Secventierea

ADN- ului
Balan Diana Madalina
Genetica Moleculara, Anul I
 Secventierea AND-ului reprezinta identificarea tipului, felului si succesiunea nucleotidelor dintru-un fragment de AND analizat

 Este procesul de determinare a secvenței de acid nucleic - ordinea nucleotidelor din ADN . Acesta include orice metodă sau
tehnologie care este utilizată pentru a determina ordinea celor patru baze: adenină , guanină , citozină și timină.
 Primele secvențe de ADN au fost obținute la începutul anilor 1970 de către cercetătorii universitari, folosind metode
laborioase bazate pe cromatografie bidimensională . În urma dezvoltării metodelor de secvențiere bazate pe fluorescență cu
un secvențiator ADN, secvențierea a devenit mai ușoară și ordinele de mărime mai rapide.
 Cunoașterea secvențelor ADN a devenit indispensabilă pentru cercetarea biologică de bază și în numeroase domenii aplicate,
cum ar fi diagnosticul medical , biotehnologia , biologia criminalistică , virologia și sistematica biologică . Compararea
secvențelor de ADN sănătos și mutant poate diagnostica diferite boli, inclusiv diferite tipuri de cancer, poate caracteriza
repertoriul de anticorpi și poate fi utilizat pentru a ghida tratamentul pacientului. Având o modalitate rapidă de secvențiere a
ADN-ului permite administrarea mai rapidă și mai individualizată a asistenței medicale, precum și identificarea și catalogarea
mai multor organisme.
 TIPURI DE SECVENTIERE
METODA AVANTAJE DEZAVANTAJE

Secventierea in timp real al unei - Citiri lungi - Numar de citiri mici

singure molecule - Rapid - Echipament scump

Ion semiconductor - Echipament ieftin - Erori  

- Rapid

 Pirosecventierea  - Citiri lungi  - Scump

- Rapid - Erori

 Secventierea prin sinteza  - Secvente multe  - Scump

- Necesita mari cantitati de ADN

 Secventierea prin ligatie  - Ieftin  - Dureaza mai mult timp

- Probleme cu secventele
 In momentul de fata s-au dezvoltat tehnici de secventiere
automate: fie chimic prin metoda Maxam Gilbert, fie enzimatic
prin metoda Sanger.

METODA SANGER
Metoda enzimatica Sanger consta in replicarea AND-ului monocatenar incepand de la un punct precis de initiere,
replicarea fiind apoi intrerupta in functie de baza existenta in secventa de analizat de catre dideoxinucleotide.
 Secvențierea Sanger este o metodă de secvențiere a AND-ului bazată pe incorporarea selectivă a di-deoxinucleotidelor de către enzima ADN polimerază în timpul replicării ADN in vitro. Metoda a fost dezvoltată de către
Frederick Sanger și colegii săi în 1977 și a fost una dintre cele mai folosite metode de secvențiere a AND-ului mai bine de 25 de ani. Mai nou, secvențierea Sanger a fost parțial înlocuită de secvențierea de nouă generație. Cu
toate acestea, este încă folosită, în contextul proiectelor mai mici, pentru validarea rezultatelor secvețierii de nouă generație, sau pentru citirea fragmentelor lungi și continue de ADN (mai mari de 500 de nucleotide).

Metoda clasică de secvențiere Sanger ia un șablon simplu de ADN, un primer ADN, enzima ADN polimerază,
deoxinucleozidetrifosfate normale (dNTP) și di-deoxinucleozidetrifosfate modificate (ddNTP), cele din urmă terminând prematur
elongarea șirului ADN. ddNTP-urilor le lipsesc grupul hidroxil (OH) de la capătul 3', deci nu pot forma legătura necesară dintre două
nucleotide, ceea ce împiedică polimeraza ADN să extindă ADN-ul. ddNTP-urile sunt marcate radioactiv sau fluorescent pentru a putea fi
detectate automat de către mașinile de secvențiere.
 Mostra ADN este împărțită în patru reacții separate, conținând fiecare toate cele patru deoxinucleotide (dATP, dGTP, dCTP și
dTTP) și enzima ADN polimerază. În fiecare dintre reacții este adăugată doar una dintre cele patru di-deoxinucleotide (ddATP,
ddGTP, ddCTP, sau ddTTP), în timp ce celelalte nucleotide sunt nemodificate. Di-deoxinucleotidele modificate sunt adăugate în
exces, în cantități de aproximativ 100 de ori mai mari decât deoxinucleotidele normale. Pe scurt, este nevoie de patru reacții
separate pentru a testa cele patru ddNTP. După mai multe runde de extensie a șablonului ADN, fragmentele rezultate sunt
denaturate prin expunere la căldură și sunt separate conform mărimii prin procedura de electroforeză pe gel.

O PARTE DIN GELUL DE SECVENTIERE MARCAT RADIOACTIV

În imaginea din stanga un film X a fost expus gelului, iar benzile închise la culoare corespund
fragmentelor ADN de diferite mărimi. O bandă de culoare închisă semnifică un fragment ADN scurtat
la incorporarea unei di-deoxinucleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP sau ddTTP). Pozițiile relative de pe cele
patru benzi, de sus în jos, sunt folosite la citirea secvețelor ADN
 Metoda Sanger pentru secvențierea ADN

In imaginea din stanga sunt benzile secvențierii prin

metoda marcării radiactive vizualizate în paralele cu
picurile fluorescente.
METODA SANGER
 METODA MAXIM & GILBERT

Metoda chimica presupune marcarea AND-ului supus secventierii la unul din capetele sale, denaturarea , urmata de separarea prin electroforeza in gel a celor 2 catene.
Are loc ulterior taierea AND-ului monocatenar cu obtinerea unor fragmente de AND cu lungime variabila ce pot fi separate electroforetic pe geluri poliacrilamida.
Secvențierea Maxam-Gilbert necesită marcarea radioactivă la un capăt de 5′ al fragmentului de ADN pentru a fi secvențiat (de obicei printr-o reacție kinazică utilizând ATP gamma- 32 P) și purificarea ADN-ului. Tratamentul chimic generează pauze la o proporție mică de una sau două dintre cele
patru baze nucleotidice în fiecare dintre cele patru reacții (G, A + G, C, C + T). De exemplu, purinele (A + G) sunt depurinate folosind acid formic , guaninele (și într-o oarecare măsură adeninele ) sunt metilate cu sulfat de dimetil , iar pirimidinele (C + T) sunt hidrolizate folosind
hidrazină . Adăugarea de sare ( clorură de sodiu ) la reacția hidrazină inhibă reacția timinei pentru reacția numai C. ADN-urile modificate pot fi apoi scindate de piperidină fierbinte ; (CH 2 ) 5 NH în poziția bazei modificate. 
 Concentrația substanțelor chimice modificatoare este controlată pentru a introduce în medie o modificare pe
moleculă de ADN. Astfel, se generează o serie de fragmente marcate, de la capătul radiomarcat până la primul loc
"tăiat" din fiecare moleculă.
Fragmentele din cele patru reacții sunt electroforizate unul lângă altul în geluri de acrilamidă denaturante pentru
separarea dimensiunilor. Pentru a vizualiza fragmentele, gelul este expus la film cu raze X pentru autoradiografie ,
rezultând o serie de benzi întunecate care arată fiecare locația moleculelor de ADN identice radiomarcate. Din
prezența și absența anumitor fragmente, secvența poate fi dedusă.
Un exemplu de reacție de secvențiere Maxam-Gilbert. Scindarea
aceluiași segment marcat de ADN în diferite puncte produce
fragmente marcate de diferite dimensiuni. Fragmentele pot fi apoi
separate prin electroforeză pe gel.
MAXAM & GILBERT
BIBLIOGRAFIE

1. G. M. Church and W. Gilbert, “Genomic sequencing,” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
vol. 81, no. 7, pp. 1991–1995, 1984.
2. https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing
3. https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0022283675902132?via%3Dihub
4. https://ro.qaz.wiki/wiki/Sanger_sequencing
5. Maxam–Gilbert DNA Sequencing Method Animation - Bing video
6. https://ro.qaz.wiki/wiki/Sanger_sequencing