cancerele femeilor din rile n curs de dezvoltare (2).
Proiectul GLOBOCAN (baz de date a Agen iei Interna ionale pentru Studiul Cancerului ; IARC International Agency for Research on Cancer ) are ca scop furnizarea estim rilor actualizate ale inciden ei i mortalit ii principalelor categorii de cancer, la nivel na ional, pentru toate rile din lume. Estim rile GLOBOCAN sunt publicate pentru anul 2008 (42), pe sexe i pe grupe de vrst , bazndu-se pe datele recente furnizate de IARC; la acestea se adaug informa iile oficiale disponibile pe site-urile institu iilor de s n tate public i datele provenite din surse locale. Dificultile n interpretarea acestor date sunt explicate m car n parte de faptul c sursele de date sunt n continu cretere i ele nu pot fi sistematizate i comparate deoarece nregistrarea acestora nu se face dup o metodologie unitar i deci, exist inegaliti n ceea ce privete colectarea de date att calitativ ct i cantitativ. n ultimii ani exist mai ales pentru rile din S-E Europei preocuparea de a crea o baz de date unic n care datele sa fie culese unitar, dup aceea i metodologie, n vederea cree rii registrului na ional de cancere.

n Romnia exist aceast preocupare pentru formarea a 8 registre de cancer, deoarece recomndrile experilor presupun creearea unui registru de cancer pentru populaii cuprinse ntre 4 5 milioane de locuitori. Aceste precizri privind calitatea datelor nregistrate (inciden, mortalitate, morbiditate) sunt utile atunci cnd tentm s comparm valori ale diferitelor forme de cancer nregistrate, n diferite ri de pe glob. De multe ori, diferenele observate pot fi rezultatul utilizrii unei metodologii diferite, sau care se modific n timp, pentru aceeai ar, ceea ce poate 9

duce la valori total diferite ale incidenei pentru aceeai ar. Utiliznd informaiile online furnizate de proiectul GLOBOCAN, identificm pentru Romnia o inciden de 23.9/0000 pentru neoplazia cervical i 3402 cazuri de cancer cervical.
Pe baza acestor date putem observa incidena extrem de sczut a cazurilor de cancer de col uterin n rile din Europa de vest i n rile Nordice, n America de Nord i Australia. La pol opus se remarc valorile ngrijortoare ntlnite n rile din Africa, America de Sud (50 56.3), India i Romania. Lipsa programelor eficiente de screening precum i gradul sczut de informare al populaiei feminine cu risc, sunt probabil principalele cauze ce au dus la creterea incidenei cancerului de col uterin n aceste zone ale globului. Date recente (iunie 2010) situeaz Romnia pe primul loc n Europa n ceea ce privete incidena (23.9) i mortalitatea (11.6) prin cancerul de col, din totalul celor 20 de ri europene analizate (4).

Fig. 1: Incidena i mortalitatea estimat pentru cancerul de col uterin, pentru 20 de ri din Europa (4) (http://globocan.iarc.fr)

10

Din ianurie 2010, Centrul de Informare pentru HPV i cancerul cervical (WHO/ICO Information Centre on HPV and Cervical Cancer) a dat publicitii date oficiale privind incidena cancerului cervical. (2) n acest raport, pentru Romnia se menioneaz c nu sunt date disponibile referitoare pentru primele 10 genotipuri HPV, n rndul femeilor cu i fr leziuni cervicale, n comparaie cu datele disponibile pentru Europa sau cele de la nivel mondial. Lipsa acestor date pentru Romnia poate fi explicat, macar n parte, prin dificultatea centralizrii unor date dup o metodologie unic i prin absena unui soft-ware dedicat, pentru nregistrarea corect, complet i unitar a datelor privind cancerele nregistrate la nivel regional, respectiv naional. O a doua explicaie este lipsa fondurilor necesare testrii prin tehnici de biologie molecular, n vederea stabilirii prevalenei i distribuiei genotipurilor HPV n rndul populaiei feminine. n acest context, studiul propus, are ca prim obiectiv estimarea prevalenei infeciei cu HPV n rndul femeilor din zona de Nord Est a Moldovei, precum i distribuia genotipurilor HPV n raport cu gradul displaziei cervicale, prin utilizarea unei metode sensibile de detecie a genotipurilor de HPV. Al doilea obiectiv este acela de a stabili rolul ncrcturii virale ca biomarker n diagnosticarea leziunilor displazice, obiectiv care presupune selectarea pacientelor HPV 16 i HPV 18 pozitive, monitorizarea ncrcturii virale, astfel nct s putem stabili acea valoare prag a ncrcturii virale util diagnosticului precoce, n vederea instituirii msurilor terapeutice n timp util. Tranziia de la cercetare la implementarea de rutin Multiple studii transversale au demonstrat faptul c testarea ADN/HPV este mult mai sensibil pentru CIN2 dect citologia, dar mai puin specific (14).
Tabel I: Comparaie ntre sensibilitate, specificitate pentru citologie vs testare ADN/HPV

HPV Citologie

Sensibilitate 96 (94 97) 53 (49 57)

Specificitate 91 (90 91) 96 (96 97)

Rezultatele prezentate n Tabelul II au fost obinute prin analiza rezultatelor a mai multor triale randomizate (NTCC Italia, Public Health Trial Finlanda, Swedescreen, POBASCAN Olanda, ARTISTIC Anglia), realizate ntre anii 2006 2008.

11

Fig. 2: Cele mai frecvente tipuri de HPV n rndul femeilor cu / fr leziuni cervicale, n ri din Europa de Est i la nivel mondial (http://www.who.int/hpvcentre/en) (2)

Tranziia de la cercetarea la implementarea rezultatelor cercetrii necesit un timp ndelungat i este n mod particular dificil atunci cnd este deja stabilit un program de screening. Toate acestea reprezint o provocare pentru noile modaliti de testare, pentru c implementarea de noi metode de screening naional presupune i consideraii politice. O asemenea problem s-a pus n Anglia, i anume, un proiect multicentric randomizat i-a propus s evalueze dac testarea HPV poate reduce incidena cancerului cervical ntr-o manier cost eficient.

12

Discrepana ntre cercetare i implementare poate fi diminuat prin proiecte randomizate, cum ar fi programe naionale de screening. Prin asemenea tipuri de proiecte se poate demonstra c utiliznd o singur rund de testare HPV se poate cheltui mai puin dect realiznd 2 runde de citologie n mediu lichid. Un asemenea proiect poate fi indeplinit n ri unde exist un program de screning al cancerului cervical foarte bine organizat i sistematizat. Implementarea presupune de asemenea ca femeile testate s primeasc mai multe informaii despre testarea ce urmeaz a li se realiza, precum i o infrastructur adecvat pentru urmrirea pe termen ndelungat (programe de screening organizate i iniiative ale guvernelor de a participa la aceste aciuni) (15). Suntem pregtii pentru implementarea testrii AND HPV ca metod de screening primar ? Una din cele mai importante descoperiri medicale n ultimii 50 de ani a fost indentificarea HPV drept cauz primar a cancerului cervical. Este cunoscut faptul c, virtual, toate cazurile de cancer cervical sunt produse de HPV, iar aceast informaie a fost utilizat pentru a obine vaccinuri mpotriva a dou tipuri majore de HPV (16 i 18), care cauzeaz aproximativ 70% din toate neoplaziile cervicale la nivel mondial. De asemenea, aceaai informaie a condus la dezvoltarea de teste screening care identific virusul direct n celulele cervicale, n opoziie cu abordarea convenional de a observa anomaliile citologice cauzate de virus. Rolul screening-ului pentru tipurile HR HPV se regsete n 3 situaii: a. managementul leziunilor cu risc sczut, n care prezena unui HR HPV sugereaz o leziune CIN; b. test of cure n cazul femeilor tratate pentru leziunile CIN cu grad nalt; c. test de screening primar: sensibilitatea crescut a testrii HPV indic faptul c testele ADN pot fi folosite ca test unic de screening primar, iar citologia poate fi utilizat ca test de triaj pentru femeile HPV pozitive. Specialiti n domeniu au revizuit o multitudine de teste care au evideniat c testarea HPV este mult mai sensibil dect citologia i poate fi, n mod sigur realizat la intervale mai mari de timp. Studii viitoare vor propune un nou algoritm pentru utilizarea testrii HPV ca unic test de screening pentru femeile cu vrsta peste 30 de ani (15).

13

5. Optimizarea metodei de detecie a 37 tipuri HPV cu ajutorul kitului Linear Array HPV Genotyping Test Principiul procedurii testul Linear Array HPV Genotyping test se bazeaz pe 4 etape majore: 1. prelucrarea probelor recoltate de la paciente; 2. amplificarea PCR a intelor ADN, utiliznd primeri HPV; 3. hibridizarea ampliconilor; 4. detecia prin determinare colorimetric a produselor amplificate. 1. Recoltarea produselor patologice de la nivelul colului uterin se realizeaz cu ajutorul periuelor Cervex Brush care se descarc n recipientele pentru transportul probei (ThinPrep PreservCyt Solution). Dup descrcarea periuei n soluia ThinPrep, aceasta se arunc. 2. Amplificarea intelor: Amplificarea intelor ADN HPV este realizat cu ajutorul polimerazei AmpliTaq Gold care faciliteaz amplificarea hot start, precum i cu ajutorul beta globinei ca i control. Iniial, mixul reaciei PCR este nclzit pentru a activa polimeraza AmpliTaq Gold, ceea ce favorizeaz denaturarea ADN-ului viral i a celui genomic, precum i punerea n contact cu secvenele primerilor int. Pe masur ce amestecul se rcete, primerii (upstream i downstream) se fixeaz pe inta ADN. Polimeraza, n prezena Mg2+ i a excesului de dNTPs, extinde fixarea primerilor pn la formarea unui ADN dublu catenar de 450 perechi de baze, sau 268 perechi de baze pentru ampliconul de beta globin. Acest process este repetat pentru un anumit numr de cicluri (40), n fiecare ciclu avnd loc dublarea cantitii de amplicon. Amplificarea are loc numai n regiunea genomului HPV sau a beta globinei, ntre cele mai apropiate perechi de primeri; nu are loc amplificarea ntregului genom. Amplificarea selectiv: Amplificarea selectiv a intelor de acid nucleic este obinut prin utilizarea enzimei AmpErase (uracil-N-glicozilaza) i a deoxiuridin trifosfat. Enzima AmpErase recunoate i catalizeaz denaturarea lanurilor ADN care conin deoxyuridina, dar nu i pe acele lanuri ADN care conin deoxitimidin. Deoxiuridina nu este prezent n ADN-ul natural, dar este prezent ntotdeauna n ampliconi, datorit faptului c Mastermix-ul conine deoxiuridin trifosfat; prin urmare, numai ampliconii conin deoxiuridin. Enzima AmpErase, care este inclus n Mastermix, catalizeaz desfacerea deoxiuridenei care conine ADN, n reziduuri de deoxiuridin, prin deschiderea lanului de deoxiriboz la nivelul C1. n timpul primului ciclu termic, la pH-ul alcalin al Mastermixului, lanurile de ADN ale ampliconilor se rup la poziia deoxiuridinei. Enzima

14

AmpErasa este inactiv la temperaturi peste 55 C, i, prin urmare nu va distruge ampliconii int. Dup amplificare, orice rest enzimatic este denaturat prin adaugarea soluiei de denaturare, ceea ce previne degradarea ampliconilor. 3. Reacia de hibridizare: Dup amplificarea PCR, ampliconii HPV i de beta globin sunt chimic denaturai i formeaz un singur lan de ADN, prin adugarea soluiei de denaturare. Ampliconii denaturai sunt trasferai n godeurile corespunzatoare din tavia de hibridizare, godeuri care conin lichidul de hibridizare i un singur strip din kit (strip care conine probe de HPV i beta globin). Ampliconii fixai de biotin vor hibridiza acele probe oligonucleotidice care conin secvena corespunztoare probei complementare. n plus, stripurile kitului sunt sensibilizate i pentru o prob oligonucleotidic cross-reactiv care hibridizeaz cu genotipurile HPV 33, 35, 52 58. Ampliconul care conine secvene apropiate (1 pn la 3 neconcordane), complementare probei, vor hibridiza cu aceast band. 4. Reacia de detecie: Dup reacia de hibridizare, stripurile sunt splate pentru a ndeprta materialul nefixat. Se adaug n tvia de hibridizare un conjugat: peroxidaza de hrean streptavidina. Aceasta se va fixa pe ampliconii hibridizai cu oligonucleotidele de pe strip. Stripul este supus unor etape de splare pentru a ndeparta excesul de streptavidina. Se adaug un substrat soluie care conine peroxid de hidrogen i 3, 3, 5, 5 tetrametilbenzidin (TMB). n prezena peroxidului de hidrogen, streptavidina fixat catalizeaz oxidarea TMB ctre formarea unui complex albastru, care precipit la poziia probei unde a fost relizat hibridizarea. Stripul este citit vizual prin compararea benzilor de pe strip cu ablonul din kitul Linear Array HPV Genotyping Test (16). Interpretare rezultate Linear Array HPV Genotyping test: test calitativ in vitro ce detecteaz prezena a 37 genotipuri HPV: 13 genotipuri cu risc nalt oncogen: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68; 24 genotipuri cu risc intermediar i sczut oncogen: 6, 11, 26, 40, 42, 45, 53, 54, 55, 61, 62, 64, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, IS39, CP6108; beta globina martor de recoltare, purificare, amplificare corecte a ADN / HPV.

15

Fig. 3: ablon de interpretare, martor pozitiv i negativ, stripul pacientei 24, pozitiv pentru HPV 16 infecie unic

Fig. 4: ablon de interpretare, martor pozitiv i negativ, stripul pacientei 14, pozitiv pentru HPV 16 i HPV 18 infecie multipl

Concluzii: 1. ndeplinirea criteriilor de validare impuse de protocoalele de lucru ale productorilor ne-au permis confirmarea rezultatelor i optimizarea tehnicii de lucru pentru genotiparea HPV. 2. Validarea n cazul testului de genotipare a fost posibil prin ndeplinirea criteriilor de calitate pentru martorul pozitiv i negativ, cat i prin prezena benzilor de beta globin (cu cele dou valori, high, respectiv low).

16

6. Optimizarea tehnicii Real Time PCR pentru cuantificarea ADN/HPV 16 i a ADN/HPV 18 n anul 1996, compania Applied Biosystems (ABI) a realizat primul instrument Real Time PCR (PCR n timp real) comercial instrumentul denumit ABI 7700. De atunci, RT qPCR (RT CPCR PCR cantitativ n timp real) a devenit cea mai exact i sensibil metod pentru detecia i cuantificarea acizilor nucleici. Principiul RTPCR: intensitatea fluorescenei din sistemul de reaie este direct proporional cu cantitatea iniial a produsului de amplificat; vizualizarea este posibil prin utilizarea unei molecule fluorescente (26). Comparaie PCR versus RT PCR : o fluorescena este msurat n timpul fiecrui ciclu de amplificare (semnalul este direct propoional cu cantitatea produsului PCR) ; o curbele de amplificare cresc dup un numr de cicluri care este proporional cu cantitatea iniial de matri (template) ADN; o raportarea la valorile curbei standard va oferi date legate de cuantificarea produsului dorit (27). o momentul n care se vizualizeaz produsul reaciei de amplificare: n reacia PCR clasic, rezultatele se evideniaz n gelul de electroforez, dup ce amplificarea s-a finalizat i cnd pot apare inhibitori ai reaciei; n RT PCR, msurarea fluorescenei se realizeaz n timpul fiecrui ciclu de amplificare. Aceasta permite cuantificarea intei nainte de acumularea inhibitorilor, inactivarea polimerazei. Evaluarea datelor qPCR Odat ce experimentul a fost finalizat, se realizeaz analiza datelor obinute. Aceast analiz presupune anumii pai: o Analiza preliminar a datelor: corectia baseline; setarea threshold cycle; verificarea controalelor negative / pozitive; verificarea probelor necunoscute; realizarea analizei specifice a experimentului: curba standard - cuantificarea absolut / parametri; quantificarea relativ; curba de melting / topire (doar pentru SYBR Green). Baseline este ciclul iniial n RTPCR cnd se poate observa o mic schimbare n semnalul fluorescent, de obicei regsindu-se la ciclurile 3-15.

17

Threshold cycle / Ct primul ciclul PCR la care fluorescena msurat de instrument este determinat peste nivelul semnalului de fond (back-ground) (fig 24). Cuantificarea absolut: presupune construirea unei curbe standard pentru fiecare int; curba standard este realizat dintr-o serie de diluii ale unei probe cu o concentraie cunosct; Ct-ul fiecrui standard se situeaz pe axa orizontal , iar pe axa vertical sunt notate valorile logaritmice ale concentraiilor cunoscute; curba standard este utilizat pentru a estima concentraia probelor necunoscute. Parametrii unei curbe standard corect realizat: o eficien nalt: 90% - 110%; o precizie bun: 0,985 1,00; o variabilitate sczut ntre standarde. Etapele de lucru: recoltare produse patologice; purificare ADN HPV; cuantificare AND/HPV 16 i HPV 18 prin Real Time PCR. 1. Recoltarea produselor patologice i purificarea ADN HPV se realizeaz similar testului de genotipare, anterior detaliat. Singura deosebire este faptul c protocolul nu presupune concentrarea probei prin centrifugare, tehnica Real Time PCR fiind mult mai sensibil dect PCR ul clasic. 2. Quantificarea HPV 16 i 18 utiliznd kiturile Path-HPV16 Real-time PCR detection kit for Human Papillomavirus, Path-HPV18 Real-time PCR detection kit for Human Papillomavirus, 2 x Precision TM Mastermix, PrimerDesign, cu ajutorul instrumentului qPCR STRATAGENE, MX3000P:

Fig. 5: Termocyclerul Stratagene MX3005P

18

v Kitul 2 x Precision TM Mastermix conine: buffer, 0,025 U/ l Taq Polimeraz, 5 mM MgCl2, dNTP Mix (200 M pentru fiecare dNTP) (29). v Kiturile Path-HPV16 Real-time PCR detection kit for Human Papillomavirus i Path-HPV18 Real-time PCR detection kit for Human Papillomavirus conin: Probe lucrate i optimizate: a. Pacienta H. L., 29 ani, cu urmtorul istoric: - 6.04.09: HSIL; - 12.04.09: HPV 16 pozitiv. Parametrii generai de soft-ul instrumentului pe baza celor 5 standarde s-a ncadrat in limitele normale (fig. 8): o eficien nalt: 99,2 % (90% - 110%); o precizie bun: 0,999 (0,985 1,00);

Fig 6: Curba standard optimizat realizat pentru 5 standarde

b. Pacienta V. D, 23 ani, pozitiv pentru HPV 18, 53, 54.

Fig 7: Curba standard (pacienta V.D.)

o eficien nalt: 93,5% (90% - 110%); o precizie bun: 0,997 (0,985 1,00). Concluzie: n aceast etap a cercetrii a fost optimizat cuantificarea ncrcturii virale prin RT PCR, pentru genotipurile nalt oncogene de HPV, respectiv tipurile 16 i 18.

19

7. Validarea tehnicii de genotipare prin participarea la HPV Proficiency Testing

(WHO HPV LabNet Report on HPV DNA Proficiency Panel 2010) Evaluarea vaccinrii HPV, implementarea efectiv i monitorizarea programului de vaccinare HPV necesit utilizarea de metode corecte de detecie i de tipare a ADN HPV, care pot fi comparate la nivel internaional. WHO Global HPV LabNet este o iniiativ a OMS (Organizaia Mondial a Sntaii) al crei scop este sprijinirea implementrii vaccinrii HPV la nivel mondial, prin standardizarea laboratoarelor i asigurarea calitii testrii HPV i a metodelor de genotipare utilizate pentru evaluarea vaccinrii anti HPV i pentru supravegherea i monitorizarea programelor de vaccinare. (http://www.who.int/biologicals/vaccines/hpv/en/index.html ). O strategie important pentru atingerea acestui demers este dezvoltarea, pregtirea i validarea unui panel de proficien pentru a califica metodele de genotipare i laboratoarele n care se utilizeaz aceste metode. Apelul pentru participarea la acest studiu de competen a fost publicat pe site-ul OMS i trimis apoi birourilor regionale ale OMS n data de 10 aprilie 2010, pentru publicul larg. Scopurile acestui panel au fost: a. Evaluarea competenei metodelor de tipare a HPV utilizate n mod curent n laboratoare la nivel mondial; b. Evaluarea sensibilitii deteciei tipurilor specifice de HPV, prin diferite metode de lucru; c. Identificarea problemelor fiecrei metode utilizate de rutin. Metoda de realizare a testului de proficien Compoziia panelului: n laboratorul de referin LabNet Global Reference Laboratory (GRL) al University Hospital in Malm, Suedia, au fost primite genme complete ale HPV clonate n plasmide, nsoite de apobarea scris a aparintorilor de a fi utilizate n acest panel de proficien OMS. Toate probele au fost plasmide diluate n ADN uman placentar (Sigma-Aldrich no 7011), pn la o concentraie de 10 ng/l. Tipurile de HPV incluse au fost: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68a (HPV 68 prototip) i 68b (ME 180 izolat prin microscopie electronic). Trei probe suplimentare, A, B i C au fost linii celulare utilizate ca i control pentru purificarea ADN, primul pas al genotiprii HPV. Compoziia panelului este redat n tabelul XV.

20

Distribuirea PP: dup validare, PP a fost distribuit n perioada iunie august, 2010, ctre 105 laboratoare din 6 regiuni OMS, n urma apelului de participare i urmare a solicitrilor primite din partea laboratoarelor. Nu a fost solicitat nici o tax de participare din partea laboratoarelor. Distribuirea PP a fost de asemenea pltita de ctre WHO HPV LabNet. Numrul laboratoarelor incluse n PP, n funcie de regiune OMS a fost (fig. 39): o 1 (AFRO Regional Office for Africa); o 5 (EMRO Regional Office for the Eastern Mediterranean); o 49 (EURO Regional Office for Europe); o 9 (SEARO Regional Office for South East Asia); o 18 (WPRO Regional Office for Western Pacific); o 23 (Regional Office for the Americas AMRO, sau Pan American Health Organization PAHO).

Fig 8: Distribuirea la nivel mondial a laboratoarelor care au trimis rezultatele pentru panelul de proficien ADN/ HPV

Au fost returnate ctre GRL 132 seturi de date cu rezultatele genotiprii HPV, nainte de dead-line, de la 98 de laboratoare. 73 de laboratoare au trimis datele obinute utiliznd o singur metod de genotipare, 17 laboratoare au utilizat cte 2 metode de genotipare HPV, 7

21

laboratoare au utilizat 3 metode, iar un laborator a genotipat probele utiliznd 4 metode diferite. n anul 2008, panelul HPV OMS a fost pregtit, administrat i distribuit de laboratorul de referin din Suedia. Datorit resurselor limitate ale laboratorului de referin, n 2010, acesta doar a pregtit materialele, iar subcontractarea, administrarea i distribuia probelor a fost realizat de compania non-profit EQUALIS (External Quality Assurance in Laboratory Medicine In Sweden), activ n domeniul asigurrii controlului extern. Modelul utilizat pentru testarea din 2010 a decurs bine i este considerat un model de organizare pe termen ndelungat, n ceea ce privete distribuirea panelurilor de proficien HPV n fiecare an. Analiza datelor: datele analizate n acest raport includ toate rezultatele care au fost trimise nainte de data de 1 noiembrie 2010. Datele au fost compilate de ctre EQUALIS i transferate apoi GRL pentru analiza rezultatelor. Fiecare set de date a primit un numr cuprins ntre 1 i 132. Aceste date au fost analizate n funcie de regiunea laboratorului i de metoda utilizat pentru genotipare. Din datele trimise, s-a remarcat faptul c laboratoarele participante au utilizat metode comerciale precum i metode in-house (Tabelul 2). Proporia rezultatelor corecte pentru genotiparea HPV, raportate de fiecare laborator n parte, a fost analizat n funcie de metoda utilizat. Un set de date analizat a fost considerat proficient / competent dac a detectat cel puin 50 uniti internaionale (UI) de HPV 16 i HPV 18 n 5 l proba i 500 genme echivalent (GE) n 50 l pentru alte tipuri HPV, fie n infecii unice, fie in infecii multiple. Pentru stabilirea proficienei/competenei, a fost de asemenea stabilit condiia de a nu se fi raportat mai mult de un genotip ca reacie fals pozitiv. Aceasta corespunde unei specificiti de 97 %. Rezultate: 98/105 laboratoare au raportat 132 seturi de date. 4 seturi de date au fost obinute utiliznd metode care nu au difereniat genotipurile HPV sau rezultatele au fost raportate ca HPV 16, 18 i alte genotipuri HR HPV. Aceste seturi de date nu au fost incluse n analiza genotip specific din acest raport. Fiecare set de date trimis de fiecare laborator n parte a fost analizat, iar participanii au primit o scrisoare de feed back n noiembrie 2010. Fig. 41 include numai datele care au fost obinute prin testarea a mai mult de dou genotipuri HPV (118 seturi de date). Rezultatele laboratoarelor care au au genotipat numai HPV 16 i 18 au fost excluse din aceast figur.

22

Fig. 9: Proficiena testrii ADN/HPV n funcie de regiunea OMS

Fig. 10: Imaginea celor 48 de stripuri obinute prin prelucrarea probelor ADN/HPV OMS Rezultatele obinute n laboratorul de Virusologie Molecular al UMF Grigore T. Popa, Iai, pentru care am fost evaluai ca fiind proficieni pentru genotiparea HPV, sunt redate n tabelul XVIII (42).

23

Tabel II: Rezultatele obinute la HPV Proficiency Testing 2010, OMS

Panel ID 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 11, 16, 31, 33, 58 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 51 6 58 66 39, 45, 52, 56, 68 33 39 52 68 11 11, 16, 31, 33, 58 16 56 33 6, 16, 18, 51 Negative 35 18 58 68ME 39, 45, 52, 56, 68 6 45 68
a

HPV type(s) in the panel

Content (IU or GE per 5 l) 50 500 500 500 50 500 500 50 500 500 50 50 500 500 50 500 500 50 500 50 500 500 5 50 50 50 0 50 5 50 50 50 50 50 500

59 31 6, 16, 18, 51 45 16 35, 59, 66, 68ME 56 18 35 68ME

Your results Linear Array 50 l input volume HPV 59 HPV 31 HPV 6, 16, 18, 51 HPV 45 HPV 16 HPV 35, 59, 66, 68; * HPV 56 NEGATIVE HPV 35;* HPV 68 HPV 11, 16, 31, 33, 58;*. HPV 51 HPV 6 HPV 58; * HPV 66 HPV 39, 45, 56, 52. HPV 33 HPV 39 HPV 52. NEGATIVE HPV 11 HPV 11, 16, 31, 33, 58;* HPV 16 HPV 56 HPV 33 HPV 6, 16, 18, 51. NEGATIVE HPV 35; * HPV 18 HPV 58; * HPV 68 HPV 39, 45, 52, 56; * HPV 6 HPV 45 NEGATIVE

24

36 37 38 39 40 41 42 43 A B C

66 11 59 52 35, 59, 66, 68ME 31 39 51 16 none 16

500 50 500 50 50 50 500 500 25 0 2500

HPV 66 HPV 11 HPV 59 HPV 52 HPV 35, 59, 66, 68;* HPV 31 HPV 39 HPV 51 NEGATIVE; NEGATIVE; HPV 16 LOW;

* menion m c toate datele prezentate n acest raport au fost traduse cu permisiunea organizatorilor panenului de proficien (53).

8. Prevalena i distribuia genotipurilor HPV n rndul femeilor din zona Moldovei

Obiective: Estimarea prevalenei i distribuiei genotipurilor HPV n zona de Nord a Moldovei. Corelarea infeciei HPV cu factorii de risc ai displaziei cervicale. Material i metode: n perioada septembrie 2009 mai 2011 am genotipat 353 de probe ADN purificat din celule cervicale, recoltate de la pacientele invitate s participe la studiu. Participantele au semnat formularul de consim mnt informat aprobat de Comisia de Etic a Universitii de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa, Iai. nainte de recoltarea de celule cervicale, medicii ginecologi au completat, mpreun cu pacientele, date personale ale acestora. n acest formular de solicitare a analizei de genotipare HPV am ncercat sa afl m care sunt co-factorii displaziei cervicale: numrul de nateri, utilizarea de contraceptive orale, fumatul, numrul de parteneri sexuali, alte infecii genitale (Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Candida albicans, virusul herpes simplex), rezultatul examenului citologic Babe Papanicolau. De asemenea, am solicitat n acest formular date despre utilizarea tratamentului antiinflamator n antecedente, dac a existat suspiciune macroscopic sau simptomatologie sugestiv (fig. 46).

25

Datele anamnestice ale pacientelor precum i rezultatul testrilor au fost prelucrate cu ajutorul programului de prelucrare statistic a datelor SPSS 16.0.
infectii multiple 11% infectii unice 25%

negative 64%

Fig. 11: Prevalena infeciilor HPV

Fig. 12: Formularul de solicitare a analizei de genotipare HPV

26

n tabelul IV este redat prevalena genotipurilor HPV n toate infeciile detectate, iar n fig. 15 sunt redate frecvenele genotipurilor HPV n cazul pacientelor cu citologie normal i patologic.
Tabel III: Prevalenta genotipurilor HPV pentru toate tipurile de infecii: unice i multiple
Tip HPV negativ 16 53 51 18, 31 52 6, 42 58, CP6108 45 33, 66, 70 68, 73, 84 56, 82 40 Frecventa 226 35 20 18 11 10 8 7 6 5 4 2 1 Procent 64,0 9,91 5,66 5,09 3,11 2,83 2,26 1,98 1,69 1,41 1,13 0,65 0,28

Fig. 13: Cele mai frecvente genotipuri HPV identificate in rndul femeilor din Nordul Moldovei, cu citologie normal i patologic

27

Concluzii: genotiparea prin testarea ADN /HPV este cea mai indicat metod de screening pentru cancerul cervical, datorit sensibilitii, criteriilor de validare i obiectivitii cu care se fac interpretrile; identificarea tipului de HPV ofer posibilitatea evalurii displaziei cervicale post conizaie; prevalena genotipurilor HPV 16 i HPV 18 n rndul pacientelor testate a fost de 9.91 %, respectiv 3.11, ceea ce justific necesitatea vaccinrii anti HPV n zona noastr, mai ales pentru HPV16; studiul de fa permite selectarea pacientelor HPV 16 i HPV 18 pozitive, care vor fi urmrite n dinamic, prin tehnica Real Time PCR, n vederea stabilirii valorii prag a ncrcturii virale, ct mai precoce, ideal, anterior evoluiei ctre neoplazia cervical, n vederea instituirii terapiei chirurgicale; deoarece genotiparea HPV permite evaluarea fenomenului de persisten a infeciilor cu HR HPV, se impune, pe viitor, repetarea testrii la 6, respectiv 12 luni, pentru a departaja obiectiv, infeciile tranzitorii, de cele permanente;

9. Corelaii ale ncrcturii virale a HPV16 i HPV 18 cu gradul displaziei cervicale i cu factorii de risc ai neoplaziei cervicale

Material i metod: Am cuantificat prin Real Time PCR probele ADN HPV detectate pozitive pentru HPV 16 (34 paciente) i HPV 18 (8 paciente) prin tehnica de genotipare Linear Array HPV Genotyping Test. Determinarea ncrcturii virale a fost realizat cu ajutorul kiturilor Precision 2X qPCR mastermix, Path-HPV16 Real-time PCR detection of Human Papillomavirus 16 Advanced kit i Path-HPV18 Real-time PCR detection of Human Papillomavirus 18 Advanced kit. Amplificarea n timp real a utilizat termocyclerul MX 3005P, Stratagene. Determinrile prin Real Time PCR au fost realizate n 4 sesiuni de lucru.

28

A. Setarea godeurilor: standarde in dublu, controale, probe paciente

Sesiunea I

Sesiunea II

Sesiunea III

Sesiunea IV

Fig. 14: Imaginea plcuelor RT PCR setate

B. Profilul termic al experimentului a presupus 1 ciclu de 10 la 95 C i 50 de cicluri formate din dou segmente: primul segment a presupus 15 sec la 95 C i al doilea 1 min la 60 C.

Fig. 15: Profilul termic al experimentului

29

C. RUN: odat setate godeurile i profilul termic, s-a selectat opiunea RUN a soft-ului Stratagene. ntregul experiment a avut o durat de 72,5 minute. D. Evaluarea rezultatelor s-a putut realiza i n timpul amplificrii PCR, n timp real, iar n lucrarea de fa am redat doar rezultatele finale ale experimentului. Evaluarea calitii unei determinri prin Real Time PCR trebuie s urmeze paii urmtori de analiz preliminar: - examinarea curbelor de amplificare; - verificarea / ajustarea liniei de background; - verificarea / ajustarea threshold; - verificarea controalelor (negative, pozitive); - verificarea probelor testate; - analiza specific a experimentului.

Sesiunea I

Sesiunea II

Sesiunea III

Sesiunea IV

Fig. 16: Curbele de amplificare

30

Sesiunea I

Sesiunea II

Sesiunea III

Sesiunea IV

Fig. 17: Verificarea controalelor

Sesiunea I

Sesiunea II

Sesiunea III

Sesiunea IV Sesiunea IV

Sesiunea IV

Sesiunea IV

Fig. 18: Curbele standard ale celor 4 sesiuni

31

Sesiunea I

Sesiunea II

Sesiunea III

Sesiunea IV

Fig. 19: Numrul de cpii virale detectate

Analiza spectrofotometric a acizilor nucleici, proteinelor i a culturilor celulare face parte din rutina zilnic a unui laborator modern. NanoPhotometrulTM universal combin masurtorile probelor, ncepnd de la 0,7 l pn la volumele standard ale probelor 3500 l. Msurtorile probelor n volume mai mici de 1 l sunt realizate fr a fi necesare prezena cuvetelor, cu ajutorul celulei integrate LabelGuardTM Microliter. Etapele de msurare a ADN-ului purificat cu ajutorul nanodropului NanoPhotometerTM Pearl sunt: - pipetarea probei de ADN n centrul ferestrei de msurare; - ataarea capacului; - curarea ferestrei de msurare cu un erveel fr praf; - ndeprtarea surplusului de prob din oglinda capacului cu un erveel. Proba de msurat este pipetat direct pe fereastra de msurare. nchiderea capacului favorizeaz formarea unei picturi de lichid la o grosime a stratului optic exact definit (fig. 24). Tehnologia de compresie a probei ADN elimin riscul evaporrii probei i de asemenea evit costurile unor calibrri repetate.

32

Fig. 20: Utilizarea nanodropului n laboratorul de biologie molecular

Sesiunea a IV-a de RT PCR a beneficiat de avantajele utilizrii nanodropului NanoPhotometerTM Pearl (achiziionat n cadrul grantului ID_1642). n tabelul V s-a facut corespondena ntre numrul de cpii virale detectate prin RT PCR, numrul CT-urilor i valoarea ADN cuantificat prin nanodrop.
Tabel IV: Asociere valoarea ADN cuantificat prin nanodrop , numr copii virale i valoarea CT-urilor

Nr. Prob testat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Cuantificare ADN nanodrop (g/ml) 3,493 12,5 3,493 24,5 18,5 31,4 18 26,9 15,5 9,481

Numr cpii detectate n proba iniial No Ct 1,593 x 103 No Ct No Ct 4, 072 x 102 7, 915 x 105 3, 341 x 105 3, 722 x 10 1,321 x 103 No Ct

Valoarea Ct corespunztoare fiecrei probe No Ct 29,73 No Ct No Ct 31,66 20,97 22,19 35,04 30,00 No Ct

33

Cu ajutorul programului SPSS versiunea 16.0 am analizat statistic, descriptiv, prin crostabulare, relaiile dintre ncrcturile virale i diagnosticul citologic. Aa cum se poate vedea n figura 22, cele mai mari ncrcturi virale (105 i 106 cpii ADN / HPV 16, respectiv) au fost detectate n 40% din cazurile de LGSIL i n 60% n cazurile cu HGSIL. Totusi, am detectat o ncrcare viral de 105 cpii i n cazul unei paciente cu citologie normal, i n cazul uneia cu celule atipice, ceea ce sugereaz c ncrctura viral nu poate fi un marker eficient de detecie a femeilor cu risc crescut de evoluie ctre neoplazia cervical. De asemenea, am evaluat relaia dintre ncrcturile virale i factorii de risc (fumat, contraceptive orale, grupul de vrst, tipul infeciei HPV unic versus multipl). Cele mai mari valori ale ncrcturilor virale ale ADN/HPV 16 au fost detectate la grupurile de vrst 20 30 i 40 50 ani. De asemenea, cpii virale de ordinul a 106 au fost identificate i la paciente cu vrsta cuprins ntre 50 60 ani. Pentru lotul nostru studiat, fumatul nu a fost un factor de risc care s fie corelat cu valori ridicate ale cpiilor virale de ADN/HPV 16. Cele mai ridicate valori ale cpiilor virale au fost detectate n lotul nostru pentru pacientele care au declarat c nu au utilizat contraceptive orale. Cele mai ridicate valori ale cpiilor virale de HPV 16 au fost detectate n cazul infeciilor unice cu HPV 16, rezultat comparabil cu cele gsite i de ali autori.

Fig. 21: Corelaii ntre ncrcturile virale ale ADN/HPV 16 i rezultatele examenului citologic

34

Grupa de vrsta

Fumat

Contraceptive

Tipul infeciei HPV

Fig. 22: Corelaii ntre numrul de cpii virale i factorii de risc ai neoplaziei cervicale

Concluzii:
Diversitatea valorilor ncrcturii virale detectate in raport cu gradul displaziei cervicale (am detectat ncrcturi virale mari, de 105 106 cpii virale, att in situaiile n care pacientele aveau HSIL, cum era de ateptat, dar i in cazurile cu LSIL, ASCUS si chiar cu citologie normala), a fcut imposibil stabilirea unei valori limit, care s indice intervenia chirurgical terapeutic. Pentru 7 dintre pacientele testate am realizat monitorizarea lor, la 6, 12 si 18 luni, prin genotipare i prin cuantificarea ADN HPV 16 &18 prin Real Time PCR. Lipsa de aderen a pacientelor la monitorizarea la care au fost invitate s participe, conform formularului de consim mnt informat, se poate explica prin nenelegerea necesitii urmririi pacientelor n vederea precizrii evoluiei bolii. Se impune informarea populaiei cu privire la relaia dintre infeciile determinate de HPV i cancerul cervical ca i la utilitatea participrii la programele de monitorizare.

35

10. Testarea ADN/HPV post-intervenie chirurgical excisional Strategiile terapeutice n cazul bolii bolii confirmate colposcopic pot fi distructive sau excizionale. Nu exist nici un avantaj demonstrat pentru nici una din tehnicile chirurgicale conservatoare pentru tratarea i eradicarea neoplaziei cervicale intraepiteliale. Superioritatea chirurgiei excizionale este dat ns de rata de succes a terapiei. Terapiile excisionale sunt preferate n majoritatea circumstanelor, deoarece ele sunt n mod clar superioare metodelor distructive, avnd avantajul posibilitii evalurii histologice a zonei de transformare. Examinarea histologic a esutului excizat permite anatomopatologului s recunoasc sau s elimine existena unui cancer microinvaziv, a unei boli glandulare sau a implicrii marginilor zonei de transformare (90). Monitorizarea dup terapia CIN utiliznd examenul citologic a fost cea mai frecvent procedur de urmrire, dar eficiena ei a fost discutat datorit sensibilitii sczute pentru detecia CIN prin aceast metod. Deoarece infecia HPV este esenial pentru dezvoltarea i meninerea CIN, detecia ADN/HPV poate detecta leziunile CIN reziduale sau recurente mai rapid i cu o sensibilitate mai ridicat. Unele studii au identificat c ADN/HPV este de obicei eliminat dupa terapia eficient a CIN, iar persistena ADN/HPV este predictiv pentru recuren . Studiile ntreprinse pn n prezent au analizat cteva metode diferite de terapie, care au fost identificate a avea rate de succes diferite n clearance-ul ADN/HPV, sugernd c testarea ADN/HPV este util pentru evaluarea diferitelor tehnici de terapie (92). Unul din obiectivele tezei de doctorat a fost evaluarea tipului de infecie HPV, tranzitorie versus infecie persistent , la 6 luni de la intervenia chirurgical, evaluat cu un test sensibil de identificare a ADN/HPV: Linear Array HPV genotyping test. Pentru atingerea acestui obiectiv, au fost analizate cazurile selectate din rndul pacientelor genotipate HPV. 21 paciente (22 46 ani) au fost testate post intervenie chirurgical excizional. Au fost incluse n acest studiu toate pacientele care mpreun cu ginecologul au completat formularul de consimmnt informat pentru participarea la studiu, precum i formularul de solicitare a genotiprii HPV (fig. 46); n acest formular se cere menionarea motivului solicitrii genotiprii HPV (screening, testare post intervenie chirurgical, suspiciune macroscopic, control dup tratament radio-chirurgical, simptomatologie sugestiv sau investigaiii preoperatorii).

36

Metoda de lucru i kiturile utilizate au fost aceleai ca cele descrise n capitolul 4. Rezultatele acestui studiu pot fi sumarizate astfel: anterior interveniei chirurgicale: 14,2% (3/21) dintre paciente au fost pozitive pentru HPV 16; 4,7% au fost pozitive cu HPV 31 (1/21) i respectiv HPV 53 (1/21); o pacient a prezentat infecie multipl cu tipurile HPV 31, 51, 54; genotiparea post-intervenie terapeutic a identificat trei infecii persistente: dou infecii unice (HPV 18 i respectiv HPV 51); o infecie cu tipuri HPV multiple (6, 39); 3 paciente negative pentru ADN/HPV post conizaie au prezentat aceleai rezultate citologice patologice pe toat durata monitorizrii, nefiind influienate de terapia excisional . Utiliznd tehnica Linear Array HPV Genotyping Test am identificat o persisten a infeciei HPV, att cu HR ct i cu LR n 14,28% din cazurile testate. Din lotul pacientelor testate post conizatie am selectat 3 cazuri particulare: Prezentri de caz: 1 Pacienta N.L, 30 ani displazie sever examene citologice repetate: HGSIL examene colposcopice repetate: sugestive pentru infecia HPV 2 intervenii excizionale 2 testri ADN/HPV la 6 luni: ambele negative pentru oricare din cele 37 genotipuri HPV testate ultimul examen citologic: normal Observaie: posibil afectare a celulelor cervicale produs de tratamentul hormonal urmat de pacient. Acesta este un exemplu de caz care a suferit multiple intervenii chirurgicale, marcante afectiv pentru pacient, din cauza subiectivitii testelor citologice i colposcopice. Prezentri de caz: 2 N. M., 32 ani examen citologic periodic: ASCUS, LGSIL, HGSIL test ADN/HPV pozitiv pentru HPV 16, persitent la 6 luni conizaie

37

 retestare prin genotipare la 6 luni: HPV negativ Observaie: eficiena conizaiei, certificat prin testarea ADN/HPV. Infecie persistent tratat eficient prin conizaie, confirmat prin testul ADN. Pacienta este meninut n programul de urmrire. Prezentri de caz: 3 D.C., 45 ani examen citologic: ASCUS testare ADN/HPV prin metoda HC II: negativ examen citologic: HGSIL genotipare HPV LA: HPV 18 biopsie la 6 luni: HPV 18 examen citologic: ASCUS genotipare la 6 luni dupa biopsie: HPV 18 se menine hemoragia intermenstrual histerectomie total (mai 2011): CIN 2 Observaie: lipsa concordanei ntre examenle citologice i cele de biologie molecular. Examenul citologic nu a fost concordant cu persistena ADN HPV 18. Concluzii: Numrul redus de paciente urmrite post-coniza ie impune revizuirea consim mntului informat, astfel nct pacientele s neleag avantajele participrii la studii similare, ca modalitate de monitorizare a reactivrii infeciei persistente, ce impune strategii terapeutice diferite Exist evidene tiinifice despre faptul c testarea HPV dup terapie poate prezice eecul tratamentului cu o sensibilitate semnificativ mai mare i cu specificitate similar, n comparaie cu citologia repetat i cu statusul histologic al marginilor. Dat fiind acest risc al recurenei infeciei HPV, se impune realizarea unor protocoale de urmrire a pacientelor, n funcie de statusul ADN/HPV i cel al citologiei. n cazul pacientelor ADN/HPV pozitive dar cu citologie normal, se impune repetarea testrii ADN/HPV la 5 ani, dar trebuie avut grija la impactul unui rezultat HPV pozitiv asupra pacientei. Sunt nc discuii legate de perioada de realizare a unui test HPV dup terapie. Timpul optim de a efectua o testare ADN/HPV a fost analizat doar n cteva studii: o proporie substanial de femei a eliminat virusul la 3 luni, dar semnificativ este perioada de 3 6 luni post terapie. Dup 6 luni, eliminarea virusului este rar posibil (119, 120). Utilizarea testrii HPV post terapie ar trebui explorat pentru realizarea de noi protocoale pentru monitorizarea dup terapia CIN. Evidenele tiinifice sugereaz de asemenea c urmrirea consecutiv a

38

femeilor negative att pentru HPV ct i pentru citologie ar trebui s fie mai puin intens. Se recomand implementarea i monitorizarea cu grij a pacientelor, prin diferite protocoale de urmarire. Se impun studii de analiz a proteciei pe termen ndelungat a unui rezultat HPV negativ, precum i realizarea de ghiduri naionale i europene pentru management i urmarire. n figura 98 este prezentat un posibil algoritm de urmrire a femeilor dup terapia leziunilor CIN: Colposcopie Acceptabil Colposcopie inaceptabil (CIN 2, 3 recurenta)

Proceduri de urmarire propuse pentru monitorizarea post terapie Excizie / ablaia zonei de transformare Procedura diagnostic excisional

Citologie Citologie i/sau colposcopie

Testare ADN/HPV

Negativ negativ

ASC

HPV pozitiv

HPV

Screening de rutin

Colpscopie Screening de rutin

Fig. 23: Algoritm de monitorizare dup terapia leziunilor CIN (adaptat dup 90)

39

11. Evaluarea riscului de evoluie ctre neoplazia cervical n cazul pacientelor HIV pozitive HPV ca factor de risc pentru HIV Numeroase studii au detectat o prevalen i o inciden mai mare, precum si o persisten a infeciei HPV i a displaziilor anogenitale n cazul femeilor i brbailor HIV pozitivi, n comparaie cu subiecii negativi pentru HIV. Studiul HERS (HIV Epidemiology Research Study) a identificat c aproape toate tipurile HPV se pare c persist n rndul femeilor HIV pozitive, n comparaie cu cele HIV negative (OR = 2,5). Fenomenul de persisten a fost de 1,9 ori mai mare, cu nivele CD4 < 200 celule / l, n comparaie cu femeile cu nivele CD4 > 500 celule / l (123). Prevalena infeciei HPV crete odat cu scderea imunitii. Astfel, n cazul pacientelor HIV negative, prevalena HPV a fost de 29,8% i apoi a crescut dup cum urmeaz: 51,7% pentru cazurile cu CD4 > 200 i cu ARN/HIV < 20.000 copii, 66% pentru cazurile cu CD4 > 200 dar cu ARN/HIV > 20.000 i a crescut apoi la 76% n cazul n care CD4 < 200 celule / l (124). Exist evidene consistente despre faptul c displazia cervical este mult mai prevalent n rndul femeilor HIV infectate, n comparaie cu femeile seronegative. 15 40% dintre femeile HIV pozitive prezint displazie evident, acest procentaj fiind de 10 11 ori mai mare dect n cazul femeilor negative (125). Frecvena i severitatea frotiurilor citologice precum i displaziile confirmate histologic crete odat cu scderea CD4. n aceste cazuri, displazia este asociat cu o implicare extensiv la nivelul cervixului i deseori implic i alte situsuri (vagin, vulv, regiunea perianal) (126). Lot de studiu, metoda, rezultate n perioada februarie iunie 2011 am testat ADN/HPV din celule cervicale recoltate de la paciente cunoscute HIV/AIDS pozitive, monitorizate de o echipa de medici ginecologi a Spitalul Clinic de Obstetrica si Ginecologie Cuza Voda, Iai. Lotul testat a inclus 20 de paciente cu media vrstei de 21 de ani (limite 19 30 ani). 10 / 20 (50%) dintre femeile testate au fost detectate pozitive pentru HPV, dintre care doar 3 au fost infecii unice HPV (52, 68 i respectiv 84). 35% (7/20) paciente au prezentat infecii cu multiple tipuri HPV, fiind detectate ntre 2 i 7 genotipuri HPV pe strip (fig. 24).

40

infectii multiple 35%

negative 50% infectii unice 15%

negative

infectii unice

infectii multiple

Fig. 24: Rezultatele genotiprii lotului de paciente HIV pozitive

Infeciile cu multiple tipuri HPV detectate au fost: - pacienta C. A.: HPV 51, 52, 55, 68, CP 6108; - pacienta D.I.: HPV 6, 16, 51, 52, 66, 73, 83; - pacienta S. E: HPV 6, 16, 73, 82; - pacienta A. A.: HPV 39, 42, 51, 73; - pacienta P. C.: HPV 31, CP 6108; - pacienta B. C.: HPV 6, 11, 52, 58; - pacienta T. A-M.: HPV 42, 53, 82, CP 6108. n fig. 27 am redat imaginea ctorva din aceste stripuri cu multiple benzi albastre care corespund infeciilor cu multiple tipuri HPV.

Fig. 25: Imaginea unor stripuri cu multiple benzi detectate corespunztoare infeciilor cu multiple tipuri HPV

41

Pentru pacientele care au fost pozitive i pentru HPV 16, am cuantificat ADN/HPV 16 prin Real Time PCR. Prezentarea principiului RT PCR i validarea experimentului a fost prezentat n capitolul 3.7. n tabelul VI am prezentat rezultatele obinute pentru aceste dou paciente: cuantificarea ADN cu ajutorul nanodropului, valorile Ct-urilor i numrul de cpii virale detectate prin Real Time PCR.
Tabel V: Rezultatele cuantificrii ADN/HPV 16 pentru dou paciente HIV + Paciente Rezultat genotipare LA HPV 6, 16, 51, 52, 66, 73, 83 HPV 39, 42, 51, 73 Valoare ADN citit la nanodrop 18,5 26,9 Numr Ct / RTPCR 31,66 35,04 Numr cpii ADN/HPV 16 4,072 x 102 3,722 x 10

D.I. S.E.

Discuii: lotul nostru, dei mic ca dimensiune, prezint aceleai caracteristici ca i loturile mari din studiile citate anterior. n primul rnd prevalena ADN/HPV n rndul femeilor HIV pozitive este de 50%, versus 32,1% din lotul nostru prezentat n capitolul 3.4. Dintre infeciile HPV detectate n cazul femeilor HIV pozitive, doar 30% au fost infecii unice, restul fiind infecii cu multiple tipuri HPV. HPV 16 a fost detectat doar n dou din infeciile mutiple, cele mai frecvente HR HPV detectate n aceste cazuri fiind 51 (3 paciente), 52 (3 paciente), 73 i CP6108 (cte 2 paciente).Ca i n cazul altor infecii cu multiple tipuri HPV, ncrcatura viral a ADN/HPV 16 a fost mai mic dect n cazul infeciilor unice. Concluzii: se impune monitorizarea atent a acestor paciente, mai frecvent dect n cazul femeilor HIV negative, chiar dac media lor de vrst este de doar 21 ani, din cauza riscului mai mare de persisten a infeciilor HPV n cazul femeilor HIV pozitve. Pentru ara noastr se recomand de asemenea protocolul scren and treat pentru monitorizarea acestor paciente (135).

12. Infecii asimptomatice cu transmitere sexual

n legatur cu amploarea i importana infeciilor asimptomatice transmise pe cale sexual, este binecunoscut faptul c cele mai multe infecii transmise pe cale sexual (ITS) sunt simptomatice, dar nu este definit exact conceptul ITS asimptomatice, si nu se cunoate frecvena lor sau importana infeciilor asimptomatice n transmiterea ITS.

42

n acest sens se impune alctuirea unui cadru conceptual pentru categorizarea ITS n funcie de simptomatologie, determinarea proporiei indivizilor cu infecie asimptomatic si de asemenea, se impune estimarea proporiei transmiterii ITS datorit infeciilor asimptomatice. Conceptul poate fi construit pe baza prezenei simptomelor, indivizii fiind divizai n mai multe categorii: indivizi simptomatici (simptomele sunt prezente); indivizi cu infecie inaparent (individul prezint simptome dar nu sunt recunoscute ca fiind produse de o ITS); persoane asimptomatice- aceast categorie este important, deoarece, numai pacienii simptomatici vor solicita tratament specific. Analiznd studii de transmitere care au evaluat pacieni simptomatici, pacieni asimptomatici sau cu infecii inaparente, s-a observat c acetia au un rol important n transmiterea ITS, iar partenerii sexuali ai indivizilor cu ITS, simptomatici sau nu, sunt n mod caracteristic asimptomatici. Att publicul larg ct i cadrele medicale trebuie s aprecieze importana naturii asimptomatice a ITS. Mesaje de s ntate public concentrate pe simptomele ITS se vor finaliza cu un impact semnificativ asupra transmiterii acestor infecii. n acelai scop, cadrele medicale trebuie s intensifice evaluarea riscului pacienilor, screening-ul acestora pentru ITS, precum i acordarea de informaii corecte. Este important de discutat potenialul impact al unui test HPV pozitiv asupra unei femei, precum i mesajul transmis acestei femei, att ei ct i partenerului ei n timpul consilierii. Se impune explicarea semnificaiei unui test ADN HPV pozitv i se indic literatura adecvat acestor paciente. Pacientele vor fi sftuite ce msuri s ia n legtur cu partenerul lor i de asemenea, partenerul va trebui informat. Se va verifica necesitatea unei monitorizri ulterioare psihologice i de asemenea pacientele vor fi consiliate din punct de vedere sexual. Viitorul preveniei cancerului cervical presupune utilizarea testrii ADN HPV ca test primar de screening, precum i prevenia secundar ntro populaie complet vaccinat. Principiile unui program de screening populaional presupun testarea unui grup mare al populaiei aparent sanatoase, pentru a detecta semnele precoce ale bolii. Screening-ul este intenionat a inti / viza n special acele persoane care vor beneficia cel mai mult din urma acestui screening, iar scopul unui screening este obinerea unui beneficiu maxim de sntate pentru populaie. Clinicienii au un rol important n transferul de informaie ctre paciente, pentru a favoriza scderea anxietii pacientelor detectate HPV pozitiv. n cazul detectrii unui test HPV pozitiv este necesar concentrarea pe elementele cheie ale mesajului pentru a scdea anxietatea pacientelor. Mesajul ar trebui s

43

conin cunotinte despre faptul c tipurile HPV sunt heterogene, avnd riscuri diferite pentru dezvoltarea cancerului cervical; de asemenea, mesajul ar trebui s conin informaii despre prevalena crescut a infeciei HPV i de asemenea, ar trebui avut n vedere componenta motivaional a preveniei cancerului cervical (136). Monitorizarea i consilierea femeilor HPV pozitive, cu citologie normal Din lotul pacientelor testate prin genotipare n rndul femeilor care nu i-au realizat niciodat un test Papanicolau, am detectat 33,3% paciente ADN/HPV pozitive, iar n cazul femeilor cu un test Papanicolau normal am identificat 19,2% pozitive. n ambele situaii, cazurile ADN HPV pozitive au presupus infecii cu tipuri HRHPV, LRHPV, pHRHPV, precum i infectii cu multiple genotipuri HPV. Putem afirma c n cazul femeilor fr testarea citologic am identificat 33,3% infecii HPV asimptomatice, iar cazul pacientelor cu Papanicolu normal am identificat 19,2% infecii asimptomatice i inaparente (fig. 26: 1-fr citologie efectuat, 2-citologie normal).
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 HR-HPV pHR-HPV LR-HP V NEGA TIV E LR-HP V HR-HP V MULTIPLE INFE CTIONS NEGA TIV E

Fig. 26: Rezultatele testrii ADN/HPV n cazul femeilor fr examen citologic sau cu rezultat normal al examenului Papanicolau n momentul n care am comunicat rezultatul testrii ADN/HPV n cazul acestor dou categorii de paciente, am identificat situaii delicate, de neacceptare, n momentul iniial, al rezultatului genotiprii HPV. Neacceptarea se datoreaz faptului ca pacientele erau n momentul testrii, asimptomatice, i nu voiau sa accepte faptul c au fost detectate pozitive pentru un virus care poate produce cancer. Avnd n vedere ritmul rapid al inovaiei n prevenirea i controlul cancerului de col uterin, au fost realizate puine eforturi concentrate pentru diseminarea informaiei ctre publicul larg, ntr-un mod adecvat i semnificativ. Cele mai multe femei au aflat de HPV n momentul primirii unui rezultat anormal pentru frotiul Papanicolau. Puine persoane nteleg legatura dintre HPV i cancerul cervical. Infecia HPV este o infecie

44

transmis pe cale sexual foarte frecvent, care ns rareori evolueaz ctre cancer. Se impun eforturi pentru optimizarea programelor educaionale de sntate public, care s presupun informarea pacientelor care urmeaz s fie monitorizate, informarea pacientelor pentru nelegerea relaiei dintre un test citologic anormal i un test ADN HPV pozitiv i cum plaseaz aceste rezultate o pacient la risc pentru cancerul cervical. Este important facilitatea lurii unei decizii importante de ctre pacienta cu privire la status-ul infeciei HPV (62). Literatura de specialitate sugereaz c detecia unui HR HPV la o femeie este un indicator important pentru evoluia ctre CIN 2 sau chiar grade mai avansate ale displaziei cervicale. n rndul femeilor cu vrsta peste 30 ani, cu citologie negativ, CIN 3 a fost identificat pe parcursul a 10 ani de monitorizare n 21% din cazurile HPV 16 pozitive i n 18% n cazul pacientelor HPV 18 pozitive. n cazul femeilor pozitive pentru alte HR HPV, riscul pentru CIN 3 a fost doar de 1,5% (62). Probe recoltate de la femei HPV pozitive dar cu citologie negativ trebuie testate prin genotipare HPV, iar femeile detectate pozitive pentru genotipuri specifice HR HPV, cum ar fi HPV 16 i 18 trebuie evaluate i colposcopic. Femeile pozitive pentru alte HR HPV trebuie retestate la 12 luni prin citologie i prin testare ADN HPV. Acest algoritm de urmrire va permite femeilor cu risc de a avea un rezultat fals negativ citologic s fie evaluate colposcopic (63). Multe femei testate n screening-uri populaionale care au fost detectate HPV pozitive au avut un rezultat citologic negativ. ntr-un studiu care a nrolat mai mult de 213.000 femei cu vrsta de 30 ani, prevalena HPV a fost de 6,5% i doar 58% dintre femei au avut un rezultat concordant ntre rezultatul testrii HPV i rezultatul evalurii citologice (136). Femeile HPV pozitive necesit consilierea cu privire la riscul de evoluie ctre CIN 2, cu privire la sursa infeciei i la gradul lor de infectivitate. Riscul de a avea o leziune CIN 2 nedetectat n cazul femeilor HPV pozitve cu citologie negativ a fost detectat a fi ntre 2,4 5,1% (137 142). Este important de menionat c n cazul femeilor cu vrsta peste 30 ani, majoritatea femeilor HPV pozitive devin HPV negative dup monitorizare. Un studiu din Frana a detectat, dup o perioad de 6 luni de urmrire, c 60% din pacientele monitorizate au devenit negative (143). Pe baza acestor considerente, cel mai adecvat management al acestor paciente este monitorizarea prin citologie i testarea ADN HPV la 12 luni. Pacientele care la testri repetate sunt n mod persistent HPV

45

pozitive, ar trebui evaluate colposcopic, n timp ce femeile care devin negative la ambele teste ar trebui retestate dup 3 ani (algoritm fig. 27) (62). Citologie negativ

HPV (-)

HPV (+)

Screening de rutin (nu mai devreme de 3 ani)

Repetarea ambelor teste la 12 luni

Ambele negative anormal, HPV (+)

Citologie (-), HPV (+) Citologie

Screening de rutin

Colposcopie (3 ani)

Management conform ghid ASCCP

Fig. 27: Utilizarea testelor ADN HPV n screening-ul cancerului cervical pentru femeile cu vrsta peste 30 ani, cu citologie negativ (adaptat dup 62)

13. Concluzii generale Romnia se situeaz pe primul loc n Europa n ceea ce privete incidena (23,9/100,000) i mortalitatea (11.6/100,000) prin cancerul de col uterin. n pofida acestor date, rapoartele OMS menioneaz c nu sunt date disponibile pentru ara noastr referitor la prevalena genotipurilor HPV n rndul femeilor cu diferite diagnostice citologice. Introducerea testrii prin RT PCR a infeciilor simptomatice i asimptomatice, induse de HPV, reprezint pentru zona noastr o noutate, deoarece este primul studiu care abordeaz la nivel molecular, relaia dintre

46

aceste infecii i cancerul cervical, utiliznd infrastructura Laboratorului de Microbiologie din cadrul Facultii de Medicin a UMF Gr. T. Popa Iai. Au fost optimizate metodele de biologie molecular ce au fost utilizate n realizarea obiectivelor tiintifice ale tezei (metoda de detecie a 37 genotipuri HPV prin tehnica Linear Array HPV Genotyping Test si tehnicia Real Time PCR pentru cuantificarea HPV 16 i a HPV 18). Pe parcusul celor 3 ani destinai cercetrii tiinifice n cadrul doctoranturii, am realizat genotiparea probelor pentru un lot reprezentativ de paciente (353), iar rezultatele privind prevalena genotipurilor cu risc nalt oncogen detectate (9,91% pentru HPV 16 i 3,11% HPV 18), susin introducerea vaccinrii anti HPV n zona noastr. Genotiparea prin tehnica Linear Array HPV Genotyping test a fost validat prin participarea la un panel internaional de testare a proficienei, organizat de ctre OMS. Pacientele pozitive pentru HPV 16 i 18 au fost testate prin tehnica Real Time PCR, n vederea stabilirii unei valori prag a ncrcturii virale, utile pentru identificarea precoce a riscului de evoluie ctre cancerul cervical. Diversitatea valorilor ncrcturii virale detectate n raport cu gradul displaziei cervicale (mai exact, am detectat ncrcturi virale mari, de 105 106 cpii virale, att n situaiile n care pacientele aveau HSIL, cum era de ateptat, dar i n cazurile cu LSIL, ASCUS i chiar cu citologie normal), a facut imposibil stabilirea unei valori limit, care s indice intervenia chirurgical terapeutic. Cuantificarea prin RT PCR este util n cazul n care se poate realiza testarea n dinamic a ncrcturii virale, pentru a evalua istoria natural a infeciei cu genotipurile nalt oncogene. Pentru apte dintre pacientele testate am realizat monitorizarea lor la 6, 12 i18 luni, prin genotipare i prin cuantificarea ADN HPV 16 i 18 prin Real Time PCR. Lipsa de aderen a pacientelor la monitorizarea la care au fost invitate s participe, conform formularului de consim mnt informat, se poate explica prin nenelegerea necesitii urmririi pacientelor n vederea precizrii evoluiei bolii. Se impune educarea populaiei cu privire la conexiunea dintre HPV i cancerul cervical i la utilitatea participrii la programele de monitorizare. Necesitatea monitorizrii prin testarea ADN HPV se impune i n cazul pacientelor tratate excizional, pentru displazii cervicale de grad nalt. Am evaluat prin testarea ADN HPV, 21 paciente, la 6 luni dup intervenia chirurgical i am detectat o persiste a infeciei HPV, att cu HR ct i cu LR n 14,28% din cazurile testate (dou infecii unice: HPV 18 i respectiv HPV 51, i o infecie cu tipuri HPV multiple - 6, 39). Se impune revizuirea consim mntului informat, astfel nct pacientele s neleag avantajele participrii la astfel de studii, ca modalitate de monitorizare a reactivrii

47

infeciei persistente, ce impune strategii terapeutice diferite. n unele ri, colposcopia, cu o sensibilitate ce variaz n limite foarte largi (24 96 %) este o tehnic abandonat, n favoarea tehnicilor de biologie molecular. Testarea pentru genotipurile HPV nalt oncogene, dup terapia excizional, este cea mai sensibil metod (96%) pentru stabilirea leziunilor CIN reziduale sau recurente. O alt categorie de femei care necesit monitorizare prin testare ADN HPV o reprezint femeile cu vrsta peste 30 ani, asimptomatice, ADN HPV pozitive dar cu citologie negativ. n cazul femeilor cu Papanicolu normal am identificat 19,2% infecii HPV asimptomatice (4 paciente pozitive pentru HPV 16 i alte 4 paciente din aceast categorie, pozitive cu HPV 18). Categoria persoanelor asimptomatice este important, deoarece, numai pacienii simptomatici vor solicita tratament specific. Ghidurile europene recomand monitorizarea atent a acestor paciente prin testarea ADN HPV. n contextul transmiterii simultane a mai multor ageni infecioi, o atenie particular trebuie acordata pacientelor HIV HR HPV pozitive. Am testat 20 de paciente HIV pozitive, cu media vrstei de 21 de ani: 50% au fost pozitive pentru HPV, dintre care 70% au prezentat infecii cu tipuri HPV multiple, fiind detectate concomitent ntre 2 i 7 genotipuri HPV. Prevalena ADN/HPV n rndul femeilor HIV pozitive a fost de 50%, versus 32,1%. HPV 16 a fost detectat doar n dou dintre infeciile multiple, cele mai frecvente HR HPV detectate n aceste cazuri fiind 51 (3 paciente), 52 (3 paciente), 73 i CP6108 (cte 2 paciente). Ca i n cazul altor infecii cu tipuri HPV multiple, ncrctura viral a ADN/HPV 16 a fost mai mic dect n cazul infeciilor unice. Se impune monitorizarea atent a acestor paciente, mai frecvent dect n cazul femeilor HIV negative, chiar dac media lor de vrst este de doar 21 ani, deoarece prevalena infeciei HPV crete odat cu scderea imunitii, iar cancerul cervical n rndul femeilor HIV pozitive nu pare s fi sczut n era HAART. Cele mai multe infecii transmise pe cale sexual (ITS) sunt simptomatice, dar nu se cunoate frecvena lor sau importana infeciilor asimptomatice n transmiterea ITS. Din lotul pacientelor testate prin genotipare n rndul femeilor care nu i-au realizat niciodat un test Papanicolau, am detectat 33,3% paciente ADN/HPV pozitive, iar n cazul femeilor cu un test Papanicolau normal am identificat 19,2% pozitive. n ambele situaii, cazurile ADN HPV pozitive au presupus infecii cu tipuri HRHPV, LRHPV, pHRHPV, precum i infectii cu multiple genotipuri HPV. Putem afirma c n cazul femeilor fr testarea citologic am identificat 33,3% infecii HPV asimptomatice, iar cazul

48

pacientelor cu Papanicolu normal am identificat 19,2% infecii asimptomatice i inaparente. Pn n prezent rile dezvoltate au ajuns la stadiul n care se preconizeaz posibilitatea eradicrii cancerului cervical (teoretic sunt ndeplinite toate condiiile eradicrii unei infecii HPV) i ar fi de dorit ca i n ara noastr s se realizeze un screening organizat pentru detectarea cancerului cervical n stadii incipiente, prin introducerea la nivel naional a genotiprii HPV. Vaccinarea anti HPV, n asociere cu testarea ADN HPV, ar putea conduce la scderea incidenei i mortalitii cancerului cervical pentru ara noastr. Studiul de fa a fost posibil prin utilizarea fondurilor aferente proiectului de cercetare ctigat prin competiie naional: Tehnica Real Time PCR ca instrument practic n diagnosticul i monitorizarea infeciilor HPV, grant CNCSIS, IDEI_1642. 14. Originalitatea contribuiilor proprii Introducerea pentru prima dat a dou metode de biologie molecular (PCR clasic urmat de hibridizare i Real Time PCR) n activitatea de rutin a Laboratorul de Virusologie, din cadrul Disciplinei de Studiu Microbiologie, a Facultii de Medicin, ca etap preliminar iniierii studiului infeciei HPV i a relaiei acesteia cu cancerul de col. Evaluarea prevalenei genotipurilor HPVcirculante n zona de Nord a Moldovei pe un lot reprezentativ, cu obinerea unor rezultate care susin implementarea vaccinrii anti HPV n zona noastr. Obinerea proficienei pentru genotiparea HPV din partea experilor OMS, prin participarea la un panel, la nivel mondial. Evaluarea ncrcturii virale pentru ADN HPV 16 si 18, evaluat prin RT PCR, n raport cu gradul displaziei cervicale;

Studiul a fost axat i pe atingerea altor obiective ale tezei de doctorat, cum au fost testarea ADN/HPV post intervenie excizional i evaluarea riscului de evoluie ctre neoplazia cervical pentru pacientele HIV HPV pozitive;
Diagnosticul infeciei HPV, inclusiv pentru pacientele ncadrate ca HR HPV, urmat de terapia adecvat stadiului, cu scopul reducerii riscului de evoluie nefavorabil.

49

15. Perspectivele pe care le deschide teza realizarea screening-ul cancerului cervical prin determinarea: markerilor corelai cu prezena virusului: ADN /HPV; HPV E6/E7 mARN / Real Time PCR; genotiparea HPV. markerilor leziunilor cervicale: p16INK4a CINTEC; markerii de metilare (CADM1) / Real Time PCR; tranziia de la cercetare, la implementarea ca diagnostic de rutin a genotiprii HPV; diagnosticul infeciilor asiptomatice cu ajutorul tehnicii Real Time PCR, pentru a surprinde boala cervical n stadii incipiente, n vederea unei intervenii terapeutice eficiente.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVA:
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Pagliusi S, Aguado MT. Efficacy and other milestones for human papillomavirus vaccine introduction, Vaccine 2004 23(5):569-578. WHO/ICO Information Centre on HPV and Cervical Cancer (HPV Information Centre). Human Papillomavirus and Related Cancers in World. Summary Report 2009. F. Xavier Bosch, Global Burden & Epidemiology of HPV & associated diseases, HPV Today, July 2010. Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C and Parkin DM. GLOBOCAN 2008, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 10 Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2010. Available from: http://globocan.iarc.fr Doorbar J., The natural history of papillomavirus disease; from silent and productive infections to neoplasia and latency, The 26th International Papillomavirus Conference and Workshops. Harald zur Hausen et al, Classification of papillomaviruses, Virology 324 (2004) 17 27 Margaret Stanley, Mechanisms of HPV infection and immunity - A state of the Art , HPV Immunity online WEBMINAR, Elselvier, 16 / 06 / 2010. Mark Schiffman, HPV: Natural History of the infection from the epidemiologic and clinical perspective, The 26th International Papillomavirus Conference and Workshops. Mark Schiffman et al. Classification of weakly carcinogenic human papillomavirus types: addressing the limits of epidemiology at the borderline, Infectious Agents and Cancer 2009 4:8 doi:10.1186/1750-9378-4-8 Anna Barbara Moscicki, Natural history of infection in younger women: implication for screening, follow-up and treatment, The 26th International Papillomavirus Conference and Workshops. Margaret Stanley, How do HPV vaccines protect? , The 26th International Papillomavirus Conference and Workshops. Anthony B. Miller, Cervical cancer screening: the principles and evaluation parameters of the programme, The 26th International Papillomavirus Conference and Workshops. Chris J.L.M. Meijer, Biological markers in cervical cancer screening, The 26th International Papillomavirus Conference and Workshops. Jack Cuyick, Rational transition from research studies to implementation in programmes, The 26th International Papillomavirus Conference and Workshops. Jack Cuyick et al., Overview of the European and North American studies on HPV testing in primary cervical cancer screening Int. J. Cancer: 119, 10951101 (2006). *** Linear Array HPV Genotyping Test, Roche Diagnostic handbook. *** High Pure PCR Template Preparation Kit for genomic DNA (ROCHE Diagnostics) handbook S Brismar-Wendel, M Froberg, A Hjerpe, S Andersson, B Johansson, Age-specific prevalence of HPV genotypes in cervical cytology samples with equivocal or low-grade lesions, British Journal of Cancer (2009), 1 7.

50

19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47.

J. Jamison, R. T. Wilson and J. Carson , The evaluation of human papillomavirus genotyping in cervical liquidbased cytology specimens; using the Roche Linear Array HPV genotyping assay , Cytopathology 2009, 20, 242 248. Christoph Koidl, MD; Michael Bozic; Ita Hadzisejdic, Comparison of molecular assays for detection and typing of human papillomavirus, Am J Obstet Gynecol, 2008;199:144.e1-144.e6. Philip E. Castle, Carolina Porras, Wim G. Quint , Comparison of Two PCR-Based Human Papillomavirus Genotyping Methods, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Oct. 2008, p. 34373445. J. Jeronimo, N. Wentzensen, R. Long, M. Schiffman, Evaluation of Linear Array Human Papillomavirus Genotyping Using Automatic Optical Imaging Software, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2008, p. 27592765. Matthew P. Stevens, Suzanne M. Garland, Jeffrey H. Tan, HPV Genotype Prevalence in Women With Abnormal Pap Smears in Melbourne, Australia, J. Med.Virol.81:12831291,2009. Marinko Dobec, Fridolin Bannwart, Franz Kaeppeli, Pascal Cassinotti, Automation of the linear array HPV genotyping test and its application for routine typing of human papillomaviruses in cervical specimens of women without cytological abnormalities in Switzerland, Journal of Clinical Virology 45 (2009) 2327. Muoz N, Bosch FX, de Sanjos S, Herrero R, Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer, N. Engl. J Med., 2003, Feb 6; 348 (6); 518 27. *** Introduction to Quantitative PCR, Stratagene, Methods and Application Guide; Tevfik Dorak M., (editor) Real Time PCR, BIOS Advanced Methods; *** qPCR course - Freising, Germany, TATAA BIOEPS COURSE; *** PrecisionTM 2X qPCR Mastermix handbook, Primer Design LTD, handbook. *** Quantification of Human Papilloma Virus 16 (HPV 16) genomes, Primer Design handbook; *** Quantification of Human Papilloma Virus 18 (HPV 16) genomes, Primer Design handbook; *** Mx300XP_Demo_mature, Azra Dedic Biomedica Medizinprodukte GmbH. WHO & IARC, IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenetic Risks to Humans, Human Papillomaviruses, volume 90, Lyon, France, 2007. van Duin, Snijders PJ, Meijer CJ, Human Papillomavirus 16 load in normal and abnormal cervical scrapes; an indicator of CIN II/III and viral celearance, Int J Cancer, 2002, Apr 1; 98 (4); 590 5. Peter J.F. Snijders, Albertus T. Hesselink, Chris J.L.M. Meijer, Determination of viral load thresholds in cervical scrapings to rule out CIN 3 in HPV 16, 18, 31 and 33-positive women with normal cytology, Int. J. Cancer: 119, 11021107 (2006). Albertus T. Hesselink, Chris J.L.M. Meijer, Peter J.F. Snijders1, High-risk human papillomavirus DNA load in a population-based cervical screening cohort in relation to the detection of high-grade cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer, Int. J. Cancer: 124, 381386 (2009). Inger Gustavssona, Ivana Juko-Pecirepa, Ingrid Backlund, Comparison between the Hybrid Capture 2 and the hpVIR real-time PCR for detection of human papillomavirus in women with ASCUS or low grade dysplasia, Journal of Clinical Virology 45 (2009) 8589. Karin Biedermann, Nadia Dandachi, Maria Trattner, Comparison of Real-Time PCR Signal-Amplified In Situ Hybridization and Conventional PCR for Detection and Quantification of Human Papillomavirus in Archival Cervical Cancer Tissue, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2004, p. 37583765. Ming Guo, Nour Sneige, Elvio G Silva, Distribution and viral load of eight oncogenic types of human papillomavirus (HPV) and HPV 16 integration status in cervical intraepithelial neoplasia and carcinoma, Modern Pathology (2007) 20, 256266. Long Fu Xi, Nancy B. Kiviat, Denise A. Galloway, Effect of Cervical Cytologic Status on the Association between Human Papillomavirus Type 16 DNA Load and the Risk of Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade 3, The Journal of Infectious Diseases 2008; 198:324 31. Nelba Tbora, Annabelle Ferrera, Judith M. J. E. Bakkers, High HPV 16 Viral Load is Associated with Increased Cervical Dysplasia in Honduran Women , Am. J. Trop. Med. Hyg., 78(5), 2008, pp. 843846. Jean-Luc Prtet, Vronique Dalstein, Sylvain Monnier-Benoit, High risk HPV load estimated by Hybrid Capture II correlates with HPV16 load measured by real-time PCR in cervical smears of HPV16-infected women, Journal of Clinical Virology 31 (2004) 140147. Elisa Leo, Simona Venturoli , Monica Cricca, High-throughput two-step LNA real time PCR assay for the quantitative detection and genotyping of HPV prognostic-risk groups, Journal of Clinical Virology 45 (2009) 304310. Tibor Takacs, Csaba Jeney, Laura Kovacs, Molecular beacon-based real-time PCR method for detection of 15 high-risk and 5 low-risk HPV types, Journal of Virological Methods 149 (2008) 153162. Roger A. Hubbard, Human Papillomavirus Testing Methods, Arch Pathol Lab MedVol 127, August 2003. Francois Coutle,, Helen Trottier, Simon Gagnon, Low-risk human papillomavirus type 6 DNA load and integration in cervical samples from women with squamous intraepithelial lesions, Journal of Clinical Virology 45 (2009) 9699. Roberto Flores-Munguia, Erin Siegel, Walter T. Klimecki, and Anna R. Giuliano, Performance Assessment of Eight High-Throughput PCR Assays for Viral Load Quantitation of Oncogenic HPV Types, Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 6, No. 2, May 2004.

51

48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65.

66. 67. 68. 69. 70.

71.

Francesco Broccolo, Stefania Chiari, Andrea Piana, Prevalence and Viral Load of Oncogenic Human Papillomavirus Types Associated With Cervical Carcinoma in a Population of North Italy, Journal of Medical Virology 81:278287 (2009). Martina Schmitza, Cornelia Scheungraber, Jrg Herrmann, Quantitative multiplex PCR assay for the detection of the seven clinically most relevant high-risk HPV types, Journal of Clinical Virology 44 (2009) 302307. Merja P. Ruutu, Satu-Maria Kulmala, Panu Peitsaro, The performance of the HPV16 real-time PCR integration assay, Clinical Biochemistry 41 (2008) 423428 Christopher Payan, Alexandra Ducancelle, Mohamed H. Aboubaker, Human Papillomavirus Quantification in Urine and Cervical Samples by Using the Mx4000 and LightCycler General Real-Time PCR Systems , JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Mar. 2007, p. 897901. Ramona Gabriela Ursu, Lumini a Smaranda Iancu, HR-HPV viral load, p16INK4a: predictive of persistence infection, 25th International Papillomavirus Conference. Malmo, May, 2009. Carina Eklund, Keng-Ling Wallin, Ola Forslund, Joakim Dillner, WHO HPV LabNet Report on HPV DNA Proficiency Panel, 2010 De Sanjose et al. Worldwide prevalence and genotype distribution of cervical human papillomavirus DNA in women with normal cytology: a meta-analysis. Lancet Infect Dis 2001 7(7): 453 459. K S Cuschieri et al., Multiple high risk HPV infections are common in cervical neoplasia and young women in a cervical screening population, J Clin Pathol 2004;57:6872 Silvia Franceschi, Oral contraceptives and cervical cancer, HPVToday, 17. Stuart Collinsa et al., Cigarette smoking is an independent risk factor for cervical intraepithelial neoplasia in young women: A longitudinal study, Eur J Cancer. 2010 January ; 46(2): 405411. Ann Nielsen Acquisition of high-risk human papillomavirus infection in a population-based cohort of Danish women, Sex Transm Dis. 2009 October ; 36(10): 609615 Giancarlo Ripabelli et al., Prevalence and genotype identification of human papillomavirus in women undergoing voluntary cervical cancer screening in Molise, Central Italy, Cancer Epidemiology 34 (2010) 162 167 Ameli Trope et al., Performance of Human Papillomavirus DNA and mRNA Testing Strategies for Women with and without Cervical Neoplasia, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2009, p. 24582464 *** NanoPhotometerTM Pearl hand book Carcopino X, Henry M, Benmoura D, Fallabregues AS, Richet H, Boubli L, Tamalet C., Determination of HPV type 16 and 18 viral load in cervical smears of women referred to colposcopy., J Med Virol. 2006 Aug;78(8):1131-40. Snijders PJ, Hogewoning CJ, Hesselink AT, Berkhof J, Voorhorst FJ, Bleeker MC, Meijer CJ., Determination of viral load thresholds in cervical scrapings to rule out CIN 3 in HPV 16, 18, 31 and 33-positive women with normal cytology., Int J Cancer. 2006 Sep 1;119(5):1102-7 Yoshida T, Sano T, Kanuma T, Owada N, Sakurai S, Fukuda T, Nakajima T., Quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of the type distribution, viral load, and physical status of human papillomavirus in liquid-based cytology samples from cervical lesions., Int J Gynecol Cancer. 2008 Jan-Feb;18(1):121-7. Syrjnen K, Kulmala SM, Shabalova I, Petrovichev N, Kozachenko V, Zakharova T, Pajanidi J, Podistov J, Chemeris G, Sozaeva L, Lipova E, Tsidaeva I, Ivanchenko O,Pshepurko A, Zakharenko S, Nerovjna R, Kljukina L, Erokhina O, Branovskaja M, Nikitina M, Grunjberga V, Grunjberg A, Juschenko A, Santopietro R, Cintorino M, Tosi P, Syrjnen S., Epidemiological, clinical and viral determinants of the increased prevalence of high-risk human papillomavirus (HPV) infections in elderly women., Eur J Gynaecol Oncol. 2008;29(2):114-22. Hesselink AT, Berkhof J, Heideman DA, Bulkmans NW, van Tellingen JE, Meijer CJ, Snijders PJ., High-risk human papillomavirus DNA load in a population-based cervical screening cohort in relation to the detection of high-grade cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer., Int J Cancer. 2009 Jan 15;124(2):381-6. Broccolo F, Chiari S, Piana A, Castiglia P, Dell'Anna T, Garcia-Parra R, Maneo A, Villa A, Leone EB, Perego P, Maida A, Mangioni C, Cocuzza CE., Prevalence and viral load of oncogenic human papillomavirus types associated with cervical carcinoma in a population of North Italy., J Med Virol. 2009 Feb;81(2):278-87. Winer RL, Harris TG, Xi LF, Jansen KU, Hughes JP, Feng Q, Welebob C, Ho J, Lee SK, Carter JJ, Galloway DA, Kiviat NB, Koutsky LA., Quantitative human papillomavirus 16 and 18 levels in incident infections and cervical lesion development., J Med Virol. 2009 Apr;81(4):713-21. Xi LF, Edelstein ZR, Meyers C, Ho J, Cherne SL, Schiffman M., Human papillomavirus types 16 and 18 DNA load in relation to coexistence of other types, particularly those in the same species., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2009 Sep;18(9):2507-12. Damay A, Didelot-Rousseau MN, Costes V, Konate I, Ouedraogo A, Nagot N, Foulongne V, Van de Perre P, Mayaud P, Segondy M., Viral load and physical status of human papillomavirus (HPV) 18 in cervical samples from female sex workers infected with HPV 18 in Burkina Faso., J Med Virol. 2009 Oct;81(10):178691. Yoshida T, Sano T, Oyama T, Kanuma T, Fukuda T., Prevalence, viral load, and physical status of HPV 16 and 18 in cervical adenosquamous carcinoma., Virchows Arch. 2009 Sep;455(3):253-9.

52

72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. 83.

84. 85. 86. 87. 88. 89.

90. 91.

92. 93.

Singh A, Datta P, Jain SK, Bhatla N, Dutta Gupta S, Dey B, Singh N., Human papilloma virus genotyping, variants and viral load in tumors, squamous intraepithelial lesions, and controls in a north Indian population subset., Int J Gynecol Cancer. 2009 Dec;19(9):1642-8. Xi LF, Koutsky LA, Castle PE, Edelstein ZR, Meyers C, Ho J, Schiffman M., Relationship between cigarette smoking and human papilloma virus types 16 and 18 DNA load., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2009 Dec;18(12):3490-6. Dinc B, Rota S, Onan A, Bozdayi G, Taskiran C, Biri A, Gner H., Prevalence of human papillomavirus (HPV) and HPV-16 genotyping by real-time PCR in patients with several cervical pathologies., Braz J Infect Dis. 2010 Jan-Feb;14(1):19-23. Ramanakumar AV, Goncalves O, Richardson H, Tellier P, Ferenczy A, Coutle F, Franco EL., Human papillomavirus (HPV) types 16, 18, 31, 45 DNA loads and HPV-16 integration in persistent and transient infections in young women., BMC Infect Dis. 2010 Nov 11;10:326. Carcopino X, Bolger N, Henry M, Mancini J, Boubli L, Olive D, Cleary S, Prendiville W, Tamalet C., Evaluation of type-specific HPV persistence and high-risk HPV viral load quantitation in HPV positive women under 30 with normal cervical cytology., J Med Virol. 2011 Apr;83(4):637-43. doi: 10.1002/jmv.22022. Marks M, Gravitt PE, Utaipat U, Gupta SB, Liaw K, Kim E, Tadesse A, Phongnarisorn C, Wootipoom V, Yuenyao P, Vipupinyo C, Rugpao S, Sriplienchan S, Celentano DD., Kinetics of DNA load predict HPV 16 viral clearance., J Clin Virol. 2011 May;51(1):44-9. Li Y, Xiang Y, Zhang RF, Cai YP, Yang Y, Cheng XM, Zhu BL. , Viral load, genomic integration frequency of human papillomavirus 16 in cervical cancer and precancerous lesions, Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2011 Apr 5;91(13):906-10. Nielsen A, Kjaer SK, Munk C, Osler M, Iftner T., Persistence of high-risk human papillomavirus infection in a population-based cohort of Danish women., J Med Virol. 2010 Apr;82(4):616-23. Gunnell AS, Tran TN, Torrng A, Dickman PW, Sparn P, Palmgren J, Ylitalo N., Synergy between cigarette smoking and human papillomavirus type 16 in cervical cancer in situ development., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006 Nov;15(11):2141-7. Epub 2006 Oct 20. Muoz N, Castellsagu X, de Gonzlez AB, Gissmann L., Chapter 1: HPV in the etiology of human cancer., Vaccine. 2006 Aug 31;24 Suppl 3:S3/1-10. Epub 2006 Jun 23. Rajeevan MS, Swan DC, Nisenbaum R, Lee DR, Vernon SD, Ruffin MT, Horowitz IR, Flowers LC, Kmak D, Tadros T, Birdsong G, Husain M, Srivastava S, Unger ER., Epidemiologic and viral factors associated with cervical neoplasia in HPV-16-positive women., Int J Cancer. 2005 May 20;115(1):114-20. Wang SS, Schiffman M, Herrero R, Carreon J, Hildesheim A, Rodriguez AC, Bratti MC, Sherman ME, Morales J, Guillen D, Alfaro M, Clayman B, Burk RD, Viscidi RP., Determinants of human papillomavirus 16 serological conversion and persistence in a population-based cohort of 10 000 women in Costa Rica., Br J Cancer. 2004 Oct 4;91(7):1269-74. Reesink-Peters N, Burger MP, Kleter B, Quint WG, Bossuyt PM, Adriaanse AH., Using a new HPV detection system in epidemiological research: change of views on cervical dyskaryosis?, Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2001 Oct;98(2):199-204. Ho GY, Kadish AS, Burk RD, Basu J, Palan PR, Mikhail M, Romney SL., HPV 16 and cigarette smoking as risk factors for high-grade cervical intra-epithelial neoplasia., Int J Cancer. 1998 Oct 29;78(3):281-5. del Amo J, Gonzlez C, Belda J, Fernndez E, Martnez R, Gmez I, Torres M, Saiz AG, Ortiz M., Prevalence and risk factors of high-risk human papillomavirus in female sex workers in Spain: differences by geographical origin., J Womens Health (Larchmt). 2009 Dec;18(12):2057-64. Flores R, Papenfuss M, Klimecki WT, Giuliano AR., Cross-sectional analysis of oncogenic HPV viral load and cervical intraepithelial neoplasia., Int J Cancer. 2006 Mar 1;118(5):1187-93. Ylitalo N, Srensen P, Josefsson A, Frisch M, Sparn P, Pontn J, Gyllensten U, Melbye M, Adami HO., Smoking and oral contraceptives as risk factors for cervical carcinoma in situ., Int J Cancer. 1999 May 5;81(3):357-65. Daling JR, Madeleine MM, McKnight B, Carter JJ, Wipf GC, Ashley R, Schwartz SM, Beckmann AM, Hagensee ME, Mandelson MT, Galloway DA., The relationship of human papillomavirus-related cervical tumors to cigarette smoking, oral contraceptive use, and prior herpes simplex virus type 2 infection., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1996 Jul;5(7):541-8 Arbyn M., Anttila A., Jordan J., Ronco G., Schenck U., Segnan N., Wiener H. G., Herbert A., Daniel J., von Karsa L., European guidelines for quality assurance in cervical cancer screening, Second Edition, IARC. Wright TC Jr, Massad LS, Dunton CJ, Spitzer M, Wilkinson EJ, Solomon D; 2006 American Society for Colposcopy and Cervical Pathology-sponsored Consensus Conference., 2006 consensus guidelines for the management of women with abnormal cervical cancer screening tests., Am J Obstet Gynecol. 2007 Oct;197(4):346-55. Review. Jordan J, Martin-Hirsch P, Arbyn M, Schenck U, Baldauf JJ, Da Silva D, Anttila A, Nieminen P, Prendiville W., European guidelines for clinical management of abnormal cervical cytology, part 2., Cytopathology. 2009 Feb;20(1):5-16. Strander B, Ryd W, Wallin KL, Wrleby B, Zheng B, Milsom I, Gharizadeh B, Pourmand N, AnderssonEllstrm A., Does HPV-status 6-12 months after treatment of high grade dysplasia in the uterine cervix predict long term recurrence?, Eur J Cancer. 2007 Aug;43(12):1849-55.

53

94. 95. 96. 97. 98. 99. 100. 101. 102. 103. 104. 105. 106. 107. 108. 109. 110. 111. 112. 113. 114.

115. 116. 117.

Distfano AL, Picconi MA, Alonio LV, Dalbert D, Mural J, Bartt O, Bazn G, Cervantes G, Lizano M, Carranc AG, Teyssi A., Persistence of human papillomavirus DNA in cervical lesions after treatment with diathermic large loop excision., Infect Dis Obstet Gynecol. 1998;6(5):214-9 Arbyn M, Paraskevaidis E, Martin-Hirsch P, Prendiville W, Dillner J., Clinical utility of HPV-DNA detection: triage of minor cervical lesions, follow-up of women treated for high-grade CIN: an update of pooled evidence., Gynecol Oncol. 2005 Dec;99(3 Suppl 1):S7-11. Paraskevaidis E, Arbyn M, Sotiriadis A, Diakomanolis E, Martin-Hirsch P, Koliopoulos G, Makrydimas G, Tofoski J, Roukos DH., The role of HPV DNA testing in the follow-up period after treatment for CIN: a systematic review of the literature., Cancer Treat Rev. 2004 Apr;30(2):205-11. Review. Zielinski GD, Bais AG, Helmerhorst TJ, Verheijen RH, de Schipper FA, Snijders PJ, Voorhorst FJ, van Kemenade FJ, Rozendaal L, Meijer CJ., HPV testing and monitoring of women after treatment of CIN 3: review of the literature and meta-analysis., Obstet Gynecol Surv. 2004 Jul;59(7):543-53. Nobbenhuis MA, Meijer CJ, van den Brule AJ, Rozendaal L, Voorhorst FJ, Risse EK, Verheijen RH, Helmerhorst TJ., Addition of high-risk HPV testing improves the current guidelines on follow-up after treatment for cervical intraepithelial neoplasia., Br J Cancer. 2001 Mar 23;84(6):796-801. Bar-Am A, Gamzu R, Levin I, Fainaru O, Niv J, Almog B., Follow-up by combined cytology and human papillomavirus testing for patients post-cone biopsy: results of a long-term follow-up., Gynecol Oncol. 2003 Oct;91(1):149-53. Almog B, Gamzu R, Kuperminc MJ, Levin I, Fainaru O, Niv J, Bar-Am A., Human papilloma virus testing in patient follow-up post cone biopsy due to high-grade cervical intraepithelial neoplasia., Gynecol Oncol. 2003 Mar;88(3):345-50. Negri G, Gampenrieder J, Vigl EE, Haitel A, Menia E, Mian C., Human papilloma virus typing at large loop excision of the transformation zone of the cervix uteri., Anticancer Res. 2003 Sep-Oct;23(5b):4289-92. Herndi Z, Szoke K, Spy T, Krasznai ZT, Sos G, Veress G, Gergely L, Knya J., Role of human papillomavirus (HPV) testing in the follow-up of patients after treatment for cervical precancerous lesions., Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2005 Feb 1;118(2):229-34. Denny LA, Wright TC Jr., Human papillomavirus testing and screening., Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2005 Aug;19(4):501-15 Coup VM, Berkhof J, Verheijen RH, Meijer CJ., Cost-effectiveness of human papillomavirus testing after treatment for cervical intraepithelial neoplasia., BJOG. 2007 Apr;114(4):416-24. Leguevaque P, Motton S, Decharme A, Soul-Tholy M, Escourrou G, Hoff J., Predictors of recurrence in highgrade cervical lesions and a plan of management., Eur J Surg Oncol. 2010 Nov;36(11):1073-9. Heymans J, Benoy IH, Poppe W, Depuydt CE., Type-specific HPV geno-typing improves detection of recurrent high-grade cervical neoplasia after conisation., Int J Cancer. 2010 Nov 9. Liu Y, Li C, Wang J, Zhang W., Repeat low-grade squamous intraepithelial cytology with unsatisfactory colposcopy treated by the loop electrosurgical excision procedure: a retrospective study., Eur J Gynaecol Oncol. 2010;31(6):632-5. Fambrini M, Penna C, Pieralli A, Bussani C, Fallani MG, Andersson KL, Scarselli G, Marchionni M., PCR detection rates of high risk human papillomavirus DNA in paired self-collected urine and cervical scrapes after laser CO2 conization for high-grade cervical intraepithelial neoplasia., Gynecol Oncol. 2008 Apr;109(1):59-64. Jeong NH, Lee NW, Kim HJ, Kim T, Lee KW., High-risk human papillomavirus testing for monitoring patients treated for high-grade cervical intraepithelial neoplasia., J Obstet Gynaecol Res. 2009 Aug;35(4):706-11. Ribaldone R, Boldorini R, Capuano A, Arrigoni S, Di Oto A, Surico N., Role of HPV testing in the follow-up of women treated for cervical dysplasia., Arch Gynecol Obstet. 2010 Aug;282(2):193-7. Ostoji DV, Vrdoljak-Mozetic D, Stemberger-Papi S, Finderle A, Eminovi S., Cervical cytology and HPV test in follow-up after conisation or LLETZ., Coll Antropol. 2010 Mar;34(1):219-24. Ding Z, Jiang C, Shore T, Pather S, Dalrymple C, Atkinson K, Murali R, Yousef Al-Rayyan ES, Luo K, Carter J., Outcome of cervical intraepithelial neoplasia 2 diagnosed by punch biopsy in 131 women., J Obstet Gynaecol Res. 2011 Mar 13. doi: 10.1111/j.1447-0756.2010.01427.x. Kucera E, Sliutz G, Czerwenka K, Breitenecker G, Leodolter S, Reinthaller A., Is high-risk human papillomavirus infection associated with cervical intraepithelial neoplasia eliminated after conization by largeloop excision of the transformation zone?, Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2001 Dec 10;100(1):72-6. Kreimer AR, Guido RS, Solomon D, Schiffman M, Wacholder S, Jeronimo J, Wheeler CM, Castle PE., Human papillomavirus testing following loop electrosurgical excision procedure identifies women at risk for posttreatment cervical intraepithelial neoplasia grade 2 or 3 disease., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006 May;15(5):908-14. Gk M, Coup VM, Berkhof J, Verheijen RH, Helmerhorst TJ, Hogewoning CJ, Snijders PJ, Meijer CJ., HPV16 and increased risk of recurrence after treatment for CIN., Gynecol Oncol. 2007 Feb;104(2):273-5. Fallani MG, Penna C, Marchionni M, Bussani C, Pieralli A, Andersson KL, Fambrini M., Prognostic significance of high-risk HPV persistence after laser CO2 conization for high-grade CIN: a prospective clinical study., Eur J Gynaecol Oncol. 2008;29(4):378-82. Dyson S, Pitts M, Lyons A, Mullins R., Providing high quality information about human papillomavirus for women after treatment for high-grade cervical dysplasia., Sex Health. 2010 Mar;7(1):49-54.

54

118. Valasoulis G, Koliopoulos G, Founta C, Kyrgiou M, Tsoumpou I, Valari O, Martin-Hirsch P, Daponte A, Karakitsos P, Paraskevaidis E., Alterations in human papillomavirus-related biomarkers after treatment of cervical intraepithelial neoplasia., Gynecol Oncol. 2011 Apr;121(1):43-8. 119. Nobbenhuis MA, Meijer CJ, van den Brule AJ, Rozendaal L, Voorhorst FJ, Risse EK, Verheijen RH, Helmerhorst TJ., Addition of high-risk HPV testing improves the current guidelines on follow-up after treatment for cervical intraepithelial neoplasia., Br J Cancer. 2001 Mar 23;84(6):796-801. 120. Elfgren K, Jacobs M, Walboomers JM, Meijer CJ, Dillner J., Rate of human papillomavirus clearance after treatment of cervical intraepithelial neoplasia., Obstet Gynecol. 2002 Nov;100(5 Pt 1):965-71. 121. Soutter WP, Sasieni P, Panoskaltsis T., Long-term risk of invasive cervical cancer after treatment of squamous cervical intraepithelial neoplasia., Int J Cancer. 2006 Apr 15;118(8):2048-55. 122. Kalliala I, Dyba T, Nieminen P, Hakulinen T, Anttila A., Mortality in a long-term follow-up after treatment of CIN., Int J Cancer. 2010 Jan 1;126(1):224-31. 123. Schuman P, Ohmit SE, Klein RS, Duerr A, Cu-Uvin S, Jamieson DJ, Anderson J, Shah KV; HIV Epidemiology Research Study (HERS) Group., Longitudinal study of cervical squamous intraepithelial lesions in human immunodeficiency virus (HIV)-seropositive and at-risk HIV-seronegative women., J Infect Dis. 2003 Jul 1;188(1):128-36. 124. Silverberg MJ, Ahdieh L, Munoz A, Anastos K, Burk RD, Cu-Uvin S, Duerr A, Greenblatt RM, Klein RS, Massad S, Minkoff H, Muderspach L, Palefsky J, Piessens E, Schuman P, Watts H, Shah KV., The impact of HIV infection and immunodeficiency on human papillomavirus type 6 or 11 infection and on genital warts., Sex Transm Dis. 2002 Aug;29(8):427-35. 125. Strickler HD, Palefsky JM, Shah KV, Anastos K, Klein RS, Minkoff H, Duerr A, Massad LS, Celentano DD, Hall C, Fazzari M, Cu-Uvin S, Bacon M, Schuman P, Levine AM, Durante AJ, Gange S, Melnick S, Burk RD., Human papillomavirus type 16 and immune status in human immunodeficiency virus-seropositive women., J Natl Cancer Inst. 2003 Jul 16;95(14):1062-71. 126. Harris TG, Burk RD, Palefsky JM, Massad LS, Bang JY, Anastos K, Minkoff H, Hall CB, Bacon MC, Levine AM, Watts DH, Silverberg MJ, Xue X, Melnick SL, Strickler HD., Incidence of cervical squamous intraepithelial lesions associated with HIV serostatus, CD4 cell counts, and human papillomavirus test results., JAMA. 2005 Mar 23;293(12):1471-6. 127. Auvert B, Lissouba P, Cutler E, Zarca K, Puren A, Taljaard D., Association of oncogenic and nononcogenic human papillomavirus with HIV incidence., J Acquir Immune Defic Syndr. 2010 Jan 1;53(1):111-6. 128. Clarke B, Chetty R., Postmodern cancer: the role of human immunodeficiency virus in uterine cervical cancer., Mol Pathol. 2002 Feb;55(1):19-24.99. Gage JR, Sandhu AK, Nihira M, Bonecini-Almeida M da G, Cristoforoni P, Kishimoto T, Montz FJ, Martnez-Maza O., Effects of human papillomavirus-associated cells on human immunodeficiency virus gene expression., Obstet Gynecol. 2000 Dec;96(6):879-85. 129. Gray RH, Serwadda D, Kong X, Makumbi F, Kigozi G, Gravitt PE, Watya S, Nalugoda F, Ssempijja V, Tobian AA, Kiwanuka N, Moulton LH, Sewankambo NK, Reynolds SJ, Quinn TC, Iga B, Laeyendecker O, Oliver AE, Wawer MJ., Male circumcision decreases acquisition and increases clearance of high-risk human papillomavirus in HIV-negative men: a randomized trial in Rakai, Uganda., J Infect Dis. 2010 May 15;201(10):1455-62. 130. Cu-Uvin S., HPV as a risk factor for HIV, the 26 th International Papillomavirus Conference, Montreal, Canada, 2010 131. Clifford GM, Gonalves MA, Franceschi S; HPV and HIV Study Group., Human papillomavirus types among women infected with HIV: a meta-analysis., AIDS. 2006 Nov 28;20(18):2337-44 132. De Vuyst H, Lillo F, Broutet N, Smith JS., HIV, human papillomavirus, and cervical neoplasia and cancer in the era of highly active antiretroviral therapy., Eur J Cancer Prev. 2008 Nov;17(6):545-54. 133. Gervaz P, Hahnloser D, Wolff BG, Anderson SA, Cunningham J, Beart RW Jr, Klipfel A, Burgart L, Thibodeau SN., Molecular biology of squamous cell carcinoma of the anus: a comparison of HIV-positive and HIV-negative patients., J Gastrointest Surg. 2004 Dec;8(8):1024-30; discussion 1031. 134. Kitchener H, Nelson L, Adams J, Mesher D, Sasieni P, Cubie H, Moore C, Heard I, Agarossi A, Casolati E, Denny L, Bradbeer C, Lyons F, Beattie G, Niemiec T., Colposcopy is not necessary to assess the risk to the cervix in HIV-positive women: an international cohort study of cervical pathology in HIV-1 positive women., Int J Cancer. 2007 Dec 1;121(11):2484-91. 135. Franceschi S., Epidemiology of HPV infection in HIV infected people, the 26th International Papillomavirus Conference, Montreal, Canada, 2010 136. Ogilvie G., Follow-up and counseling for HPV positive women with normal smears, the 26th International Papillomavirus Conference, Montreal, Canada, 2010 137. Kjaer S, H gdall E, Frederiksen K, Munk C, van den Brule A, Svare E, Meijer C, Lorincz A, Iftner T., The absolute risk of cervical abnormalities in high-risk human papillomavirus-positive, cytologically normal women over a 10-year period., Cancer Res. 2006 Nov 1;66(21):10630-6. 138. Khan MJ, Castle PE, Lorincz AT, Wacholder S, Sherman M, Scott DR, Rush BB, Glass AG, Schiffman M., The elevated 10-year risk of cervical precancer and cancer in women with human papillomavirus (HPV) type 16 or 18 and the possible utility of type-specific HPV testing in clinical practice., J Natl Cancer Inst. 2005 Jul 20;97(14):1072-9.

55

139. Goldie SJ, Kim JJ, Wright TC., Cost effectiveness of human papillomavirus DNA testing for cervical cancer screening in women aged 30 years or more., Obstet Gynecol. 2004 Apr;103(4):619-31. 140. Ronco G, Segnan N, Giorgi-Rossi P, Zappa M, Casadei GP, Carozzi F, Dalla Palma P, Del Mistro A, Folicaldi S, Gillio-Tos A, Nardo G, Naldoni C, Schincaglia P, Zorzi M, Confortini M, Cuzick J; New Technologies for Cervical Cancer Working Group., Human papillomavirus testing and liquid-based cytology: results at recruitment from the new technologies for cervical cancer randomized controlled trial., J Natl Cancer Inst. 2006 Jun 7;98(11):765-74. 141. Bigras G, de Marval F., The probability for a Pap test to be abnormal is directly proportional to HPV viral load: results from a Swiss study comparingHPV testing and liquid-based cytology to detect cervical cancer precursors in 13,842 women., Br J Cancer. 2005 Sep 5;93(5):575-81. 142. Cuzick J, Szarewski A, Cubie H, Hulman G, Kitchener H, Luesley D, McGoogan E, Menon U, Terry G, Edwards R, Brooks C, Desai M, Gie C, Ho L, Jacobs I, Pickles C, Sasieni P., Management of women who test positive for high risk types of human papillomavirus: the HART study., Lancet. 2003 Dec 6;362(9399):1871-6. 143. Clavel C, Masure M, Bory JP, Putaud I, Mangeonjean C, Lorenzato M, Nazeyrollas P, Gabriel R, Quereux C, Birembaut P., Papillomavirus testing in primary screening for the detection of high-grade cervical lesions: a study of 7932 women., Br J Cancer. 2001 Jun 15;84(12):1616-23.

LISTA ARTICOLE PUBLICATE

I. II.

Ursu RG, Onofriescu M, Nemescu D, Iancu LS., Enhanced molecular techniques for the diagnosis of human papillomavirus infections., Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2009 Oct-Dec; 113(4):1205-10. Ramona Gabriela Ursu, Mircea Onofriescu, Drago Nemescu, Roxana Nemescu, Luminia Smaranda Iancu, Detection of HPV 16 and HPV 18 viral loads by Real Time PCR in women with cervical dysplasia, Analele tiinifice Ale Universitii Alexandru Ioan Cuza, Seciunea Genetic i Biologie Molecular, Tom XII, fasc. I, 2011, pag 25 29. Luminia-Smaranda Iancu, Ramona Gabriela Ursu, Ecaterina Mariana Enache, Mircea Onofriescu, Particularitatile consimtamntului informat pentru pacientele HPV pozitive, Revista Romana de Bioetica, ISSN: 1583-5170 RAMONA GABRIELA URSU, MIRCEA ONOFRIESCU, DRAGOS NEMESCU, LUMINITA SMARANDA IANCU, HPV prevalence and type distribution in women with or without cervical lesions in the North - East region of Romania, Virology Journal (trimis spre publicare).

III. IV.

56

CURRICULUM VITAE Nume: Ramona Gabriela Ursu Data naterii: 9 noiembrie 1977 Tel.: 0744269946 E-mail: ursuramona@yahoo.com Educatie: o 2007 - prezent: doctorand n specialitatea Microbiologie, cu teza Infecii cu transmitere sexual asimptomatice. Utilitatea clinic a determinrii cantitative prin Real Time PCR a genotipurilor HPV cu risc nalt oncogen; o 2007 2008: coala doctoral; o 2006 2007: Masterat de Epidemiologie clinic. Metodologia de studiu n bolile multicauzale Disciplina de Asisten Primar a Strii de Sntate i Epidemiologie; lucrare de dizertaie: Determinarea cantitativ a genotipurilor Human Papilloma Virus cu risc nalt oncogen i caracterizarea statusului integrrii genomului HPV; o 1997 2003: Universitatea de Medicin i Farmacie Iai, Facultatea de Medicin; o 1993 1997: Liceul Teoretic "tefan cel Mare, Suceava. Calificri: o 2009: Responsabil Management Calitate Transmed Expert o 2008: Medic Specialist Medicin de Laborator; o 2003 2008: Rezident Medicina de Laborator; o 2003: Diploma de Medic. Experienta profesional: o 2008 prezent : asistent, Disciplina de Microbiologie, UMF Grigore T. Popa Iai; o 2004 2008: preparator, Disciplina de Microbiologie, UMF Grigore T. Popa Iai. Cursuri postuniversitare / burse: o 2010: Antimicrobial Stewardship: Measuring, Auditing and Improving, ESCMID Postgraduate Education Course, 8 - 10 April 2010, Vienna, Austria o 2009: Curs Asigurarea calitatii in laboratoarele conform standardului ISO 15189; o 2009: Curs perfectionare tehnica Real Time PCR (PCR cantitativ), prin participarea la cursul orgnizat de TATAA Biocenter, Freising, Germania; o 2009: curs postuniversitar Efectuarea i interpretarea testelor de sensibilitate in vitro pentru principalele specii de interes medical n raport cu noile fenotipuri de rezisten, UMF Grigore T. Popa Iasi, februarie - martie 2009;

57

o 2008: vizit de o sptmna la Organizaia Mondial a Sntii, Departamentul HIV / AIDS, unde, sub indrumarea Dr. George Schmid am selectat bibliografia necesar analizei temei Infecii asimptomatice transmise pe cale sexual; o MD (Mobilitate Doctoral) realizat la Institutul de Virusologie tefan S. Nicolau, Bucureti, pentru deprinderea i aprofundarea tehnicii Real Time PCR (2008) grant PNCDI PNII : Proiecte de mobilitate a doctoranzilor (2/2008). o 2008: participare la Beating Cervical Cancer Webminar, Global Videoconference World Cancer Congress, Geneva, International Union Against Cancer, August 28, 2008; o 2008: grant participare la 47th ESCMID Postgraduate Technical Workshop, Gene Expression during Infection, March, 2008, Siena, Italia; o BD (Bursa Doctoral), Infecii cu transmitere sexual asimptomatice. Utilitatea clinic a determinrii cantitative prin Real Time PCR a genotipurilor HPV cu risc nalt oncogen, competiie CNCSIS (51/2007); o 2007: grant participare la A modern approach to the management of sexually transmitted diseases, 45th ESCMID Postgraduate Education Course, September, 2007, St. Petersburg, Rusia; o 2007: stagiu de perfecionare n laboratorul de Virusologie din cadrul I.N.C.D.M.I. CANTACUZINO, Bucureti - introducere n tehnicile: purificare ADN, PCR standard i genotipare HPV prin metoda INNO LiPA, februarie 2007; o 2006: participare la SUMMER SCHOOL OF PUBLIC HEALTH, Institute of Public Health, Iunie, Iai, Romnia; o 2005 - 2006: mobilitate ERASMUS SOCRATES la University of Southern Denmark, Institute of Public Health, Esbjerg; o 2005: participare la 4th ESCMID Summer School Szeged, Hungary, June, 2005; o 2004: Curs Perfectionare Grecia Bioetica i legislaia sanitar n Romnia. Activitate didactic : o Stud. Silvia Salceanu; coordonatori: Ramona Ursu, Luminia Smaranda Iancu, Genotyping HPV in precancerous cervical lesions: AGC, ASC-US, ASC-H, LGSIL and HGSIL, CONGRESSIS 2011, Al 8-lea Congres Internaional pentru Studeni i Tineri Medici, Iasi o Stud. Silvia Salceanu, coordonatori Ramona Ursu, Luminia Smaranda Iancu., Human Papillomavirus genotype prevalence in Pacani, Romania, 64th International Students' and Young Scientists' Conference "Actual Problems of Modern Medicine", Kyiv, Ukraine , March 3-4th, 2011 o Stud: Ioana Sacar, Silvia Slceanu; coordonatori: Ramona Gabriela Ursu, Luminia Smaranda Iancu, Optimization of Real Time PCR technique for HPV 16 viral load absolute quantification,

58

CONGRESSIS 2010, Al 7-lea Congres Internaional pentru Studeni i Tineri Medici, Iasi o Stud. Oana Murariu, Olivia Jigreanu; coordonatori: Ramona Gabriela Ursu, Luminia Smaranda, Breaking boundaries in Human Papilloma Viruses (HPV) infections diagnosis: from classical Papanicolau test to HPV DNA /mRNA tests, CONGRESSIS 2010, Al 8-lea Congres Internaional pentru Studeni i Tineri Medici, Iasi o 2009: Challenges Related to Acceptability of Human Papilloma Virus Vaccines, Autor: Andreea-Georgiana Aiacoboae, Co-autori: Alexandru Lacatus, Victor Constantinescu, Coordonator tiinific: Assistant Ramona Ursu M.D., CONGRESSIS 2009, Al 6-lea Congres Internaional pentru Studeni i Tineri Medici, Iasi o 2009: Genotyping Human Papillomavirus: Which Assay?, Autori: Salceanu Silvia Olivia, Coordonator tiinific: Assistant Ramona Ursu M.D., CONGRESSIS 2009, Al 6-lea Congres Internaional pentru Studeni i Tineri Medici, Iasi o 2009: participare la conferina studenilor cu prezentarea Implementarea vaccinrii anti HPV, n cadrul Sptmnii Europene de Prevenire a Cancerului de Col Uterin (18-24 ianuarie 2009) o 2008 : pregtirea practic a whorksop-urilor Real Time PCR & ELISA, as laboratory tool in the diagnosis of infectious diseases, The 5th International Congress for Medical Students and Young Doctors, Iai, Romania o 2007: Advantages of HPV genotyping by INNO LiPA method, studeni: Ioana Sacar, Andrei Hristov, coordonator tiinific Ramona Ursu, CONGRESSIS 2007, the 4TH International Congress for Medical Students and Young Doctors, Iai o 2006: Cauzal relation between HBV HCC, studeni: Ioana Sacar, Andrei Hristov, coordonator tiinific Ramona Ursu, International Congres of Young Doctor and Students, Bucharest Membru n proiecte de cercetare : o Tehnica Real Time PCR ca instrument practic n prognosticul i monitorizarea infeciilor cu virusuri papilloma umane cu risc oncogen nalt grant PNCD2 - IDEI (1642/2008), director de proiect prof. dr. Iancu Lumina Smaranda; o Diagnostic prenatal neinvaziv prin analiza molecular a ADN fetal din plasma matern - grant PNCD2 - IDEI (1155/2007), director de proiect prof. dr. Onofriescu Mircea; o Cercetri privind sinteza i activitatea antibacterian a unor derivate de acid-4-chinolon-3- carboxilic. Relaii structur chimic-activitate biologic, grant CEEX, Faza III, director de proiect prof. dr. Mihai Nechifor (2007-2008). Prezentri: o R. Ursu, M. Onofriescu, D. Nemescu, R. Nemescu, L.S. Iancu, HPV 16&18 viral load and risk factors for cervical cancer, The 27the

59

International Papillomavirus Conference 17-22 September 2011, Berlin, Germany o A C Anton, C Cojocaru, G Anton, R Ursu, D Socolov, M Grigore, S Chelemen, Multiple Electrosurgical Excisions Treatment For Precancerous Cervical Lession, The 27the International Papillomavirus Conference 17-22 September 2011, Berlin, Germany o Ramona Gabriela Ursu, Cristina Ana Anton, Lavinia Dimitriu, Maria Carlan, Grigore Alexandru Dimitriu, Luminia Smaranda Iancu, Importana testrii ADN/HPV prin Linear Array Genotyping Test post intervenie excisional n neoplaziile intraepiteliale cervicale, 18lea Congres al Societii Romne de Medicin de Laborator, 25 - 28 mai 2011 la Sibiu o Ramona Ursu, M. Onofriescu, D. Nemescu, Silvia Slceanu, Roxana Nemescu,Mioara Matei, Luminia Smaranda Iancu, Screeningul cancerului cervical: tranziia de la evaluarea citologic, la testarea ADN/HPV, prin tehnici de biologie molecular, Conferinta Nationala de Oncologie, Iasi, noiembrie 2010. o Ursu Ramona, Onofriescu Mircea, Nemescu Drago, Slceanu Sivia, Nemescu Roxana, Matei Mioara, Iancu Luminia Smaranda, Prevalena i distribuia genotipurilor HPV n zona Moldovei; corelaii ntre ncrctura viral de HPV 16 i gradul displaziei cervicale, Conferinta, A II-a Conferinta Nationala de Microbiologie, 2010, Sinaia o Ramona Ursu, Luminia Smaranda Iancu, Prevalence of human papilloma virus types and viral load Pap test correlation in Romania, 26th International Papillomavirus Conference and Workshops, Montreal, iulie 2010, poster P 179. o Ramona Gabriela Ursu , Luminita Smaranda Iancu, Optimizarea tehnicii Real time PCR pentru cuantificarea genotipurilor nalt oncogene de HPV 16 i 18, Conferinta Nationala de Microbiologie si Epidemiologie, octombrie 2009, Brasov O 2009: prezentarea posterului "HR-HPV viral load, p16INK4a predictive of persistence infection" la conferina "25th International Papillomavirus Conference" , Malmo, Suedia, mai 2009 (facilitarea participrii la conferin s-a datorat grantului oferit de International Papillomavirus Society, grant obinut prin competiie). o 2007: HPV: viral load and physical status - clinical utility n cadrul cursului A modern approach to the management of sexually transmitted diseases, 45th ESCMID Postgraduate Education Course, St Petersburg, Rusia; o 2005: Coinfection HBV HCV n cadrul colii de var ESCMID, Szeghed, Ungaria. Articole : o RAMONA GABRIELA URSU, MIRCEA ONOFRIESCU, DRAGOS NEMESCU, LUMINITA SMARANDA IANCU, trimis spre evluare si publicare la Virology Journal

60

o Ursu RG, Onofriescu M, Nemescu D, Iancu LS., Enhanced molecular techniques f, HPV prevalence and type distribution in women with or without cervical lesions in the North - East region of Romania or the diagnosis of human papillomavirus infections., Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2009 Oct-Dec; 113(4):1205-10. o Luminia-Smaranda Iancu, Ramona Gabriela Ursu, Ecaterina Mariana Enache, Mircea Onofriescu, Particularitatile consimtamnatului informat pentru pacientele HPV pozitive, Revista Romana de Bioetica, ISSN: 1583-5170 o Ramona Gabriela Ursu, M. Onofriescu, D. Nemescu, Luminia Smaranda Iancu Optimizarea unor tehnici de biologie molecular pentru diagnosticul infeciilor cu virusuri papilloma umane, Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi, nr. 4, 113/09. o Lucia Pintilie, Catalina Negut, C. Oniscu, M.T. Caproiu, M.Nechifor, Luminita Iancu, Cristina Ghiciuc, Ramona Ursu, Synthesis and Antibacterial Actyvity of some Novel Quinolones, Romanian Biotechnology Letters, Vol. 14, No. 5, 2009, pp. 4756 4767, http://ebooks.unibuc.ro/biologie/RBL/rbl5vol14/19.pdf o Luminita Smaranda Iancu, Medea Berea, Ramona Ursu, M. Onofriescu, The prevalence of MRSA among the lying in women and their new born infants in two maternities from Iai,, Journal of Preventive Medicine, volume 14, 2006. Activitate stiintific: o membru societi tiinifice European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases International PapillomaVirus Society HPV Global Community o membru n comitete de organizare 2008: Cursul Epidemiologie i Sntate Public, creditat CMR, cu participare internaional - invitat Prof. Gabriel Gulis, University of Southern Denmark, Institute of Public Health, Esbjerg. Experient educational: o participare curs de PSIHOPEDAGOGIE organizat de UMF Gr. T. Popa Iai; lucrarea de Dizertaie Comunicarea didactic, coordonator Conf. Dr. erban Turliuc. Activitatea profesional: o 8 ani practic (laborator de bacteriologie - UMF Gr. T. Popa, Iai, laborator de virusologie - ISP Iai, laborator privat analize medicale). Limbi strine: engleza, franceza.

61