Biotehnologia preparatelor enzimatice, Masterat anul II SIA

Metode de dozare a proteinelor enzimatice

din extractele biologice
Metoda Lowry

In prezent pentru determinarea cantitativa a proteinelor sunt cunoscute si

utilizate mai multe metode colorimetrice: metoda biuretului, Lowry, Bradford. Acestea
permit determinarea relativ simpla, rapida si sensibila a proteinelor.
In alegerea metodei de analiza cele mai adecvate pentru proteinele studiate,
trebuie sa se tina cont de principiul metodei si de eventualele interferente ce ar putea
avea loc intre reactivii utilizati si substantele insotitoare ale proteinei. Acestea sunt tot
mai frecvente la determinarea cantitativa a proteinelor din materialele biologice.
Metoda Lowry este sensibila, dar permite detectarea aminoacizilor aromatici
din structura proteinelor, astfel incat pot sa apara erori in exprimarea rezultatelor, daca
proteina standard (utilizata drept etalon) are compozitia diferita de cea a proteinelor
analizate. Si prin aplicarea acestei metode apar interferente intre reactivii analizei si o
gama larga de compusi prezenti in probele de analizat (ioni de potasiu si magneziu,
reactivi tiol si glucide).

Principiul metodei
Proteinele formeaza combinatii complexe colorate in albastru violet, cu ionul
Cu2+ in mediul alcalin (reactia biuretului). Complexul proteina- Cu2+ reduce
fosfomolibdatii si fosfowolframatii din reactivul Folin-Ciocalteu. La procesul de
reducere mai contribuie si resturile de tirozina si triptofan prezente in proteine.
Concentratia proteinelor din proba se determina fotocolorimetric.

Reactivi
- reactiv alcalin de cupru format din doua solutii:
A – solutie Na2CO3 10 % in solutie de hidroxid de sodiu 0,5 N
B – solutie CuSO4 . 5 H2O 0,5% in solutie de citrat de sodiu 1%. Inainte de
intrebuintare se amesteca 10 parti solutie A cu 1 parte solutie B (reactiv de lucru –
preparat proaspat).
- reactiv Folin-Ciocalteu. Intr-un balon cu fund rotund si gat rodat avand
capacitatea de 1,5-2 l, se introduc in ordine stricta 100 g wolframat de sodiu
(Na2WO4 . 2H2O), 25 g molibdat de sodiu (Na2MoO4 . 2H2O) si 700 ml apa
distilata, agitand incet pana la dizolvarea completa. Se adauga 50 ml acid
ortofosforic 85% (d=1,75) si 100 ml acid clorhidric concentrat, se ataseaza un
refrigerent ascendent si se refluxeaza pe sita 10 ore. Dupa scurgerea perioadei
de reflex se adauga 150 g sulfat de litiu dizolvat partial in 50 ml apa distilata si
cateva picaturi de brom, apoi se fierbe 15 minute fara refrigerent, timp in care
amestecul de reactie devine galben. Continutul balonului se raceste, se
dilueaza cu apa distilata pana la un volum total de 1 l si se filtreaza. Pentru
conservare reactivul de culoare galbena, trebuie introdus in sticle brune,
curate, inchise etans si tinut la frigider, 4ºC. Inainte de folosirea reactivului se
amesteca cu apa distilata in raport de 1:10 (reactiv de lucru).
- Solutie standard de albumina serica de bovina 10 mg%, preparat in apa
distilata(corespunde la 100 µg/ml sau 0,1 mg/ml)
- Extract proteic (sau solutie de proteina)

- Modul de lucru
Intr-o eprubeta se introduce 1 ml solutie de proba (extract proteic), 1 ml
reactiv alcalin de cupru, se agita bine si se lasa la temperatura camerei. Dupa 10
minute se adauga 3 ml reactiv Folin-Ciocalteu (reactiv de lucru) se agita si se lasa la
temperatura camerei 45 de minute (sau 10 minute intr-o baie termostatata la 50ºC).
In continuare, eprubeta se raceste, dupa care continutul ei se fotocolorimetreaza la
660 nm fata de apa distilata.
Biotehnologia preparatelor enzimatice, Masterat anul II SIA

Construirea curbei etalon

In 11 eprubete numerotate aranjate in ordine crescatoare, intr-un stativ, se adauga
solutia standard de albumina serica de bovina in apa distilata, corespunzand
concentratiilor din tabelul 1.

Tabelul 1
Numarul eprubetelor 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Solutie 100 µl albumina/ml 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
(ml)
Apa distilata (ml) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Concentratia de albumina 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
eprubete (µg/ml)

Se mai adauga in fiecare eprubeta cate 1 ml reactiv alcalin de cupru si dupa

agitare se lasa in repaus 10 minute la temperatura camerei. Se introduc cate 3 ml
reactiv Folin-Ciocalteu (reactiv de lucru) si dupa o buna agitare se lasa la temperatura
camerei 45 de minute (sau 10 minute intr-o baie termostatata la 50ºC). Eprubetele se
racesc dupa care continutul lor se fotocolorimetreaza la 660 nm fata de apa distilata.
Cu datele obtinute se traseaza curba etalon luand pe abscisa concentratia de
albumina din fiecare eprubeta (in µg/ml) iar pe ordonata densitatea optica
corespunzatoare (DO 660 nm).

Calculul rezulatelor
Densitatea optica obtinuta pentru proba de analizat se interpoleaza pe curba
etalon, determinandu-se concetratia µg/ml. In cazul cand densitatea optica a probei
este mai mare decat densitatile optice de pa curba etalon, proba se dilueaza cu apa
distilata pentru a fi adusa in limitele concentratiilor necesare, insa la calcule se tine
seama de factorul de dilutie. Astfel, se determina densitatea optica pentru solutia
diluata, se interpoleaza pe curba etalon determinandu-i concentratia in µg/ml.
Valoarea gasita se va amplifica cu numarul care arata de cate ori a fost diluata solutia
probei si se transforma in mg/ml. Cu ajutorul ei se poate determina concentinul
procentual al proteinelor in proba de analizat.

Observatii
- pH-ul reactiei trebuie sa fie in jur de 10. Avand in vedere ca reactivul Folin-
Ciocalteu se distruge in mediul alcalin, adaugarea lui trebuie facuta repede.
- O serie se substante cum sunt glicina, hidrazina, sarurile de potasiu, sulfatul
de amoniu si acidul sulfosalicilic influenteaza negativ determinarile prin
aceasta metoda.