CITOGENETICA MOLECULARA

Definitie: combina cunostinte din domeniul biologiei moleculare si al

citogeneticii clasice in vederea identificarii anomaliilor cromozomiale
prin metodele biologiei moleculare.

 faciliteaza detectarea anomaliilor cromozomiale (deletii,

duplicatii, translocatii) mai mici decat cele ale unei benzi
cromozomiale (sub 5 Mb) utilizand cromozomi metafazici sau
cromatina interfazica;
 faciliteaza detectarea anomaliilor genomice cantitative de
marimi variabile si realizarea unui cariotip “molecular”
 reuneste tehnici de analiza cromozomială de generatia IV si V
introduse dupa anii ’80 si au ca pricipii:

HIBRIDIZAREA MOLECULARA si AMPLIFICAREA sondelor

atasate la secventa tinta (PCR).

Tipuri:

CONVENTIONALA - CROMOZOMI METAFAZICI

Analiza prin:

 Bandare G
 Bandare R
 Bandare C
 Bandare NOR
MOLECULARA - CROMOZOMI METAFAZICI NUCLEI INTERFAZICI
Analiza prin:

 FISH standard

 M-FISH/SKY

 FISH-telomere

 Fiber - FISH

 CGH

Tehnicile conventionale

- Necesita cultura celulara;

- Examinare simultana a intregului genom;

Tehnica FISH

- Nu necesita cultura celulara pentru cromatina interfazica;

- Identifica microdeletii, translocatii, inversii, insertii, cromozomi

Tehnici bazate pe PCR (clonarea unei secv.ADN)

- Necesita ADN sau ARN

F. I. S. H. (Fluorescent In Situ Hybridization)

Definitie: tehnica de vizualizare a localizarii cromozomiale a unei

secvente specifice de ADN sau ARN ; foloseste metode citologice,
genetice si moleculare.

Principiu : hibridizarea prin complementaritate intre o sonda ADN

marcata si o tinta (ADN genomic) reprezentata de regiunea
cromozomiala analizata de sonda.

Foloseste proprietatile moleculei de ADN: DENATURAREA si

RENATURAREA (hibridizarea moleculara)
Hibridizarea moleculară se bazează pe capacitatea unor sonde
monocatenare de acid nucleic de a forma, pe bază de
complementaritate, molecule bicatenare cu o secvenţă de acid nucleic
“ţintă” (monocatenar).

SONDA

Definitie: este un fragment de ADN monocatenar, circa 50-300

nucleotide, complementar unei regiuni din cromozom; recunoaste o
secventa unica printre milioane de secvente.

≈ SONDA are SPECIFICITATE ! ≈

Tipuri:

• 1. Pan-CENTROMERICE sau Pan-TELOMERICE

• 2. CENTROMERICE-specifice unui cromozom
• 3. Specifice unui LOCUS dat ( specifice unei gene)
• 4. Specifice unui CROMOZOM intreg sau unui brat cromozomial

TINTA

Definitie: reprezinta fragmentul genomic analizat de sonda.

Pot fi reprezentate de:

1. Segmente ADN din cromozomii metafazici;

2. Segmente ADN din cromatina nucleilor interfazici (in special din
celule fetale);
4. Intregul cromozom, in tehnicile de colorare/pictura cromozomiala
(chromosome painting );
3. Fibra de cromatina extinsa;
5. Intregul genom (in tehnicile CGH).

Cand este recomandat sa folosim analiza FISH ?

  Materialul biologic de analizat nu contine metafaze;
 Rearanjari cromozomiale complexe;
 Identificarea cromozomilor marker;
 Analiza mozaicismului cu frecventa mica;
 Diagnosticul sindroamelor cu microdeletii/microduplicatii

Aplicatii FISH:

TEHNICA FISH APLICATII

- numarul de copii ale unui segment ADN;
- rearanjari sau translocatii cromozomiale;
FISH cu sonde specifice - aplicabil cromozomilor metafazici si
unui locus dat cromatinei interfazice;
- aplicabil suspensiilor citogenetice si
preparatelor in parafina.
-numarul de copii;
- aplicabil cromozomilor metafazici si
FISH cu sonde
cromatinei interfazice;
centromerice
- aplicabil suspensiilor citogenetice si
preparatelor in parafina.
-numarul de copii;
M-FISH / SKY / - rearanjari si translocatii cromozomiale;
Multicolor Band FISH - rearanjari intra cromozomiale;
- aplicabil numai cromozomilor interfazici.
-determina lungimea telomerelor asociata
varstei celulei si erodarea telomerelor;
FISH telomere
- aplicabil cromozomilor metafazici si
cromatinei interfazice.

TEHNOLOGIILE MICROARRAY
Variatie genetica intraspecifica: 0,9-1,3%

Array – dispunerea ordonată a unor spoturi, sub forma unei grile, pe o

membrană sau suport de sticlă (lamă). Fiecare spot conţine (ex., în cazul
arrayului pentru acizi nucleici), molecule multiple şi identice ADN; pentru
un spot dat, fiecare secvenţă este complementară şi specifică unei secvenţe
unice din ADN genomic al speciei de interes.

Structuri tinta:
≈ Acizi nucleici:
• ADN;

• ARN;

≈ Proteine, fragmente peptidice  protein microarray:

- identifică interacțiunile proteină-proteină, substraturile protein-kinazelor,
activatorii factorilor transcripționali, țintele moleculelor active mici;

- grila constă din proteine, secvențe ADN specifice sau anticorpi, care
captureaza proteine din lizatul celular.

≈ Alte componente celulare:

• lipide  lipid array: grila este constituită din lipide, ce capturează
proteine cu care respectivele lipide interacționează;

• polizaharide: grila este reprezentată de lectine sau anticorpi, ce permit

screeningul și identificarea glicanilor;

≈ Celule / fragmente de celule  cell microarray:

-grila constă din proteine, lipide sau anticorpi, care interacționează cu
celulele, capturându-le, sau chiar declanșând răspunsuri specifice (secreție
etc)
≈ Țesuturi  tissue array:
-fragmente mici (0,6 mm diametru) sunt extrase din țesturi fixate și
inserate într-un bloc de parafină, într-o dispoziție tip grilă; ulterior, din
acest bloc sunt tăiate secțiuni, la microtom, montate pe lama de microscop
și analizate prin metodele standard de histologie (imunohistochimie, FISH
etc); un bloc poate fi tăiat în 100-500 secțiuni.

Cariotipare
 Cromozomi bandaţi GTG
 Detectează anomalii grosiere
 Analiza se realizează în microscopie optică
 Oferă imaginea întregului genom
 Rezoluţie 3-5 Mb

FISH

 Sonde fluorescente
 Specificitate de locus
 Detectează aberaţii de dimensiuni medii
 Analiza se realizează în microscopie fluorescentă
 Oferă imaginea unor loci specifici
 Rezoluţie 60-100 kb
 Cariotipare digitală sau virtuală
 Echivalent unui FISH de densitate foarte mare
 Analiza se realizează folosind un scaner cu laser
 Oferă imaginea întregului genom
 Rezoluţie 40-200 pb

Sisteme de marcare microarray:

 Radioizotopi
 Electrochimic
 Fluorocromi / detecție optică

Tipuri de microarray:
1. Număr de copii / SNP (aCGH-SNP)
 2. Metilare (CH3)

3. Factori de transcriptie (ChIP)

4. ARN-m (GX)

5. Izoforme ARN-m (EXON)

6. ARN de interferenta (miARN)

1. TEHNOLOGIA HIBRIDIZĂRII COMPARATIVE GENOMICE

BAZATE PE MICROARRAY (array-based comparative genomic
hybridization - aCGH)

Definiţie: metodă care foloseşte tehnologia microarray pentru a identifica, prin

compararea ADN de interes cu un ADN de referinţă, schimbările cantitative
(duplicaţii, deleţii etc) din genom şi locul specific în care acestea s-au produs.

≈ aCGH se bazează pe utilizarea unor sonde ADN pentru hibridizarea cărora

ADN de interes intră în competiţie cu ADN de referinţă.

Etape:

Etapele 1-2: ADN genomic de interes şi de referinţă sunt fragmentate şi marcate
fluorescent

Etapa 3: ADN genomic este amestecat, purificat din amestecul de marcare şi
pregătit pentru hibridizare

Etapa 4: ADN genomic de interes şi de referinţă sunt în competiţie pentru a
hibridiza cu sondele din grilă

Etapa 5: Semnalele fluorescente emise sunt măsurate de către un scaner

Etapa 6: În urma analizei computerizate este generat un profil

genomic/cromozomial
Aplicatii:

 Diagnostic preimplantaţional, prenatal

 Diagnostic în numeroase boli genetice: retard mental, cancer etc
 Stratificarea pacienților
 Monitorizarea tratamentului. In oncologie
 Predicția supraviețuirii
 Cuantificarea numărului de copii ADN (segmente).
 Identificarea disomiei uniparentale / pierderii de heterozigoție.
 Detecţia şi diagnoza (timpurie) a aberaţiilor genetice, inclusiv a celor de
tip microdeleţie/microamplificare.
 Cartografierea punctelor de rupere.
 Întelegerea mecanismelor patogenetice și de rezistență la medicamente.
 Identificarea de noi biomarkeri.

Avantaje:

 Rezoluția mare, permițând detectarea anomaliilor mici, discrete;

 Simplitatea relativă a tehnicii;
 ADN este o moleculă stabilă;
 Pot fi folosite si probe biologice împarafinate;
 Cantitate mare de date;
 Flexibilitate mare – grilele pot fi construite dupa designul utilizatorului.

Dezavantaje:

 Costul ridicat;
 Aparatul matematic implicat, complex;  Dificultățile de interpretare a
datelor.

2. ARRAY SPECIFIC PENTRU METILARE

Metilarea AND – principalul mecanism de reglare epigenetică.

Epigenetica – studiul modificărilor funcţiei sau expresiei genelor care au loc

prin alte mecanisme decât modificarea secvenţei acestora.
 3. ARRAY “ChIP-on-chip”– ARRAY PENTRU ANALIZA
FACTORILOR TRANSCRIPŢIONALI

 Identifică factorii transcripţionali legaţi la ADN folosind cromatina (ADN

complexat cu proteine) imunoprecipitată;
 Permite caracterizarea transcripţiei, replicării şi reparării ADN;
 Cartografiază nucleozomii;
 Cartografiază modificările histonelor.
 Cartografiază metilarea ADN prin identificarea proteinelor de metilare
legate la ADN.

4. ARRAY PENTRU EXPRESIA GENICA

Expresia genică = un proces cu specificitate mare pentru un set de condiţii date

(specie, tip tisular/celular, moment de dezvoltare ontogenetică, condiţii de
mediu etc);

≈ reprezentată de transcrierea informaţiei codificate în genă în ARNm, urmată

de translarea în proteină.

≈ Array-ul pentru analiza expresiei genice permite investigarea activităţii

întregului genom, astfel încât se poate stabili care gene sunt exprimate în
anumite condiţii experimentale, fiziologice sau patologice.

Aplicatii:

 Caracterizarea căilor de semnalizare, metabolice etc;

 Identificarea de markeri de diagnostic și prognostic;
 Clasificarea moleculară a subtipurilor patologice / stratificarea
pacienților;
 Identificarea de noi ținte terapeutice;
 Descoperirea de noi medicamente;
 Studii toxicologice etc.
 Analiza a cca. 12.600 de gene exprimate în eșsntioane de la 12 adulți cu
LAM.
 Modele de expresie genică asociate cu leucemii cu translocații
cromozomiale, respectiv cu leucemii cu cariotip normal;
 Subgrupe noi cu semnificație prognostică si terapeutică
5. ARRAY PENTRU ANALIZA EXONILOR

Investighează transcriptomul şi identifică fomele de splicing alternativ, implicit,

rolul lor în procese fiziologice normale şi patologice, răspunsul la medicamente
etc.

Aplicatii:

 Investigarea splicingului alternativ- specific de tesut; specific de stadiu de

dezvoltare; datorat modificărilor cu efect patologic;

 Descoperirea de noi transcripți;

 Detectarea translocațiilor și cartografierea punctelor de rupere;

 Studierea profilelor de expresie genică.

6. ARRAY PENTRU ANALIZA miARN

 molecule ARN monocatenare de 22 nucleotide;

 reglatori-cheie ai translaţiei şi ai dezvoltării celulare;

 1 miARN reglează mai multe ARNm;

 >1000 identificaţi la oameni, reglatori a >30% din genele umane;

 >5000 identificaţi la plante, animale şi virusuri;

 au modele de expresie specifice de ţesut și stadiu de dezvoltare

 reglatori ai proceselor patologice (ex.: cancer), unde au modele de

expresie distincte;

 cu potenţial de diagnostic şi prognostic;

 miARN17-92 sunt esențiali pentru dezvoltarea plamânului, inimii și a

celulelor B.

Alte functii:

 miR-17-92 stimulează proliferarea;

 miR-17-92 inhibă apoptoza;
 miR-17-92 stimulează angiogeneza;
 miR-17-92 stimulează supraviețuirea.

miARN in terapia cancerului:

 miARN sunt preturbate în cancer;

 Fenotipul tumoral poate fi modificat prin alterarea expresiei miARN;
 miARN controlează rețele și gene multiple, vulnerabile în oncogeneză
(oncogene, supresori tumorali).