METODE DE DIAGNOSTIC

MOLECULAR
=studiul bazelor moleculare ale procesului de replicare,
transcriere și translație a materialului genetic.

ADN

ARN

Proteine
• Transcripția = primul pas în expresia genică.
ADN Transcripție ARN
Revers transcripție

• Transcripția este procesul de creare a unei copii de ARN echivalentă a unei

secvențe de ADN.
• In timpul transcrierii, o secvență de ADN este citită de ARN polimeraza, care
produce o, catenă complementară de ARN.
• Translația = primul pas în biosinteza proteinelor.
 Tehnici de biologie moleculară
▪ Izolarea ADN sau ARN
• Verificarea purității și determinarea cantității de ADN sau ARN
• Reacția de polimerizare în lanț (Polymerase chain reaction - PCR)
• Electroforeza în gel de agaroză
• Secvențierea
• Clonarea moleculară și Expresia genelor

• Tehnici bazate pe hibridizarea acizilor nucleici:

• Northern Blot
• Southern Blot
• FISH
• PCR
• Microarray
EXTRACȚIA MATERIALULUI GENETIC
• izolarea ADN-ului/ARN-ului este o procedură folosită în vederea
obţinerii materialului genetic al diverselor tipuri de organisme, în
scopul utilizării acestuia în analizele moleculare ulterioare.
• orice protocol de extracţie a ADN-ului/ARN-ului genomic are 4 etape
principale:
1. liza celulară, pentru ca moleculele de acizi nucleici să fie expuse
tratamentelor ulterioare.
2. îndepărtarea membranelor lipidice folosind detergenţi.
3. îndepărtarea proteinelor cu ajutorul anumitor enzime numite proteaze (ex:
proteinaza K).
4. precipitarea acizilor nucleici folosind alcooli (etanol, izopropanol etc.)
EXTRACȚIA MATERIALULUI GENETIC
Metoda coloanelor cu membrană de siliciu
Tehnica cu particule magnetice
 Determinarea spectrofotometrică a purităţii şi
concentraţiei acizilor nucleici izolați
• Inainte de a folosi ADN-ul extras şi purificat, în diverse
manipulări moleculare, este necesar să se verifice puritatea şi
integritatea lui.
• Verificarea purităţii ADN-ului se realizează de regulă
spectrofotometric, ţinând cont de următoarele considerente:
➢ moleculele ADN (atât formele dublu-, cât şi cele moncatenare)
prezintă absorbanţa maximă la lungimi de undă ce variază între 257 şi
260 nm;
➢absorbanţa maximă pentru proteinele rămase eventual în extract este
la λ=280 nm ;
➢unele polizaharide absorb radiaţiile luminoase cu λ = 230 nm;
➢absorbanţa la 220 nm este dată de oligonucleotide ce reprezintă de
obicei molecule de ADN fragmentat în mod artificial în timpul
tehnicilor de extracţie şi purificare.
 Determinarea spectrofotometrică a purităţii şi
concentraţiei acizilor nucleici izolați
• In funcţie de valorile A260şi A280 se
poate stabili gradul de contaminare
proteică, astfel :
➢ raportul A260 / A280 optim este de 1.8-
2.0
➢dacă acest raport este mai mic de 1.7,
atunci contaminarea proteică a extractului
ADN este semnificativă
➢gradul de contaminare cu ARN a
extractului este indicat de valori mai mari
de 2.0 ale raportului A260 / A280
Determinarea spectrofotometrică a purităţii şi
concentraţiei acizilor nucleici izolați
• Având în vedere faptul că în marea majoritate a cazurilor valoarea
concentraţiei ADN-ului este importantă pentru manipulările
ulterioare ale acestuia, este absolut necesar ca înainte de
determinarea concentraţiei să se estimeze gradul de puritate al
extractului, şi respectiv, determinarea exactă a A260 .
Exemple de determinarea a purității
ADN-ului genomic si modificări ale
raportului A260 / A280 prin
adăugarea de proteine:

A) 0 μg/mL SFB
B) 250 μg/mL SFB
C) 500 μg/mL SFB
D) 1000 μg/mL SFB
SFB = ser fetal bovin
 Sondele de acizi nucleici

• Asocierea spontană a ADN-ului pe baza de

complementaritate reprezintă baza pentru tehnicile
folosite în detectarea și caracterizarea genelor.
• Sondele (primerii) sunt utilizate pentru a identifica
gene individuale sau secvențe de ADN.
• Sonda de acid nucleic reprezintă un segment scurt de
ADN sau ARN de secvență cunoscută utilizată pentru a
identifica prezența unei singure catene complementare
de ADN în proba de cercetat.
 Sondele de acizi nucleici
• Legarea între cele două secvențe (sonda și proba de cercetat) este
cunoscută sub numele de hibridare.
• Cele două secvențe trebuie să împărtășească cel puțin 16-20 baze
consecutive de complementaritate perfectă pentru a forma hibrid
stabil.
• Sondele pot fi marcate: radioizotop, fluorocrom, enzimă sau substrat
chemiluminescent.
• Hibridarea poate avea loc în mediu suport solid sau lichid.
Animația video este disponibilă la :
https://www.youtube.com/watch?v=9ibpveRD6pM
 FISH
(Fluorescent In-Situ Hibridization)
• este o tehnică ce poate localiza
secvențe de acid nucleic în
materialul celular.
• Metoda folosește sonde
fluorescente care se leagă numai la
acele părți ale catenei față de care
prezință un grad ridicat de
complementaritate.
• Microscopul cu fluorescență este
folosit pentru a afla localizarea
sondei fluorescente.
Animația video este disponibilă la :
https://www.youtube.com/watch?v=BKuHt3lBvTg
 EXEMPLU

Aplicații ale metodei în

diagnosticul de laborator
 Microarrays (tehnica cipurilor ADN)
• Un cip ADN (ADN microarray) este un biosenzor care
analizează informații de segmente genomice provenite
de la bacterii, virusuri, paraziți, fungi.
• Aceasta se bazează pe principiul complemetarității
cele patru baze azotate: A (adenina), T (timină), G
(guanina) și C (citozina) în care A este pereche cu T și
G este pereche cu C prin legături de hidrogen.
• O secvență de ADN cunoscută (sonda de ADN) este
plasată în plăci de sticlă cu microspoturi (cu diametrul
de câțiva microni în diametru, aranjate în mai multe
rânduri).
• Segmentele de gene sunt extrase din materiale
patologice diferite (de ex sânge, țesuturi), apoi
amplificate și depuse în cipuri de ADN.
 EXEMPLU

Aplicații ale metodei în diagnosticul de laborator

Principiu test: Rapid, cu rezultate precise ce evidențiază

care alergeni la care este sensibil un animal.

Proba patologică: Indiferent de talia animalului de

companie și de vârstă, este nevoie de doar 1-2 ml de sânge
integral (sau mai mult de 0,2 ml de ser / plasma) pentru
testare.
Animația video este disponibilă la :
https://www.youtube.com/watch?v=Pz_yucMksTc
Animația video este disponibilă la:
https://www.youtube.com/watch?v=mYWVi7B-13c
 PCR (Polymerase chain reaction)
• Reacţia PCR (Polymerase Chain Reaction =
Reacţie de Polimerizare în Lanţ) este o metodă
de amplificare enzimatică in vitro a unei anumite
secvenţe de ADN.
• În prezent a fost dezvoltată o adevarată
tehnologie PCR care este folosită într-o varietate
foarte mare de domenii: biologie moleculară,
ştiinţele mediului, criminalistică, ştiinţe
medicale, biotehnologie, microbiologie,
industria alimentară, epidemiologie etc.
PCR (Polymerase chain reaction)
• Din punct de vedere chimic, reacţia PCR este constituită din cicluri
succesive de replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri
oligonucleotidici ce hibridizează cu cele 2 catene ale secvenţei
originale (folosită ca matriţă în replicare).
• Diferenţa esenţială între o asemenea reacţie de replicare şi un proces
de replicare ADN in vivo, îl reprezintă faptul că în reacţia PCR etapa de
desfacere a dublului helix matriţă şi, respectiv, cea de ataşare a
primerilor, nu sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea unor trepte
de temperatură, iar singura enzimă folosită în reacţie este o ADN
polimerază ADN-dependentă (cu funcţie de replicază).
ETAPELE REACȚIEI PCR

Principalele etape ale unei reacţii

PCR pot fi sintetizate astfel:

ADN d.c. matriţă

↓
ADN m.c.
↓
ataşarea primerilor
↓
polimerizare
ADN polimerază ADN dependentă
termostabilă
↓
2 molecule ADN d.c. identice cu
molecula matriţă
ETAPELE REACȚIEI PCR
• Principalele componente ale reacţiei sunt:
➢ ADN matriţă,
➢ o ADN polimerază termostabilă,
➢ primeri oligonucleotidici,
➢ deoxinucleotidtrifosfati (dNTP),
➢ tamponul de reacţie,
➢ ioni de Mg++.
• O reacţie PCR este formată din n cicluri (între 25 şi 40), în fiecare ciclu fiind parcurse 3 etape
principale:
❖ denaturarea termică a matriţei (deci, desfacerea dublului helix ADN),
❖ ataşarea primerilor
❖ polimerizarea propriu-zisă.
• La terminarea unui ciclu de replicare in vitro (de amplificare), cantitatea de ADN rezultată este
dublă faţă de matriţă. Mai mult, produsele rezultate într-un ciclu sunt folosite ca matriţă în ciclul
urmator, astfel încât numărul final de copii ADN este de 2nx y, unde y = numărul iniţial de copii,
iar n = numărul de cicluri de replicare. Este de subliniat faptul că moleculele acumulate
exponenţial reprezintă copii ale matriţei care la capete au încorporaţi primerii.
• In concluzie, reacţia PCR este o metodă prin care se obţin cantităţi
mari dintr-o anumităsecvenţă ADN. Aceste molecule pot fi ulterior
manipulate/analizate fără a fi necesară o prealabila clonare
moleculară a acestora.
• Reacția PCR are mai multe variante dintre care se pot enumera:
• Revers-transcription PCR (RT-PCR) pentru amplificarea ARN
• PCR în timp real (qPCR) care permit măsurarea cantitativă a moleculelor de
ADN sau ARN.
• Multiplex PCR-ul permite amplificarea mai multor segmente de ADN într-un
singur experiment PCR.
Principiul tehnicii
PCR clasic
Principiul tehnicii real
time PCR cu sonde
TaqMan
Animația video este disponibilă la:
https://www.youtube.com/watch?v=QVeVIM1yRMU
metoda PCR (tehnică calitativă)
 EXEMPLE

Aplicații ale metodei în

diagnosticul de laborator
Metoda real-time PCR (metodă cantitativă)
Platou

Fază lineară
Semnal fluorescent

Fază exponențială

Valoare prag

Referință

Număr cicluri de amplificare

 TaqMan RT-PCR
pentru detecție Enterovirus

LCR
Urină
Ser
Martor pozitiv

Număr cicluri de amplificare

 EXEMPLU

Aplicații ale metodei în diagnosticul de laborator

Aplicații ale tehnologiei PCR
• Marele avantaj al tehnicilor PCR îl reprezintă faptul că permite obţinerea
unei cantităţi mari dintr-o anumită secvenţă ADN
• Pe de altă parte, tehnologia PCR a revoluţionat şi implicarea geneticii
moleculare în domenii în care se apelează la cantităţi foarte mici de
ADN.
• Asemenea situaţii se întâlnesc în :
➢diagnosticul unor boli monogenice, precum şi detectarea de noi tipuri de mutaţii
în gene importante în anumite boli;
➢diagnosticul unor infecţii: permite detectarea particulelor infecţioase bacteriene
şi virale chiar aflate într-o proporţie mică, chiar pentru specii ce se cultivă dificil
in vitro, chiar pentru patogeni cu variabilitate antigenică mare, şi chiar pentru
patogeni ce au perioadă mare de latenţă; astfel, pot fi identificaţi indivizii pozitivi
înainte de seroconversie;
Aplicații ale tehnologiei PCR
• studii privind mecanismele genetice ce acompaniază procesele
maligne (detectarea secvenţei şi ţesutului în care se exprimă anumite
oncogene în diverse procese maligne);
• studii de taxonomie, sistematică şi filogenie moleculară: obţinerea
rapidă a unei cantităţi mari din secvenţe ADN cu valoare
taxonomicăşi/sau filogenetică;
• biologia populaţiilor, inclusiv la organisme mici: tehnologia PCR
permite secvenţierea rapidă a unor molecule de ADN de la foarte
mulţi indivizi.
Aplicații ale tehnologiei PCR
• studii de antropologie: tehnica PCR permite în prezent recuperarea şi
analiza unor secvenţe ADN din fosile;
• medicină legală: cu ajutorul reacţiilor PCR pot fi în prezent analizate la
nivel molecular o serie întreagă de probe biologice.