Calu Maria Lorena

MG II, grupa 2

Reacția de polimerizare în lanț

1. Generalitati

Reacția de polimerizare în lanț ( PCR = Polymerase Chain Reaction ) este o metodă de

amplificare enzimatică in vitro a unei anumite secvențe de ADN. Această tehnică a fost
descoperită în anul 1983 de către Kary Mullis care a și primit în anul 1994 premiul Nobel
pentru această descoperire. Reacția PCR se bazează pe selectarea unui fragment de ADN –
prin intermediul a două secvențe denumite primeri, și amplificarea acestui fragment prin
cicluri repetate de sinteză de ADN.

Principalele componente ale reacției sunt: ADN matriță, o ADN polimerază

termostabilă, primeri oligonucleotidici, deoxinucleotidtrifosfați (dNTP), tamponul de reacție
și ioni de Mg2+ .

O reacție PCR este formată din n cicluri( între 25 și 40), în fiecare ciclu fiind parcurse
3 etape principale: denaturarea termică a matriței (desfacerea dublului helix ADN), atașarea
primerilor și polimerizarea propriu-zisă. La terminarea unui ciclu de replicare in vitro (de
amplificare), cantitatea de ADN rezultată este dublă față de matriță.

2. Principiul reactiei:

Reacția PCR se bazează pe selectarea unui fragment de acid nucleic, cu ajutorul

primerilor concepuți astfel încât secvența lor, să fie complementară cu fiecare capăt al
secvenței și amplificarea acestui fragment prin cicluri repetate de sinteza de DNA. Primerii,
dNTP-urile și celelalte componente ale recției, inclusiv matrița DNA, sunt amestecate și
tuburile de reacție sunt plasate întrun thermal cycler, care trece reacția printr-o succesiune de
etape ce se desfasoară la temperaturi diferite și perioade de timp diferite. Fiecare ciclu de
reacție cuprinde trei pasi: topirea, la 950C, hibridizarea, la o temperatură variabilă funcție de
primer și sinteza noii catene ADN, la 720C. Fiecare ciclu PCR dublează teoretic cantitatea de
secvențe ale matriței în reacție

Numărul final de copii ADN este 2nxy, unde y = numărul inițial de copii, iar n=
numărul de cicluri de replicare. În concluzie, reacția PCR este o metodă prin care se obțin
cantități mari dintr-o anumită secvență ADN, molecule care pot fi ulterior manipulate sau
analizate fără a fi necesară o prealabilă clonare moleculară a acestora.

3. Primerii

 dimensiunea primerilor să fie cuprinsă între 10-30 bp ;

 primerii să aibe un procent molar de guanină + citozină cuprins intre 40-60% ;
 primerii să nu fie complementari între ei la capatul 3’ astfel încât să nu formeze dimeri
 valoarea Tm a primerilor să permită atașarea la temperatura de 50˚-60˚C
 să existe o distribuție echilibrată a domeniilor bogate în A/T și G/C
 primerii să nu prezinte structuri secundare interne Enzimele
 Calu Maria Lorena
MG II, grupa 2

 Kary Mullis a folosit în primele sale reacții PCR fragmentul Klenow al ADN-
polimerazei I de la Escherichia coli pentru a cataliza extensia primerilor. Această
enzimă este inactivată termic în timpul etapei de denaturare din ciclul PCR și de aceea
trebuie adaugată enzimă proaspata în fiecare ciclu al procesului.
 Ulterior au fost introduse enzime termostabile care catalizează sinteza unor lanțuri
polinucleotidice lungi formate din deoxinucleotide trifosfat.
 Sinteza ADN-ului începe întotdeauna de la capatul 5’ și se desfasoară în directia 3’,
nucleotidele atașându-se la gruparea libera 3’ –hidroxil a primerului și formează o
catenă complementară cu matrita. Componenetele reactiei PCR MgCl2
 Ionii Mg2+ formează complexe solubile cu deoxinucleotidtrifosfații, formând astfel
substratul recunoscut de ADN polimerază .
 Concentrația optimă de MgCl2 variază între 1mM -5mM. Excesul ionilor de Mg2+ în
reacția PCR poate determina atașări nespecifice ale primerilor.
Deoxinucleotidtrifosfați (dNTP)- dCTP, dGTP, dATP, dTTP
 În reacție trebuiesc introduse cantități echimolare din toate cele patru tipuri de
molecule pentru a micșora riscul unei polimerizari eronate.
 Concentrația finală recomandată este de 50-500mM pentru fiecare dNTP. Concentrația
dNTP trebuie corelată cu concentrația ionilor Mg2+.

4. Indicatii:

 Diagnosticul infecțiilor virale și bacteriene

 Boli genetice
 Neoplasme
 Evaluarea prognosticului recurenței anumitor afecțiuni, în special maligne.

5. Interpretari:

 Tehnica este utilizata pentru detectia patogenilor bacterieni si virali  (ex: HIV-1,
Cytomegalovirus, Virusuri enterice, Chlamydia trachomatis, Neisseria
gonorrhoeae,  Mycobacterium tuberculosis, etc)
 Un rezultat negativ înseamnă că agentul infecțios nu este detectat
 Un rezultat pozitiv indică prezența ADN sau ARN patogen

6. Bibliografie

1. https://www.reginamaria.ro/utile/dictionar-de-analize/reactia-de-polimerizare-lant
2. http://doccdn.simplesite.com/d/ee/48/281756458863184110/cb9c9e5f-4498-43f7-984b-
b165b8835c97/GBP_LP5%2BReactie%2BPCR.pdf