Secventierea AND-ului

Secvențierea ADN este procesul de determinare a secvenței de acid nucleic - ordinea

nucleotidelor din ADN . Acesta include orice metodă sau tehnologie care este utilizată pentru a
determina ordinea celor patru baze: adenină , guanină , citozină și timină.

Primele secvențe de ADN au fost obținute la începutul anilor 1970 de către cercetătorii
universitari, folosind metode laborioase bazate pe cromatografie bidimensională . În urma
dezvoltării metodelor de secvențiere bazate pe fluorescență cu un secvențiator ADN, secvențierea a
devenit mai ușoară și ordinele de mărime mai rapide.

Viteza rapidă de secvențiere a AND-ului atinsă cu tehnologia modernă a fost esențială în

secvențierea secvențelor ADN complete, sau genomurilor , a numeroase tipuri și specii de viață,
inclusiv genomul uman.

Cunoașterea secvențelor ADN a devenit indispensabilă pentru cercetarea biologică de bază

și în numeroase domenii aplicate, cum ar fi diagnosticul medical , biotehnologia , biologia
criminalistică , virologia și sistematica biologică . Compararea secvențelor de ADN sănătos și mutant
poate diagnostica diferite boli, inclusiv diferite tipuri de cancer, poate caracteriza repertoriul de
anticorpi și poate fi utilizat pentru a ghida tratamentul pacientului. Având o modalitate rapidă de
secvențiere a ADN-ului permite administrarea mai rapidă și mai individualizată a asistenței medicale,
precum și identificarea și catalogarea mai multor organisme.

https://ro.qaz.wiki/wiki/Sanger_sequencing

METODA SANGER SAU DIDEOXY

Secvențierea Sanger este o metodă de secvențiere a AND-ului bazată pe incorporarea

selectivă a di-deoxinucleotidelor de către enzima ADN polimerază în timpul replicării ADN in vitro.
Metoda a fost dezvoltată de către Frederick Sanger și colegii săi în 1977 și a fost una dintre cele mai
folosite metode de secvențiere a AND-ului mai bine de 25 de ani. Mai nou, secvențierea Sanger a
fost parțial înlocuită de secvențierea de nouă generație. Cu toate acestea, este încă folosită, în
contextul proiectelor mai mici, pentru validarea rezultatelor secvețierii de nouă generație, sau
pentru citirea fragmentelor lungi și continue de ADN (mai mari de 500 de nucleotide).

Metoda clasică de secvențiere Sanger ia un șablon simplu de ADN, un primer ADN, enzima
ADN polimerază, deoxinucleozidetrifosfate normale (dNTP) și di-deoxinucleozidetrifosfate
modificate (ddNTP), cele din urmă terminând prematur elongarea șirului ADN. ddNTP-urilor le
lipsesc grupul hidroxil (OH) de la capătul 3', deci nu pot forma legătura necesară dintre două
nucleotide, ceea ce împiedică polimeraza ADN să extindă ADN-ul. ddNTP-urile sunt marcate
radioactiv sau fluorescent pentru a putea fi detectate automat de către mașinile de secvențiere.

Mostra ADN este împărțită în patru reacții separate, conținând fiecare toate cele patru
deoxinucleotide (dATP, dGTP, dCTP și dTTP) și enzima ADN polimerază. În fiecare dintre reacții este
adăugată doar una dintre cele patru di-deoxinucleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP, sau ddTTP), în timp
ce celelalte nucleotide sunt nemodificate. Di-deoxinucleotidele modificate sunt adăugate în exces, în
cantități de aproximativ 100 de ori mai mari decât deoxinucleotidele normale. Pe scurt, este nevoie
de patru reacții separate pentru a testa cele patru ddNTP. După mai multe runde de extensie a
șablonului ADN, fragmentele rezultate sunt denaturate prin expunere la căldură și sunt separate
conform mărimii prin procedura de electroforeză pe gel.

O PARTE DIN GELUL DE SECVENTIERE MARCAT RADIOACTIV

În imaginea din dreapta un film X a fost expus gelului, iar benzile închise la culoare
corespund fragmentelor ADN de diferite mărimi. O bandă de culoare închisă semnifică un fragment
ADN scurtat la incorporarea unei di-deoxinucleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP sau ddTTP). Pozițiile
relative de pe cele patru benzi, de sus în jos, sunt folosite la citirea secvețelor ADN.
 Benzile secvențierii prin metoda marcării radiactive
vizualizare în paralele cu picurile fluorescente

https://ro.wikipedia.org/wiki/Secven%C8%9Bierea_Sanger

Numărul de nucleotide care poate fi determinat dintr-o singură reacție de secvențiere este
limitat. Au fost descrise mai multe strategii pentru secvențierea fragmentelor lungi de ADN (Tabel).
Alegerea metodei (metodelor) va depinde în mare măsură și de câtă secvență trebuie făcută și de
resursele disponibile.

https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing

bibliografie

G. M. Church and W. Gilbert, “Genomic sequencing,” Proceedings of the National Academy

of Sciences of the United States of America, vol. 81, no. 7, pp. 1991–1995, 1984.

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0022283675902132?via%3Dihub

https://ro.qaz.wiki/wiki/Sanger_sequencing

METODA AVANTAJE DEZAVANTAJE

Secventierea in timp real al - Citiri lungi - Numar de citiri mici
unei singure molecule - Rapid - Echipament scump
Ion semiconductor - Echipament ieftin -
- Rapid

Maxam–Gilbert DNA Sequencing Method Animation - Bing video