1.

(ADN)
1.1. 3

STRUCTURA MOLECULAR A ACIDULUI DEZOXIROBONUCLEIC .................................................................................................................... 3

Structura primar a ADN-ului i semnificaia ei genetic ..................................................... Semnificaia genetic a structurii primare a ADN................................................................... 5 Structura secundar a ADN-ului i semnificaia ei genetic.................................................. 5

1.1.1. 1.2.

2.
2.1.

MARKERII MOLECULARI......................................................................... 9
Metode de marcare molecular bazate pe restricie enzimatic ......................................... 11 Marcarea RFLP ...................................................................................................................... 11 Amprentarea genetic bazat pe ADN repetitiv .................................................................... 12 Metode de marcare molecular bazate pe amplificarea PCR ............................................. 14 Principiul reaciei PCR ........................................................................................................... Markerii RAPD ...................................................................................................................... 17 Markerii SCAR....................................................................................................................... 19 Markerii SSR (microsatelii) .................................................................................................. 19 Metode de marcare molecular bazate pe amplificarea PCR i restricie enzimatic ..... 21 Markerii CAPS ....................................................................................................................... 21 Markerii AFLP ....................................................................................................................... 22 Aplicaii....................................................................................................................................... 24 n ameliorare ........................................................................................................................... n genetica populational i taxonomie.................................................................................. 25

2.1.1. 2.1.2. 2.2. 2.2.1. 14 2.2.2. 2.2.3. 2.2.4. 2.3. 2.3.1. 2.3.2. 2.4. 2.4.1. 24 2.4.2.

3.
3.1. 33

INGINERIA GENETIC ........................................................................... 33

Tehnologia ADN-ului recombinant. ........................................................................................ Transformarea genetic la procariote..................................................................................... 33 Secvenierea ADNului. ..............................................................................................................

3.1.1. 3.2. 59 3.3. 62 3.4. 3.4.1. 3.4.2. 3.4.3.

Mutageneza dirijat. .................................................................................................................

Transformarea genetic la eucariote. ..................................................................................... 67 Transformarea genetic prin metode indirecte. ..................................................................... 67 Transformarea genetic de tip SID (Site Directed Integration) ............................................ 71 Transformarea genetic prin metode directe. ........................................................................

72 3.4.4. Instabilitatea exprimrii transgenelor..................................................................................... 74

3.5. 3.5.1. 3.5.2. 3.5.3. 3.5.4. 3.5.5. 3.5.6. 3.5.7. 3.5.8. 3.6.

Realizri privind transformarea genetic a plantelor de cultur........................................ 75 Ameliorarea rezistenei la virusuri. ........................................................................................ 76 Ameliorarea rezistenei la bacterii i ciuperci........................................................................ 78 Ameliorarea rezistenei la atacul duntorilor. ...................................................................... 80 Ameliorarea rezistenei la erbicidele neselective. ................................................................. 82 Ameliorarea calitii. .............................................................................................................. 83 Producerea de noi compui. ................................................................................................... 84 Ameliorarea rezistenei la stresul abiotic (stresul osmotic, toxicitatea metalelor grele). ..... 86 Manipularea sterilitii mascule. ............................................................................................ 89 Analiza obiectiv i legislaia referitoare la problematica Organismelor Modificate

Genetic (OMG urilor). ........................................................................................................................................... 91

4.
4.1. 101

HIBRIDAREA I CIBRIDAREA CELULAR........................................ 101

Hibridarea celular. ................................................................................................................ Obinerea protoplastelor. ...................................................................................................... Fuziunea protoplastelor ........................................................................................................ Izolarea celulelor hibride...................................................................................................... Regenerarea plantelor hibride. ............................................................................................. Confirmarea naturii hibride. ................................................................................................. Importana hibridrii celulare...............................................................................................

4.1.1. 101 4.1.2. 101 4.1.3. 103 4.1.4. 104 4.1.5. 105 4.1.6. 105 4.2. 107

Cibridarea celular. ................................................................................................................

5.
5.1. 108 5.2. 108 5.3. 109

HAPLOIDIA PRIN ANDRO I GINOGENEZ ...................................... 108

Haploidia prin androgenez...................................................................................................

Haploidia prin ginogenez......................................................................................................

Importana practic a haploidiei. ..........................................................................................

6. 7.

VARIABILITATEA SOMACLONAL .................................................... 111 BIBLIOGRAFIE ...................................................................................... 113

1. Structura molecular a acidului dezoxirobonucleic (ADN)

1.1. Structura primar a ADN-ului i semnificaia ei genetic

Structura primar a ADN-ului este monocatenar, macromolecular. Macromolecula de ADN este. de fapt, un heteropolimer alctuit din mai multe subuniti elementare numite nucleotide. Un nucleotid este alctuit dintr-un radical fosforic (P), dezoxiriboz (dR) i o baz azotat (N), formula general a unui nucleotid putnd fi reprezentat astfel: P-dR-N. Dezoxiriboza este o glucid cu cinci atomi de carbon (deci o pentoz), atomi notai de la 1' la 5' (fig. 8.1). Radicalul fosforic este legat printr-o legtur esteric de atomul de carbon 5'. Bazele azotate pot fi purinice i pirimidinice. Bazele azotate purinice sunt: adenina (6aminopurina) i guanina (2-amino, 6-oxipurina) avnd cte un nucleu purinic cu cinci atomi de carbon i patru atomi de azot, atomi notai de la 1 la 9 (fig. 1.2).

Figura 1.1: Dezoxiriboza, monozaharid cu cinci atomi de carbon (pentoz)

Figura 1.2: Bazele azotate purinice Bazele azotate pirimidinice sunt, de regul, timina (2,6-dioxi, 5-metilpirimidina) i citozina (2-oxi, 6-aminopirimidina), avnd cte un nucleu pirimidinic cu patru atomi de carbon i doi de azot, atomi notai de la 1 la 6 (fig. 1.3).

Figura 1.3: Bazele azotate pirimidinice Relativ n puine cazuri n lumea vie pot s apar i alte tipuri de baze azotate, cum ar fi de pild 5-hidroximetilcizina sau 6-metiladenina, evideniate la unii fagi. Dezoxiriboza realizeaz legturi l'-9 cu bazele azotate purinice i legturi l'-3 cu bazele azotate pirimidinice. Dezoxiriboza mpreun cu o baz azotat formeaz un nucleotid. Celor patru tipuri de baze azotate le corespund urmtoarele tipuri de nucleotide: dezoxiadenozina; dezoxiguanozina; dezoxitimidina; dezoxicitidina. Aceste nucleotide formeaz patru tipuri de nucleotide n urma legrii radicalului fosforic de atomul de carbon 5' al dezoxiribozei: dezoxiadenozin 5'-monofosfat sau acidul dezoxiadenilic (dAMP); dezoxiguanozin 5'-monofosfat sau acidul dezoxiguanilic (dGMP); dezoxitimidin 5'-monofosfat sau acidul dezoxitimidilic (dTMP); dezoxicitidin 5'-monofosfat sau acidul dezoxicitidilic (dCMP). Dou nucleotide sunt legate de un radical fosforic prin legturi monofosfodiesterice ntre atomii de carbon 5' i 3' a dezoxiribozei aparinnd celor dou nucleotide vecine (Fig. 1.4). Monocatena de ADN este polarizat, n sensul c la unul din capete gruparea OH, aparinnd atomului de carbon 5' este esterificat n timp ce la cellalt capt gruparea OH, aparinnd atomului de carbon 3' este liber. Figura 1.4: structura primar a ADN

1.1.1. Semnificaia genetic a structurii primare a ADN.

Specificitatea moleculei de ADN este determinat de secvena nucleotidelor n cadrul monocatenei, nucleotidele difereniindu-se n raport cu tipul de baz azotat pe care le conin. Numrul deosebit de mare de combinaii care poate s rezulte din combinarea celor patru tipuri de nucleotide (4n, unde reprezint numrul de nucleotide din cadrul unei molecule de ADN ce poate s ajung la cteva mii sau milioane), reprezint suportul material al variabilitii lumii vii, determinnd specificitatea informaional a fiecrei vieuitoare i capacitatea, practic, nelimitat a moleculei de ADN de a stoca informaia genetic.

1.2.

Structura

secundar

a ADN-ului

i semnificaia

ei

genetic
Structura secundar reprezint starea natural obinuit n care se gsete ADN-ul. Conform modelului descoperit de WATSON i CRICK (1953) pentru care n anul 1962 le-a fost decernat premiul Nobel, structura secundar a ADN-ului este bicatenar, cele dou catene fiind nfurate helicoidal spre dreapta (ADN de dreapta, dextrogir), plectonemical (catenele petrecute una peste alta la fiecare rsucire), formnd un dublu helix cu diametrul de 20 (1 = 10
-8

cm), pasul sau distana n cadrul unei nfurri complete este de 34.

Distana ntre dou nucleotide este de 3,4, deci n interiorul unei nfurri complete a dublului helix se gsesc 10 nucleotide. Spre exterior se afl scheletul glucido-fosforic al moleculei de ADN, iar spre interior se gsesc bazele azotate, legate prin puni de hidrogen, de natur electrostatic. mperecherea bazelor azotate i legarea lor prin puni de hidrogen se face pe principiul complementaritii, n sensul c aceasta se realizeaz strict specific ntre o baz azotat purinic i una pirimidinic. De regul adenina se mperecheaz prin intermediul a dou puni de hidrogen cu timina, iar guanina se mperecheaz prin intermediul a trei puni de hidrogen cu citozina. Aceast specificitate rezult din particularitile sterice a celor dou perechi de baze. Ca urmare a acestui mod de mperechere a bazelor azotate o caten este complementul sau negativul celeilalte catene, fapt deosebit de important pentru asigurarea continuitii genetice n procesul de copiere i transmitere a mesajului genetic (prin mesaj genetic se nelege totalitatea informaiei genetice nmagazinate n ADN sub forma unei secvene particulare de nucleotide). Datorit complementaritii n molecula de ADN coninutul purinic este totdeauna egal cu coninutul pirimidinic (A + G = T + C).

Raportul (A + T) / (G + C) difer ns de la o specie la alta fiind caracteristic unei anumite specii (CHARGAFF, 1951). Aceast regul de mperechere a bazelor azotate n cadrul moleculei de ADN bicatenare, prezint i unele excepii, n legtur cu posibilitatea trecerii bazelor azotate n formele lor tautomere, prin redistribuirea atomilor de hidrogen n cadrul moleculelor. Astfel, citozina poate trece din forma amin n forma imin (Fig. 1.5). Fenomenul este cunoscut sub denumirea de "tautomeric shift" i are ca i consecin schimbarea proprietilor de mperechere, n sensul c n acest caz citozina se mperecheaz cu timina i nu cu guanina. La fel n cazul unor modificri tautomere adenina se mperecheaz cu guanina nu cu timina. Modificarea proprietilor de mperechere a bazelor n cazul schimbrilor tautomere pot s aib ca efecte secundare apariia unor mutaii.

Figura 1.5: Tautomerizarea citozinei din forma amin n forma imin Cele dou catene ale moleculei de ADN sunt antiparalele n sensul c dac ntr-o catena legturile fosfodiesterice sunt pe direcia 5'-3', n cealalt caten legturile sunt pe direcia 3'-5' (fig. 1.6). Pe lng acest tip de ADN de dreapta, n ultimii ani a fost pus n eviden un nou tip de ADN cunoscut ca ADN-z sau ADN de stnga (senestra) la care cele dou catene sunt spiralizate spre stnga, scheletul glucido-fosforic avnd un traiect mai sinuos, n zig-zag (de unde i denumirea de ADN-z). Rolul acestui tip de ADN nu este nc cunoscut. De asemenea, dup cum s-a mai artat exist n stare natural i ADN monocatenar, de pilda in cazul fagilor 0 X 174 i S 13. Acetia i formeaz catena complementar numai dup ptrunderea lor n celula gazd n vederea multiplicrii. Semnificaia genetic a structurii secundare a ADN Structura secundar bicaternar asigur pe de o parte stabilitatea fizic i metabolic a moleculei de ADN. Acest fapt are cu att mai mare importan cu ct molecula de ADN este sintetizat o singur dat pentru ntreaga via a celulei Aceast stabilitate este relativ, n sensul c n anumite condiii naturale, n procesul de replicare i transcriere, sau artificiale (pH alcalin, temperatur ridicat n jur de 70-90C) poate s aib loc denaturarea ADN-ului sau trecerea lui n stare monocatenar. n condiii artificiale, prin rcire lent poate s aib loc renaturarea lui, sau 6

revenirea la structura bicatenar. Rata de renaturare este o msur cantitativ a complexitii secvenei nucleotidelor n molecula de ADN. Astfel, rata cea mai rapid de renaturare o prezint secvenele nalt repetitive, eventual polinucleotidele sintetice cu o secven monoton de nucleotide. n cazul secvenelor unice rata de renaturare este mai lent. Eficiena ratei de renaturare poate fi apreciat cu ajutorul valorii Cot definite prin formula Co x t, n care Co reprezint timpul de incubaie n condiii standard, dat n secunde. Cu ct eficiena renaturrii este mai mare cu att valoarea Cot este mai mic. De menionat c valorile Cot au specificitate de specie.

Figura 1.6: Structura secundar a ADN

Prin tehnica denaturrii-renaturrii pot fi realizai hibrizi moleculari ntre specii diferite, putndu-se stabili pe aceast baz legturile lor filogenetice. n acest sens renaturarea este cu att mai eficient sau proporia de renaturare este cu att mai mare cu ct speciile respective sunt mai nrudite Biogenetic. Astfel, proporia de renaturare n cazul hibrizilor moleculari om-maimu este de 75% n timp ce n cazul hibrizilor moleculari om-oarece este numai de 25%. Complementaritatea bazelor, n cadrul structurii secundare, asigur, pe de alt parte, posibilitatea realizrii celor dou funcii importante ale materialului genetic: funcia autocatalitic, n cadrul procesului de biosintez replicativ a ADNului, prin care se realizeaz copierea i transmiterea mesajului genetic, deci continuitatea genetic; funcia heterocatalitic, n cadrul procesului de biosintez proteic, prin care se asigur exprimarea mesajului genetic la nivelul fiecrui individ.

2. Markerii moleculari
Analiza diversitii genetice i a relaiilor inter- sau intraspecifice, populaionale sau individuale, este o problem central a multora dintre disciplinele biologiei. n ultimii ani, strategii clasice de evaluare a variabilitii genetice, cum ar fi studiile comparative de anatomie, morfologie, embriologie i fiziologie au fost tot mai mult completate de tehnici ale biologiei moleculare. Acestea includ analiza compuilor chimici (de ex. metaboliii secundari) i cel mai important analiza macromoleculelor. Dezvoltarea aa numiilor markeri moleculari, care pun n eviden polimorfismele la nivel de ADN sau proteine, a facilitat cercetrile ntr-o multitudine de discipline cum ar fi taxonomia, filogenia, ecologia, genetica i ameliorarea plantelor (Vila i colab., 1996) Marcherii genetici sunt reprezentai de orice diferen genetic sau fenotipic care este specific individului i se transmite la descendeni, putnd fi urmrit de-a lungul generaiilor. (Staub i colab., 1996) Marcherii genetici sunt de trei tipuri: marcheri morfologici, marcheri proteici i marcheri moleculari (de Vicente i colab., 2004) Marcherii morfologici: cu ajutorul acestor marcheri se poate efectua a evaluare rapid a fenotipului individului, deoarece sunt uor de utilizat i nu necesit echipamente costisitoare. Au fost utilizai n determinarea variabilitii att n cadrul populaiilor ct i ntre acestea; cu toate acestea prezint urmtoarele dezavantajele: se gsesc n numr limitat, necesit evaluarea expertului n cunoaterea speciei la care se utilizeaz i sunt influenai de condiiile de mdiu i de stadiul de dezvoltare al plantei. Marcherii biochimici: se mai numesc i proteici, deoarece se bazeaz pe proprietatea proteinelor de a fi separate n urma electroforezei. Tipuri de marcheri biochimici, sunt proteinele rezultate n urma stocrii seminelor, izoenzimele. Marcherii moleculari: prezint numeroase caracteristici importante, pot fi obinui n numr nelimitat, pot fi obinui din orice esut n orice etap de dezvoltare a plantei, sunt independeni de condiiile de mediu, independeni de expresia fenotipic a genei, nu prezint epistazie i pleiotropie, se transmit mendelian dominant sau codominant i sunt indifereni fa de presiunea de selecie. Spre deosebire de cei morfologici (controleaz caractere morfologice uor de evideniat controlate genetic simplu, monogenic), prezint marele avantaj c sunt mult mai numeroi i nu perturb fiziologia organismului. 9

Izoenzimele sunt enzime ce difer ca structur (secven de aminoacizi), dar catalizeaz aceeai reacie, avnd acelai substrat. Izoenzimele sunt codificate de gene omoloage. (Tanksley i colab., 1983.) Ca marcheri, au fost intens folosii n genetica populaiilor, fiind codominani i prezentnd o reproductibilitate mare. Dezavantajul izoenzimelor ca marcheri const n numrul sczut (sub 90) i faptul c sunt influenate de condiiile de mediu i de stadiul dezvoltrii plantei. (de Vicente i colab., 2004) Marcherii ADN evideniaz polimorfismul la nivelul ADN-ului nuclear i

citoplasmatic. Acetia nu sunt influenai de condiiile de mediu, fiind o msur obiectiv a variabilitii, exist n numr nelimitat, acoperind ntregul genom, dar necesit echipamente complexe de analiz. Marcherii ideali ar fi caracterizai de urmtoarele proprieti: polimorfism ridicat, reproductibilitate mare, codominan, distribuie uniform n genom, distinctivitate (s evidenieze diferenele ntre indivizi nrudii), neinfluenai de condiiile de mediu, neutri (alela prezent la locusul marcherului s fie independent fa de presiunea de selecie aplicat individului), necostisitori, uor de utilizat (de Vicente i colab, 2004). Marcherii moleculari pun n eviden diferenele existente ntre secvenele de nucleotidice din ADN-ul extras de la indivizi diferii, diferene care nu sunt neaprat vizibile n fenotip. O singur nucleotid diferit, dintr-o gen sau chiar din ADN-ul repetitiv, poate determina formarea sau dispariia unui marcher molecular (N. Jones i colab., 1997). Marcarea molecular are avantajul de a nu fi limitat de exprimarea fenotipic a caracterelor la nivelul plantei ntregi, fcnd posibil cuantificarea variaiei genetice direct la nivel de ADN. De-a lungul timpului s-au dezvoltat o serie de tehnici de punere n evident a variaiei genetice, aprnd astfel o multitudine de marcheri moleculari (Grant i Shoemaker, 2001). Markerii moleculari pot fi clasificai n funcie de tehnicile moleculare implicate precum i n funcie de modul lor de manifestare. Astfel n funcie de tehnicile implicate markerii moleculari pot fi bazai pe : Amplificarea PCR (RAPD, SSR, SCAR, SRAP, TRAP) Restricie enzimatic (RFLP, SSR) Amplificarea PCR i restricie enzimatic (AFLP,

CAPS) n funcie de modul de manifestare markerii moleculari pot fi: Dominani (RAPD, AFLP) SRAP, TRAP) 10

Codominani (SSR, CAPS, RFLP)

2.1.

Metode de marcare molecular bazate pe restricie

enzimatic
2.1.1. Marcarea RFLP
Marcarea RFLP (Restriction Fragment Length Polimorfism) a fost prima metod utilizat n vederea cartrii variaiilor secvenelor de ADN. Tehnica se bazeaz pe proprietatea endonucleazelor de a recunoate secvene specifice scurte de ADN (4-8 pb) i de a rupe molecula de ADN la nivelul acestor secvene (situsuri de restricie). Datorit faptului c secvenele recunoscute de endonucleaze se repet aleatoriu de mai multe ori de-a lungul genomului, vor rezulta n urma digestiei enzimatice cu o anumit endonucleaz o multitudine de fragmente de lungimi diferite. Orice modificare aprut n interiorul acestor secvene (fie i o singur nucleotid) conduce la imposibilitatea enzimei de a recunoate secvena i de a rupe molecula de ADN. Aceasta nseamn c dac doi indivizi difer n secvena unui astfel de situs de restricie, endonucleaza va tia molecula de ADN a unui individ dar nu i a celuilalt (Grant i colab., 1995). n funcie de lungimea sondei utilizate, respectiv de specificitatea ei, se poate vorbi n cazul markerilor moleculari bazai pe hibridare, de analiza RFLP clasic, care utilizeaz ca sonde secvene cu lungime mai mare fiind astfel specifici unui anumit locus. O alt variant a analizei RFLP este obinerea de amprente genetice, caz n care se folosesc ca sonde secvene scurte care se vor hibridiza cu mai multe fragmente, rezultnd astfel un profil electroforetic cu mai multe benzi dect n cazul analizei RFLP clasice (Vila i colab., 1996) O proprietate foarte util a markerilor RFLP este acea c ei sunt codominani, spre deosebire de markerii fenotipici care sunt n general dominani/recesivi. Aceasta nseamn c prezena uneia dintre alele nu mpiedic detectarea celeilalte alele n cazul n care individul este heterozigot (Grant i colab., 1995; Staub i colab., 1996). Metoda de lucru const n extracia ADN-ului genomal, digerarea lui cu ajutorul unei enzime de restricie i migrarea electroforetic n gel de agaroz. Fragmentele de ADN sunt ulterior transferate prin tehnica Soutern blotting pe o membran de nylon sau nitroceluloz i hibridate cu sonde marcate radioactiv (Olive i colab., 1999;Vila i colab., 1996). Membrana este mai apoi autoradiografiat, rezultnd astfel un film pe care fragmentele de

11

ADN care s-au hibridizat cu sondele marcate radioactiv, vor aprea sub forma de benzi (Staub i colab., 1996).

2.1.2. Amprentarea genetic bazat pe ADN repetitiv

Tehnica clasic de amprentare genetic bazat pe hibridizare scoate n eviden, la organismele eucariote, cteva clase de secvene repetitive, cu un polimorfism ridicat a cror nomenclatur este uneori confuz. Secvenele repetitive sunt o parte integrant a genomului eucariotelor i reprezint uneori pn la 90% din totalul genomului. n funcie de organizarea sa, secvenele repetitive pot fi clasificate n intercalate (risipite de-a lungul genomului) sau n tandem. n cazul secvenelor intercalate, ele se repet de cteva ori n genom. Pe de alt parte, cele repetate n tandem sunt constituite din dou pn la cteva mii de secvene scurte (motive) repetate, aezate cap-coad. Dei acest tip de organizare este ntlnit i n cazul unor gene (de ex. genele care codific histonele sau cele pentru ARNr), cele mai multe secvene repetitive sunt probabil noninformaionale. (Weising i colab., 1995) Fragmentele repetate n tandem pot fi clasificate, n funcie de lungimea lor i numrul de repetiii, astfel: 1. ADN-ul satelit a fost descris pentru prima dat acum mai bine de 35 de ani. El a fost denumit dup separabilitatea lui din ADN-ul total prin centrifugarea n gradient de densitate. Acest tip de ADN repetitiv este constituit dintr-un numr foarte mare de repetiii (1000 pn la 100.000 de copii), a unui motiv format din 2 pn la cteva mii de perechi de baze, dar cel mai des din 100-300 pb. Sateliii apar de obicei ntr-un numr redus de loci n genom. 2. ADN minisatelit. Termenul a fost introdus n 1985 i descrie o alt familie de secvene repetate n tandem. Aceast clas este constituit din motive mai scurte (de obicei din 10-60 pb), repetate de un numr mai mic de ori. Minisateliii pot forma familii de secvene nrudite i se ntlnesc n mai muli loci. 3. ADN microsatelit n sau

secvenele simple

repetitive (SSR), sau

secvene simple i cu cele mai scurte motive).

tandem sunt formate din motive scurte (1-10 pb),

repetate de un numr mic de ori dar prezente n muli loci (cei mai muli loci

12

4. Pentru completarea listei de mai sus, a secvenelor repetate n tandem Nakamura i colab. au introdus i termenul de midisatelii pentru a descrie secvenele care combin caliti ale sateliilor (numr foarte mare de repetiii la nu singur locus) i ale minisateliilor (numr variabil de repetiii a unor motive de aproximativ 40 pb) Markerii genetici obinui pe baza acestui tip de amprentare molecular au un comportament codominant, n sensul c prezena uneia dintre alele nu inhib punerea n eviden a unei alte alele (Grant i colab., 1995). Din punct de vedere tehnic, amprentarea genetic pe baza secvenelor repetitive difer de analiza RFLP doar prin lungimea i secvena sondelor utilizate i n ceea ce privete interpretarea rezultatelor. Dac n cazul analizei RFLP vor aprea, n general, pe autoradiografia gelului electroforetic doar una sau dou benzi pentru fiecare individ studiat, n cazul amprentei genetice apare un numr mult mai mare de benzi, corelat cu numrul de loci n care apare secvena repetitiv. Astfel pentru fiecare locus vom avea una sau dou benzi n funcie de starea homozigot sau heterozigot a individului (Fig. 2.1).

Figura 2.1 Amprentarea genetic bazat pe analiza secvenelor repetitive

13

2.2. PCR

Metode de marcare molecular bazate pe amplificarea

n anul 1985 a fost pus la punct o noua tehnic, care a revoluionat genetica molecular. Aceast tehnic poart numele de Polimerase Chain Reaction PCR (reacia n lan a polimerazei). Tehnica permite amplificarea n vitro a unei secvene dorite de ADN, ntr- un numr foarte mare de copii. Pentru a putea amplifica o secven ADN dorit, sunt necesare dou oligonucleotide monocatenare, complementare capetelor secvenei pe care dorim s o amplificm este (primeri). Totodatpentru necesar a realiza o amplificare o ADN-polimeraz termostabil, nucleotide (sub form

de deoxinucleotidtrifosfat DNTP) ct i de un tampon de amplificare potrivit. Reacia are loc pe fondul unui ciclu termic care va permite denaturarea ADN, fixarea primerilor i polimerizarea (extensia) secvenei de ADN cuprinse ntre cei doi primeri (Vila i colab., 1996). Pe baza reaciei PCR s-au dezvoltat o serie de tehnici de obinere a unor amprente genetice i de detectare a polimorfismelor la nivel de ADN. Aceste tehnici utilizeaz primeri specifici (PCR) sau primeri alei aleatoriu (RAPD, DAF, AP-PCR, etc.).

2.2.1. Principiul reaciei PCR

n reacia PCR tipic se pot distinge trei etape distincte controlate prin temperatura de reacie, repetate ciclic de 25 pn la 50 de ori. Amestecul de reacie cuprinde: Tampon de reacie format n general din TRIS-HCl, KCl, i MCl2;

ADN polimeraz termostabil care adaug nucleotide la captul 3 al unui primer ataat la o secven de ADN monocatenar; Patru deoxinucleotide (dNTP: dATP, dCTP, dGTP, dTTP); Doi primeri oligonucleotidici; ADN-ul matri.

Principiul reaciei PCR este reprezentat schematic n Fig 2.2. n prima etap ADN-ul matri (genomic) este denaturat prin ridicarea temperaturii la 94 C etapa de denaturare. n cea de a doua etap (de ataare a primerilor) prin scderea temperaturii de reacie la 25 - 65 C, n funcie de lungimea i secvena primerilor, se realizeaz ataarea primerilor la catenele matri. Primerii se vor ataa preferenial la situsurile unde

gsesc o secven 14

complementar, sau aproape complementar. Vor aprea astfel unele greeli n special la captul 5. Etapa a treia este etapa de elongaie (polimerizare). n aceast etap temperatura este aleas n funcie de temperatura optim de activitate a ADN-polimerazei termostabile. n general aceasta este n jurul valorii de 72 C. De-a lungul acestei etape, la captul 3 al primerului, ADN-polimeraza adaug nucleotide pe baz de complementaritate cu catena matri. Acest ciclu cu trei etape va fi repetat de 24-50 de ori. Specificitatea reaciei este determinat de alegerea primerilor. Primerii sunt secvene oligonucleotidice monocatenare cu secven complementar regiunilor care flancheaz secvena int. Pentru ca amplificarea s aib loc, primerii trebuie s se ataeze n direcii opuse, astfel nct capetele 3 ale lor s fie ndreptate spre secvena int. Pentru o amplificare eficient, distana dintre cei doi primeri nu trebuie s depeasc 4 Kb. n condiii optime de reacie pot fi amplificate, cu eficien mai mic, i fragmente cu dimensiuni de pn la 10 Kb. n funcie de tipul mutaiei i de modul n care au fost concepui primerii n relaie cu mutaia, markerii PCR pot a avea o manifestare dominant sau codominat. Astfel n cazul n care polimorfismul (mutaia) afecteaz unul dintre situsurile de ataare a primerilor, markerii PCR au o manifestare dominant caracterizat prin prezena sau absena produsului de amplificare. Markerii PCR pot fi codominani dac polimorfismul, situat ntre situsurile de ataare a primerilor, este reprezentat de o inserie sau o deleie (mutaii de tip indel), situaie caracterizat de polimorfisme de lungime a fragmentelor amplificate.

15

Fiura 2.2: Principiul reaciei n lan a polimerazei (PCR)

16

2.2.2. Markerii RAPD

Tehnica RAPD a fost conceput de Williams i colaboratorii (Williams i colab., 1993) i este cea mai simpl i mai utilizat dintre tehnicile de marcare molecular, care au la baz amplificarea PCR cu primeri alei aleatoriu (DAF, AP-PCR) (Vila i colab., 1995). Markerii RAPD (Random Amplified Plymorphic DNA) sunt obinui pe baza tehnicii PCR, utiliznd primeri scuri (de obicei decameri). Primerii se vor hibridiza cu molecula de ADN matri n mai multe locuri n mod aleatoriu. Dac distana dintre doi primeri este suficient de mic i dac sunt orientai corespunztor unul fa de cellalt, fragmentul dintre cei doi primeri va fi amplificat. Produii de amplificare vor fi migrai electroforetic, rezultnd n general un numr de 5 20 de benzi pentru fiecare primer (Grant i colab., 1995) (Fig. 2.3). Primerii utilizai n aceast tehnic sunt de obicei decameri i au un coninut de cel puin 50% n guanin i citozin (GC). Deoarece ntre adenin i timin sunt doar dou puni de hidrogen, primerii cu un coninut de peste 50% n aceste dou nucleotide, nu vor rezista temperaturii la care se face extensia i se vor denatura nainte ca aceasta s nceap (Vila i colab., 1995; Williams i colab., 1993). Datorit faptului c secvena primerilor este fcut arbitrar, nu este necesar cunoaterea prealabil a secvenelor de ADN care vor fi amplificate (Vila i colab., 1995), dar alegerea secvenei primerilor care s evidenieze cel mai bine polimorfismele existente se face prin cercetri empirice (Olive i colab., 1999). Aproape toi markerii RAPD sunt dominani, ei manifestndu-se prin prezena sau absena unei benzi n gelul de electroforez. Este imposibil de spus dac fragmentul amplificat provine de la un locus care este heterozigot sau homozigot pe baza markerilor RAPD. Totui n unele cazuri au fost observai i markeri RAPD codominani. Acetia se pot observa sub forma unor produi de amplificare cu lungimi diferite provenite de la acelai locus (Williams i colab., 1993). n ceea ce privete capacitatea diferenieri ntre dou genotipuri, analiza RAPD s-a dovedit n unele cazuri, mai eficient dect analiza RFLP, dar mai puin eficient dect RepPCR (Vila i colab., 1995). Unul dintre neajunsurile markerilor RAPD este reproductibilitatea sczut a acestui tip de analiz. Aceasta se datoreaz faptului c primerii nu sunt specifici unui anumit locus i, astfel, o parte dintre produii de amplificare sunt rezultatul unei atari defectuoase a primerilor. Analiza este astfel foarte sensibil la o serie de factori cum ar fi: temperatura de 17

ataare a primerilor, calitatea i concentraiile componentelor tamponului de extracie, ADNpolimeraza utilizat, etc. (Olive i colab., 1999)

Figura 2.3: Principiul metodei RAPD

18

2.2.3. Markerii SCAR

Markerii SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions regiuni amplificate caracterizate prin secveniere). n anul 1993 Paran i Michelmore, au dezvoltat un nou tip de marker molecular care se obine n urma analizei RAPD, dar este lipsit de unele neajunsuri ale acesteia. Astfel, pornind de la o band identificat prin RAPD, considerat de interes, excizat din gel, clonat i apoi secveniat, se sintetizeaz primeri de 16-24 pb, complementari cu capetele markerilor RAPD clonai. Amplificarea cu primerii astfel obinui va da produi ce formeaz un tipar mai simplu n gel, respectiv un numr mai mic de benzi (de Vicente i colab., 2004). Markerii SCAR au o reproductibilitate mult mai mare dect markerii RAPD, datorit folosirii unor primeri specifici lungi, complementari anumitor loci din genom i datorit condiiilor de specificitate mrit n care are loc amplificarea PCR i care nltur competiia primerilor pentru situsurile de fixare. Un alt avantaj este faptul c i pot pstra caracterul dominant de transmitere n descenden (la fel ca i fragmentul RAPD original), sau pot fi transformai n markeri codominani, prin digestie cu endonucleaze. Identificarea polimorfismului se face prin electroforez n gradient de denaturare (DGGE - denaturing gradient gel electrophoresis), sau prin intermediul tehnicii SSCP (single strand conformational polymorphism) (Rafalski i Tingey, 1993)

2.2.4. Markerii SSR (microsatelii)

Microsateliii (ADN nalt repetitiv) reprezint secvene scurte (1-10 pb, de obicei 2-3 pb) de nucleotide ce se repet n tandem, gsindu-se n proporie mai mare la nivelul centromerului i telomerelor (ADN non-informaional) (Gupta i colab, 1996). Pentru a putea fi utilizai ca markeri trebuie cunoscut localizarea lor n genom. Majoritatea markerilor microsatelit STR i SSR sunt constituii din repetiii dinucleotidice [(AC)n, (AG)n i (AT)n]. Similar cu repetiiile dinucleotidice (CA)n de la om, repetiiile dinucleotidice (AT)n sunt relativ abundente la plante i prezint un grad ridicat de polimorfism (Morgante i Vogel, 1994). Acest grup de markeri are o expresie codominant. Desi tehnica clasic de analiz a polimorfismelor existente la nivelul locilor SSR era bazat pe digestia enzimatic i hibridare, aceasta prezint unele dezavantaje prin faptul c este o tehnic laborias, care necesit cantiti relativ mari de ADN de bun calitate, i care utilizeaz izotopi radioactivi. Mai mult pentru a putea analiza un anumit locus, acste trebuie

19

sa fie flancat de situsuri de restricie speciice unei anumite enzime de restricie. Aceste dezavantaje sunt inlturate prin adaptarea lor la tehnica PCR. Polimorfismul apare datorit variaiei n numr a repetiiilor n tandem n urma amplificrii PCR cu primeri complementari secvenelor ce flancheaz ADN-ul microsatelit (secvene conservate n cadrul speciei, uneori i a genului). Produii de amplificare (benzi de 200-300 pb, ce difer ntre ele ca mrime prin cel puin 10-20 pb) sunt migrai n gel de agaroz i vizualizai prin colorare cu BrEt. Produii ce difer ntre ei ca mrime prin mai puin de 10 pb n general sunt migrai n gel de poliacrilamid i vizualizai prin colorare cu azotat de argint sau se pot secvenia pentru o analiz foarte clar a rezultatelor. Avantajele markerilor SSR sunt date de: distribuia lor uniform n genom, polimorfism ridicat, posibilitatea separrii mai multor markeri n aceeai coloan a gelului asigurndu-se n acest fel o economie important de munc, timp i costuri reduse, posibilitatea de automatizare a analizelor, interpretarea simpl a rezultatelor, reproductibilitate mare - rezultatele pot fi cu uurin echivalate ntre laboratoare cu condiia ca metoda de separare a fragmentelor ADN prin electroforez s fie aceeai i sunt codominani-ceea ce permite identificarea tuturor alelelor. Principalele impedimente ar fi legate de costul elaborrii primerilor, de necesitatea cunoaterii secvenei de ADN de interes i de faptul c la migrarea n gelpot s apar unele benzi false alturi de fragmentele ateptate, ceea ce poate duce la probleme n aprecierea mrimii alelelor sau confundarea heterozigoilor cu homozigoii dac cele dou benzi sunt suprapuse. Markerii SSR i gsesc aplicabilitate n genotipizarea indivizilor, evaluarea germoplasmei, a diversitii genetice, cartarea genomului, amprentarea genetic, studii de filogenie i de evoluionism. Identificarea markerilor SSR este o problem mai dificil dect analiza n sine. Izolarea i caracterizarea regiunilor microsatelit, secvenierea acestora i testarea primerilor sunt toate operaiuni care necesit timp i costuri mrite. n programele de cercetare n care se analizeaz numeroi microsatelii, vizualizarea polimorfismelor se poate realiza concomitent n acelai gel de electroforez-MULTIPLE SSR.

20

Metodele clasice de izolare a marcherilor SSR presupun realizarea unor biblioteci de gene i apoi screeningul acestora pentru evidenierea prezenei microsateliilor. Procentul de clone pozitive astfel obinute este relativ sczut, n jur de 2,3 % (Zane i colab., 2002). Costul elaborrii marcherilor SSR, att prin metodele clasice, ct i prin cele moderne, este relativ ridicat i necesit experien n ceea ce privete realizarea i screeningul bibliotecilor de gene. Pe de alt parte, mai muli autori (Huang i colab., 1998; Cipriani i colab., 1999; Downey i Iezzoni, 2000; Yamamoto i colab., 2001; Wnsch i Hormaza, 2002; Mnejja i colab., 2005; Ganopoulos i colab., 2010; Ercisli i colab., 2011, Berindean i colab., 2012) au relevat transferabilitatea marcherilor SSR n cadrul speciilor aparinnd aceluiai gen.

2.3.

Metode de marcare molecular bazate pe amplificarea

PCR i restricie enzimatic

2.3.1. Markerii CAPS
Markerii CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences), dezvoltai n 1993 de ctre Konieczny i Ausubel n vedera cartrii genetice la Arabidopsis thaliana, au la ora actual o larg rspndire n studiile care vizeaz cartarea genetic la plante, animale i om. Tehnica const n amplificarea unei secvene int n interiorul creia sa existe unul sau mai multe situsuri de restricie, urmat re restricia enzimatic a respectivelor fragmente. Dac o mutaie afecteaz un situs de restricie acesta nu va mai recunoscut de ctre enzim i astfel n gelul electroforetic nu vor aprea dou benzi ci una singur cu o lungime mai mare (Fig 2.4). n cazul n care un individ este heterozigot n gelul electrofortic vor aparea trei benzi. Astfel acest tip de markeri se ncadreaz n categoria markerilor cu manifestare codominant.

Figura 2.4 Principiul metodei CAPS 21

2.3.2. Markerii AFLP

Analiza AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), este o metod de amprentare genomic elaborat de Zabeau i Vos (1993), bazat pe amplificarea selectiv a o parte din fragmentele de ADN, obinute n urma digestiei enzimatice cu endonucleaze (Olive i colab., 1999; Staub i colab., 1996). Se poate spune astfel c aceast analiz este o combinaie a tehnicilor de amprentare genetic RFLP i a celor bazate pe amplificarea PCR. n funcie de numrul de enzime de restricie utilizate i implicit a numrului de primeri, se pot distinge dou variante de analiz AFLP: analiza n care se utilizeaz o singur enzim de restricie i un primer, sau analiza care utilizeaz dou enzime de restricie i doi primeri (Olive i colab., 1999), cel mai des utilizat fiind cea de-a doua variant. Metoda const n extracia ADN-ului genomic total, digestia lui cu ajutorul a dou enzime de restricie, ligarea a doi adaptori oligonucleotidici bicatenari cu capete coezive complementare capetelor rezultate n urma digestiei enzimatice. Fragmentele astfel obinute vor fi amplificate PCR utiliznd primeri complementari adaptorului i situsului de restricie. Pentru a mri specificitatea reaciei i a micora numrul fragmentelor amplificate se poate proceda la o nou amplificare cu primeri la care, pe lng secvenele complementare adaptorului i situsului de restricie, se mai adaug 2-4 nucleotide. Produii de amplificare vor fi migrai electroforetic n gel de poliacrilamid (Olive i colab., 1999) (Fig. 2.5). Polimorfismele sunt date de lungimea fragmentelor amplificate, metoda fiind foarte sensibil. Datorit numrului mare de benzi rezultate, a reproductibilitii bune i a posibilitii scanrii ntregului genom, markerii AFLP se preteaz utilizrii n scopul amprentrii genetice, crerii de hri genetice, estimrii diversitii, analizrii distanei genetice i a caracterizrii coleciilor de germoplasm. Sunt bine adaptai pentru studierea speciilor neexploatate i au fost deja folosii cu succes pentru a discrimina specii diferite, cu diferite niveluri de ploidie (de exemplu: Gossypium i Oryza) (Aggarwal et al, 1999; Abdalla et al, 2001). Dezavantajele markerilor AFLP sunt date de necesitatea tehnologiei computerizate n analizarea rezultatelor, de faptul c sunt dominani, iar din punct de vedere tehnic manopera este laborioas. Markerii AFLP au un caracter dominant, dar, datorit posibilitii de determinare cantitativ n funcie de intensitatea benzilor, se poate face uneori distincie ntre genotipurile

22

homozigote (benzile mai intense) i cele heterozigote (benzile mai puin intense). Din acest motiv se poate spune ca markerii AFLP se transmit codominant (Staub i colab., 1996).

Figura 2.5: Principiul metodei AFLP

23

2.4.

Aplicaii

2.4.1. n ameliorare
Selecia asistat de markeri (MAS)este un proces prin care un marker molecular este utilizat pentru selecia indirect a unei gene care determin un caracter de interes (de exemplu, productivitate, rezisten la o boala, toleranta la stres biotic sau abiotic). Acest proces este folosit n ameliorarea plantelor i animalelor. Selecia asistat de markeri combin tehnicile de ameliorare clasice cu cele de biologie molecular. Markerii moleculari care sunt strns linkai cu gene importante, n sens agronomic sunt folosii ca instrumente moleculare pentru selecia asistat de marcheri n ameliorarea plantelor. Cu ajutorul marcherilor moleculari se urmrete efectuarea unei selecii indirecte a caracterelor de interes folosind strnsa legatur (linkage-ul) dintre gena sau genele care controleaz caracterul i un marcher molecular. Ulterior stabiliri distanei de nlnuire markerul molecular poate fi utilizat n munca de seleie fr a mai fi necesar urmrirea caracterului cu care acesta este nlnuit, astfel se pot selecta indivizii doar pe baza markerului, ceea ce permite selectarea acestora foarte timpuriu (la plante foarte tinere), reducndu-se astfel timpul necesar seleciei. Un alt avantaj al folosirii markerilor moleculari rezid din independena acestora fa de expresia fenotipic. MAS d rezultate foarte bune i n cazurile n care selecia pe baza fenotipului este foarte dificil. Pentru a putea fi utilizat in ameliorare un marker molecular trebuie s fie nlnuit cu o gen de interes la o distana ct mai mic (cel mult 5 cM). Astfel primul pas pe care trebuie s l parcurgem n MAS este tocmai stabilirea distanei de nlnuire dintre caracterul de interes i markerul molecular. Aceasta se realizeaz prin efectuarea de hibridri i urmrirea segregrii n descenden. Selecia unui marcher ADN pentru ameliorarea plantelor depinde de anumite obiective: structura populaiei, complexitatea genomului speciei analizate, tipul de marcheri disponibili, timpul necesar pentru analize i costul per marcher. n mod cert, fiecare tip de marcher are avantaje i dezavantaje i de aceea este greu de evaluat potenialul fiecrui tip de marcher nainte de a fi folosit.

24

2.4.2. n genetica populational i taxonomie

Analizarea

variabilitii

genetice

cu ajutorul marcherilor

dominani

prezint

dezavantajul unui nivel sczut al informaiei obinute comparativ cu cea obinut prin utilizarea marcherilor de tip codominant. Acest dezavantaj este ns compensat prin numrul mare de loci analizai att n cazul utilizrii marcherilor AFLP ct i n cazul marcherilor RAPD. Cu toate acestea analiza matematic a rezultatelor este mai dificil i se bazeaz pe o serie de prezumii. n timp ce analiza diversitii cu ajutorul marcherilor codominani se bazeaz n principal pe compararea frecvenelor alelelor i a genotipurilor observate cu cele teoretice, ateptate n cazul respectrii echilibrului Hardy-Weinberg, n cazul marcherilor dominani acest lucru nu poate fi fcut n mod direct. Pentru analiza diversitii genetice cu ajutorul marcherilor dominani se pot utiliza dou metode de analiz. Astfel o prim metod este cea care implic calcularea unor distane genetice ntre taxonii analizai pe baza crora se ntocmesc mai apoi dendrograme (arbori), arbori care pot oferi indicaii asupra modului de grupare a taxonilor n funcie de asemnrile sau diferenele dintre ei. Datele obinute prin marcarea molecular cu marcheri dominani sunt cel mai adesea analizate prin ntocmirea de dendrograme prin metodele UPGMA sau Neighbor Joining. n vederea calculrii distanelor genetice dintre indivizi, necesare ntocmirii dendrogramelor pot fi utilizai diferii coeficieni de distan (D) sau de similaritate (S) cunoscnd relaia: D=1-S. Distanele sunt calculate pentru fiecare pereche de taxoni analizai pe baza prezenei/absenei alelelor dominante (benzilor n gelurile electroforetice). Cel mai des utilizai coeficieni de similaritate sunt coeficientul de similaritate simpl (simple matching) [1] (Sneath, i colab., 1973), coeficientul Jaccard [2] (Jaccard, 1908), i coeficientul Nei Li/Dice [3] (Nei i colab., 1979). Astfel pentru a calcula coeficienii de similaritate ntre indivizii x i y putem uttuliza formulele: S SM = n11 + n00 n n11 [2] n n00 [3] [1]

SJ = SD =

2n11 2n11 + n10 + n01

25

unde: n = numrul total de benzi, n11 = Numrul de poziii unde x=1 i y=1, n00 = Numrul de poziii unde x=0 i y=0, n01 = Numrul de poziii unde x=0 i y=1, n10 = Numrul de poziii unde x=1 i y=0. Datorit incertitudinilor privind identitatea alelelor nule cei mai muli autori recomand evitarea utilizrii coeficientului de similaritate simpl [1], care consider identici locii la care ambii indivizi prezint alela nul. Datorit cauzelor multiple care pot concura la lipsa unui fragment amplificat (lipsa situsului F sau R de ataare, inserii sau deleii n interiorul secvenei amplificate), este recomandat evitarea considerrii lor ca un indicator al identitii. Coeficienii Jaccard i Dice [2, 3] nu includ n calculul similaritii benzile absente (alelele nule) i astfel reduc din erorile care pot fi induse din considerarea acestor alele ca fiind identice. 2.4.3. Generarea arborilor prin metoda UPGMA. Metoda UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) este cea mai simpl metod pentru construirea unei dendrograme, dezvoltat iniial pentru construcia fenogramelor, dar care poate fi utilizat i pentru generarea de arbori filogenetici, atunci cnd rata evoluiei este egal pentru toate liniile analizate. Metoda utilizeaz un algoritm secvenial care ncepe cu obinerea unui taxon compozit din perechea de taxoni care au cel mai mare indice de similaritate (cea mai mic distan). Utiliznd n continuare acest taxon compozit se trece mai departe la obinerea unei noi matrice de distante (prin calcularea mediilor aritmetice) n care intr taxonul compozit i restul taxonilor rmai. Pe baza acestei noi matrice de distane se caut urmtorul taxon compozit, i aa mai departe pn n momentul n care rmn doar doi taxoni S presupunem c avem sase taxoni, distanele dintre ei fiind prezentate n tabel.
B C D E F A 6 8 11 13 13 B 10 13 15 15 C D E

11 13 13

8 12

14

Primul pas este de a grupa taxonii cu cea mai mica distanta (A i B). Nodul dintre ramuri va fi marcat la jumtatea distantei dintre A i B (2/2=1)

26

Prin gruparea celor doi taxoni se obine un taxon nou, compozit. Se trece mai apoi la calcularea unei noi matrice de distane dup cum urmeaz: dist(A,B),C = (distAC + distBC) / 2 = 4 dist(A,B),D = (distAD + distBD) / 2 = 6 dist(A,B),E = (distAE + distBE) / 2 = 6 dist(A,B),F = (distAF + distBF) / 2 = 8 Cu alte cuvinte distana dintre un taxon simplu i unul compozit este egal cu media distanelor dintre taxonul simplu i fiecare dintre taxonii componeni ai celui compozit. ntregul pas se repet pentru matricea nou generat Pasul 2
C D E F (AB) 9 12 14 14 C 11 13 13 D E

8 12

14

Pasul 3
C (DE) F (AB) 9 13 14 C 12 13 (DE)

13

27

Pasul 4
(DE) F ((AB)C) 11 13,5 (DE) 13

Pasul 5
F (((AB)C)(DE)) 13,25

28

Dei metoda conduce spre un arbore nenrdcinat, ea presupune rate egale ale evoluiei, deci rdcina teoretica trebuie s fie echidistant fa de toi taxonii. Astfel putem aplica metoda punctului de mijloc i deci o vom aplica la o distan de: (ABCDE),F / 2 = 4. Dezavantajele metodei: Metoda este foarte sensibila la ratele de evoluie inegale. Astfel n cazul n care un taxon a avut o rat mai mare a mutaiei (evoluiei) dect ceilali taxoni aceasta va conduce la obinerea unor arbori eronai. Metoda va funciona dor n cazul distantelor ultrametrice (cu respectarea conditiei celor trei puncte)

2.4.4. Generarea arborilor prin metoda Neighbor-Joining Neighbor-joining (Saitou and Nei, 1987) este o metod de grupare care nu cere ca datele sa fie ultrametrice i deci nu presupune c taxonii au o rat egal a evoluiei. n cazul acestei metode se pornete de la un arbore de tip stea, urmrindu-se, spre deosebire de metoda precedenta, distantele dintre noduri i nu cele dintre taxoni sau grupuri de taxoni. Datele brute sunt de asemenea reprezentate de o matrice binar, dup care se calculeaz o a doua matrice modificat, n care distana dintre fiecare doua noduri este ajustat n funcie de distanta medie fa de toate celelalte noduri. Construcia ncepe prin gruparea celor mai apropiate dou noduri i adugarea la arbore a nodului ancestral comun lor. Dup aceasta nodurile terminale sunt nlturate din analiza, astfel nodul ancestral devine nod terminal, ntr-un arbore cu dimensiuni mai mici. Practic n fiecare pas al analizei dou noduri terminale sunt nlocuite cu unul terminal nou. Procesul se ncheie atunci cnd n analiza rmn doar doua noduri separate printr-o singur ramur. Algoritmul permite apariia ramurilor cu valoare negativa. Daca acest fenomen apare atunci lungimea ramurii respective se seteaz la zero, valoarea ei fiind adugat la valoarea ramurii adiacente, astfel c distanta totala dintre cele dou noduri adiacente rmne neschimbat, i topologia general nu este afectat. Avantajele i dezavantajele metodei Neighbor-joining

Avantaje

29

Este o metod rapid i deci compatibil cu seturi mari de date i pentru analize de tip bootstrap

o o

Permite construirea de arbori cu lungimi diferite ale braelor Permite corecii n cazul substituiilor multiple

Dezavantaje
o o

Genereaz un singur arbore posibil Foarte dependent de modelul de evoluie utilizat.

Exemplu

S presupunem c avem ase OTU, distanele dintre ele fiind prezentate n tabel.
B C D E F A 6 8 11 13 13 B 10 13 15 15 C D E

11 13 13

8 12

14

N=6 Pasul 1: Se calculeaz distana neta r(i) pentru fiecare OTU fa de toi ceilali OTU, prin nsumarea distanelor lui fa de ceilali:

r(A) = 6+8+11+13+13=51 r(B) = 59 r(C) = 55 r(D) = 55 r(E) = 63 r(F) = 67 Pasul 2: Se calculeaz o nou matrice de valori M dup formula: M (ij ) = d (ij ) j )] Astfel, pentru perechea A-B: [r (i ) + r ( N2

M ( AB) = d ( AB)

[r ( A) + r ( B)] 51 + 59 =6 = 21,5 N2 4
30

B C D E F

A -21,5 -18,5 -15,5 -15,5 -16,5

B -18,5 -15,5 -15,5 -16,5

-16,5 -16,5 -17,5

-21,5 -18,5

-18,5

Pasul 3: Pornind de la un arbore stea (figura 1.6, A), se alege pentru grupare acea pereche de OTU pentru care M(ij) are cea mai mic valoare. n cazul nostru aceasta este perechea A-B perechea A-B se va separa de grup prin formarea unui nou nod (intern) pe care l denumim U1. Calculm lungimile ramurilor de la nodul U1 la A, respectiv B dup formulele: S (iU) = d (ij ) j )] 2 + [ r (i ) r ( 2( N 2)

S ( jU ) = d (ij ) S (iU )

S ( AU 1 ) =

D( AB) [r ( A) r ( B)] 6 [51 59] + = + =2 2 2( N 2) 2 2(6 2)

S ( BU 1 ) = d ( AB ) S ( AU ) = 6 2 = 4

Arborele rezultat va fi cel din Figura 1.6, B Pasul 4: Se calculeaz distantele fiecrui nod terminal fa de nodul U dup formula:

d (kU ) =

d (ki ) + d (kj ) d (ij ) 2

astfel n cazul nostru:

d (CU ) = d (DU ) = d (EU ) = d (FU ) =

i se creeaz o nou matrice:

d ( AC ) + d ( BC ) d ( AB) =6 2

d ( AD ) + d ( BD) d ( AB) =9 2

d ( AE ) + d ( BE ) d ( AB) = 11 2 d ( AF ) + d ( BF ) d ( AB) = 11 2
U C D E

31

C D E F

6 9 11 11

7 6 8

5 9

N= 5 Procedura se repet, pentru noua matrice de distane, pn la determinare tuturor nodurilor interne, obinndu-se succesiv arborii din figura 1.6, C, D i E. Trebuie menionat c prin aceast metod se obine un arbore nenrdcinat, care pentru o mai bun claritate poate fi afiat i sub forma unei dendrograme rectangulare.

Figura 2.6: etapele constuciei unui arbore de tip Neighbor-Joining 32

3. Ingineria genetic
Ingineria genetic reprezint totalitatea metodelor i tehnicilor prin care se acioneaz in vitro asupra genelor, cromozomilor sau celulelor cu scopul obinerii unor structuri genetice noi, posibil prestabilite. Prin faptul c se acioneaz in vitro, ingineria genetic aparine biotehnologiilor, n cadrul crora se particularizeaz prin urmtoarele domenii specifice: Tehnologia ADN-ului recombinant; Mutageneza dirijat. Hibridarea i cibridarea celular; Haploidia prin andro- i ginogenez; Variabilitatea somaclonal;

3.1.

Tehnologia ADN-ului recombinant.

Tehnologia ADN-ului recombinant presupune introducerea prin intermediul unui vector (V) a unei gene strine numit pasager (P), provenit de la o specie donor, ntr-o celul gazd (de regul procariot), celul gazd care sufer prin aceasta un proces de transformare genetic n sensul c gena este capabil s se replice i eventual s se exprime n celula gazd. Pasagerul mpreun cu vectorul formeaz ADN-ul recombinant.

3.1.1. Transformarea genetic la procariote.

Obiectivul transformrii genetice la procariote (bacterii) este clonarea sau

multiplicarea genelor, odat cu multiplicarea bacteriilor. Transformarea genetic la procariote nu este un proces integrativ. Genele transferate se multiplic, odat cu vectorul i uneori pot fi capabile s se exprime n celula gazd. Scopul clonrii poate fi foarte divers. Astfel genele multiplicate pot fi utilizate n vederea caracterizrii lor sub aspectul hrilor de restricie sau chiar sub aspectul obinerii secvenelor nucleotidice. Prin exprimarea genelor n celula gazd, n prezena unui promotor de expresie ce aparine, de regul, vectorului, se urmrete recoltarea produsului de expresie a genelor din mediul de cultur. Foarte cunoscut este obinerea pe aceast cale a insulinei umane sau a interferonului. Prin strategia antisens, ce permite blocarea exprimrii unor gene, se poate deduce care este funcia genelor respective. Strategia antisens presupune introducerea unei gene ntr-o poziie invers fa de promotor n raport cu gena endogen pe care dorim s 33

o blocm, astfel c gena introdus s fie transcris sub forma unui ARN mesager antisens, complementar ARN-ului sens produs de gena endogen. Cele dou molecule de ARN mesager fiind complementare vor forma o structur bicatenar care nu mai poate fi tradus sub forma unei proteine specifice n procesul de translaie. i nu n ultimul rnd, n contextul transformrii genetice la eucariote, o prim etap este reprezentat de izolarea i clonarea genelor ce urmeaz a fi transferate, operaiune realizat, de asemenea, prin tehnologia ANDului recombinant.

Etapele clonrii.
Etapele clonrii sunt: a. Izolarea vectorului; b. Obinerea pasagerului; c. Integrarea pasagerului n vector i obinerea ADN-ului recombinant; d. Introducerea ADN-ului recombinant n celula gazd; e. Selecia celulelor gazd ce poart pasagerul integrat n vector; f. Selecia celulelor gazd ce poart un anumit pasager; g. Clonarea propriu zis a genei odat cu multiplicarea celulelor gazd ce poart un anumit pasager sau a genei dorite. a. Izolarea vectorului. n acest context ne vom referi, mai nti, la caracteristicile generale ale vectorilor precum i la exemple de vectori. Vectorii utilizai trebuie s prezinte urmtoarele caracteristici: s fie capabili s se replice n celula gazd; greutatea molecular s nu fie prea mare (de regul n jur de 2-5 kb dar n cazul unor virui poate ajunge pn la 50 kb); s poarte marcheri genetici asociai care s permit identificarea i izolarea celulelor transformate; s poat integra specific pasagerul. Integrarea pasagerului se face la nivelul unui situs de restricie. ntr-un vector pot exista mai multe situsuri de restricie ns un anumit situs trebuie s fie, de regul, unic. Vectorii moderni poart mai multe situsuri de restricie diferite, dispuse n tandem, formaiune numit polilinker sau MCS (Multi Cloning Sites). Vectorul, dup cum s-a mai artat, poate s poarte promotori specifici celulelor gazd pentru ca genele transferate s poat fi exprimate. Ca exemple de vectori putem meniona: plasmidele, fagul , cosmidele, fagul M13 ce aparine vectorilor monocatenari, vectorii YAC (Yeast Artificial Chromosome) .a. Plasmidele ca vector de clonare. 34

Plasmidele aparin sistemului genetic citoplasmatic al procariotelor (bacteriile i algele albastre), reprezentate, de regul, de molecule de ADN bicatenare, circulare, de dimensiuni reduse (cam 0,2 pn la 4% din lungimea cromozomului bacterian), molecule ce poart gene cu funcii de adaptare. Plasmidele, n starea lor natural sunt supersucite (SC sau supercoils) i rezistente la denaturare. n contextul operaiunilor de izolare se pot rupe la nivelul unei singure catene, devenind circulare (OC sau open circles), sau se pot rupe la nivelul ambelor catene, devenind liniare (L sau linear), sensibile la denaturare. Dup cum se va vedea, aceste caracteristici sunt exploatate n protocolul de izolare a plasmidelor. Pe lng genele ce asigur procesul de conjugare ca form special a funciei reproductive sau genele ce controleaz producerea unor toxine (vibriocin, cloacin, colicin) exist gene care, n condiii obinuite de mediu nu sunt vitale, n schimb, n condiii deosebite de mediu pot asigura supravieuirea indivizilor care le poart. Astfel sunt genele ce determin rezistena la antibiotice, sau capacitatea de a metaboliza un anumit substrat, de regul nociv, cum ar fi capacitatea de a metaboliza, hidrocarburi, compuii aromatici sau chiar acidul salicilic, precum n cazul speciei Pseudomonas putida. Plasmidele se clasific n raport cu capacitatea sau incapacitatea de a realiza conjugarea precum i n raport cu numrul i dimensiunea lor. Dup primul criteriu exist plasmide conjugative i neconjugative. Plasmidele conjugative, cum ar fi plasmidele F (sau factorul de fertilitate) sau chiar plasmidele R (pentru rezistena la antibiotice), poart genele implicate n procesul de conjugare. Conjugarea reprezint un proces sexuat de unire a dou celule bacteriene, una mascul i alta femel, prin intermediul unor puni citoplasmatice, urmat de transferul unidirecional de material genetic, ce poate s aib ca i consecin recombinarea genetic. Ca gene implicate n procesul de conjugare menionm gena tra ce asigur formarea pililor (punile de legtur de natur citoplasmatic dintre celulele ce conjug), gena mob ce codific o endonucleaz ce taie plasmida la punctul de iniiere a transferului sau originea transferului oriT. Conjugarea se face, de regul, ntre indivizii aparinnd unor specii nrudite. Exist situaii n care conjugarea se poate face ntre specii relativ ndeprtate din punct de vedere sistematic. n cazul acestora plasmidele implicate n conjugare poart gene BDH (Broad Host Range) i se numesc plasmide promiscue (promiscuous plasmids). n raport cu numrul i dimensiunea lor exist dou grupe de plasmide, n funcie de mecanismul de control al replicrii (Gartland, 1993) . Replicarea plasmidelor este supus controlului unui represor al replicrii cu valoare de prag, represor codificat de o gen 35

plasmidial. Astfel exist plasmide aflate sub un control relaxat (relaxed plasmids), plasmide la care represia replicrii se realizeaz la o valoare mai ridicat a pragului, i ca atare se gsesc n numr mai mare n celul i sunt de dimensiuni mai mici. Cealalt grup, aflat sub control stringent (stringent plasmids) au o valoare mai redus a pragului la care replicarea este inhibat i deci se gsesc n numr mai mic n celule (1-2) i au dimensiuni mai mari. Din aceeai cauz, legat de valoarea de prag a represorului, ntr-o celul nu pot coexista cele dou grupe de plasmide, plasmidele aflate sub control stringent fiind eliminate. Plasmidele care nu pot coexista n aceiai celul se spune c sunt incompatibile. Din acest punct de vedere exist mai multe grupe de plasmide numite grupe de incompatibilitate (C, P,Q, W) iar plasmidele care aparin unei anumite grupe nu pot coexista n aceiai celul. Ca vectori de clonare plasmidele pot inte-gra pasageri de pn la 15 kb. n continuare vom da cteva exemple de plasmide utilizate ca vectori, de la vectorii ce in mai mult de istoria utilizrii lor ca vectori la vectorii moderni. Acetia se difereniaz n raport cu numrul situsurilor de restricie, marcherii de selecie i posibilitatea izolrii celulelor transformate cu pasageri integrai n vector, posibilitate legat, de regul, de inactivarea unui marcher n care s-a integrat pasagerul sau inactivarea de inserie (tabelul 1). Tabelul 1
Exemple de plasmide utilizate ca vectori de clonare Situsuri Marcheri de Inactivarea de Plasmida de restricie selecie inserie ColE1 pBR322 pUC 18 pGMT pJET EcoRI Mai multe n marcheri MCS n lacZ+ MCS n lacZ+ MCS ntr-o gen letal Imunitate la colicin ApR, TcR ApR ApR Gen letal Incapacitatea de a produce colicin TcS, ApR(colonii albe n prezena penicilinei i IK) lacZ-(colonii albe) lacZ-(colonii albe) Supravieuire colonii

Mai multe detalii vom da la paragraful ce se refer la izolarea celulelor gazd ce poart pasagerul integrat n vector, adic ADN-ul recombinant. O categorie de vectori plasmidiali este reprezentat de vectorii navet (Shuttle vectors). Acetia poart marcheri de selecie care permit transformarea unor organisme diferite, att procariote ct i eucariote. Un exemplu este vectorul pDBJ3 care poart marcherul pyrG util pentru selecia trans-formanilor speciei Aspergillus nidulans, n cazul n 36
+

care gazda este pyrG incapabil de a crete pe un mediu lipsit de pirimidin, i marcherul Ap , care permit selecia trans-formanilor E.coli, pe un mediu cu ampicilin, n cazul n care gazda este sensibil la ampicilin. Exist mai multe metode de izolare a plasmidelor. Una dintre metode, utilizat n mod curent (dup Birnboim i Doly, 1979), se bazeaz pe faptul c ADN-ul plasmidelor ntregi (SC) este mai rezistent la denaturare fa de cel cromozomal sau plasmidial rupt prin manipulri (OC sau L). Dup liza bacteriilor n mediu alcalin, ADN-ul cromozomal fragmentat i ADN-ul plasmidial (OC i L) se va denatura n timp ce plasmidele SC vor rmne n starea lor natural. Prin reducerea pH-ului cu acetat de potasiu ADN-ul denaturat se va renatura dezordonat, rezultnd, mpreun cu fragmentele celulare, un conglomerat care va putea fi separat prin centrifugare de plasmidele SC, care rmn n suspensie n supernatant, sau n lizatul celular limpezit. Din suspensie, ADN-ul plasmidial urmeaz a fi precipitat cu alcool i recuperat, n urma centrifugrii. Fagul ca vector de clonare. Fagul este un fag temperat ce paraziteaz bacteria E. coli, motiv pentru care se mai numete bacteriofag. El poate exista att n stare integrat n cromozomul bacteriei, n cadrul ciclului lizogenic, ct i autonom n bacterie, n cadrul ciclului litic, ciclu ce se ncheie cu liza bacteriei i formarea plajelor de liz, cu aspectul unor pete clare pe suprafaa culturii bacteriene. Genomul fagului slbatec care are 48,5 kb, este bicatenar, cu excepia capetelor care sunt monocatenare, complementare, cunoscute ca situsul cos. n cadrul genomului amintim gena A care codific o endonucleaz care taie, n dreptul situsului cos, molecula concatemer de ADN care include, n cadrul procesului de replicare, mai multe genomuri. Urmeaz genele E i D, implicate n formarea capsidei; gena cI ce codific un represor care mpiedec intrarea fagului n ciclul litic. Mai exist o zon central, ntre genele D i cI, neesenial n ciclul de multiplicare a fagului, numit zona stuffer, care poate fi nlocuit cu ADN strin, pasager. Fagul slbatec nu poate fi utilizat ca vector de clonare deoarece n cadrul genomului su exist situsuri de restricie multiple ceea ce ar conduce la fragmentarea lui n mai multe buci. De aceea, ca vectori de clonare, se utilizeaz vectori derivai de la fagul la care situsurile de restricie multiple au fost eliminate . Exist dou tipuri de vectori derivai i anume vectorii de inserie i vectorii de nlocuire.
R

37

Vectorii de inserie ( gt 10; Charon 16 A; Charon 3A) pot s integreze pasageri de pn la 7,6 kb deoarece o cantitate mai mare de ADN nu ar mai putea permite ncapsidarea. Vectorului gt 10 are un situs de restricie EcoRI n gena cI care codific represorul. Vectorul Charon 16 A are un situs de restricie EcoRI n gena lacZ care codific -galactozidaza (Old i Primrose,1994). Vectorul Charon 3A poart o mutaie amber care i permite s se replice doar pe bacterii E. coli supresoare a mutaiei amber, bacterii disponibile doar n laborator, fapt ce contribuie la un anumit nivel de protecie biologic. Vectorii de nlocuire (EMBL-3, EMBL-4, EMBL-3Sam) pot integra pasageri de pn la 23 kb, deoarece o parte din genomul virusului, i anume secvena stuffer, poate fi eliminat. n cazul vectorului EMBL-4, aceast secven este flancat, de o parte i de alta de MCS urile cu urmtoarele situsuri de restricie : EcoR I, BamH I i Sal I i deci poate fi eliminat n urma digestiei cu una din enzimele de restricie specifice unui anumit situs. Menionm faptul c secvena stuffer poart genele red i gam responsabile pentru inhibarea creterii fagului pe o bacterie gazd lizogen pentru fagul P2 deci care asigur sensibilitatea la inhibiia determinat de fagul P2 (SPI adic Sensitive to P2 inhibition). Fragmentul urmeaz a fi nlocuit cu un pasager obinut prin digestia ADN-ului de la donor cu aceiai enzim de restricie, fagul devenind SPI , adic rezistent la inhibiia determinat de fagul P2 i deci poate crete pe o bacterie lizogen cu acest fag i, n anumite condiii, pot forma plci de liz (Old i Primrose,1994). Vectorul EMBL-3 Sam poart o mutaie amber, mutaie care i permite s se dezvolte doar pe bacterii supresoare a mutaiei amber, fapt ce asigur, de asemenea, un anumit nivel de protecie biologic. Pentru izolarea ADN-ului fagic se utilizeaz ca material biologic o cultur bacterian, reprezentat de regul de E. coli, infectat cu fagi. Liza bacteriilor se realizeaz n mod natural, sau, n cazul fagilor lizogeni, liza este idus sub aciunea unui agent inductor cum ar fi radiaia UV. Separarea fagilor de restul celulelor sparte sau chiar ntregi se realizeaz prin centrifugare, fagii rmnnd n suspensie. Din suspensie fagii sunt precipitai cu poli etilen glicol (PEG) i se recupereaz prin centrifugare. Dup resuspendare proteina capsidal este eliminat prin digestie cu prteinaz K sau cu ajutorul fenolului iar ADNul este recuperat prin centrifugare, dup precipitate cu alcool sau izopropanol.
+

38

Cosmidele ca vectori de clonare. Cosmidele pot fi considerate ca vectori de nlocuire a fagului , fag de la care s-a reinut doar situsul cos. Restul ADN-ului (n jur de 5 kb) este reprezentat de ADN plasmidial, cu marcheri de selecie specifici ADN-ului plasmidial. n consecin cosmidele pot s integreze pasageri de pn la 50 kb. Deoarece lipsesc toate genele fagului, cu excepia situsului cos rezult dou consecine majore. Pe de o parte cosmidele nu vor forma niciodat plaje de liz, selecia transformanilor bazndu-se exclusiv pe marcherii plasmidiali iar pe de alt parte ADN-ul recombinant, adic cosmidele plus pasagerul, nu se poate ncapsida i deci nu poate produce infecia celulelor gazd. Din acest motiv se procedeaz la ncapsidarea in vitro care const n amestecarea ADN-ului recombinant cu dou forme mutante amber ale fagului la care s-a indus lizogenia cu radiaii UV, stare care s le permit intrarea n ciclul litic. O form are o mutaie amber n gena D responsabil de maturarea fagului, i n consecin acumuleaz precursori capsidiali codificai de gena E a mutantului, cealalt are o mutaie amber n gena E, deci nu produce precursori capsidiali dar funcia de maturare a fagului este ndeplinit de gena D normal a mutantului. Menionm faptul c mpachetarea in vitro este necesar i n cazul vectorilor de nlocuire. Alte exemple de vectori. Fagul P1 poate integra pasageri de pn la 100 kb. Vectorul PAC (P Artificial Chromosome, vector derivat de la fagul P1, de unde deriv numele) poate integra pasageri de pn la 300 kb. Vectorul BAC (Bacterial Artificial Chromosome, vector derivat de la bacterii de unde deriv numele) poate integra pasageri mai mari de 300 kb. Vectorul de clonare YAC (Yeast Artificial Chromosomes). Vectorul YAC se aseamn cu cromozomii normali ai eucariotelor, avnd un centromer (cen) ce mparte cromozomul n dou brae ce poart marcheri de selecie cum ar fi trp1, ntr-un bra i ura 3 n cellalt bra, precum i originea replicrii (ars1 sau autonomously replicating sequence), iar la capete sunt prezeni telomerii (tel),(fig.3.1). Vectorul YAC are n

Figura 3.1. Prezentarea schematic a unui vector YAC. 39

jur de 10 kb i este meninut sub form circular, ca orice plasmid. n momentul utilizrii, pentru integrarea pasagerului, este tiat n dou cu o anumit enzim de rstricie. Un astfel de vector poate integra pasageri de pn la 1 MB (1000 kb) n zona MCS. Vectorii monocatenari sunt derivai de la virusurile monocatenare (M13, f1, fd) care sunt virusuri filamentoase care infecteaz bacteriile E. coli cu pili. Vectorii au n jur de 6,5 kb i nu au limite pentru mpachetare, n ceea ce privete dimensiunea pasagerului. Acetia au utilizri speciale pentru secvenierea ADN-ului prin metoda dideoxi sau pentru mutageneza dirijat. Fagemidele au dou origini ale replicrii, una derivat de la fagul f1, i alta derivat de la plasmida bacterian ColE1, de unde i deriv i numele. Ca exemplu citm vectorul Bluescript II, vector ce poate funciona ca vector de clonare plasmidial sau ca vector monocatenar. Pe lng aceasta polilinkerul sau MCS-ul se gsete n secvena genic lacZ mrginit la cele dou capete de promotorii fagilor T3 i T7 astfel c genele pasager se pot exprima sau nu n funcie de orientarea acestora fa de un anumit promotor. Phasmidele rezult n urma inseriei unei plasmide n fagul la situsul att (lifting) pe baz de crossing over. Un astfel de vector este vectorul ZAP, foarte complex, vector ce poart secvene att de la fagul ct i de la fagii M13, T3 i T7. Pentru alegerea vectorului de clonare se ine cont de anumii factori i anume: Dimensiunea vectorului i pasagerului; Organismul ce urmeaz a fi transformat; Markerii de selecie disponibili; Metoda utilizat pentru selecia celulelor gazd ce poart un anumit pasager; Numrul de transformani dorii i eficiena transformrii; Preferina personal i experiena cercettorului.

Fiecare vector are avantajele i dezavantajele n legtur cu factorii menionai. n cazul plasmidelor, ca avantaje menionm faptul c sunt de dimensiuni mici, uor de manipulat i poart un numr mare de marcheri de selecie. Ca dezavantaje se menioneaz dimensiunea relativ redus a pasagerului (pn la 15 kb), eficiena mai redus a transformrii n cazul pasagerilor mai mari i izolarea mai dificil a recombinanilor. n cazul fagilor ca avantaje menionm dimensiunea mai mare a pasagerului (pn la 23 kb n cazul vectorilor de nlocuire), eficiena mare a infeciei celulelor utilizate n mod natural ca gazd, ncapsidarea presupune o selecie a dimensiunii pasagerului i izolarea mai 40

uoar a recombinanilor. Ca dezavantaje menionm transformarea (transfecia) mai dificil a altor organisme dect cele utilizate n mod natural ca gazd i faptul c pasagerii de dimensiuni mari sunt susceptibili la recombinri. n cazul cosmidelor ca avantaje menionm dimensiunea mai mare a pasagerului (pn la 45 kb) i faptul c mpachetarea (ncapsidarea n vitro) presupune o selecie a dimensiunii pasagerului. Ca dezavantaje menionm faptul c pasagerii de dimensiuni mari sunt susceptibili la recombinri i de asemenea este relativ dificil din punct de vedere tehnic s izolezi pasageri de dimensiuni mari. a. Obinerea pasagerului. Pasagerul poate fi obinut pe mai multe ci: prin digestia ADN-ului genomal de la donor cu enzime de restricie; prin reverstranscrierea ARN-ului mesager i obinerea cADNului; prin amplificare PCR sau prin sintez artificial.

Enzimele de restricie sunt enzime produse de plasmidele bacteriene i sunt capabile de a tia specific ADN-ul, la nivelul unor situsuri de restricie. De exemplu enzima EcoRI poate tia ADN-ul la nivelul secvenei: ntre baza azotat G i A. n acest fel vor rezulta capete adezive monocatenare 5`, de felul: Enzima de restricie PstI produs de bacteria Providencia stuarti produce capete monocatenare adezive 3`, deoarece n cadrul situsului de restricie pe care l recunate

(CTGCAG) taie monocatena 5`-3` ntre A i G. Enzima de restricie SmaI produs de bacteria Seratia marcescens produce capete bicatenare bonte, deoarece n cadrul situsului de restricie pe care l recunoate (CCCGGG) taie ambele catene ce sunt complementare ntre C i G. La fel se ntmpl i n cazul enzimei de restricie HaeIII produs de bacteria Haemophilus aegyptius care n cadrul situsului de restricie pe care l recunoate (GGCC) taie ambele catene ntre G i C. b. Integrarea pasagerului n vector i obinerea ADN-ului recombinant. Pasagerul este integrat n vector n funcie de modul de obinere a acestuia.

41

n cazul n care pasagerul este obinut cu enzime de restricie, vectorul trebuie tiat cu aceiai enzim de restricie pentru a forma i acesta capete adezive monocatenare, complementare. Ca urmare pasagerul se integreaz n vector pe baza complementaritii bazelor capetelor adezive a pasagerului i vectorului, dup care urmeaz legarea covalent a pasagerului n cadrul vectorului sub aciunea enzimei ADN ligaza (figura 3.2).

Figura 3.2: Integrarea pasagerului n vector pe baza complementaritii capetelor monocatenare adezive (dup Suzuki i colab., 1986) Dac enzima de restricie a produs capete bicatenare bonte integrarea pasagerului n vector este mult mai puin eficient i se realizeaz n prezena ADN ligazei. Pentru sporirea eficienei integrri se pot crea secundar capete monocatenare adezive complementare la pasager i vector. Acest lucru se pateu face n trei moduri: Adiionarea unor linkeri la capetele bonte cu ajutorul ADN ligazei, linkeri ce

reprezin secvene scurte de ADN sintetizate artificial ce poart un anumit situs de restricie. Dup adiionare urmeaz digestia cu enzima de restricie specific n urma creia rezult capete monocatenare adezive complementare la vector i pasager. Adiionarea unor adaptori la capetele bonte cu ajutorul ADN ligazei, adaptori

ce reprezint secvene scurte de ADN sintetizate artificial, secvene ce poart capete

42

monocatenare adezive specifice unei anumite enzime de restricie. Menionm faptul c capetele monocatenare 5` ale adaptorilor trebuie s fie defosforilate pentru a nu exista riscul s se cupleze ntre ei. Adiionarea la capetele 3` a pasagerului i vectorului a unor cozi homopolimere

complementare cu ajutorul transferazei terminale din timus de viel (Figura 3.3) .

Fig. 3.3. Adiionarea la capetele 3` a pasagerului i vectorului a unor cozi homopolimere complementare (dup Suzuki i colab.,1986) 43

Astfel de capete monocatenare se pot obine prin digestie cu enzima Pst I sau

prin digestia capetelor 5` graie funciei exonucleazice 5`-3` a ADN polimerazei. n acest caz capetele homopolimere ale pasagerului i vectorului se cupleaz pe baz de complementaritate dar mai rmn goluri care vor fi umplute cu ajutorul ADN polimerazei n prezena celor patru dezoxinucleotid trifosfat prezente n mediu. n final legarea covalent dintre pasager i vector se face n prezena AND ligazei. n cazul n care pasagerul este obinut prin reverstransciere sub form de ADNc (complementar) este posibil clonarea direcional a acestuia (Lessard et.al, dup Clarck 1997), ntr-o anumit poziie fa de promotor. Aceast situaie este deosebit de favorabil n contextul strategiei antisens. Se pleac de la ARNul mesager, ARN ce poart la captul 3`, n cazul eucariotelor, cozi poli A (figura 3.4).

Fig.3.4. Integrarea direcional a pasagerului n vector n vederea clonrii direcionale (dup Clark, 1997) 44

Mai nti se hibridiaz cozile poli A cu un primer poli T, primeri ce poart i o secven ce corespunde unui situs de restricie specific unei enzime de restricie (s spunem R1). Urmeaz sinteza unei monocatene de ADNc, plecnd de la primer, n prezena celor patru dNTPuri (dezoxi nucleotid trifosfat) i a reverstranscriptazei. Odat cu ndeprtarea catenei de ARNm sub aciunea ARNazei H ale loc sinteza celei de a doua catene complementare ADNc, n prezena ADN polimerazei I i a celor patru dNTPuri, dup modelul nick translation. Urmeaz adiionarea de adaptori n prezena ADN ligazei T4, adaptori ce poart capete monocatenare adezive specifice unei alte enzime de restricie (s spunem R2). Dup digestia cu enzima de restricie specific situsului de restricie R1, va rmne pasagerul flancat de capetele monocatenare adezive specifice pentru cele dou enzime de restricie (R1 i R2), fapt ce permite integrarea pasagerului ntr-un vector, ntr-o anumit poziie fa de promotor. Evident c, n acest scop, vectorul trebuie tiat la nivelul MCSului cu enzimele de restricie care s corespund orientrii dorite a pasagerului fa de promotor. Mulimea de pasageri integrai n cte un vector constitue n acest caz o banc de gene ADN genomal. Dac pasagerul a fost obinut prin reverstranscriere va rezulta o banc de gene ADNc. Bncile de gene se mai pot diferenia i dup felul vectorului astfel putem avea bnci de gene plasmidiale, bnci de gene YAC .a. Clonarea pasagerilor obinui prin amplificare PCR prezint cteva caracteristici. n primul rnd este vorba de clonarea unui anumit fragment amplificat i nu se mai poate vorbi de o banc de gene. Aceeai situaie este valabil i n cazul n care pasagerul a fost obinut prin sintez artificial. n al doilea rnd pasagerul poart, de regul, la captul 3` o nucleotid cu Adenin, nucleotid adugat de enzima taq polimeraza fr a exista matri la nivelul secvenei ADN de amplificat , cum s-ar spune din greeal. Alte polimeraze nu au un astfel de efect. Aceast greeal poate fi corectat prin eliminarea nucleotidei (blantare) sau poate fi exploatat prin utilizarea unor vectori T-A, la care,la captul 3` , a fost adugat o nucleotid cu Timin. n acest fel, pe baza complementaritii T-A eficiena integrrii pasagerului n vector este foarte bun. Exist kituri cu astfel de vectori cum ar fi vectorul pGMT. utilizat de Botez i colab., 2002. De menionat c produsul de amplificare trebuie utilizat proaspt, deoarece un produs mai vechi, ngheat i dezgheat de mai multe ori, poate pierde extranucleotida cu Adenin. d.Introducerea AND-ului recombinant n celula gazd se realizeaz difereniat n funcie de felul vectorului i dimensiunea pasagerului. n cazul plasmidelor, ce poart pasageri de dimensiuni relativ mici, introducerea se realizeaz printr-un proces cunoscut de 45

transformare bacterian. n cazul fagilor are loc un proces de infecie. n cazul vectorilor YAC ce poart pasageri de dimensiuni foarte mari se utilizeaz polietilenglicolul (PEG) sau se practic electroporarea. Celula gazd trebuie s fie o form mutant, lipsit de funcia de restricie (restr ), modificare (mod ) i recombinare (rec ) pentru a nu degrada, inactiva prin metilare sau rearanja prin recombinare ADNul utilizat ca pasager. Bncile de gene se conserv, de regul, dup introducerea ADNului recombinant n celula gazd. Dimensiunea bncii de gene ADN genomal, sau numrul de coloni N necesare, n cazul cnd gazda este o bacterie, pentru a avea o anumit probabilitate p ca un pasager de o anumit dimensiune x,exprimat n kb, s se regseasc n banca de gene este dat de relaia: N= ln(1 p) x ln(1 ) y
-

n care y este mrimea genomului haploid exprimat tot n kb. n cazul bncilor de gene ADN complementar, dimensiunea acestora este dat de relaia: N= ln(1 p) ln(1 n)

n care n reprezint fracia de ARNul mesager specific, ce vreau s-l clonez, fa de total ARN mesager. e. Selecia celulelor gazd ce poart pasagerul integrat n vector. Selecia celulelor gazd ce poart pasagerul integrat n vector se realizeaz graie inactivrii de inserie ce presupune inactivarea genei marcher n urma integrrii pasagerului n aceasta. Reamintim faptul c situsul de restricie sau situsurile de restricie multiple (MCSurilke) se gsesc n anumite gene marcher. Prin integrarea pasagerului marcherii se inactiveaz. n cazul vectorului plasmidial pBR322 dac integrarea pasagerului se face n gena marcher Tc
R

ce asigur rezistena la tetraciclin, celulele transformate, purttoare a

pasagerului, vor fi sensibile la tetraciclin. Pentru a putea izola aceste celule se procedeaz n felul urmtor : De la cultura mam, original, se fac dou replici a bncii de gene prin preluarea coloniilor pe o hrtie de filtru i plasarea lor pe mediu de selecie, primul mediu este cu 46

ampicilin iar al doilea mediu este cu ampicilin i tetraciclin. Pe mediu cu ampicilin vor supravieuii toate coloniile transformate, att cele transformate numai cu vector ct i cele transformat cu vector i pasager. Pe al doilea mediu vor supravieui doar coloniile transformate cu vector. Cele transformate cu vector i pasager vor pieri deoarece gena pentru rezistena la tetraciclin a fost inactivat. Pe aceast baz se revine la cultura mam i se izoleaz coloniile care au pierit pe al doilea mediu de selecie (Figura 3.5).

Figura 3.5. Clonarea n plasmide (dup Qutier i colab., 1988).

47

La fel se procedeaz i n cazul cosmidelor dac poart acelai marcher (Fig.3.6)

Figura 3.6:Clonarea n cosmide (dup Qutier i colab., 1988) Dac integrarea pasagerului s-a fcut n gena de rezisten la ampicilin, izolarea celulelor gazd transformate cu pasager integrat n vector se realizeaz pe baza unei reacii de culoare. Menionm faptul c gena de rezisten la ampicilin codific o enzim, beta lactamaza, care pe lng faptul c asigur rezistena inactivnd ampicilina, poate transforma penicilina n acid peniciloic care poate fixa iodul. Ca urmare pe un mediu de cultur cu penicilin, amidon i iodur de potasiu, coloniile transformate doar cu vectorul, deci cu gena de rezisten la ampicilin activ, vor fi albe , iodul ce ar trebui s produc culoarea albastr

48

fiind fixat de acidul peniciloic. Coloniile transformate cu pasagerul integrat n vector, deci cu gena de rezisten inactivat, vor fi albastre. Cu acestea se va merge mai departe. n cazul vectorului plasmidial pUC 18 pentru izolarea coloniilor transformate cu pasager integrat n vector se utilizeaz, de asemenea, o reacie de culoare. n acest caz MCSul pentru integrarea pasagerului se gsete n gena lacZ responsabil de producerea peptidei, ce reprezin prima parte a unei enzime ( galactozidaza) enzim care produce o reacie de culoare albastru n prezena unui anumit substrat cromogen (Xgal) i a unui agent inductor(IPTG sau Izo Propil Thio Galactozida). Celulele gazd ce urmeaz a fi transformate sunt forme mutante ce sunt capabile s produc a doua parete a enzimei (s spunem peptida). Coloniile transformate doar cu vectorul vor fi albastre, deoarece, n celula gazd, vor exista ambele pri ale enzimei i deci enzima galactozidaza va fi funcional. Coloniile transformate cu pasagerul integrat n vector vor fi albe deoarece prin integrarea pasagerului n gena lacZ aceasta a fost inactivat iar prima parte a enzimei lipsete. Deci cu coloniile albe se va merge mai departe. n cazul vectorului plasmidial pJET integrarea pasagerului se face ntr-o gen letal ce poate determina moartea celulelor gazd. Datorit inactivrii genei letale doar celulele gazd transformate cu pasagerul integrat n vector vor supravieui, i cu acestea se va merge mai departe. Un astfel de vector a fost utilizat pentru clonarea unor benzi polimorfe RAPD, presupuse a marca gene de rezisten la Phytophthora infestans, agentul patogen ce produce mana la cartof (Balazs i colab., 2010). n cazul vectorului gt10, vector de inserie derivat de la fagul , inseria pasagerului se face n gena cI, responsabil de producerea represorului ce mpiedec intrarea n ciclul litic i deci producerea unor plaje de liz . Prin itegrarea pasagerului n aceast gen nu se mai produce represor iar fagi intr n ciclul litic producnd plaje de le liz, mai ales dac celulele gazd sunt hfl (high frequency lysogeny). Cu acestea se merge mai departe. n cazul vectorului Charon16A, de asemenea vector de inserie derivat de la fagul , integrarea pasagerului se face n gena lacZ responsabil de producerea galactozidazei care, n cazul celulelor gazd E.coli mutante (lac ) i n prezena substratului cromogen Xgal, produce colonii albastre. n cazul integrrii pasagerului gena lacZ este inactivat iar coloniile vor fi albe. Cu acestea se merge mai departe. n cazul vectorului de nlocuire EMBL3 se poate face o selecie pozitiv a celulelor gazd ce poart ADN recombinant prin faptul c doar n urma nlocuirii secvenei stuffer cu
+ +

49

pasagerul, vectorul se transform din fag Spi , sensibil la inhibiia produs de fagul P2 lizogen cu celulele gazd, fag ce nu poate infecta aceste celule , n fag Spi insensibil la aceast inhibiie care va putea infecta celulele gazd. Cu acesta se merge mai departe. f. Selecia celulelor gazd ce poart pasagerul dorit se poate realiza, de regul, prin hibridare molecular sau prin metode imunologice. Exist i alte tehnici cum ar fi transposon tagging (Erik i colab., 1994), T-DNA tagging (Schulz i colab., 1994), map based cloning (chromosome walking) mpreun cu testul de complementaritate sau tehnici care se bazeaz pe exprimarea difereniat a genelor la nivelul ARNului mesager cum ar fi differential screening ( Leyser i Chang, 1996). Unele dintre aceste tehnici au fost prezentate n partea de genetic molecular. n cazul hibridrii moleculare s considerm o banc de gene a fagului , obinut cu vectorul gt10 (Fig. 3.7) . Fiecare fag poart, probabil o alt gen i formeaz cte o plaj de liz vizibil ntr-o cultur bacterian sub forma unei pete clare. Aceste plaje urmeaz a fi transferat pe o membran de nitroceluloz. Dup denaturarea ADNului se procedeaz la hibridarea molecular a acestuia cu o sond, eventual radioactiv, ce reprezint o secven ADN, de asemenea monocatenar, complementar genei pe care dorim s o izolm. Prin autoradiografie se depisteaz poziia plajei de liz ce poart gena de interes iar din cultura iniial se izoleaz aceast plaj ce poart fagii ce au integrat gena de interes. n continuare gena izolat, urmeaz a fi multiplicat, deci clonat, odat cu fagii. Se pot utiliza i sonde neradioactive sau reci cum ar fi sistemul cu digoxigenin sau biotin (Karcher,S.J., 1994). Tehnica transposon tagging pentru izolarea i clonarea genelor se bazeaz tot pe hibridarea molecular doar c n acest caz sonda utilizat este reprezentat de un transposon integrat n cadrul genei pe care urmeaz s o clonm. Transpzonii sunt elemente genetice mobile descoperite de ctre Barbara McClintock n 1946 la porumb (citat de Roberts, 1996). Transposonii au capacitatea de a-i schimba poziia n cadrul genomului, fenomen numit transpoziie. Transposonii sunt peste tot rspndii n lumea vie, att la procariote ct i la eucariote, att la plante ct i la animale. Mai mult studiai au fost transposonii de la porumb i gura leului (Antirrhinum majus) care determin, prin transpoziie, variegarea culorii boabelor sau a florilor. Exist dou categorii de elemente genetice mobile dup mecanismul lor de transpoziie: elemente genetice mobile care se transpozeaz via ADN, numii n mod curent transposoni, i elemente genetice mobile care se 50
-

transpozeaz via ARN intermediar, numii retrotranspozoni. Structural se difereniaz prin faptul c n cazul transpozonilor zona centarl ce codific transpozaza este delimitat de secvene repetitive inversate (IR) n timp ce n cazl retrotransposonilor, zona central ce codific i reverstranscriptaza este delimitat de secvene repetitive directe, neinversate (LTR). Cteva exemple de elemente genetice mobile la plante sunt date n tabelul 2.

Figura 3.7: Selecia celulelor gazd ce poart pasagerul dorit prin metoda hibridrii moleculare ntr-o banc de gtene a fagului gt10 (dup Suzuki i colab.1986) 51

Tabelul 2 Elemente genetice mobile la cteva specii de plante (dup Roberts 1996)
Specia Porumb Antirrhinum Arabidopsis Petunia Tutun Nicotiana plumbaginifolia Orez Drojdia de bere Elementul Ds/Ac En/Spm Mu (Mutator) Tam Tat 1 Tag 1 dTph 1 Tnt 1 Tto 1 Tto 2 Asemntor lui Ac dTnp 1 Tos 17 Ty Categoria Transposon Transposon Transposon Transposon Transposon Transposon Transposon Retrotransposon Retrotransposon Retrotransposon Transposon Transposon Retrotransposon Retrotransposon

n cazul elementelor DS/Ac la porumb se didting dou tipuri: tipul autonom (Ac) care se poate transpza independent i tipul neautonom disociator (Ds) sau receptor ce se poate transpoza doar n prezena elementului activator (Ac) sau reglator. Elementul (Ds) este deficient datorit unei deleii i nu poate codifica transpozaza, enzima activ n cadrul procesului de transpoziie. Tehnica transposon tagging se bazeaz pe faptul c, pe lng alte consecine care le poate avea transpoziia, n urma inseriei ntr-o nou gen aceasta se poate inactiva sau i poate modifica modul de exprimare genernd un fenomen mutaional instabil. Instabilitatea se refer la faptul c n urma exciziei din gena n care s-a inserat, pentru realizarea uneii noi transpoziii, gena i poate redobndi expresia slbatec, iniial. Clonarea genelor n acest caz este facilitat de faptul c integrarea este nsoit de schimbarea dimensiunii moleculare a genei n care se integreaz astfel c transpoziia se poate detecta prin tehnica RFLP, utiliznd ca sond transposonul sau fragmente din transposon. Evident c pentru aceasta transposonul trebuie s fie cunoscut sub aspectul secvenei nucleotidice. Metodologia de izolare i clonare a genelor prin tehnica transposon tagging presupune parcurgerea mai multor etape: a. Obinerea de mutani. Materialul de plecare ar trebui s fie reprezentat de o linie consangvinizat izogenic, purttoare a unui element genetic mobil, transpozabil, activ, material ce constitue generaia

52

M0. n cazul mutagenezei neintite (non-tageted mutagenesis), cnd se preconizeaz obinerea unor noi forme mutante ca urmare a transpoziiei ntr-o gen oarecare, plantele generaiei M0 vor produce prin autopolenizare generaia M1 care ar trebuin s conin noi inserii ale transpozonului. Expresia fenotipic a mutaiei eventual produse n urma noii transpoziii, fiind, de regul, recesiv, nu se evideniaz dect prin homozigotare n generaia M2 , n urma autopolenizrii indivizilor din generaia M1. n cazul mutagenezei intite (tageted mutagenesis), dac locusul vizat a fi clonat este reprezentat de o form mutant, mai veche, cunoscut, indivizii generaiei M0 se ncrucieaz cu un tester homozigot pentru mutaia cunoscut, rezultnd n descendena M1 heterozigot, att plante slbatece, asemntoare indivizilor generaiei M0 ct i plante mutante. Plantele mutante rezult prin inactivarea genei slbatice n urma fenomenului de transpoziie, astfel c, n heterozigot, gena mutant se poate experima. b. Analiza cosegregrii. Este vorba de cosegregarea sau linkageul fenotipului mutant cu o inserie particular a transpozonului. Acest lucru este demonstrat doar dac, n urma hibridrii moleculare a ADNului de la forma mutant i forma slbatec, cu sonda reprezentat de transposon, banda este evideniat numai n cazul hibridrii ADNului obinut de la forma mutant. Cosegregarea este confirmat i dac n urma hibridrii moleculare cu sonda transpozon a ADNului de la eventualii revertani, rezultai de la forma mutant homozigot spre forma slbatec n cazul mutagenezei intite, banda nu se evideniaz. c. Izolarea secvenelor ADN ce flancheaz transpozonul. Secvenele ADN ce flancheaz transpozonul aparin genei slbatice. Izolarea acestor secvene se poate face prin tehnbica invers PCR dup digestia ADNului de la forma mutant cu o enzim de restricie i recircularizarea fragmentelor. Pe baza secvenelor ce aparin transposonului din cadrul fragmentului se proiecteaz doi primeri orientai n sens invers. (invers PCR). Cu ajutorul acestora se va amplifica sevenele ce aparin genei slbatece ce dorim s o clonm. d. Clonarea genei slbatice. Produii de amplificare obinui, dup marcare, se vor putea utiliza ca sonde, ntr-un proces de hibridare molecular, pentru izolarea i clonarea dintr-o banc de gene obinut de la o form slbatic, a genei slbatice, ntregi. Interesant este faptul c elementele genetice mobile de la porumb, de exemplu, pot fi transferate prin transformare genetic i la alte specii, permind clonarea unor gene de interes la aceste specii. Astfel elementul DS de la porumb a fost utilizat pentru clonarea genei Cf9 de

53

la tomate ce asigur rezistena la Cladosporium fulvum (Jones i colab, 1994, citat de Roberts, 1996). Prin utilizarea elementului genetic mobil Ac de la porumb a fost clonat gena N ce controleaz rezistena tutunului la virusul mozaicului tutunului (TMV), (Whitham i colab.,1994, citat de Roberts 1996). n mod special tehnica transposon tagging se utilizeaz n cazul n care dorim s clonm o gen a crei secvene nucleotidice nu sunt cunoscute sau a crui produs de expresie nu este cunoscut. Pe aceast cale s-a putut izola genele R ce determin rezistena cartofului la Phytophthora infestans; sau gena H1 (Globodera rostochinensis). Clonarea genelor ce se bazeaz pe cartare (map based cloning sau chromosome walking) are ca punct de plecare tot hibridarea molecular, iar mpreun cu testul de complementaritate permite izolarea i clonarea genelor dispuse n cadrul unor fragmente mari de ADN. Metoda se aplic atunci cnd genomul unei specii a fost deja cartat RFLP i s-au stabilit relaii de nlnuire ntre marcherii moleculari RFLP i o anumit gen de interes, pentru care exist forme mutante pe care alela slbatec, ce dorim s o clonm, pot s le complementeze. . Nici n acest caz nu sunt necesare cunotine prliminare privind secvena nucleotidic a genei sau produsul de expresie proteic a genei. O condiie a succesului este ca n sectorul delimitat de marcherii moleculari i care include gena de interes s nu fie foarte mult ADN repetitiv, satelit i genomul s nu fie prea mare. Foarte potrivit pentru o astfel de tehnic este specia Arabidopsis thaliana. n tabelul 3 sunt date cteva realizri privind clonarea unor gene prin tehnica chromosome walking. ce determin rezistena cartofului la nematozi

54

Tabelul 3 Ralizri privind clonarea unor gene prin tehnica chromosome walking (dup Layser i Chang, 1996)
Gena Specia de plante Fenotipul mutaiei Lungimea fragmentului analizat 340 kb 250 230 400 500 kb kb kb kb

ABI3 FAD3 AXR1 ETR1 Pto ABI1 DET1 RPS2

Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis Tomate Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis

Lipsa sensibilitii fa de acidul abscisc Desturaia redus a acidului linoleic Rezistena la auxin Rezistena la etilen Rezistena la boli Lipsa sensibilitii fa de acidul abscisc Impiedecarea rspunsului la etiolare Rezistena la boli

870 kb -

Ca punct de plecare se ia n considerare marcherul RFLP cel mai apropiat de gena pe care dorim s o clonm, marcher definit de o anumit sond. Pentru nceput genomul formei slbatece este digerat parial cu o enzim de restricie, astfel ca s rezulte fragmente mari, n jur de 80 kb, fragmente ce parial se suprapun. Fragmentele sunt separate electroforetic prin tehnica PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) care permite separarea fragmentelor mari. Fragmentele recuperate din gel sunt clonate ntr-un vector YAC (Yeast Artificial Chromosome), vector care poate integra astfel de fragmente mari, rezultnd o banc de gene YAC. Din cadrul bncii de gene, prin tehnica hibridrii moleculare, utiliznd sonda ce definete marcherul molecular RFLP, se izoleaz primul fragment, fragment ce l vom nota clona YAC-A. De la aceast clon se izoleaz unul dintre capete prin tehnica invers-PCR, capt ce, dup marcare, va fi utilizat ca sond pentru izolarea din banca de gene a celui de al doilea fragment, s spunem clona YAC-B, i aa mai departe. Se consider c printre clonele izolate se gsete i gena de interes. Pentru identificarea clonei ce poart gena de interes se utilizeaz testul de complementaritate. S presupunem c dorim s izolm i s clonm gena AXR 1 , gen ce controleaz sensibilitatea plantulelor de Arabidopsis la auxin, fapt ce se traduce prin incapacitatea rdciniei embrionare de a crete pe un mediu cu auxin (Leyser ;i Chang, 1996).. Forma mutant axr 1, controleaz rezistena plantulelor la auxin fapt ce se traduce prin creterea normal a rdciniei embrionare pe un mediu cu auxin. Explante de la forma mutant urmeaz a fi transformate cu diferitele clone. Se consider c acea clon, care,

55

n urma transformrii, restaureaz fenotipul slbatic, de sensibilitate la auxin, poart de interes, n cazul nostru gena de sensibilitate la auxin.

gena

n cazul metodelor imunologice, aplicate de regul la bncile de gene plasmidiale, indivizii ce poart gena de interes se depisteaz, la nivelul unei replici a bncii de gene, pe baza produsului de expresie proteic a genei cu ajutorul anticorpilor specifici. Anticorpii, la rndul lor pot s fie cuplai cu o enzim ce va determina o reacie de culoare sau de chemiluminiscen n prezena unui anumit substrat. Dac anticorpii sunt radioactivi, produsul de expresie proteic a genei se identific prin autoradiografie. Pe baza unei astfel de analize se revine la banca de gene mam, de la care s-a obinut replica, i se izoleaz colonia identificat ca purttoare a genei de interes, gen a crui produs de expresie proteic a fost identificat cu ajutorul anticorpilor. Tehnici care se bazeaz pe exprimarea difereniat a genelor la nivelul ARN-ului mesager- differential screening. n cazul metodelor imunologice selecia celulelor gazd care poart pasagerul dorit s-a bazat pe identificarea produsului de expresie proteic a genei la nivelul translaiei sau la nivelul expresiei finale a genei. n cazul tehnicii differential screening aceast selecie se bazea pe identificarea produsului de expresie a genei, la nivelul transcripiei sau expresia intermediar a genei. Tehnica este o variant a metodelor de hibridare molecular (Old and Primrose, 1994), (Fig. 3.8).

Figura 3.8.Differentrial screening (dup Old i Primrose,1994). 56

S considerm dou surse de ARNm, sursa A i B. S presupunem ca la sursa A (+) se exprim o gen care nu se exprim la sursa B(-). De la cele dou surse se izoleaz ARNul total, se purific ARNul mesager prin cromatografie de afinitate utiliznd coloane de granule de celuloz mbrcate n poli T i se obine prin reverstranscriere, de la cele dou surse, ADNc. De la sursa A(+), mam, se obine o banc de gene ADNc de la care se preiau pe hrtie de filtru dou replici. De la fiecare surs se obin sonde ADNc marcate cu izotopul
32

P.

Cele dou replici se hibrideaz molecular cu sondele provenite de la fiecare surs. Prin autoradiografie se identific clonele (coloniile) care au dat semnal n urma hibridrii cu sondele de la sursa A(+) i nu au dat semnal n urma hibridrii cu sondele de la sursa B(-). Coloniile respective se recupereaz din cultura mam, colonii ce poart gena ce s-a exprimat difereniat la sursa A(+) i nu s-a exprimat la sursa B(-). Cu acestea se merge mai departe. g. Clonarea propriu zis a genei odat cu multiplicarea celulelor gazd ce poart un anumit pasager sau, cu alte cuvinte, clonarea genei dorite. Cu coloniile ce poart gena dorit se merge mai departe adic se multiplic pe mediu de cultur. Prin aceast multiplicare se multiplic i gena dorit adic se cloneaz. Caracterizarea secvenelor ADN clonate (sau a genelor clonate). n cadrul unei secvene ADN clonate, purttoare a unei gene dorite (vezi paragraful e), gena poate ocupa o anumit poziie. Exist mai multe metode pentru localizarea genei n cadrul secvenei de ADN clonate, una dintre ele fiind Chromosome walking (Foster and Twell, editori, 1996). De asemenea exist metode pentru analiza regiunilor regulatoare ale genei, a capetelor genei sau a secvenelor intronice (Gartland, 1993). Prezentarea acestor aspecte, de mare finee, nu face obiectul prezentului subcapitol. n acest subcapitol ne vom referi doar la caracterizarea secvenelor clonate prin ntocmirea hrilor de restricie i secveniera sau stabilirea succesiunii nucleotidelor n cadrul secvenelor clonate.

ntocmirea hrilor de restricie a secvenelor ADN clonate.

ntocmirea hrilor de restricie presupune stabilirea situsurilor de restricie n cadrul secvenei clonate, situsuri specifice pentru diferite enzime de restricie. Cea mai simpl metod pentru ntocmirea unei hri de restricie este metoda dublei digestii. Metoda se bazeaz pe digestia secvenei clonate cu dou enzime de restricie. Mai nti secvena este digerat, s spunem, cu enzima 1 iar produii de digestie, dup separare prin 57

electroforez i recuperare din gelul de agaroz, sunt digerai cu enzima 2. Tot aa secvena este digerat cu enzima 2 iar produii de digestie, dup separare prin electroforez i recuperare din gelul de agaroz, sunt digerai cu enzima 1. Cel de al doilea set de fragmente sunt separate prin electroforez, dimensiunea tuturor fragmentelor determinndu-se prin comparaie cu un ladder sau marcher molecular ce are mai multe fragmente de ADN de dimensiuni cunoscute, separate, de asemenea, prin electroforez. Trebuie s realizm faptul c fragmentele obinute n urma primei digestii cu enzima 1 poart la capetele fragmentelor obinute situsuri de restricie specifice pentru enzima 1, fragmente pentru care, n urma celei de a doua digestii cu enzima 2, se obin al doilea set de fragmente ce poart la capete situsuri de restricie pentru enzima 2. La fel se ntmpl i atunci cnd prima digestie se face cu enzima 2 i a doua digestie se face cu enzima 1. Analiza i ntocmirea hrii de restricie pentru cele dou enzime de restricie const n compararea dimensiunii fragmentelor obinute. S presupunem c n urma primei digestii a secvenei analizate cu enzima 1 am obinut fragmentele A de 4000 pb i B de 1000 pb. De la fragmentul A recuperat s-au obinut prin digestie cu enzima 2 dou fragmente de 500 i 3500 pb iar de la fragmentul B s-au obinut dou fragmente de 400 i 1000 pb. Pe de alt parte n urma primei digestii a secvenei analizate cu enzima 2 am obinut fragmentul C de 4100 pb de la care n urma digestiei cu enzima 1 s-au obinut dou fragmente de 600 i 3500 pb. Pe baza comparrii dimensiunii fragmentelor obinute i a faptului c la capetele fiecrui fragment obinut cu o enzim de restricie se gsete situsul specific enzimei respective vom avea situaia din fig. 3.9. Procedeul poate continua i cu alte enzime de restricie.

Figura 3.9. Harta situsurilor de restricie obinut n urma dublei digestii. Dimensiunea fragmentelor de restricie se exprim n pb.

58

3.2.

Secvenierea ADNului.

Secvenierea ne ofer informaii precise privind succesiunea nucleotidelor n cadrul moleculei de ADN. La ora actual exist mai multe metode de secveniere clasificate n funcie de momentul apariiei lor n metode clasice i metode de generaia a doua (next generation). Din prima categorie fac parte metoda chimic a lui Maxam i Gilbert i metoda enzimatic sau metoda dideoxy a lui Sanger care vor fi prezentate succint n cele ce urmez. Metoda chimic ine mai mult de istoria secvenierii deoarece este relativ greoaie i nu se preteaz la automatizri. n prezent este utilizat metoda dideoxy cu multiplele ei variante dintre care electroforeza de capilaritate este cea mai uzual deoarece se preteaz la automatizare. Metoda chimic utilizeaz chimicale pentru a rupe molecula de ADN n dreptul anumitor nucleotide. Dup marcarea capetelor 5` cu (este fcut monocatenar) i se mparte n patru mostre. Fiecare din cele patru mostre este tratat chimic (cu piperidin) pentru a produce rupturi la nivelul unor nucleotide cu baze specifice, care sunt deasemenea modificate n prealabil chimic ntr-un anumit fel. Condiiile sunt astfel reglate ca rupturile s nu se produc la toate nucleotidele din fragment astfel c se obin populaii de fragmente de dimensiuni diferite pentru fiecare mostr, unele marcate la captul 5` . Fragmentele sunt separate prin electroforez i sunt identificate prin autoradiografie. Menionm faptul c, n funcie de pretratamentul aplicat, rupturile la cele patru mostre se produc n dreptul unei anumite baze, astfel la o mostr ruptura se produce n dreptul guaninei (G) , la alta n dreptul adeninei sau guaninei (A+G), la alta n dreptul citozinei sau timinei (C+T) iar la alta
Fig. 3.10: Autoradiograma obinut de la cele patru mostre rezultate de la bucata de ADN analizat n vederea stabilirii secvenei nucleotidice prin metoda chimic
32

P, ADN-ul de secveniat se denatureaz

59

n dreptul timinei (T). Pe autoradiografie citirea se face de la fragmentele cele mai mici de la captul 5` a bucii de ADN analizat spre fragmentele de dimensiuni mai mari dinspre captul 3`, du cum se poate vedea n fig.10. Dac banda este prezent , de exemplu, att la mostra G ct i la mostra G+A nseamn s considerm c este secvena G iar dac banda este prezent doar la mostra G+A i nu este prezent la mostra G, considerm c este secvena A. La fel se raioneaz i n cadzul mostrelor C+T i T. Aa dar bucata de ADN analizat prezint urmtoarea secven: 5` CAGCCGACCTTGAG 3` Metoda dideoxi sau metoda enzimatic. n cazul metodei dideoxi ADN-ul ce dorim s-l secveniem este de regul subclonat ntr-un vector capabil s produc ADN monocatenar. Vectorul poart, de asemenea, un sit de fixare a primerului de secveniere pentru sinteza celei de a doua catene. ADNul monocatenar se mparte n patru mostre. n mediul de reacie, alturi de enzima ADN polimeraza i cele patru dNTPuri se afl nucleotide modificate i anume 2`3` dideoxinucleotid trifosfat cu baze azotate specifice pentru fiecare mostr. Lipsind grupul OH i la carbonul 3`, atunci cnd o astfel de nucleotid este primit pe baz de complementaritate n catena n curs de sintez, sinteza este blocat, neputndu-se realiza legturile urmare monofosfodiester alturate. cte rezult ntre Ca o dou nucleotide

populaie de fragmente , de lungimi variabile, nou sintetizate. Pentru fiecare mostr blocarea sintezei fcndu-se specific n raport cu felul nucleotidei modificate adugate. Fragmentele pot fi marcate radioactive fie prin utilizarea unui primer marcat sau a unui dNTP marcat, eventual radioactiv. Fragmentele pot fi separate prin electroforez i identificate, n cazul nostru, prin autoradiografie. Pe autoradiografie citirea se face de la fragmentele cele mai mici de la captul 5` a bucii de ADN analizat spre fragmentele de dimensiuni mai mari dinspre captul 3`, dup cum se poate vedea n fig. 2.11.
Fig. 3.11: Autoradiograma obinut de la cele patru mostre rezultate de la bucata de ADN analizat n vederea stabilirii secvenei nucleotidice prin metoda dideoxi

60

n urma analizei autoradiogramei secvena nucleotidic a bucii de ADN analizate (de fapt a catenei nou sintetizate) este urmtoarea: 5`GGTCCAGACTTCGA 3` Metoda dideoxi a cunoscut o rspndire rapid odat cu dezvoltarea tehnologiei electroforezei n capilaritate, care este o variant tehnic a electroforezei clasice cu deosebirea c migrarea probelor se face printr-un tub capilar, n ordinea mrimii lor (Fig 2.12 Fragmentele de ADN marcate florescent sunt detectate de ctre un senzor optic n urma excitrii flourocromului cu o lumin laser. Metoda face posibil automatizarea procesului precum i multiplexarea celor patru reacii diferite caracteristice metodei dideoxi ntr-un singur amestec de reacie care conine toate cele patru nucleotide dideoxi, marcate fluorescent diferit, precum i migrarea ntr-un singur canal de migrare pentru toate nucleotidele simultan, marind astfel foarte mult viteza de lucru dar i acurateea analizei. Fragmentele de ADN rezultate n urma replicrii ADN-ului n prezena celor patru nucleotide modificate (dideoxi), fiecare fiind marcat cu un fluorocrom diferit, migreaz prin tubul capilar spre anod. n drumul lor fragmentele sunt citite de un detector, fiecrei nucleotide dideoxi corespunzndu-i o culoare. Datele sunt nregistrate de un computer i sunt afiate sub forma unei cromatograme (Fig.2.13).

capilar senzor

laser

catod
tampon tampon

anod computer

sursa proba

destinaie proba

Figura 3.12: Cromatograma unui fragment de AND obinut n urma migrrii electroforetice n capilaritate.

Figura 3.13: Prezentarea schematic a echipamentului pentru electroforeza de capilaritate destinat secvenierii AND-ului.

61

3.3.

Mutageneza dirijat.

Mutageneza dirijat, ca domeniu specific ingineriei genetice, se realizeaz in vitro i presupune modificarea direct a unei anumite gene, izolate i clonate n prealabil i ca atare mutageneza dirijat reprezint o aplicaie a tehnologiei ADNului recombinant. Termenul de mutagenez n vitro utilizat de unii autori n loc de mutagenez dirijat considerm c nu este potrivit. n cazul mutagenezei clasice se poate aciona n vitro cu ageni mutageni asupra plantulelor n ntregime sau asupra unor organe sau esuturi, mutaia putnd s se produc randomizat, la nivelul oricrei gene i deci nu poate fi considerat ca aparinnd ingineriei genetice.. Mutageneza dirijat poate viza ingineria genetic a proteinelor prin obinerea deliberat a unor structuri genetice noi, posibil prestabilite, sau poate viza analiza secvenelor regulatoare ale exprimrii genelor. Se cunosc mai multe metode de mutagenez dirijat dintre care vom prezenta cteva: a. Mutageneza n caset; b. Mutageneza chimic; c. Mutageneza prin sinteza unor oligonucleotide modificate; d. Metoda deleiilor cuibrite; e. Mutageneza cu ajutorul tehnicii PCR; f. Mutageneza aleatorie la nivelul unei gene; g. Mutageneza prin supresia mutaiilor amber. n continuare le vom prezenta pe scurt pe fiecare. a.Mutageneza n caset presupune nlocuirea unei secvene de ADN din interiorul unei gene cu o secven oligonucleotidic sintetizat artificial. Metoda dei este simpl are o utilizare limitat deoarece trebuie s existe situsuri de restricie care s flancheze secvena ce trebuie nlocuit cu secvena sintetizat artificial. b. Mutageneza chimic presupune obinerea unor mutaii de substituie pe cale chimic. Secvena int trebuie s fie integrat ntr-un vector bicatenar (Fig.14). Dup scindarea intei cu o enzim de restricie (de exemplu HaeIII) urmeaz digestia unei monocatene pe direcia 5`-3`, graie funciei exonucleazice a enzimei ADN polimeraza I,

62

i n prezena unui dNTP (de exemplu Dezoxi Timidin Trifosfat). n aceste condiii digestia se oprete n momentul n care enzima a ntlnit nucleotida cu Timin.. Urmeaz inducerea substituiei care se poate realiza pe dou ci: Utilizarea bisulfitului de sodiu care poate

transforma prin dezaminare Citozina n Uracil. n acest caz, n continuare, n prezena celor patru dNTPuri i a enzimei Klenow (o fraciune a ADN polimerazei I , lipsit de funcia cu exonucleazic) rezultnd Uracilul se tranziia, va adic mperechea Adenina

substituia perechii iniiale C-G n perechea T-A. Utilizarea unor analogi ai bazelor azotate care nu au aceiai specificitate de mperechere ca bazele azotate normale. De exemplu N 4 Hidroxicitozina este un analog al Timinei dar se poate mperechea i cu Guanina. n acest caz va rezulta o tranziie prin nlocuirea perechi A-T cu pereche G-C. c. Mutageneza prin sinteza unor oligonucleotide modificate. n acest caz gena int trebuie clonat ntr-un vector monocatenar (Fig.15). Se procedeaz la sinteza artificial a unei secvene oligonucleotidice (pn la 20 pb) de la captul 5` a genei, iar n procesul de sintez se introduce o modificare anume (o mutaie). n condiii speciale (temperatur mai sczut i concentraie mare de sare) secvena oligonucleotidic se va hibrida cu gena slbatec i va funciona ca primer n procesul de extensie (replicare) a genei ntregi i chiar a vectorului. n acest fel mutaia va fi integrat n gena replicat. n consecin gena bicatenar va fi format dintr-o caten slbatec i una
Fig. 3.14: Autoradiograma obinut de la cele patru mostre rezultate de la bucata de ADN analizat n vederea stabilirii secvenei nucleotidice prin metoda chimic

63

mutant. urma transfeciei unor bacterii gazd de E.coli acestea vor segrega, rezultnd bacterii cu gena slbatec i bacterii cu gena mutant. De regul frecvena mutantelor este foarte sczut i datorit sistemului de reparare genetic. Exist mai multe procedee pentru a spori frecvena formelor mutante.

Figura 3.15. Mutageneza prin sinteza unor oligonucleotide modificate (dup Suzuki i colab., 1986). Una dintre ele este metoda Kunkel. n acest caz vectorul monocatenar (fagul M13) este crescut pe o gazd mutant dut (deficient n enzima dUTPhosphataza) i ung (deficient n enzima uracil glicozilaza) ce permite ncorporarea n molecula de ADN a nucleotidei dUTP n loc de dTTP. n consecin fagul va conine, n mai multe puncte, uracil n loc de timin, i ca atare nu va putea crete pe gazda slbatec ung . n condiiile n care extensia primerului se face n prezena nucleotidei dTTP va rezulta un heteroduplex avnd o caten, ce poart alela slbatec, cu uracil i o caten, ce poart gena mutant, cu Timin. n urma transfeciei ntr-o gazd E.coli ung vor rezulta numai descendene mutante.
+ + -

64

O alt metod se bazeaz pe selecia in vitro a formelor mutante.Pentru aceasta se utilizeaz incapacitatea unor enzime de restricie (Ava I, Pst I, Nci I) de a tia catena de ADN fosforotioat, caten n care una din nucleotide, de exemplu dCTP, este nlocuit cu o nucleotid fosforotioat, adic oxigenul de la un radical fosforic este nlocuit cu sulf astfel c nucleotida va fi dCTPS. Dac extensia primerului se face n prezena dCTPS va rezulta un heteroduplex, o caten, ce poart secvena slbatec, va fi normal, iar cealalt caten va finfosforotioat. Dac heteroduplexul va fi tratat in vitro cu enzima Nci I aceasta va tia numai catena normal care va fi digerat, mai apoi, cu o exonucleaz. n aceste condiii, dup transfecie, vor rezulta numai forme mutante. d. Metoda deleiilor cuibrite (dup Gartland, 1993). Metoda deleiilor cuibrite este utilizat pentru analiza secvenelor reglatoare ale exprimrii genelor. Obinerea deleiilor se poate realiza cu ajutorul unor nucleaze cum ar fi Bal 31, exonucleaza III sau ADNaza I. Secvena int, integrat ntr-un vector bicatenar, reprezentat de promotor i o gen reporter, trebuie s fie flancat de dou situsuri de restricie pentru dou enzime de restricie, s spunem enzimele 1 i 2. Prin iducerea unor deleii progresive la nivelul intei, deleii numite cuibrite, se poate intui zonele cu funcie reglatorie. Metoda se bazeaz exonucleazice. pe posibilitatea Bal att 31 pe realizrii unui control atent al activitii Enzima are activitate exonucleazic, mdirecia 5`-3` ct i pe direcia 3`-5`. Cu una dintre enzimele de restricie, s spunem enzima 1, se taie molecula circular de ADN, molecula ajungn s fie linear (Fig. 2.16). Molecula liniarizat este supus aciuni enzimei Bal 31 diferite perioade de timp, rezultnd deleii din ce n ce mai mari. Cu cea de a doua enzim de restricie se recupereaz secvena int trunchiat, 65 Figura 3.16. Metoda deleiilor cuibrite cu ajutorul enzimei Bal 31 (dup Gartland, 1993)

secven ce poart deleii din ce n ce mai mari. Secvenele int trunchiate sunt reclonate i se analizeaz exprimarea genei reporter. e. Mutageneza cu ajutorul tehnicii PCR. Mutageneza cu ajutorul tehnicii PCR se bazeaz pe faptul c primerul, suport, spre captul 5` nepotriviri destul de mari fa de gena pe care o amplificm, nepotriviri ce sunt incluse n gena amplificat, rezultnd o gen mutant.. Higuchi (1988) a propus un protocol care permite realizarea de mutaii prin tehnica PCR n interiorul genei int. f. Mutageneza aleatorie. Mutageneza aleatorie permite modificarea unor secvene de ADN randomizat, n puncte diferite, ca urmare a ncorporrii greite a unor nucleotide necomplementare. Aceast ncorporare poate fi produs de unele polimeraze cum ar fi reverstranscriptaza AMV (Avian Myeloblastosis Virus), n codiiile n care lipsete una dintre nucleotidele dNTP. Ca urmare poate rezulta o mare diversitate de proteine codificate de diferitele forme mutante. g. Mutageneza prin supresia mutaiilor amber. Mutaia amber se datoreaz apariiei unui codon nonsens sau stop (UAG) n cadrul mesajului genetic ce corespunde unei gene, codon ce determin terminarea sintezei proteice la acest nivel i deci producerea unei proteine incomplete. Exist unele bacterii gazd capabile de a supresa mutaia amber prin producerea unui ARNt ce poate totui integra un anumit aminoacid n dreptul codonului stop i deci sinteza proteinei poate continua dei va fi o protein mutant. Prin una dintre metodele deja menionate se introduce o mutaie amber n gena int, la locul dorit. Dup ce gena este clonat ntr-un vector , este introdus n diferite tulpini supresoare ce pot insera, n dreptul codonului stop, aminoacizi diferii. Ca urmare n urma unei singure mutaii induse pot rezulta proteine diferite. n continuare vom prezenta cteva exemple privind ingineria genetic a proteinelor prin mutagenez dirijat. Astfel, n cazul fagului T4, prin nlocuirea aminoacidului isoleucina din poziia 3 a lizozimului cu aminoacidul cisteina a crescut semnificativ tolerana enzimei la temperaturi ridicate. n cazul bacteriei E.coli, transformat genetic pentru a produce interferon, activitatea acestuia a fost amplificat de cca 100 ori prin nlocuirea cisteinei din poziia 17 cu serina. 66

n cazul omului enzima -1-antitripsina inhib o alt enzim, neutrofil elastaza , prezent la fumtori n cantiti mari fiind implicat n producerea emfizemului. Din pcate 1-antitripsina este inactivat prin oxidarea metioninei din poziia 358. Prin nlocuirea metioninei cu valina -1-antitripsina a devenit rezistent la oxidare, fiind mai eficient mpotriva neutrofil elastazei.

3.4.

Transformarea genetic la eucariote.

Obiectivul transformrii genetice la eucariote este regenerarea plantelor transgenice, capabile s exprime gena transferat. Transformarea genetic la eucariote, sau transgeneza, este un proces integrativ deoarece pentru exprimarea stabil a genei transferate, gen aparinnd unor specii nenrudite, gena trebuie s se integreze n materialul genetic al gazdei. Plantele transgenice astfel obinute se mai numesc i organisme modificate genetic sau OMGuri. Spre deosebire de transgenez, termenul de cisgenez se refer tot la transferul unor gene, prin aceeai tehnologie, ns ntre specii nrudite (Jacobsen, 2008).. Dup modul de introducere a ADNului n celula gazd exist dou grupe de metode de transformare genetic: transformare genetic prin metode indirecte i transformare genetic prin metode directe.

3.4.1. Transformarea genetic prin metode indirecte.

n cazul metodelor indirecte ADN-ul este introdus prin intermediul unui agent natural de transfer cum ar fi bacteria Agrobacterium tumefaciens , o bacterie gram negativ prezent n sol i care produce, de regul la dicotiledonate, cancerul bacterian, sau Agrobacterium rhizogenes, ce produce rdcinile filiforme (hairy roots). Producerea cancerului bacterian reprezint un proces natural de transformare genetic indus, n cazul lui Agrobacterium tumefaciens, de plasmidele Ti (tumor inducing), (Fig. 2.17).

Figura 3.17. Reprezentarea schematic a unei plasmide Ti slbatec

67

Plasmidele Ti sunt de dimensiuni mari (cca 250 kb), poart originea replicrii, genele vir de virulen, genele responsabile de asimilarea opinelor, substane analoage a aminoacizilor, cum ar fi octopina, nopalina, agrocinopina .a., ce pot fi utilizate doar de ctre Agrobacterium ca surs de azot i carbon, i secvena ADNt (de transfer). Secvena ADNt este delimitat de dou secvene ADN repetitive directe de cca. 25 pb, notate L (left border) i R (right border). n interior se gsesc gene responsabile de sinteza regulatorilor de cretere (auxine, citochinine) ce induc tumorogenitatea, i gene responsabile de sinteza opinelor. Pentru inducia tumoral bacteria are un chemotropism pozitiv fiind sensibil la fenolii produi de esuturile vegetale rnite cum ar fi acetosiringonul (Fig.2.18).

Figura 3.18: Prezentarea schematic a procesului de inducie tumoral Mecanismul inducerii tumorale precum i mecanismul integrrii stabile a transgenelor n genomul plantei gazd, destul de complexe, sunt bine nelese i explicate (Binns, 1988;Tinland, 1996; Pcurar i colab.2011). n urma activrii genelor vir de ctre acetosiringon doar secvena ADNt este transferat n nucleul celulelor gazd, celule care sufer prin aceasta un proces de transformare genetic ce se manifest, datorit exprimrii genelor responsabile de supra producia de hormoni, prin formarea tumorilor. n procesul de transformare genetic prin metode indirecte se folosete acest mecanism natural cu precizarea faptului c genele 68

responsabile de inducia tumorii sunt nlocuite cu gene utile i markeri genetici utilizai pentru identificarea i izolarea celulelor transformate. Procesul de nlocuire este destul de complex i se finalizeaz prin obinerea a dou tipuri de vectori, vectori co-integrai i vectori binari, utilizabili pentru transformarea celulelor plantelor superioare ( Walkerpeach i Velten, 1994). n cazul vectorilor co-integrai construcia genetic purtat de secvena ADNt ( ce poart marcheri i genele utile) se gsete n poziie cis cu genele vir, pe aceiai plasmid. Acest tip de vectori, n prezent, nu se mai folosesc deoarece sunt de dimensiuni relativ mari i deci sunt mai fragili. n cazul vectorilor binari, utilizai n prezent, construcia genetic purtat de secvena ADNt se gsete pe o plasmid iar genele vir se gsesc pe alt plasmid, dezarmat. n acest caz cele dou plasmide fiind de dimensiuni mai reduse sunt mai puin fragile iar genele vir vor aciona n poziie trans pentru transferul construciei genetice purtate de secvena ADNt n celulele plantelor superioare. Manipularea secvenei ADNt, cu introducerea markerilor i genelor utile se face dup subclonarea acesteia ntr-o plasmid purtat de bacteria E.coli, rezultnd construcia genetic dorit. Aceasta va putea fi introdus n Agrobacterium n cadrul unui proces de conjugare, prin hibridare triparental (Old i Primrose, 1994). Un printe este reprezentat de bacteria E.coli cu construcia genetic, al doilea printe este reprezentat de gazda final, Agrobacterium purttoare a genelor BDH (Broud Host Range) iar al treilea printe este reprezentat de o bacterie E.coli helper, purttoare a unei plasmide cu genele care asigur conjugarea. Introducerea construciei genetice n gazda final se poate face i n mod direct, prin electroporare. Bacteria Agrobacterium purttoare a genelor dorite n cadrul vectorului va fi utilizat pentru transformarea celulelor gazd a plantelor superioare. Pentru transformare se utilizeaz, de regul, explante reprezentate de poriuni de frunz (leaf disc transformation), ax hipocotil sau alte explante sterile. Mai rar se utilizeaz protoplaste (celule nude fr perete celular) sau n cazul unor plane cu semine foarte mici cum ar fi Arabidopsis sau Tabacum, se pot utiliza chiar semine. Protocolul de transformare a unor explante de frunz, de pild la salat, ar putea include urmtoarele operaiuni: Seminele sunt germinate n condiii sterile; Frunzele cotiledonare se detaeaz mpreun cu peiolul, se taie apexul i se rnesc cu bisturiul, pe partea inferioar; Se face infecia prin inocularea explantului ntr-o suspensie de Agrobacterium purttoare a unui vector binar;

69

Cocultivarea bacterei cu explantul pe un mediu calogen (generator de calus), 2-3 zile,timp n care se realizeaz transformarea.

Transferul explantelor pe un mediu de selecie cu kanamicin, dac markerul de selecie asigur rezistena la kanamicin, mpreun cu un antibiotic (carbenicilin) pentru omorrea bacteriilor care i-au fcut treaba.

Pasarea explantului pe un mediu de selecie caulogen (pentru inducerea lstririi), operaiune ce se poate repeta la dou sptmni pn la formarea lstarilor;

Pasarea pe un mediu de selecie de nrdcinare.

n final trebuie fcut confirmarea transformrii prin teste histochimice, moleculare sau imunologice. Testele histochimice pot pune n eviden, dup cteva ore, reuita transformrii tranzitorii, nainte de integrarea ADNului strin n genomul celulei vegetale. n cazul marcherului GUS-int, datorat prezenei genei uidA cu introni, n cazul reuitei transformrii apare culoarea albastr n prezena substratului cromogen X-Gluc (5-bromo 4cloro 3- indolil glucuronida) sau esutul devine fluorescent n cazul substratului fluorogenic H Mu Gluc (Metil Umbeliferon Glucuronida). Intronii au rostul de a elimina semnalele fals pozitive datorate bacteriilor, deoarece gena cu introni nu se poate exprima dect n celulele plantelor superioare. Din pcate esutul analizat nu mai poate fi utilizat deoarece n urma protocolului pentru testul histochimic nu mai este viu. Dac se utilizeaz marcherul GFP (Green Floorescent Protein) esutul transformat poate fi utilizat n continuare (Pang i colab, 1996; Selvaraj i colab., 2010).. Analizele moleculare se refer la tehnica PCR, Southern Blotting sau testele imunologice. n cazul tehnicii PCR dac, n urma utilizrii unor primeri specifici unuia dintre marcheri sau chiar a genei utile transferate, apar produi de amplificare, se confirm succesul transformrii. La fel n cazul tehnicii Southern blotting, se confirm reuita transformrii dac prin utilizarea unor sonde specifice apar semnale pozitive. n aceste cazuri ns nu avem i garania exprimrii genelor. n cazul metodelor imunologice, dac se utilizeaz anticorpi specifici produsului de expresie a genelor utile transferate, putem avea i garania exprimrii genelor. Transformarea genetic prin metode indirecte, mediat de Agrobacterium, n cazul monocotiledonatelor este, ns, ineficient din mai multe motive. n primul rnd 70

monocotiledonatele

nu

sunt

gazde

naturale

pentru

Agrobacterium.

cazul

monocotiledonatelor lipsesc inductorii cum ar fi acetosiringonul (prezent n cazul dicotiledonatelor). De asemenea exist ageni inhibitori ai bacteriei (DMBOA). Rspunsul la rnire este diferit n sensul c, de regul, nu se formeaz calus ca n cazul dicotiledonatelor, esut nedifereniat apt pentru transformare ci se produce lignificarea zonei rnite, celulele devenind inapte pentru transformare. De asemenea la monocotiledonate repararea genetic, ce presupune eliminarea ADN-ului strin i implicit a genelor transferate, este mult mai activ iar regenerarea plantelor, din celulele eventual transformate, este mai dificil. n condiii speciale, exist totui posibilitatea transformrii genetice mediate de Agrobacterium i la unele specii monocotiledonate. Aceste condiii se refer la utilizarea n mediu de cultur a agentului inductor; utilizarea unor tulpini hipervirulente de Agrobacterium cum ar fi tulpina purttoare a plasmidului pBO542 i pTOK47 (Jin i colab.,1987); precultura explantelor pe un mediu calogen naintea inoculrii; utilizarea petru transformare a unor varieti lipsite de agent inhibitor. Dei exist unele dovezi privind transformarea genetic mediat de Agrobacterium la unele specii sau genuri de plante monocotiledonate cum ar fi Asparagus officinalis, Narcisus, Chlorophytum, Dioscorea bulbifera (Schafer i colab., 1987; Old i Primrose,1994) rezultatele la plantele de cultur monocotiledonate au fost obinute mai ales prin utilizarea metodelor directe de transformare.

3.4.2. Transformarea genetic de tip SID (Site Directed Integration)

n cazul transformrii genetice prin metode indirecte, mediate de ctre Agrobacterium, integrarea ADNului- t (T-DNA) i deci a transgenelor n ADN-ul plantei gazd se face randomizat. La fel se nmpl i n cazul metodelor directe de transformare, inclusiv la animale. Pe acest model de integrare se bazeaz i posibilitatea izolrii i clonrii unor gene prin tehnica T-DNA tagging (Sculz i colab., 1995), oarecum asemntoare cu tehnica transposon tagging. Din pcate acest mod de integrare este i cauza instabilitii exprimrii primare a transgenelor (n T0) sau secundare (n descendenele T1 sau T2). Integrarea precis a unei transgene ntr-un loc genomic predeterminat poate reduce mult variaia n expresia transgenelor ( Fukushige i Sauer, 1992; Day i colab.,2000). Acest lucru se poate realiza prin utilizarea sistemului de recombinare specific unui site,cu ar fi cre/lox de la fagul P1, sau FLP/FRT de la drojdie (Ow,2002). Strategia implic dou runde de transformare. n prima rund un locus int, cum ar fi locusul lox de la fagul P1 este intordus randomizat n genomul plantei (Albert i colab.1995. n a doua rund construcia genetic nou (gena dorit purtat de vectorul de schimb) este integrat n locusul int (caseta int), prin intermediul unui 71

vector de schimb, unde se integreaz n cadrul unui proces de recombinare indus de recombinaz (R), codificat de gena cre. Att gena int ct i gena dorit ( caseta de schimb) purtat de vectorul de schimb sunt flancate de doi loci Rs (sau lox) inversai, fiind capabile de recombinare. Gena marcher ipt, gena pentru recombinaz (R) i gena dorit este flancat de doi loci Rs orientai n acelai sens fiind capabile de inducerea deleiei. n cazul recombinrii se face un schimb ntre gena int i gena dorit care se va integra n cromozomul gazdei, la un loc precis, unde a fost gena int. n cazul n care integrarea se face randomizat n genomul gazdei, recombinaza va elimina prin deleie gena dorit. n consecin vor rmne pentru exprimare doar genele dorite integrate la loc fix (SDI). Srivastava i colab.(2004) a demonstrat faptul c, la orez, genele integrate la loc fix, n copie simpl, sunt mult mai stabile n expresie dect cele integrate randomizat, n copii multiple.

3.4.3. Transformarea genetic prin metode directe.

n cazul metodelor directe ADN-ul este introdus n celula gazd n mod direct, fr participarea unui agent natural de transfer. Dintre multitudinea de metode cunoscute menionm: transformarea genetic a protoplastelor; electroporarea i porarea laser; micro i macro injecia; metodele biolistice (Deavy i colab, 1989; Potrykus, 1991).. Transformarea genetic a protoplastelor. n acest caz trebuie obinute mai nti protoplastele care sunt celule nude, fr perete celular. Acest lucru se realizeaz prin digestia enzimatic a peretului celular cu celulaz i pectinaz. Ptrunderea ADN-ului se realizeaz prin endocitoz. Pentru a nu fi degradat enzimatic gena de transferat este, de regul, integrat ntr-un vector (plasmid). Vectorul poart i markerii genetici necesari izolrii i identificrii celulelor transformate. Ptrunderea ADN-ului recombinant poate fi facilitat prin electroporare sau cu ajutorul polietilenglicolului. i n cazul metodelor directe urmeaz regenerarea plantelor transgenice i confirmarea transformrii. Electroporarea i porarea laser Electroporarea i porarea laser se pot practica i la celule sau explante vegetale, nefiind absolut necesar obinerea protoplastelor. Ptrunderea ADN-ului recombinant, n cazul electroporrii, este facilitat de realizarea unor pori reversibili sub aciunea unui curent continuu pulsatoriu, sau n cazul porrii laser sub aciunea razelor laser.

72

Microinjecia i macroinjecia. Microinjecia presupune injectarea ADN-ului recombinant n protoplaste, ncastrate pe o lam de sticl n alginat sau agaroz. Injectarea se face cu ajutorul unor microseringi, sub microscop, utiliznd micromanipulatorul. Metoda este mult utilizat pentru transformarea genetic a celulelor animale. n cazul celulelor vegetale trebuie avut mare grij s nu lezm vacuolele care conin enzime litice ce pot digera celulele. Dup injecie, protoplastele trebuie trecute urgent pe un mediu de cultur adecvat. Newhaus i colab., (1987) a reuit prin microinjecie transformarea unor structuri embrioide la Brassica napus. n acest caz s-au obinut, mai nti, forme himere, cu esut normal i esut transformat, care prin segregare, n urma autopolenizrii, au generat plante transgenice, homozigote pentru gena transferat. Macroinjecia presupune pulverizarea soluiei de ADN recombinant pe inflorescen, imediat dup polenizare. Pe aceast cale s-au obinut plante transgenice la secar (De la Pena i colab., 1987). Se presupune c se transform direct spermatiile n timpul creterii tubului polenic n stilul plantelor. Dei metoda pare promitoare, deoarece nu se mai pune problema regenerrii, nu se cunosc realizri noi prin aceast metod. Metoda biolistic este metoda cel mai mult utilizat n prezent. Metoda permite realizarea transformrii i la nivelul ADN-ului citoplasmatic. n acest caz ADN-ul recombinant dispus la suprafaa unor microproiectile de aur sau tungsten, de dimensiuni foarte mici (0,4-1,2 m), este propulsat n esutul int sub aciunea unei fore explozive. Prima oar s-a utilizat pentru aceasta praful de puc ntr-o instalaie numit tunul de particule (Sanford, 1988; Klein i colab., 1988), pictura cu microproiectile fiind dispus la captul unui macroproiectil de plastic (fig.2.19). La 1 mg aur pulbere se utilizeaz 40 g ADN recombinant care se lipete de microproiectile n prezena spermidinei, a clorurii de Ca i n condiii de vortexare activ, pentru a mpiedica aglomerarea microproiectilelor. Pentru transformare se utilizeaz Figura 3.19: Tunul de particule

73

explante uor plasmolizate n sorbitol sau manitol 0,2 M, cu 4 ore naite de aplicarea metodei biolistice i 6 ore dup. n acest fel se reduce riscul ca celulele s plesneasc la impactul microproiectilelor, iar dup tratament membrana celular se reface n condiiuni mai bune. n prezent se utilizeaz fora exploziv rezultat n urma ruperii unor membrane sub aciunea heliului sub presiune (Takeuchi i colab., 1992). Fora de explozie poate fi reglat utiliznd diferite grosimi a membranelor. Totul se realizeaz n condiii de vacuum parial. Parametrii optimi, fizici, chimici i biologici pentru reuita transformrii genetice prin metoda biolistic sunt prezentai n detaliu de ctre Christou (1994). Au fost realizate ncercri de transformare a plantelor prin utilizarea unor proiectile biologice (fagi, drojdii sau bacterii). De fapt este vorba de utilizarea ADNului recombinant purtat de gazd, fr a mai fi necesar, de pild, izolarea plasmidelor utilizate ca vectori. n acest caz bacteriile urmeaz s fie dispuse la suprafaa microproiectilelor (Kikkert i colab.,1999). Dei porumbul i plantele furajere sunt refractare la transformare genetic i regenerare, n urma analizei dimensiunii microproiectilelor, a morfologiei calusului sau a esutului generativ obinut din smn, au fost obinute cu succes plante transgenice (Frame i colab., 2000; Ha i colab., 2001). Wang i colab.,(2006) au realizat o sintez privind transformarea genetic a plantelor furajere . Relativ recent au fost analizai parametrii optimi pentru exprimarea transgenelor prin utilizarea echipamentului biolistic cu heliu sub presiune la sorg (Able i colab., 2010).

3.4.4. Instabilitatea exprimrii transgenelor.

Confirmarea reuitei transformrii, cu excepia metodelor imunologice, nu este o garanie a funcionrii transgenelor. Este posibil s se fi transferat doar poriuni de gen sau gene ntregi dar inactivate secundar. n acest din urm caz se vorbete de tcerea genelor sau gene silencing. Fenomenul de inactivare este un fenomen somatic astfel c pot rezulta plante himere cu lstari la care transgenele se exprim i lstari la care nu se exprim (Galun i Breiman, 1997). Inactivarea secundar a exprimrii se poate datora metilrii acestora sau poate fi generat de influiena unor factori externi sau interni, datorit inactivrii transcripionale sau postranscripionale a transgenelor (Marian i Botez, 1996a; Marian i Botez, 1996b). A fost anlizat i rolul remodelrii cromatinei n ceea ce privete inactivarea exprimrii unor transgene (Mayer, 1999). n context interesant, este fenomenul de co-supresie

74

ntre genele gazd i transgene, n cazul prezenei transgenelor ntr-un numr mare de exemplare (Vauchert i colab., 1995). Prin tehnica PCR i mai ales prin tehnica Southern blotting este posibil s se estimeze numrul transgenelor. n urma transformrii genetice transgenele sunt prezente n stare hemizigot (doar pe un cromozom omolog) , dispuse pe acelai cromozom sau pe cromozomi diferii. Dac transgenele sunt pe cromozomi diferii, n urma autopolenizrii, n descendena segregant se va evidenia, prin tehnica PCR, un raport de segregare de 3:1, dac a fost prezent o singur transgen, sau un raport de segregare de 15:1 dac au fost prezente dou transgene. Un numr mai mare de transgene este greu de pus n eviden prin aceast tehnic. Prin tehnica Southern blotting se pot pune n eviden numrul de transgene dup numrul de semnale (pete), indiferent de poziia acestora pe acelai cromozom sau nu. Trebuie menionat faptul c prezena secvenelor SAR (Scaffold Asociation Region) asigur o mai mare stabilitate n exprimarea transgenelor (Hall,Jr. i Spiker, 1994).

3.5.

Realizri privind transformarea genetic a plantelor de

cultur.
Prin transgenez pot fi realizate unele obiective imposibil sau foarte greu de obinut prin metodele clasice de ameliorare a plantelor. Evident c se pot atepta realizri deosebite n cazul unor caractere sau nsuiri controlate monogenic, de gene majore. Pentru ca acestea s funcioneze este necesar s fie echipate cu elemente genetice de reglaj, cum ar fi de pild promotorul, specifice celulelor gazd eucariote vegetale. Un promotor, frecvent utilizat, care poate asigura exprimarea puternic i constitutiv a transgenelor n esutul vegetal este promotorul 35S de la CaMV (Cauliflower Mosaic Virus, sau virusul mozaicului conopidei). Uneori transgenele trebuie echipate i cu semnalul de transfer a proteinelor codificate la locul lor de aciune.

75

3.5.1. Ameliorarea rezistenei la virusuri.

Majoritatea virusurilor vegetale sunt virusuri ARN dar exist i virusuri ADN. n tabelul 4 sunt prezentate cteva exemple de virusuri vegetale cu particularitile lor structurale: Tabelul 4 Exemple de virusuri vegetale cu particularitile lor structurale
Ribovirusuri Rhabdovirusuri Bunyavirusuri Bromovirusuri TMV(Tobacco Mosaic Virus) AlfaalfaMV Phytoreovirusuri Fuji virusuri Adenovirusuri Gemenivirusuri Particulariti structurale Monocatenare (-)

Cauliflower Mosaic Virus

Monocatenare (+) Bicatenare

Pentru a avea un cadru mai larg de nelegere a problemei ce vizeaz combaterea efectelor negative ale virusurilor vegetale, n continuare vom prezenta metodele clasice de control a infeciei virale i metodele specifice ingineriei genetice. Metodele clasice de control a infeciei virale vizeaz eliminarea vectorilor ce rspndesc virusurile cum ar fi insectele sugtoare ca de pild afidele; eliminarea infeciei virale i obinerea unui material de plantare liber de virusuri prin cultur de meristeme i termoterapie; protecia ncruciat prin infecia cu virusuri nrudite mai puin virulente; ameliorarea genetic a rezistenei prin hibridare sexuat cu surse de rezisten i selecie. Metodele specifice ingineriei genetice se refer la obinerea unor plante rezistente la infecia viral, n special prin transgenez i anume: Transgeneza genelor de rezisten, dup izolarea i clonarea lor de la plantele sau animalele care au astfel de gene. Acestea pot fi gene care codific anticorpi antivirali (planty body) sau proteine cu proprieti antivirale cum ar fi de pild ubiquitinul (Galun i Breiman, 1997). De la o specie de plante, Phytolaca americana, a fost izolat i clonat o gen care codific o protein cu proprieti antivirale, gen care dup ce a fost echipat cu promotorul 35S a fost transferat la Nicotiana benthamiana care a devenit rezistent la atacul de virusuri. De la oarece a fost izolat i clonat o gen care codific enzima 2`-5` oligoadenilat 76

synthasa, gen transferat mai apoi la cartof, care a devenit rezistent la PVX (Potato Virus X). Se pare c enzima este activat de ARNul viral bicatenar n faza de replicare determinnd sinteza 2`-5` oligoadenilatului prin polimerizarea ATPului, 2`-5` oligoadenilat-ul la rndul su activeaz o endoribonucleaz care degradeaz ARNul viral. Se pare c interferonul, utilizat la animale pentru combaterea virusurilor, are un efect similar 2`-5` oligoadenilat synthazei. Transgeneza unor gene sau secvene de gene de tip viral (pathogen derived resistence gene). n cazul virusurilor vegetale, care dup cum s-a mai artat sunt n majoritate virusuri ARN, pentru a obine secvenele genice sau genele virale ce urmeaz a fi transferate trebuie mai nti s se realizeze reverstranscripia acestora sub form de ADN, care urmeaz a se integra n genomul celulelor gazd vegetale. n context exist mai multe metode pentru obinerea rezistenei derivate de la genele agentului patogen. Transgeneza genelor ce codific proteinele de capsid (CP sau Capsid

Proteins). Virusurile vegetale, de regul, sunt ribovirusuri care ptrund n celula gazd mpreun cu capsida viral. Pentru replicare acestea trebuie, mai nti, s se decapsideze. Dac prin transformare genetic, au fost integrate n genomul gazdei gene ce codific proteine de capsid, n celul va exista un surplus de proteine de acest tip, fapt ce va mpiedeca decapsidarea virusurilor infectante, i implicit replicarea lor astfel c infecia viral nu se mai manifest, plantele devenind rezistente. Se presupune existena i altor mecanisme prin care se asigur rezistena, sau mai curnd tolerana la virusuri, deoarece n anumite situaii la plantele transgenice pentru gena ce codific proteina de capsid proteina nu a fost pus n eviden dar transcriptul genei sub form de ARN a fost pus n eviden. (Galun i Breiman, 1997, Zagrai, 2007). n acest caz ar putea fi vorba de fenomene postranscripionale de cosupresie sau PTGS (post transcriptional genes supression), ce implic procesarea unor secvene de ARN dublucatenare, n ac de pr, n urma creia rezult siRNA (short interfering RNA), secvene scurte de 22-23 nucleotide, capabile s degradeze ARNul viral ntr-o manier specific, pe baz de complementaritate, blocnd translaia (Hamilton i colab., 2002). Tian i colab., (2007) au demonstrat experimental existena unui astfel de mecanism n cazul virusului PPV (Plum Pox Virus). Transgeneza genelor ce codific ribozimul. Ribozimul este un anumit tip de

ARN de origine viral, cu funcie enzimatic, capabil de a degrada genomul unor virusuri strine. Dac astfel de gene sunt izolate, clonate i integrate n genomul celulelor vegetale, acestea vor produce ribozimul i vor deveni rezistente. 77

Transgeneza genelor ce codific proteinele de transport. Proteinele de

transport (MP sau Movment Proteins) asigur rspndirea virusului n plant. Prin blocarea proteinelor de transport se poate bloca rspndirea virusului n plant i deci generalizarea infeciei. Acest lucru se poate realiza fie prin strategia antisens fie prin introducerea unor gene ce s produc constitutiv proteine de transport mutante care s fie capabile s lege virusul dar care s nu l poat transporta. n acest fel se va asigura competiia cu proteinele de transport normale produse de virusul infectant avnd ca rezultat ncetinirea rspndirii virusului. Putem preciza c pe aceast cale se poate asigura tolerana i fa de unele virusuri mai puin nrudite. Strategia sens presupune integrarea n genomul gazdei a unor secvene genice

virale care se transcriu sub form de ARN de tip viral. Poate fi vorba de ARN satelit, specific anumitor virusuri, sau ARN DI (defectiv interfering) sintetizat artificial (Delbart i colab., 1990). Acestea corespund captului 3` a geomului viral ce marchez iniierea replicrii. n acest fel n celul va exista un surplus de astfel de secvene ce se replic activ consumnd replicaza viral necesar replicrii virusului infectant, plantele devenind rezistente. Strategia antisens presupune integrarea n genomul gazdei a unor secvene

genice virale care se transcriu sub forma unor secvene scurte de ARN complementar materialului genetic viral situat la captul 3` sau 5` cu care formeaz structuri bicatenare. n cazul n care secvena este complementar captului 3`, de iniiere a replicrii, se vorbete de ricARN (replication interfering complementary) i blocheaz replicarea materialului genetic viral. n cazul n care este complementar captului 5` blocheaz translaia genelor virale i se vorbete de micARN (mesanger interfering complementary). Cu strategia antisens ne vom mai ntlni n contextul n care este necesar blocarea exprimrii unor gene prin blocarea translaiei.

3.5.2. Ameliorarea rezistenei la bacterii i ciuperci.

Ameliorarea rezistenei la bacterii i ciuperci se bazeaz, n principal, pe transgeneza unor gene ce codific anumite proteine cum ar fi: Transgeneza genelor ce codific proteine implicate n imunitatea umoral a insectelor. Este vorba de gene preluate de la insecte, capabile s sintezizeze anticorpi n urma infeciei cu anumii ageni fitopatogeni. Astfel poate fi vorba de apidecine specifice albinelor;

78

cecropine de la Hyalophora cecropia; atacine i lisosime de la larvele de Hyalophora cecropia, cu propieti antibacteriene. Transgeneza genelor ce codific proteine implicate n procesul de patogenez. Este vorba de proteine produse de anumite specii de plante n cadrul procesului de mbolnvire ca reacie de rspuns la infecie asigurnd o rezisten sistemic (SAR sau Systemic Aquired Resistence) . Evident c planta gazd trebuie s aib receptori adecvai pentru semnalul produs de agentul patogen i canale adecvate de transmitere a semnalului pentru ca reacia de rspuns a plantei s se produc. Semnalul ce declaneaz reacia de rspuns se mai numete elicitor. Pentru obinerea rezistenei la bacterii i ciuperci poate fi vorba de transgeneza unor gene ce codific enzime implicate n sinteza fitoalexinelor. Fitoalexinele sunt substane de natur foarte diferit dar neproteic. Astfel sunt terpenele specifice solanaceelor; isoflavonoidele specifice leguminoaselor, cu forme diferite la mazre (pisantin) i fasole (kevinton); reverastrolul specific pentru via de vie i pin. Unele fitoalexine pot fi inactivate de ctre unii ageni patogeni. De exemplu pisantinul poate fi inactivat de Nectria haematococca, iar kevintonul poate fi inactivat de Fusarium solani ssp.phaseoli. Pe de alt parte exist proteine cu propieti bactericide, cum ar fi thioninelel, sau cu propieti antifungice, cum ar fi drosomicinul. Mai nou a fost identificat proteina VVTL-1, o protein asemntoare thaumatinei cu propieti antifungice (Dhekeny i colab., 2011). Proteina a fost izolat n vitro din culturi embriogene la soiul de vi Chardonnay, n prezena filtratului agentului patogen (Elsinoe amplelina). Proteina este codificat de gena vvtl-1 care a fost clonat i transferat altor soiuri sensibile. Tot o protein cu propieti antibacteriene i antifungice este lactoferina. Prin transgeneza genei ce codific lactoferina de la bovine la pr, plantele au devenit rezistente la atacul bacteriei Erwinia amylovora (Malony i colab., 2003). Se pare c n acest caz se induce i o competiie ntre bacterii i planta gazd pentru necesarul de fier. Un efect similar se poate obine prin transgeneza genei ce codific feritina (Djennane i colab., 2009). n cazul rezistenei la fungi poate fi vorba i de proteine cu propieti hidrolitice, cum ar fi chitinaza sau glucanaza, enzime ce omoar ciuperca degradnd peretele celular al fungilor ce conin chitin sau glucan. n acest sens trebuie mult atenie pentru a utiliza gena adecvat n procesul de transformare, ce codific chitinaza sau glucanaza, n funcie de agentul patogen la care dorim rezisten, agent care poate conine chitin sau glucan. Astfel gena ch1 izolat de la bacteria Serratia marcescens, gen ce codific chitinaza, poate fi 79

utilizat pentru transformarea genetic a plantelor care dorim s fie rezistente la atacul Ascomycetelor i Basidiomycetelor, ce conin n peretele celular chitin, n timp ce gena glu, izolat de la fasole, care codific glucanaza poate fi utilizat pentru transformarea genetic a plantelor care dorim s fie rezistete la atacul Oomycetelor, cum ar fi Phytophthora, Peronospora sau Pytium. n literatur se citeaz, totui, rezultate pozitive privind rezistena la Phytophthora n cazul plantelor transgenice pentru gena ce codific chitinaza, izolat de la fasole, alturi de gena AP24 izolat de la tutun, gen ce codific o protein ce destabilizeaz membrana celular (Yabor i colab., 2010). Exist, de asemenea, proteine capabile s inhibe anumite enzime fungice cum ar fi poligalacturonaza, enzim ce hidrolizeaz pectina ce conine acid poligalacturonic, facilitnd rspndirea ciupercii n plant.. Aceste poteine (PGIP sau Polygalacturonaze Inhibiting Proteins), inhibnd enzima poligalacturonaza, ciuperca nu se mai poate rspndi n plant iar infecia este foarte limitat. Transgeneza genelor ce codific proteine capabile s detoxifice toxinele bacteriene. De pild bacteria Pseudomonas syringae produce o toxin foarte puternic numit tabtoxina dar n acelai timp, pentru autoprotecie exist o gen (tt ) care codific o enzim capabil s detoxifice tabtoxina. Transgeneza unei astfel de gene la plante le fac rezistente la aciunea toxinei menionate. O situaie asemntoare este n cazul ciupercii Helminthosporium carbonum, parazite la porumb. Ciuperca produce o toxin dar n acelai timp, pentru autoprotecie exist o gen (hm ) care codific o enzim capabil s detoxifice toxina. Transgeneza unei astfel de gene la plante le fac rezistente la aciunea toxinei respective.
R R

3.5.3. Ameliorarea rezistenei la atacul duntorilor.

Ameliorarea rezistenei la atacul duntorilor se poate realiza prin transgeneza unor gene izolate i clonate de la baterii sau anumite specii de plante (Botez i colab., 1995a). Bacillus thuringiensis este o bacterie care produce n faza de sporulare o pretoxin care se poate transforma n aparatul digestiv al insectelor, cu reacie alcalin, ntr-o toxin foarte puternic. Pulverizarea unei suspensii de spori pe o cultur infestat cu o anumit specie de insecte ar putea constitui o metod de combatere a acesteia. Din pcate costul combaterii ar fi deosebit de mare i relativ ineficient deoarece pretoxina poate fi uor inactivat de radiaia UV. Transferul unor astfel de gene ce codific pretoxina respectiv la plante le-ar putea face rezistente. 80

De la diferitele tulpini ale bacteriei Bacillus thuringiensis au fost izolate i clonate genele din grupul cry, responsabile de sinteza unor pretoxine cu efect letal asupra unor grupuri de insecte. Astfel gena cry IA codific o endotoxin letal pentru Lepidoptere , gena cry III codific o endotoxin letal pentru Coleoptere iar gena cry IV codific o endotoxin letal pentru Diptere. Prin transgeneza acestor gene sau obinut plante transgenice rezistente la atacul unor diptere, lepidoptere sau coleoptere. Aceast specificitate pe grupe de insecte poate avea implicaii favorabile sub aspectul proteciei insectelor utile. Primele realizri n acest domeniu au fost obinute de Vaeck i colab.,1987 la tutun mpotriva duntorului Manduca sexta i la cartof mpotriva duntorului Phtorimaea operculella. De autunci s-au obinut i alte realizri dintre care menionm combaterea larvelor moliei Plutella xylostella la varz (Jin i colab.,2000) , combaterea viermelui capsulelor de bumbac, a larvei speciei Heliothis virescens, combaterea omidei fructificaiilor la porumb, larva speciei Helicoverpa zea, ambele Lepidoptere, Nocturidae, combaterea gndacului de Colorado la cartof (Leptinotarsa decemlineata), un coleopter (Galun i Breiman, 1997). Este foarte cunoscut porumbul transgenic MONSANTO 810 ce poart gena cry IA i care este rezistent la atacul sfredelitorului porumbului (Ostrinia nubilalis) precum i porumbul Bt 176, care poart i gena de rezisten la erbicidul Basta. De la ghiocel (Galanthus nivalis) au fost izolate i clonate gena gna (Galanthus nivalis agglutinin) ce codific lectinele, glicoproteine cu efect nociv asupra insectelor. Spre deosebire de alte lectine acestea nu sunt nocive pentru om i animale. Prin transgeneza acestor gene sau obinut plante de orez rezistente la atacul de insecte (Rao i colab. 1998; Tang i colab., 2001), precum i plante de porumb rezistente la afide (Wang i colab., 2005). Relativ recent, i n ara noastr, a fost izolat i clonat gena gna n vederea transformrii genetice la salat n cadrul unui program n care am fost i noi colaboratori (Lupan i colab.2010). Genele ce codific proteinele PIP (protease inhibiting polipeptides) au fost izolate i clonate din seminele de Vigna unguiculata. Aceste proteine (polipeptide) au proprietatea de a inhiba proteazele insectelor duntoare astfel c acestea nu mai pot asimila proteinele cu care se hrnesc murind prin inaniie. n mod asemntor acioneaz proteinele AIP (amilase inhibiting polipeptides) doar c acestea inhib amilaza, enzima care asigur asimilarea amidonului prin hidroliza lui n zaharuri cu molecul mai mic. Prin transferul unor astfel de gene s-au obinut plante de cultur transgenice rezistente la atacul duntorilor. Trebuie menionat c proteinele PIP i AIP pot fi nocive i pentru mamifere i ca atare acest sistem poate fi utilizat doar la speciile de plante tehnice sau la speciile de plante care nu se consum 81

crude. O alt posibilitate de a evita efectul negativ a acestor proteine n acelai timp cu posibilitatea combaterii nematozilor din sol, const n echiparea lor cu un promotor de tipul Tob, care se exprim numai n rdcinile plantelor. n acest fel o gen ce codific o astfel de protein (cistatinul) echipat cu promotorul Tob a fost transferat la lucern care a devenit rezistent la nematodul Globodera pallida. Furajul reprezentat de tulpinile de la suprafaa solului a putut fi consumat fr nici un risc pentru animale.

3.5.4. Ameliorarea rezistenei la erbicidele neselective.

Erbicidele neselective sau erbicidele totale distrug att buruienile ct i plantele de cultur. Spre deosebire de erbicidele selective aceste erbicide au marele avantaj c nu sunt poluante, fiind biodegradabile. De la unele bacterii au fost izolate i clonate gene ce pot asigura rezistena la aceste erbicide. Prin transgenez se pot obine plante de cultur rezistente la aceste erbicide, erbicidele devenind selective, rmnnd ns biodegradabile. Mecanismul de rezisten este foarte variat (Botez i colab.,1995 b). Poate fi vorba de supraproducia enzimei int, enzima afectat de erbicid; sau a enzimei ce degradeaz produii secundari, toxici pentru plant, rezultai n urma aciunii erbicidului. Poate fi vorba de detoxificarea erbicidului pe cale enzimatic sau de producerea unei enzime int mutante insensibile la erbicid. Rezistena la Glyphosate (erbicidul Roundup) a fost obinut prin transferul unei gene izolat de la bacteria Salmonella typhimurium, responsabil de supraproducia enzimei int (EPSPS), la plantele de cultur. Foarte cunoscut este soia Roundup Ready care are integrat gena pentru supraproducia enzimei int preluat de la Agrobacterium tumefaciens, gen echipat cu promotorul 35S i cu semnal peptidic, CTP-4 preluat de la Petunia, semnal necesar pentru transportul enzimei n cloroplast, la locul ei de aciune. Rezistena la Paraquat a fost obinut prin transgeneza unei gene responsabile de supraproducia enzimei superoxid dismutaza (SOD) capabile s detoxifice oxigenul activ ,toxic, rezultat n urma aciunii erbicidului. Menionm faptul c oxigenul activ, toxic, alturi de radicalii superoxid, peroxid i hidroxil, se afl la originea stresului oxidant, ce poate fi cauzat, pe lng erbicidele menionate, i de ali factori (Hrouart i colab., 1992). Astfel stresul oxidant poate fi cauzat de factori de mediu (excesul de lumin, diferii poluani, ozonul, SO2 etc.) sau diferii ageni patogeni (ciuperca Cercospora sau bacteria Pseudomonas). Toxicitatea oxigenului activ i a agenzilor oxidani se datoreaz faptului c 82

reacioneaz cu numeroase molecule la nivelul celulei putnd determina chiar moartea acestora. Contracararea stresului oxidant se poate realiza, ca i n cazul erbicidelor menionate, prin transgeneza unor gene care s determine producia sau supraproducia enzimelor capabile s detoxifice oxigenul activ (enzima SOD, catalaza, peroxidaza, ascorbat peroxidaza, glutation peroxidaza ). Astfel de gene au fost izolate i clonate de la specia Nicotiana plumbaginifolia. Rezistena la Phosphinotricin (erbicidul Basta) a fost obinut prin transgeneza unei gene izolat de la Streptomyces hygroscopicus, ce produce enzima PAT (phosphinotricin acetil transferaza) capabile s detoxifice erbicidul. Rezistena la inhibitorii ALS (aceto lactat shynthasa). ALS-ul reprezint enzima int pentru un grup relativ heterogen de erbicide (clorsulfuron, sulfonil uree, imidazolinone, triazolpirimidine .a.). Rezistena la aceste erbicide s-a obinut prin transgeneza unei gene mutante, izolate i clonate n culturi celulare de Arabidopsis thaliana, gene ce codific o enzim int insensibil la erbicidele respective.

3.5.5. Ameliorarea calitii.

Ameliorarea calitii are un domeniu foarte larg de cuprindere, metodele cel mai frecvent utilizate, specific ingineriei genetice, fiind: transgeneza, strategia antisens i mutageneza dirijat (Botez i colab.,1997). Ameliorarea compoziiei n proteine vizeaz mbogirea proteinei n aminoacizi eseniali (lizina, triptofanul) i n aminoacizi cu sulf (cisteina, cistamina) n care unele specii de plante de cultur, utilizate mai ales ca furaj,sunt foarte srace. Imbogirea proteinei n aminoacizi cu sulf s-a obinut prin transgeneza unei gene izolate i clonate de la nuca brazilian (Bertholletia excelsa), responsabile de producerea unei proteine foarte bogate n aminoacizi cu sulf, la alte plante de cultur. La rapi proteina este format n principal din dou componente: napin, bogat n aminoacizi cu sulf (20%) i cruciferin,srac n aminoacizi cu sulf (80%). Prin strategia antisens s-a blocat producerea cruciferinei, astfel c proteina a fost alctuit n principal din napin, cantitatea total de protein rmnnd aceeai. Una dintre cele mai mari realizri n domeniul ameliorrii calitii prin transgenez o reprezint obinerea, n anul 1999 a orezului goledn rice, bogat n vitramina A i mai apoi a orezului high iron rice bogat n fier asimilabil (Potrykus, 2011)

83

Intrzierea senescenei florilor i manipularea coacerii fructelor s-a realizat prin blocarea enzimelor responsabile de poroducerea etilenei cu ajutorul strategiei antisens. Tot pe aceast cale s-a blocat la tomate i enzima responsabil de degradarea pectinei (poligalacturonaza) astfel c fructele, la coacere, rmn ferme ( Sheehy i colab., 1988).. Reducerea coninutului n lignin s-a realizat tot prin strategia antisens, ca urmare a blocrii pariale a producerii enzimelor implicate n sinteza ligninei.

3.5.6. Producerea de noi compui.

Pentru producerea de noi compui se pot utiliza dou strategii: a. Exprimarea tranzitorie n plant a unor gene heteroloage, utile, purtate de virusuri vegetale n calitate de vectori. n acest caz fiecare generaie de plante trebuie infectate cu virusul respectiv. b. Exprimarea stabil a unor gene heteroloage, utile, de ctre planta gazd transformat genetic cu genele respective. n nacest caz genele transferate se vor exprima i n descendena plantelor transformate genetic. n ambele cazuri produsul de expresie a genei utile se extrage din esutul vegetal sau esutul vegetal, ce poart gena heteroloag, sau esutul vegetal este consumat ca atare. n ceea ce privete prima strategie menionm producerea -trichosantinului, o substan cu propieti anti HIV. Gena ce codific -trichosantinul a fost izolat de la bacteria Trichosantes kirilovi. Dup echiparea genei cu promotorul pentru proteina de capsid a virusului TMV (Tabacco Mozaic Virus) a fost integrat n genomul virusului TMV. Virusul recombinant a fost utilizat pentru infecia plantei Nicotiana benthamiana, din care s-a extras -trichosantin-ul. Cea de a doua strategie a fost utilizat pentru prima oar pentzru obinerea albuminei serice umane de ctre plantele transgenice de tutun i cartof (Sijmons i colab. 1990, citat de Julian i colab., 2005). Mai apoi a fost obinut la soia beta Caseina bovin (Maughan i colab.,1999). De asemenea au fost obinute vaccinurile orale (Korban, 2002; Mason, 2002), anticorpi i mase plastice biodegradabile. Vaccinurile orale pot fi obinute prin transformarea genetic a unor plante, cu secvene ADN ce codific un anumit antigen capabil s determine rspunsul imun al organismului uman n urma consumrii fructelor de la plantele transformate. Pe aceast cale s-au obinut

84

vaccinuri mpotriva holerei, mpotriva enteritei toxice i mpotriva hepatitei B, vaccinuri deosebit de utile mai ales pentru imunizarea populaiei din lumea a III-a, foarte vulnerabile. Anticorpii (structuri complexe imunoglobulinice) sunt alctuii din cte dou subuniti mari (heavy chain) i dou subuniti mici (light chain), ce formeaz o structur n form de Y. Asamblarea anticorpilor se realizeaz, de regul n celula animal, n reticolul endoplasmatic cu ajutorul unor proteine cu rol de chaperone, mecanism existent i n celula vegetal. Integrarea celor dou componente se poate face prin dubla transformare a unei plante cu genele ce codific cele dou lanuri.De asemenea, credem c ar putea fi luat n considerare strategia propus de Hunt i Maiti (2001) pentru expresia genelor multiple strine ntr-o construcie policistronic, sau prin transformarea separat a dou plante cu genele ce codific cele dou lanuri urmnd ca acestea s ajung mpreun n nurma hibridrii celor dou plante. Pe aceast cale s-au obinut anticorpi la tutun mpotriva lui Streptococcus mutans, o bacterie prezent n cavitatea bucal. Pentru aceasta s-a utilizat gene ADNc pentru cele dou lanuri, obinute din celule hibridoma stimulate s produc anticorpi monoclonali mpotriva bacteriei respective. Genele au fost echipate i cu semnalul peptidic ce dirijeaz transferul componentelor imunoglobulinice n reticolul endoplasmatic. Saalbach i colab. (2007) au obinut plante de mazre furajer ce exprim n semine genele ce codific anticorpul BA11 mpotriva bacteriei E.coli enterotoxicogene (ETEC), sub form scFv (single chain variable fragment). Pentru exprimarea genelor doar la nivelul seminelor acestea au fost echipate cu promotorul USP. Anticorpii de tip scFv sunt proteine ce pstreaz secvenele variabile de la cele dou lanuri (H i L) legate printr-un linker de natur peptidic. Anticorpul s-a dovedit stabil chiar i n furajele prelucrate . Includerea seminelor de mazre transformate n hrana porcinelor a asigurat protecia acestora mpotriva bacteriei E.coli toxicogene, bacterie foarte periculoas. Utilizarea unui astfel de anticorp sub forma scFv mai are avantajul c anticorpul nu a fost identificat n snge sau diferite organe, astfel c dup vaccinare nu este necesar o perioad de timp, naintea sacrificrii animalelor, pentru eliminarea lui, ca n cazul vaccinrii clasice. n tabelul 5 sunt prezentate cteva relizri privind obinerea de la plantele transgenice a unor produse fitofarmaceutice destinate tratamentului bolilor umane.

85

Tabelul 5 Produse fitofarmaceutice comercializate obinute de la plantele transgenice (dup Julian i colab., 2005)
Produsul CaroRx Toxina termolabil de E.coli Lipaza gastric Clasa Anticorp Vaccin Enzim terapeutic Indicaia Carii dentare Diaree Fibriza cistic Pancretit Crop Tutun transgenic Porumb transgenic Cartoful transgenic Transgenic maize

Antigenul virusului hepatitei B Lactoferin Capsid a virusului Norwalk Glicoprotein de rabie

Vaccine Diet Vaccin Vaccin

Hepatita B Infecii gastroitestinale Infecie cu virusul Norwalk Turbare

Cartof transgenic Salat transgenic Porumb transgenic Cartof transgenic Spanac transgenic

n ncheiere menionm obinerea maselor plastice biodegradabile (polihydroxybutirat) prin transformarea genetic a plantelor de Arabidopsis thaliana cu gene preluate de la bacteria Alcaligenes eutrophus ( dup Galun i Breiman, 1997)..

3.5.7. Ameliorarea rezistenei la stresul abiotic (stresul osmotic, toxicitatea metalelor grele).
Stresul osmotic cauzat de pierderea apei din celule datorit excesului de sruri, secetei sau ngheului. Exist mecanisme adaptive, la unele specii mecanisme foarte eficiente, ce permit limitarea pierderii apei sau contracararea efectelor negative a stresului osmotic. Acestea pot fi: Mecanisme anatomo-morfologice cum ar fi transformarea frunzelor n epi, ca

n cazul catuilor. Mecanisme ce in de dezvoltare cum ar fi modificarea perioadei de nflorit

pentru evitarea parcurgerilopr fazelor critice n perioadele de secet. Astfel exist soiuri de cereale foarte precoce care parcurg faza critic de umplere a bobului nainte de venirea secetei. Mecanisme fiziologice ce asigur, de exemplu, eliminarea srii sau acumularea

de osmoprotectori. Osmoprotectorii faciliteaz reinerea apei i protejeaz membranele

86

celulare de deficitul de ap. Ca osmoprotectori menionm: prolina, glicin betaina, zaharurile, polialcoolii (glicerolul, manitolul, sorbitolul). O analiz a genelor responsabile de tolerana la srturare a fost fcut la specia Spartina alterniflora Loisel., o specie halofit considerat model ( Subudbi i colab.,2011). Exist mai multe metode specifice ingineriei genetice prin care se pot obine plante rezstente la stresul osmotic. Metoda de baz este transgeneza genelor implicate n sinteza osmoprotectorilor, urmat de selecia de mutante din culturi de celule, mutageneza dirijat i strategia antisens. n privina prolinei, acumularea acesteia n celule, pe lng efectul osmoprotector poate asigura i o mai bun adaptare la deficitul de azot, la aciditatea solului i la prezena metalelor grele. n calea metabolic de sintez a prolinei sunt implicate dou enzime P5CS (Prolin 5 Carboxilat Syntethasa) i P5CR (Prolin 5 Carboxilat Reductaza). Majoritatea speciilor poart astfel de gene ns coninutul n prolin este relativ sczut deoarece sinteza prolinei este supus unui mecanism de control prin feed-back. n urma izolrii n culturi de celule a unor forme mutante insensibile la produsul final (prolina) s-au obinut plante de salat cu un coninut ridicat de prolin n celule ( Pileggi i colab., 2001). Astfel de forme pot fi obinute i prin mutagenez dirijat. nlocuirea Guaninei cu Adenina ntr-o anumit poziie la nivelul genei ce codific enzima reglatoare, a condus la nlocuirea aspartatului din poziia 107 cu asparagina i ca urmare s-a deranjat mecanismul de reglaj a sintezei prolinei prin feed-back avnd ca efect acumularea de prolin n celule. La unele specii, dei prolina se acumuleaz n cantitate mare este rapid degradat de enzima prolin dehidrogenaza. Prin strategia antisens s-a reuit blocarea acestei enzime astfel c s-au obinut, i n cazul acestor specii, plante rezistente la stresul osmotic. Glicin betaina este mai putin prezent la plantele superioare. n consecin au fost izolate, de la bacteria Artrobacter, gena codA ce codific colin oxidaza, iar de la bacteria E.coli gena betA ce codific colin dehidrogenaza, enzime implicate n sinteza glicin betainei, gene care au fost transferate la tutun, plantece au avut un coninut mai ridicat n glicin betain, devenind rezistente la stresul osmotic. n continuare vom amninti i alte metode ce vizeaz obinerea de plante rezistente la stresul osmotic, pe lng cele menionate n cazul osmoprotectorilor, metode ce au la baz tot transgeneza.

87

Transgeneza genelor ce codific proteinele LEA (Late Embriogenesis Abundent). Proteinele LEA sunt prezente n semine, n general, i asigur supravieuirea celulelor cu un coninut foarte sczut n ap. Prin transgeneza unor astfel de gene, echipate cu promotori care s permit exprimarea lor n plane, s-au obinut plante de orz i orez rezistente la srturare ( Zhang i colab., 2000 ). Transgeneza genelor ce codific enzime capabile s detoxifice oxigenul activ ce se rezult datorit deranjrii schimbului de gaze n perioadele de secet. O astfel de gen ce determin supraproducia enzimei SOD (Super Oxid Dismutaza) capabile s detoxifice oxigenul toxic, a fost izolat n culturi de celule de Nicotiana plumbaginifolia, i apoi transferat la lucern care adevenit rezistent la secet. Transgeneza genelor ce codific supraproducia unor proteine implicate
+ +

homeostazia ionic asigurat de sistemul proteic vacuolar antiport Na /H i sistemul proteic calcineurin, poate asigura rezistena plantelor srturare. Astfel de gene au fost izolate de la drojdia de bere i n culturi de celule de Arabidopsis thaliana. Transgeneza genelor ce codific proteine implicate n sinteza membranelor celulare. Este vorba de gene implicate n sinteza unor desaturaze care pot determina n compoziia membranelor celulare un coninut mai ridicat de acizi grai nesaturai, membrane mult mai stabile n condiii de nghe. O astfel de gen a fost izolat de la Anacystis nidulans, o cianobacterie, gen care a fost mai apoi transferat la tutun care a devenit rezistent la nghe. Contribuia ingineriei genetice pentru contracararea efectelor negative ale stresului abiotic sunt remarcabile i au tangen cu bioremedierea. Zhang i colab.,(2000) au fcut o sintez n aceast privin. Metalele grele ca arsenicul, cadmiu, cupru, plumbul, mercurul, seleniul i zincul reprezint o ameninare grav pentru mediu deoarece nu pot fi degradate nici chimic nici biologic . Acestea se acumuleaz n sol, ap, plante i n hrana omului. O soluie ar fi bioremedierea prin utilizarea unor plante capabile s fixeze n cantiti mari aceste metale. Specia Thlaspi coerulescens hyperacumuleaz cadmiu i zincul. Capacitatea de fixare poate fi amplificat prin mrirea biomasei i prin utilizarea unor gene care s asigure o toleran mai mare a plantelor i deci o bioacumulare mai mare a acestor metale. Gene care permit o hiperacumulare a arsenului au fost introduse n Arabidopsis thaliana (Dhankher i colab.,2002). Mercurul cu forma sa metilat (methylmercury) este foarte toxic deoarece ptrunde mult mai uor prin membrane iar n cadrul lanului trofic se bioamplific

88

(biomagnification). Aceast form poate fi redus la mercur metalic sub aciunea a dou enzime (o liaz i o reductaz) codificate de deou gene : merB i merA. Genele respective au fost izolate i clonate iar apoi au fost transferate speciei Arabidopsis thaliana care au avut o toleran mai mare la forma metilat a mercurului (Rugh i colab., 1996; Bizily i colab.,1999). Din pcate biomasa speciei Arabidopsis thaliana este foarte redus. Che i colab.,(2006) a reuit transformarea genetic cu gena merB a unei specii de plop (Populus deltoides) cu o biomas mare i o cretere foarte rapid fapt ce o face foarte potrivit pentru bioremediere.

3.5.8. Manipularea sterilitii mascule.

Sterilitatea mascul sau androsterilitatea reprezint incapacitatea plantelor de a produce gamei masculi funcionali i poate fi utilizat pentru eficientizarea procesului de obinere a seminei hibride F1, comerciale, pentru producie. Pentru obinerea seminei hibride F1 comerciale n loturile de hibridare, n care se seamn alternativ plantele mam i plantele tat, trebuie dirijat polenizarea, astfel ca plantele mam s se polenizeze doar cu polen de la plantele tat. n urma nsmnrii seminei hibride plantele generaiei F1 manifest un potenial ridicat de producie datorit fenomenului de heterozis. n generaiile urmtoare potenialul de producie scade foarte mult datorit segregrii. n consecin smna hibrid trebuie obinut n fiecare generaie n loturi de hibridare. Dirijarea polenizrii se poate face pe mai multe ci: Castrarea plantelor de pe rndurile mam din loturile de hibridare.Castrara se

poate face manual i ce const, n cazul porumbului ce este o plant unisexuat monoic, n ndeprtarea inflorescenei mascule, sau chimic prin tratarea plantelor de pe rndurile mam cu gametocide. Utilizarea autoincompatibilitii sexuate ce const n incapacitatea plantelor de

a realiza autofecundarea, dei gameii sunt funcionali. Fenomenul este utilizat, de pild, n cazul sfeclei de zahr. Utilizarea fenomenului de ginoicie. Ginoicia se manifest la unele specii de

plante unisexuat monoice, cum ar fi de pild castravetele, i const n faptul c plantele produc numai flori femele. Utilizarea sterilitii mascule.

89

Sterilitatea mascul sau androsterilitatea poate fi de trei feluri: nuclear, citoplasmatic i nucleocitoplasmatic. Androsterilitatea nuclear este controlat, de regul, de gene nucleare recesive, care segreg n descenden. Pentru utilizarea practic a acestui tip de androsterilitate plantele fertile trebuie s fie marcate genetic dominant pentru a putea fi eliminate de pe rndurile mam din lotul de hibridare n timp util, naintea infloririi. Androsterilitatea citoplasmatic este controlat de factori genetici citoplasmatici care se transmit dominant pe linie matern. Ca urmare hibridul obinut n urma ncrucirii formei mam androsterile cu forma tat este steril. Acest tip de androsterilitate se utilizeaz mai mult la speciile la care intereseaz doar anumite pri vegetative cum ar fi bulbii la ceap. Se pate utiliza i la porumb ns ,n acest caz, trebuie obinut att smn hibrid pe baz de androsterilitate ct i pe baz de forme parentale fertile, plantele mam trebuind s fie castrate. Smna comercial este reprezentat dintr-un amestec omogen a celor dou forme hibride. Androsterilitatea nucleo-citoplasmatic este determinat de gene citoplasmatice ce se transmit dominant pe linie matern dar se poate gsii i sub controlul unor gene nucleare dominante capabile de a restaura fertilitatea (Rf). Genele nucleare recesive (rf) sunt menintoare de sterilitate . Ca urmare hibridul obinut n urma ncrucirii formei mam androsterile cu forma tat restauratoare este fertil. n mod obinuit obinerea formei mam androsterile este un proces dificil i de durat. Pentru aceasta trebuie s dispunem o surs donoare de citoplasm cu gene de androsterilitate surs care se ncrucieaz cu viitoarea linie mam. Hibridul steril se retroncrucieaz mai multe generaii cu linia mam, astfel c n final se obine linia mam androsteril. Pentru amipularea sterilitii mascule prin inginerie genetic exist dou strategii. n cazul primei strategii linia mam androsteril se poate obine prin transgenez utiliznd gena izolat de la Bacillus amyloliquefaciens ce codific o enzim, Barnase, enzim capabil s distrug ARNul celular i deci s omoare celula n care se exprim. Pentru inducerea androsterilitii gena este echipat cu un promotor, TA 29, care se exprim doar la nivelul esutului tapet, generator al polenului. n consecin plantele ce poart aceast gen nu vor produce polen deci vor fi androsterile. Pentru ca hibridul ce urmeaz a fi obinut n lotul de hibridare prin ncruciare cu forma tat s fie fertil, forma tat este, de asemenea,

90

transformat genetic cu o gen capabil s codifice o protein, Barstar, ce suprim aciunea enzimei Barnase. n cazul celei de adoua strategii linia mam este transformat genetic cu o gen , argE, izolat de la E.coli, gen a crui produs de expresie este capabil s dezacetileze phosphinotricina acetilat, forma inactiv a erbicidului. Prin dezacetilare se reconstitue erbicidul activ. Pentru inducerea androsterilitii gena este echipat ,de asemenea, cu promotorul TA 29 care se exprim doar la nivelul esutului tapet. n consecin plantele mam din lotul de hibridare urmeaz a fi pulverizate cu Phosphinotricin acetilat care prin dezacetilare doar la nivelul esutului tapet vor afecta celulele generatoare de polen iar plantele mam vor fi androsterile. Acestea se vor poleniza cu polen de la forma tat.

3.6.

Analiza obiectiv i legislaia referitoare la problematica

Organismelor Modificate Genetic (OMG urilor).

Cu toate c OMGurile au cunoscut o rspndire spectaculoas, utilizarea acestora a generat numeroase controverse, opiniile pe aceast tem ncadrndu-se n dou curente. Pe de o parte cltivarea pe scar larg este vzut ca avnd numeroase beneficii economice, sociale i ecologice. Se apreciaz c cultivarea plantelor transgenice va determina creterea productivitii agricole globale, va contribui la asigurarea securitii alimentare, scderea srciei i va reduce dependena agriculturii de inputurile chimice, contribuind la reducerea polurii. Pe de alt parte, opozanii noii tehnologii i, n principal, adepii micrilor ecologiste i ai agriculturii biologice insist asupra potenialelor efecte negative pe care OMGurile le pot provoca echilibrului ecosistemelor, economiei i sntii. Considerm c este o gresal fundamental att respingerea global a OMGurilor ct i adoptarea lor fr discernmnt, fr a se ine cont de eventualele riscuri. Problematica trebuie privit punctual, iar eventualele riscuri pot fi eliminate cu discernmnt. n continuare ne vom referi la aceste riscuri poteniale i modul n care ele pot fi eliminate i dac aceste riscuri se regsesc sau nu n anumite situaii punctuale, cum ar fi cele referitoare la porumbul i soia transgenic (MON810 i Roundup Ready), cultivate pe suprafee mari n unele tri. Diminuarea diversitii genetice. Avantajele de natur economic n cazul OMG urilor, legate n bun parte de simplificarea tehnologiilor de cultur sunt cunoscute. Exist de asemenea numeroase avantaje 91

ce in de valoarea nutritiv i capacitate de producie superioar, perioada de pstrare i rezistena la lovire, rezistena la boli i duntori sau la condiiile de mediu (secet, exces de sruri, temperaturi sczute, metale grele, ioni de Aluminiu etc). Se poate afirma c principalul defect al OMG-urilor este faptul c sunt prea bune i risc s nlocuiasc n totalitate cultivarele obinute prin metodele clasice. Acest fapt ar putea determina o diminuare periculoas a diversitii genetice a cultivarelor i implicit o sporire a vulnerabilitii genetice a acestora. Eroziunea genetic este o caracteristic general a agriculturii moderne dar introducerea OMGurilor o ampific. Soluiile pentru rezolvarea acestei probleme sunt legate diversificarea cultivarelor obinute prin metode neconvenionale (n spe este vorba de OMG-uri) i de coexistena OMG-urilor cu cultivarele obinute prin metode convenionale n paralel cu sporirea preocuprilor pentru conservarea biodiversitii. Efectele asupra mediului i riscuri legate de transferul transgenelor la flora spontan . n cazul utilizrii organismelor modificate genetic este evident impactul favorabil de natur ecologic legat de reducerea consumului de pesticide i implicit de reducerea polurii. Din acest punct de vedere considerm c ar fi mai potrivit ca cultivarea plantelor modificate genetic s aparin, de fapt, agriculturii biologice. Un risc major care ns trebuie, de asemenea, privit punctual este legat de posibilitatea transferului transgenelor, mai ales a celor ce vizeaz rezistena la erbicide, la buruieni i n general la plantele din flora spontan. Dac acest risc este real n cazul rapiei, pentru care exist multe specii cu care s-ar putea ncrucia, n cazul soiei i proumbului transgenc acest risc practic nu exist. La SCDA Turda au fost efectuate experiene cu dou varieti de soia cu flori albe i roii, semnate alturat unele de altele. n descenden nu s-a constatat nici un amestec ntre cele dou varieti. Pentru rezolvarea acestei probleme se impune ca transformarea genetic cu astfel de gene s nu se fac la speciile care ar putea facilita transferul lor n flora spontan. Un astfel de risc ar putea exista i n privina transferului genelor marker ce determin rezistena la antibiotice, gene marker utilizate n procesul de obinere a OMG-urilor, la microflora din tubul digestiv, care ar putea deveni rezistente la antibioticele respective. n privina restriciilor impuse referitoare la posibilitatea utilizrii lor, n raport cu relevana lor pentru medicina uman sau animal, genele de rezisten la antibiotice au fost mprite, n trei grupuri (conform metodologiei EFSA-European Food Safety Authority): 92

Grupul 1: gene fr restricii. Aceste gene confer rezisten la antibiotice cu relevan limitat n medicina uman sau animal i care sunt deja foarte rspndite n natur. Grupul include genele pentru rezistena la kanamicin (nptII) i hygromicin (hph). Grupul 2: gene numai pentru testri n spaii delimitate. Aceste gene confer rezisten la antibiotice cu relevan n tratarea unor boli specifice. Grupul include genele pentru rezistena la ampicilin (amp ) i chloramphenicol (Cm ). Grupul 3: gene interzise. Aceste gene confer rezisten la antibiotice cu relevan deosebit pentru medicina uman. Grupul include genele ce determin rezistena la amikacin i tetraciclin. Plantele transgenice de soia (Roundup Ready) i cele de porumb (MON810) nu conin gene din grupurile 2 i 3 i n consecin, din acest punct de vedere, pot fi cultivate frr restricii. Spre deosebire de acestea, plantele transgenice de porumb MON 176 conin gena de rezisten la ampicilin i ca urmare unele ri, cu ar fi Spania, au fost scoase din cultur n anul 2005, decizia fiind luat la nivel naional, conform principiului subsidiaritii. Pentru depirea restriciilor impuse de genele marker ce determin rezistena la antibiotice, la organimele modificate genetic cu gene ce aparin generaiei a treia, este posibil ca acestea s segrege i s fie eliminate prin selecie, aa cum s-a ntmplat n cazul soiei modificate genetic Roundup Ready. De asemenea aceti markeri pot fi sau au fost deja nlocuii cu markeri noi cum ar fi de pild gena Bar
R R R

ce determin rezistena la erbicidul Basta. Mai recent, pentru transformarea

genetic a porumbului se propune utilizarea marcherilor de selecie dsdA, izolat de la E.coli i care codific enzima D-serin dehidrataza, i dao1, izolat de la Rhodotorula gracilis i care codific D-amino acid oxidaza ( Lai i colab., n Xu i colab.editor, 2007). D-serin dehidrataza metabolizeaz D-serina, n timp ce D-amino acid oxidaza poate metaboliza o diversitate de aminoacizi cum ar fi D- serina i D-alanina. D- serina i D-alanina, ntr-o concentraie cuprins ntre 2 i 15 mM inhib germinaia embrionilor imaturi izolai precum i creterea calusului de porumb netransgenic n vitro. Plantele transgenice pentru oricare dintre marcheri au putut fi izolate eficient n aceste condiii, marcherii dovedindu-i utilitatea. O alt strategie se refer la posibilitatea eliminrii marcherilor de selecie dup transformare, fapt ce ar permite, pe lng eliminarea riscurilor legate de mediu, i repetarea procesului de transformare cu acumularea mai multor transgene. O astfel de strategie presupune crearea unui vector de tip MAT ( Multi-Auto-Transformation) cu utilizarea unor

93

elemente genetice mobile, cum ar fi elementul genetic mobil Ac de la porumb (Ebinuma i colab. 1997). Un astfel de sistem a fost realizat la tutun n urma iuntegrrii marcherului ipt n elementul genetic mobil Ac. Marcherul ipt codific enzima isopentil transferaza implicat n sinteza citochininelor fapt ce permite diferenierea abundent a lstarilor pe un mediu de cultur lipsit de citochinine i identificarea plantulelor transformate. Din pcate marcherul determin pierderea dominanei apicale i incapacitatea plantelor transgenice de a forma rdcini. n urma integrrii marcherului ipt n elementul genetic mobil i n urma proceselor de transpoziie ce caracterizeaz acest element, marcherul poate fi pierdut, genernd plante transgenice capabile de nrdcinare. Riscuri pentru sntatea consumatorilor i organismelor non-int. Unele transgene, mai ales cele utilizate pentru combaterea duntorilor, pot codifica proteine duntoare omului sau animalelor. Aa este cazul proteinelor PIP (Protease Inhibiting Polipeptides) i cazul unor lectine. Pentru eliminarea riscului datorat proteinelor PIP se impune ca transformarea genetic cu astfel de gene s nu se fac la speciile ce se consum crude ci doar la speciile ce presupun prelucrarea termic, prelucrare prin care se inactiveaz proteinele respective. O alt cale de abordare o constitue echiparea genelor cu promotori care s permit exprimarea genei doar n anumite esuturi care nu se consum. Aa este cazul lucernei, dup cum s-a mai artat, ce a fost transformat genetic cu gena ce codific cistatina , o protein PIP. Gena a fost echipat cu un promotor ce se exprim doar n rdcini, astfel c partea aierian poate fi consumat fr nici un rsic n schimb gena se exprim n rdcini. Pe aceast cele, se pot combate, ns, nematozii care, consumnd rdcinile ce conin cistatin, vor pieri. n ceea ce privete lectinele, glicoproteine ce propieti insecticide ce pot fi nocive i pentru om sau animale, au fost identificate unele lectine inofensive, cum ar fi lectinele produse de ghiocel (Galanthus nivalis). Un alt risc se refer la posibilitatea ca transgenele s codifice proteine cu propieti toxice sau alergenice, fapt ce constitue, pentru cei care sunt mpotriva OMGurilor, un argument pentru respingerea global a acestora. i n acest caz situaia trebuie privit punctual, responsabil de producerea unor astfel de proteine este gena transferat i nu tehnologia ca atare. Gena respectiv produce n mod natural i la specia de la care a fost preluat o astfel de protein O astefel de situaiea fost ntlnit n cazul preluarii unei gene de la nuca brazilian (Bertholetia excelsa) pentru a mbogii coninutul proteinelor la plantele transgenice n aminoacizi cu sulf.

94

n ceea ce privete proteina codificat de transgena prezent n soia Roundup Ready, aceasta este omniprezent n natur i deci nu este considerat toxic sau alergenic. Acest lucru a fost confirmat de faptul c n urma analizelor comparative cu baza de date ale secvenelor de aminoaciozi ale proteinelor toxice i alergenic nu a fost identificat nici o omologie semnificativ cu acestea. O situaie asemntoare se ntlnete i n cazul proteinelor codificate de transgenele prezente n porumbul MON 810. De altfel s-a stabilit c mamiferele nu sunt susceptibile la delta endotoxinele codificate de genele preluate de la Bacillus thurigensis introduse n porumbul transgenic, deoarece n tubul digestiv al mamiferelor lipsec receptorii pentru aceste endotoxine. Un risc ce trebuie avut n vedere este legat de fenomenul de transcomplementaritate ce se poate manifesta n cazul obinerii rezistenei la virusuri prin transferul la plante a unor gene virale (Latham i Wilson, 2006). Acest fenomen se refer la consecinele negative pe care le poate avea prezena n plant a proteinelor de tip viral, att asupra sntii omului n urma ingestiei, prin agravarea unor infecii virale produse chiar de virusuri nenrudite, ct i asupra creterii infectivitii altor virusuri asupra plantelor. Trebuie avut n vedere i posibilitatea, ca n urma unor recombinri ntre transgenele virale i virusurile infectante, s apar noi forme virale mai agresive. Zagrai i colab.(2010) au demonstrat c , n cazul prunului transgenic pentru proteina de capsid a virusului Plum Pox , totui, acest lucru nu se ntmpl. Riscuri de natur etic, cultural sau religioas. Aceste riscuri sunt legate de percepia colectiv conform creia producerea i utilizarea OMGurilor reprezint un amestec brutal al omului n legiile naturii stabilite de ctre Dumnezeu. O astfel de percepie se datoreaz n mare parte ignoranei de care ns trebuie inut cont. Acest limit poate fi depit prin imformarea publicului referitor la caracterul evenimentelor de transformare i prin oferirea posibilitii de a alege cea ce s consume, fiind n cunotin de cauz ca urmare a etichetrii produselor obinute pe baz de organisme modificate genetic. Trebuie cunoscut faptul c mecanismul de transformare genetic nu a fost inventat de om ci acesta se poate petrece n mod natual cum este cazul transformrii genetice produse de bacteria Agrobacterium tumefaciens. Omul doar folosete n interesul su ce a lsat natura. Care este situaia culturii plantelor transgenice n lume i Europa?

95

Prima plant transgenic a fost o plant de tutun? Ea a fost declarat ca atare n 1983, ns comercializarea plantelor transgenice nu a nceput dect odat cu vnzarea unui hybrid de roii n Statele Unite, n 1994. Hibridul respectiv fusese modificat genetic pentru ncetinirea unei enzime care determin coacerea fructului, obinndu-se astfel un hybrid de roii cu o durat de via pe raft mai mare - aa-numitele roii Flavr Savr. n toat lumea, n 2009, s-au cultivat cu plante transgenice 148 milioane de hectare, n 29 de ri nregistrndu-se o cretere de cca.87 de ori de la introducerea lor n cultur. Ponderea de pia difer foarte mult de la o cultur la alta i de la o ar la alta. Actualmente, majoritatea recoltelor de soia i circa jumtate din cele de bumbac sunt culturi transgenice (Clive, 2011). Procentul de adoptare a culturilor transgenice, este urmtorul: SOIA: 81% (93% n S.U.A., 99% n Argentina, 75% n Brazilia); BUMBAC: 64% (93% n S.U.A., 86% n India, 69% n China) PORUMB: 29% (86% n S.U.A., 56% n Brazil, 86% n Argentina) RAPI: 23% (88% n S.U.A., 94% n Canada)

n Europa, ncepnd din luna martie a anului 2011, au fost autorizai pentru cultivare doar doi hibrizi transgenici. Cel mai cultivat dintre cei doi porumbul MON810 este un hibrid de porumb care protejeaz cultura de duntori precum sfredelitorul european al porumbului. Cellalt este un hibrid de cartof pentru utilizare industrial, denumit Amflora i aprobat n 2010. Coninutul crescut de amidon al acestui hibrid l face util pentru obinerea unor produse precum hrtia, de exemplu. n 2010, opt ri europene au cultivat plante transgenice, pe o suprafa total de 91.438 ha.(Spania 76,575 hectare PORUMB Bt; Portugalia 4,868 hectare PORUMB Bt; Polonia 3,000 hectare PORUMB Bt; Slovacia 1,248 hectare PORUMB Bt; Romnia 822 hectare PORUMB Bt; Cehia 4,680 hectare PORUMB Bt, 150 hectare CARTOF transgenic; Suedia 80 hectare CARTOF transgenic; Germania 15 hectare CARTOF transgenic. Ciudat este faptul c dei unele plante transgenice nu sunt autorizate pentru cultivare, din luna mai 2011 n Europa au fost aprobate n total 36 de plante transgenice care pot fi importate i procesate i/sau pentru alimente i furaje. Peste jumtate din aceste culturi sunt hibrizi de porumb transgenic. Alte culturi sunt: soia, rapia, sfecla de zahr i bumbacul. Explicaia pentru limitarea cultivrii plantelor transgenice s-ar datora principiului precauiei i n unele situaii principiului prevenirii. Principiul precauiei este unul de anticipare; prejudiciul nu s-a produs, iar eventualitatea producerii lui nu este demonstrata n 96

mod incontestabil i nici demonstrabila. Riscul este nesigur, realizarea lui este numai posibila, eventual plauzibila. Este vorba despre o actiune preventiva anticipata n contextul incertitudinii cu privire la risc, dificil de definit. Precautia reclama ca masurile de protejare a sanatatii umane i a mediului s fie adoptate, chiar daca actualul nivel de dezvoltare tehnicostiintifica nu prefigureaza un pericol, dar nici nu il exclude. Principiul precauiei trebuie s in, totui, cont de principiul proporionalitii ce statueaz faptul ca msurile luate s nu fie disproporionate nb raport cu riscul. Principiul Prevenirii prevede obligatia de a interveni nainte ca prejudiciul s se produc. n acest caz prejudiciul este cert. Astfel se pune problema n cazurile punctuale menionate deja cu prejudiciu cert, pentru om sau mediu, legat de OMGuri. n consecin toate organismele transgenice nu pot fi lansate pe piaa european fr o aprobare prealabil la nivelul Uniunii Europene, indiferent dac este vorba de importul unui produs alimentar sau furajer obinut din culture transgenice, sau destinat nsmnrii. Sistemul de autorizare European este recunoscut peste tot ca fiind unul dintre cele mai stricte din lume. Procesul de autorizare a organismelor transgenice n uniunea european presupune parcurgerea urmtorilor pai: 1. Evaluarea riscurilor se face pentru fiecare caz n parte i treptat, dup depunerea cererii de autorizare. 2. Dup ce ncheie evaluarea siguranei pentru mediu i sntatea uman i animal, Autoritatea European pentru Sigurana Alimentar (EFSA) emite o recomandare. Dac aceasta este pozitiv, ea va sta la baza unei hotrri preliminare, care va fi propus spre aprobare Comisiei Europene. Urmeaz votul rilor membere i autorizarea. 3. Monitorizarea, trasabilitatea i etichetarea ulterioare lansrii pe pia: nainte de comercializarea produselor, trebuie aprobate nite programe de monitorizare. Trasabilitatea este asigurat prin etichetare i prin nregistrri administrative realizate pe tot parcursul lanului alimentar. 4. Informarea publicului: pe tot parcursul procesului de autorizare, publicului i se pun la dispoziie informaii. Prin etichetare se asigur consumatorului libertatea de a alege. n Uniunea European, etichetarea este obligatorie pentru toate produsele alimentare i furajere care constau din, conin sau sunt obinute din plante transgenice, atunci cnd ingredientul transgenic depete 0,9%. Acest lucru le permite consumatorilor s aleag n cunotin de cauz. Pragul de 0,9% a fost stabilit politic i nu are nici un fundament tiinific, nefiind bazat pe nici o constatare sau fapt determinat tiinific. Este important de reinut c n multe cazuri, caracteristica introdus n genomul plantei transgenice ajut pur i simplu la mbuntirea 97

comportamentului culturii n cmp. Pentru agricultori, alegerea este garantat prin msuri de coexisten pentru culturile ecologice, transgenice i convenionale. Legislaia OMG i conex domeniului OMG are la baz directiva 2001/18/EC. Legislaia romneasc este conform cu reglementrile directivei i cuprinde urmtoarele:

Ordinul Ministrului Mediului i Pdurilor nr. 950/02.03.2012 privind constituirea Comisiei pentru Securitate Biologic i stabilirea cuantumului indemnizaiilor pentru membrii acesteia i pentru experii reprezentnd colaboratori externi ai Comisiei pentru Securitate Biologic (nepublicat n M.Of.)

OUG nr. 43/2007 privind introducerea deliberat n mediu i introducerea pe pia a organismelor modificate genetic, M.Of. nr. 435/28.06.2007

Legea nr. 247 din 30 iunie 2009 pentru aprobarea Ordonanei de urgen a Guvernului nr. 43/2007 privind introducerea deliberat n mediu i introducerea pe pia a organismelor modificate genetic, M.Of. nr. 472/08.07.2009

OUG nr. 44/2007 privind utilizarea n condiii de izolare a microorganismelor modificate genetic, M.Of. nr. 438/28.06.2007

Legea nr. 3/2008 pentru aprobarea Ordonanei de urgen a Guvernului nr. 44/2007 privind utilizarea n condiii de izolare a microorganismelor modificate genetic, M.Of. nr. 21/11.01.2008

HG nr. 497/2007 privind stabilirea unor msuri pentru aplicarea Regulamentului Parlamentului European i al Consiliului (CE) nr. 1946/2003 din 15 iulie 2003 privind micarea transfrontier a organismelor modificate genetic, M.Of. nr. 398/13.06.2007

Legea nr. 58/13.07.1994 pentru ratificarea Conveniei privind Diversitatea Biologic, M.Of. nr. 199/2.08.1994

Legea nr. 59/11.03.2003 pentru ratificarea Protocolului de la Cartagena privind biosecuritatea la Convenia privind diversitatea biologic, semnat la 5 iunie 1992 la Rio de Janeiro, adoptat la Montreal la 29.01.2000, M.Of. 192/26.03.2003

Legea nr. 86/10.05.2000 pentru ratificarea Conveniei privind accesul la informaie, participarea publicului la luarea deciziei i accesul la justiie n probleme de mediu, semnat la Aarhus la 25 iunie 1998, M.Of. nr. 224/22.05.2000

98

HG nr. 106/2002 privind etichetarea alimentelor, Anexa nr. 3 Norme metodologice privind informaiile suplimentare care se indic obligatoriu prin etichetare n cazul alimentelor obinute din organisme modificate genetic sau care conin aditivi i arome modificate genetic ori obinute din organisme modificate genetic - M.Of. nr. 407/12.06.2002; actualizat

HG nr. 173/2006 privind trasabilitatea i etichetarea organismelor modificate genetic i trasabilitatea alimentelor i hranei pentru animale, obinute din organisme modificate genetic, M.Of. nr. 206/06.03.2006

HG 256/2006 privind hrana pentru animale i alimentele modificate genetic, M.Of.nr. 206/06.03.2006

OUG nr. 195/2005 privind protecia mediului, M.Of. nr. 1.196/30.12.2005, actualizat HG nr. 115 din 30 ianuarie 2008 privind instituirea sistemului naional de coordonare a afacerilor europene n vederea participrii Romniei la procesul decizional al instituiilor Uniunii Europene, M.Of. nr. 112/12.02.2008

Ordinul nr. 98 din 25 ianuarie 2008 pentru aprobarea Regulamentului privind organizarea i funcionarea Comisiei pentru Securitate Biologic, M.Of. nr. 100/08.02.2008

Ordinul nr. 466/22.04.2008 pentru stabilirea componenei nominale a Comisiei pentru Securitate Biologic (nepublicat n M.Of.)

Ordinul nr. 1295/2005 pentru aprobarea Formularului de prezentare a rezumatului notificrii privind introducerea deliberat n mediu a organismelor modificate genetic, n alte scopuri dect introducerea pe pia, M.Of. nr. 42/17.01.2006

Ordinul nr. 838/2005 pentru aprobarea ndrumarului privind aplicarea anexei nr. 12 "Planul de monitoring" la Ordonana Guvernului nr. 49/2000 privind regimul de obinere, testare, utilizare i comercializare a organismelor modificate genetic prin tehnicile biotehnologiei moderne, precum i a produselor rezultate din acestea, aprobat cu modificri i completri prin Legea nr. 214/2002 , M.Of. nr. 864/ 26.09.2005

Ordinul nr. 923/2005 privind aprobarea Formularului de prezentare a rezumatului notificrii privind introducerea pe pia a organismelor modificate genetic, ca atare sau n produse, M.Of. nr. 937/20.10.2005 99

Ordinul nr. 606/2005 privind aprobarea Formularului pentru prezentarea rezultatelor introducerii deliberate n mediu a plantelor superioare modificate genetic, n alte scopuri dect introducerea pe pia, M.Of.nr. 704/04.08.2005

Ordinul nr. 55/2007 pentru infiinarea Registrului naional al informaiei cu privire la modificrile genetice din organismele modificate genetic i transmiterea informaiei ctre Comisia European, M.Of. nr. 81/1.02.2007

Ordinul nr. 1829/2007 al ministrului mediului i dezvoltrii durabile pentru aprobarea ndrumarului privind evaluarea riscurilor asupra mediului i sntii umane, datorate introducerii deliberate n mediu i pe pia a organismelor modificate genetic, M.Of. nr. 856/13.12.2007

Ordinul nr. 973/21.08.2008 privind nfiinarea Registrului activitilor de utilizare n condiii de izolare a microorganismelor modificate genetic, M.Of. nr. 742/03.11.2008

Ordinul nr. 1718 din 16 decembrie 2009 pentru aprobarea formatului autorizaiei i al acordului de import privind introducerea deliberat n mediu a organismelor modificate genetic, n alte scopuri dect introducerea pe pia, M.Of. nr. 900/22.12.2009

Ordinul nr. 439/2009 privind aprobarea modelelor de formulare necesare procedurii de notificare pentru utilizarea n condiii de izolare a microorganismelor modificate genetic, M.Of. nr. 303/08.05.2009

Ordinul nr. 1.205 din 16/09/2009 pentru realizarea i funcionarea Registrului naional privind locaiile introducerii n mediu a organismelor modificate genetic, M. Of. nr. 663/05.10.2009

Ordinul nr. 890/2009 pentru modificarea unor acte normative care instituie tarife n domeniul proteciei mediului, M.Of. nr. 505/22.07.2009

100

4. HIBRIDAREA I CIBRIDAREA CELULAR

4.1. Hibridarea celular.

Hibridarea celular (hibridare somatic sau parasexuat) const n fuziunea a dou celule somatice, diferite genetic, n urma creia rezult un hibrid somatic ce cumuleaz materialul genetic nuclear i citoplasmatic de la cele dou celule paretale.

4.1.1. Obinerea protoplastelor.

La plante, pentru ca fuziunea s poat avea loc, trebuie mai nti s se obin protoplaste. Protoplastele se obin prin digestia enzimatic a peretelui celular cu celulaz i pectinaz. O serie de factori concur la obinerea i meninerea viabilitii protoplastelor, altfel structuri foarte fragile. Astfel conteaz grosimea peretelui celular, temperatura, uoara plasmoliz a celulelor naintea digestiei enzimatice, durata incubrii cu enzime, valoarea pH a soluiei enzimatice, uoara agitare. (Davey, 2005). Pentru plasmoliz se poate utiliza manitol sau sorbitol (13% Wt/Vol). Uneori este necesar meninerea esutului la ntuneric cca. 4 zile naintea digestiei enzimatice. Pentru obinerea protoplastelor se poate utiliza mezofilul de frunz, dup ndeprtarea epidermei, cotiledoane, ax hipocotil, calus friabil pentru iniierea suspensiei celulare embriogenice, mai ales n cazul monocotiledonatelor. Pentru determinarea viabilitii protoplastelor se utilizeaz diacetatul de fluoroscein, n Ultra Violet, la microscopul cu epifluoresscen. Mediu de baz pentru cultura protoplastelor este mediul MS (Murashige Skoog ) sau B5 (Gamborg). Ca surs de carbon se utilizeaz glucoza, zaharoza sau maltoza. Detalii privind compoziia mediului depind foarte mult de specie. Uneori se adaug lapte de cocos, auxine, citochinine, derivai de feniluree N-(2-cloro-4-piridil)N`feniluree) , brasinosteroizi etc. Protoplastele se cultiv n mediu lichid sau semisolid la o desime de 5x10 1x10 ml . Pentru a promova diviziunea mediul se poate suplimenta cu surfactani (0,1% Pluronic F68), antibiotice (250 g ml
-1 4 6 -1

i poliamine, cum ar fi putresceina

ca diamin. De asemenea adiionarea unor purttori de oxigen , cum ar fi hemoglobina i perfluorcarbonul este benefic pentru stabilitatea i supravieuirea protoplastelor.

4.1.2. Fuziunea protoplastelor

Fuziunea protoplastelor se poate face natural sau indus pe cale chimic sau pe cale fizic.

101

n mod natural, spontan, protoplastele pot s fuzioneze n timpul izolrii lor, rezultnd homocarioni, bi sau multinucleai (Lzr, 1983). Pentru obinere celulelor hibride prin fuziunea protoplastelor aparinnd diferiilor taxoni, se utilizeaz diferite metode de inducere ce presupun crearea unor condiii speciale pentru fuziune. Pentru inducerea fuziunii pe cale chimic prima oar s-a utilizat azotatul de sodiu (o,25 M), (Potrykus, 1971, citat de Lzr, 1983). Metoda nu s-a rspndit deoarece s-a dovedit puin eficient, frecvena fuziunii fiind foarte sczut (<0,01%) i n plus azotatul de sodiu poate avea efecte fitotoxice. O alt metod presupune utilizarea unei concentraii ridicate de ioni de Ca
0 ++

(50mM)

i a unei reacii alcaline (pH 10,5) la 37 C, timp de 30-40 minute. Prin aceast metod procentul de fuziune a crescut semnificativ , pn la valori ce pot depi 20 %. Utilizarea polietilenglicolului poate facilita, de asemenea fuziunea protoplastelor. Polietilenglicolul, cu o greutate molecular cuprins ntre 1540 i 6000, se utilizeaz n concentraie de 25-50% (W/V). Rezultate mai bune s-au obinut n cazul greutii moleculare mai ridicate, a concentraiilor mai mici, n prezena ionoilor de Ca
++

i a valorilor pH ridicate.

Durata tratamentului dureaz ntre 10 i 50 de minute, depinznd de originea i calitatea protoplastelor iar frecvena fuziunii poate fi cuprins ntre 1 i 40%. Polietilen glicolul poate fi nlocuit cu alcoolul de polivinil 20%, la un grad de polimerizare de 200-300. Electrofuziunea este o metod fizic de inducere a fuziunii. Aceast metod presupune doi pai: alinierea protoplastelor ntre electrozi, prin utilizarea unui curent alternativ de joas putere ( 10 kV m ) i nalt frecven (2 MHz) i fuziuna protoplastelor sub aciunea unui curent continuu, pulsatoriu de mare intensitate (100 kV m ), durata unui puls fiind de ordinul microsecundelor. De prcizat c conductivitatea mediului trebuie s aib valori sczute (mai mici dect 10 s m ) pentru a evita supranclzirea. Electrofuziunea este considerat cea mai eficient metod, deoarece se realizeaz n condiii fiziologice normale, fapt ce asigur o mai bun supravieuire a protoplastelor, astfel c frecvena heterofuziunii este cuprins ntre 60 i 80%. n urma fuziunii pot pot s rezulte homocarioni poliploizi, sau mai corect homogenomame, dac fuziunea are loc ntre dou protoplaste aparinnd aceleiai forme parentale, sau heterocarioni, sau heterogenoame, dac fuziunea are loc ntre protoplaste genetic diferite. Heteorgenoamele sunt rezultatul fuziunii unor nuclei diferii i a unor citoplasme diferite, cu organite de tipul plastidelor i mitocondriilor, diferite.
-3 -1 -1 -1

102

Heterogenoamele pot s segrege somatic, eliminnd n cele din urm unul dintre nuclei, astfel c va rezulta un cibrid.ce conine nucleul de la o form parentale iar citoplasma de la ambele forme. Poate s apar segregare i recombinri care s afecteze att cromozomii celor dou forme parentale ct i organitele citoplasmatice, fenomene pe care se bazeaz posibilitatea manipulrii genetice la nivelul celulelor somatice.

4.1.3. Izolarea celulelor hibride.

Dup fuziune o problem foarte important care trebuie rezolvat este izolarea celulelor hibride. Acest lucru se poate face pe cale mecanic, pe baza complementaritii metabolice sau genetice. Pe cale mecanic izolarea se face cu micropipete la micromanipulator, dac celulele parentale se pot diferenia fenotipic ( celule albinotice i verzi; cu sau fr antocian). n lipsa unor diferenieri vizibile a formelor parentale se poate proceda la marcarea cu fluorocromi a celulelor parentale (rhodamina B, fluoresceintiocianat). Se poate proceda i la selecia formelor hibride dup regenerare, pe baza efectului heterozis specific hibrizilor i a unor caractere morfologice ce difereniaz formele parentale. Evident c este necesar i confirmarea naturii hibride prin analize cotologice sau moleculare. Pentru sporirea eficienei acestei metode, metod care s-a dovedit a fi foarte laborioas, o soluie ar fi mbogirea n produi de fuziune prin centrifugare n gradient de densitate izoosmotic. (Harms i Potrykus, 1978, citat de Lzr, 1983). n cazul complementaritii metabolice se inactiveaz difereniat anumite enzime la formele parentale prin tratamentul fiecreia cu inhibitori specifici cum ar fi iodoacetatul i DEPC-ul. Ca urmare se vor putea multiplica numai celulele hibride ce au echipamentul enzimatic complet, funcional. n cazul complementaritii genetice se utilizeaz markeri genetici complementari i un anumit mediu de selecie. Dac se utilizeaz dou forme parentale auxotrofe, una purtnd markerii his i met , iar cealalt purtnd markerii his i met , pe un mediu de selecie lipsit de histidin i metionin vor supravieui numai celulele hibride. Un marcher genetic mult utilizat pentru selecia celulelor hibride este gena mutant ce controleaz deficiena pentru nitrat reductaz (NR ). Nitrat reductaza este o enzim ce particip n procesul de asimilare a azotului nitric, prin convertirea lui n azot amoniacal, fapt ce permite mai apoi sinteza aminoacizilor. Formele mutante au nevoie de azot amoniacal i nu sunt capabile s prolifereze pe un mediu cu azot nitric dar pot supravieui pe un mediu cu clorat de potasiu. Formele 103
+ +

slbatece, prototrofe, pot utiliza azotul nitric dar nu pot supravieui pe un mediu cu clorat deoarece nitrat reductaza produs de aceste forme acioneaz asupra cloratului rezultnd produi fitotoxici. n consecin pe un mediu de selecie cu azot nitric i clorat vor supravieui i se vor nmulii doar produii de fuziune hibrizi obvinui ntre cele dou linii celulare parentale. Se pot utiliza i marcherii de rezisten la antimetabolii cum ar fi 5-metiltriptofanul (5MT) i S(2-aninoetil)-cisteina (AEC) ce se comport dominant (fig.4.1).

Fig.4.1. Complementaritatea genetic la hibridul somatic obinut ntre dou linii celulare cu R marcherii ce determin rezistena la 5-metiltriptofan (5MT ) i S(2-aminoetil-cistein), R (AEC ), (dup Harms, 1983).

n consecin pe un mediu de selecie cu cei doi antimetabolii, vor supravieui doar celulele hibride ce au rezultat n urma fuziunii a dou linii celulare parentale, fiecre fiind sensibil la unul dintre antimetabolii.

4.1.4. Regenerarea plantelor hibride.

O etap important i relativ dificil este reprezentat de regenerarea plantelor hibride. n procesul de regenerare este posibil ca o parte din cromozomii unei specii s fie eliminai rezultnd hibrizii asimetrici. Acetia reprezint, n cazul hibrizilor ndeprtai, singura cale de realizare a recombinrilor genetice, oferind posibilitatea eliminrii unor gene nefavorabile.

104

4.1.5. Confirmarea naturii hibride.

Confirmarea naturii hibride a regeneranilor se poate face citologic sau cu ajutorul markerilor moleculari. Analiza citologic presupune cariotipare hibrizilor prezumtivi. Confirmarea naturii hibride pe aceast cale este uor de fcut dac formele parentale difer n privina numrului de cromozomi i a morfologiei cromozomilor. n lipsa unor repere morfologice evidente se poate apela la tehnica bandrii cromozomale. Analiza molecular se poate face chiar cu ajutorul marcherilor nespecifici RAPD, AFLP sau SSR, dac formele parentale sunt suficient de polimorfe. Hibridul trebuie s poarte suma benzilor cromozomale de la formele parentale. Se poate apela i la marcarea PCR, cu primeri specifici celor dou forme parentale sau la tehnica RFLP, utiliznd sonde specifice celor dou forme parentale. Exist i alte metode cum ar fi analiza izoenzimelor sau a metaboliilor secundari, dac formele parentale difer din aceste puncte de vedere (Harms, 1983)..

4.1.6. Importana hibridrii celulare.

Hibridarea celular pare a fi de interes mai ales pentru obinerea unor hibrizi ntre specii sau chiar genuri ndeprtate, nenrudite, hibrizi care nu pot fi obinui pe cale sexuat. Printre primii hibrizi somatici sunt hibrizii interspecifici ntre Nicotiana tabacum i Nicotiana rustica (Nagao,1978, citat de Cocking, 1983) Din pcate hibrizii intergenerici obinui prin fuziune de protoplase sunt, de regul, sterili iar utilizarea lor practic se rezum la speciile ce se pot multiplica vegetativ. Considerm c prin fuziunea de protoplaste a unor hibrizi somatici, obinui ntre forme ndeprtate genetic tot prin fuziune de protoplaste, se pot obine alopoliploizi fertili. De interes ar putea fi i hibrizii asimetrici obinui n urma hibridrii unor specii cultivate cu alte specii slbatece, pentru introducerea unor gene de rezisten, de pild. Aceti hibrizi rezult n urma segregrii somatice i eliminrii randomizate a unor cromozomi. Prin selecie se rein formele ce seamn mai mult cu specia cultivat dar poart caracterul dorit, de rezisten, de la specia slbatec. Pe aceast cale s-au obinut hibrizi somatici asimetrici n urma fuziunii de protoplaste ntre Lycopersicon esculentum i alte specii slbatice aparinnd genului cum ar fi L.pimpinelifoliumn i L.peruvianum de la care s-a obinut rezistena la septorioz, sau L.hirsutum i L.parviflorum de la care s-a obinut rezistena la fuzarioz. De asemenea s-au obinut forme rezistente la insecte prin prin fuziune

105

de protoplaste de Lycopersicon esculentum i Lycopersicon hirsutum, o specie ce poart o gen ce codific t-tridecanone cu propieti insecticide ( dup Devey i Kumar, 1983). Realizrile mai recente privint transferul unor caractere utile agronomic prin fuziune de protoplaste sunt prezentate n trabelul 6. Tabelul 6 Exemple privind transferul unor caractere agronomice utile prin fuziune de protoplaste (dup Davey i colab., 2005)
Specia Brassica napus (+) B. rapa B. napus (+) Crambe abyssinica B. napus (+) Orychophragmus violaceus B. napus (+) Sinapsis arvensis Citrus. amblycarpa (+) Citroncirus webberri C35 Caracterul util transferat Creterea biomasei Coninut crescut de acid erucic n semine Imbogirea seminelor n acizi grai Rezisten la Leptosphaera maculatus Imbuntirea calitii de portaltoi pentru lmiul mexican Toleran la virusul tristeza i Phytophthora Toleran la virusul tristeza i Phytophthora Creterea vigorii plantei Obinerea de triploizi Obinerea de cibrizi fr semine Rezisten la bacterioza Ralstonia solanacearum Rezisten la virusul cartofului Y Rezisten la Phytophthora infestans Rezisten la Ralstonia solanacearum Referina bibliografic Qian et al. 2003 Wang et al. (2003) Hu et al. (2002b) Hu et al. (2002) Medina-Urrutia et al. (2004)

C. reticulata cv. Blanco (+) C. volkameriana C. sinensis cv. Ruby Blood (+) C. volkameriana C. sinensis (+) Fortunella crassifolia C. sinensis (+) Clausena lansium C. unshiu cv. Guoqing No. 1 (+) C. reticulata cv. Blanco S. melongena (+) S. aethiopicum Resistance S. tuberosum (+) S. etuberosum S. tuberosum (+) S. nigrum S. tuberosum (+) S. stenotomum

Costa et al. (2003)

Costa et al. (2003)

Cheng et al. (2003) Fu et al. (2003) Guo et al. (2004)

Collonnier et al. (2001)

Gavrilenko et al. (2003) Szczerbakowa et al. (2003) Fock et al. (2001)

Prin fuziune intraspecific de protoplaste se pot bine forme autopoliploide.

106

4.2.

Cibridarea celular.

Cibridarea celular const n unirea a dou celule somatice parentale, una normal i alta enucleat sau cu nucleul inactivat, n urma creia rezult un cibrid (hibrid citoplasmatic) ce cumuleaz materialul genetic citoplasmatic de la ambele forme parentale iar materialul genetic nuclear de la una singur. Prin anumite tehnici este posibil s se transfere numai anumite organite de la o form parental la alta sau s se piard unele dintre acestea ca urmare a segregrii somatice rezultnd cibrizi asimetrici. Izolarea celulelor cibride i regenerarea cibrizilor reprezint, de asemenea, etape foarte importante i relativ dificil de fcut. Cibridarea celular ofer posibilitatea manipulrii genelor citoplasmatice ce

controleaz rezistena la erbicide, androsterilitatea .a.

107

5. HAPLOIDIA PRIN ANDRO I GINOGENEZ

5.1. Haploidia prin androgenez.

Haploidia prin androgenez const n regenerarea unor plante haploide in vitro din elementele haploide ale gametofitului mascul. Acest lucru a fost reuit pentru prima oar de ctre Guha i Maheshwari n 1964 la Datura innoxia. Haploizii androgenici se pot obine prin cultur de antere sau cultur de microspori pe un mediu artificial. n ambele cazuri haploizii se dezvolt din microspori, de regul uninucleai. n cazul culturii de antere procedeul este mai puin pretenios dar exist i posibilitatea formrii de embrioni somatici din peretele anterei, fapt ce poate crea o anumit stare de confuzie. Succesul metodei depinde de genotip, starea fiziologic a plantei donoare, pretratamentul butonilor florali, de regul cu temperatur sczut (4-5 C), mediul de cultur i balana hormonal utilizat, stadiul de dezvoltare a microsporilor. Dup cum s-a mai spus, de regul, se utilizeaz sporii uninucleai. Exist ns i excepii. La Licopersicon esculentum stadiul optim este la meioza I., n timp ce la Brassica oleracea cele mai bune rezultate s-au obinut prin cultivarea grunciorilor de polen maturi. n cazul culturii de mirospori trebuie adugate la mediul de cultur anumite componente prezente n peretele anterei (inozitol, glutamin, serin .a).
0

5.2.

Haploidia prin ginogenez.

Haploidia prin ginogenez const n regenerarea unor plante haploide in vitro din elementele haploide ale gametofitului femel. Haploizii ginogenici se pot obine prin cultur de ovare sau ovule nefecundate, pe un mediu artificial. Un procedeu mai aparte este cunoscut sub denumirea de metoda bulbosum, utilizat pentru prima oar de Kasha i Kao n 1970 la orz. n urma hibridrii sexuate a speciilor Hordeum vulgare i H.bulbosum, embrionul hibrid este salvat pe un mediu artificial. n decursul diferitelor generaii de diviziune mitotic, pe parcursul dezvoltrii embrionului, cromozomii de la bulbosum sunt eliminai, astfel c, n final, va rezulta un embrion i mai apoi o plant haploid cu toi cromozomii de la Hordeum vulgare. Avantajul obinerii haploizilor in vitro este reprezentat de posibilitatea obinerii acestora n numr mai mare.

108

5.3.

Importana practic a haploidiei.

Din punct de vedere teoretic haploizii sunt importani n studiile de citogenetic, n meioza lor putndu-se evidenia duplicaiile la nivelul genomului. De asemenea pe baza comportrii cromozomilor n meioza haploizilor se poate deduce originea pliploid a anumitor specii. Astfel natura tetraplid a lucernei i cartofului a fost confirmat ca urmare a apariiei frecvente a cromozomilor bivaleni la meioza haploizilor acestor specii. Totodat haploizii reprezint un material ideal pentru studiile de mutagenez. Din punct de vedere practic haploizii au fost utilizai pentru accelerarea procesului de ameliorare a hibrizilor de porumb, prin obinerea rapid a formelor parentale, homozigote. n urma dublrii numrului de cromozomi a haploizilor se obin direct linii dihaploide, perfect homozigote, ce pot fi utilizate cu succes pentru obinerea hibrizilor F1, comerciali, similar formelor parentale linii consangvinizate, obinute, ns, n urma unui proces laborios de autopolenizare ndelungat (Chase 1969). De asemenea, haploizii au fost utilizai pentru ameliorarea analitic a speciilor poliploide, cum este cartoful, grul, precum i pentru obinerea hibrizilor de sparanghel F1, 100% masculi (Bajaj, eds, 1990). n cazul grului, n procesul de ameliorare, se prefer utilizarea liniilor dihaploide obinute de la un material hibrid valoros, deoarece liniile dihaploide fixeaz noile recombinri n stare homozigot stabil. n cercetrile noastre am utilizat astfel de linii n contextul utilizrii marcherilor moleculari pentru ameliorarea rezistenei grului la septorioz i mlur(Botez i colab.2009; Coa i colab.,2009 ). n cazul cartofului, Wenzel n 1979 (citat de Bajaj, 1990) a propus utilizarea unei scheme pentru obinerea unui soi de cartof rezistent la patru rase de Phytophthora infestans, agentul patogen ce produce mana la cartof. n schem se utilizeaz att inducerea haploidiei maternale la Solanum tuberosum, prin hibridarea cu specia slbatec Solanum phureja, ct i utilizarea haploidiei androgenice in vitro pentru obinerea monoploizilor,iar mai apoi se utilizeaz hibridarea natural i fuziunea de protoplaste. Iniial s-au utilizat patru linii de cartof tetraploid (4x), fiecare linie purtnd cte o gen de rezisten la cte o ras a agentului patogen. De la acestea s-au obiut plante haploide (de fapt diploide 2x deoarece haploizii au numr gametic de cromozomi, deci redus la jumtate). Acetia au fost supui seleciei n condiii de infecie artificial cu rasele de Phytophthora infestans pentru care trebuie s fie rezisteni. De la haploizi s-au obinut monoploizi androgenici (cu x cromozomi) care au fost de asemenea testai n condiii de infecie artificial. Prin dublarea numrului de cromozomi s-au obinut forme diploide homozigote rezistente la cte o ras de Phytophthora infestans. Prin hibridare sexuat a cte dou forme diploide s-au obinut hibrizi 109

rezisteni la cte dou rase de Phytophthora infestans, iar prin fuziune de protoplaste s-a obinut o form rezistent la toate patru rasele de Phytophthora infestans. Sparanghelul (Asparagus officinalis) este o specie unisexuat dioic de la care se consum lstarii tineri obinui ,mai ales, de la plantele mascule. Pentru mrirea produciei se preconizeaz obinerea unor hibrizi F1, cu un potenial de producie mai ridicat deoarece se exploateaz efectul heterozis. n acest context s-a reuit, prin utilizarea haploidiei androgenice obierea unor hibrizi F1 100% masculi, deci de calitate superioar. Pentru aceasta de la plantele mascule a liniei tat B(XY) se obin , mai nti, haploizi androgenici, cu cromozomul sexului X sau Y. La indivizii haploizi, cu cromozolul Y, se dubleaz numrul de cromozomi obinnd supermasculi homozigoi B(YY). n continuare linia mam A(XX) se ncrucieaz cu linia tat B(YY) i se obin hibrizii F1 100% masculi, AB(XY).

110

6. VARIABILITATEA SOMACLONAL
Variabilitatea somaclonal reprezint variabilitatea evideniat printre plantele regenerate in vitro din celulele somatice. Termenul a fost introdus pentru prima oar de Larkin i Scowcroft n 1981. Cauzele variabilitii somaclonale pot fi epigenetice, datorate aciunii mediului asupra exprimrii genelor i genetice. Dintre cauzele genetice menionm: mutaia somatic, mutaia numeric cromozomal de tipul poliploidiei sau aneuploidiei, transpoziia elementelor genetice mobile, crossingover-ul amplificarea genic. Dintre factorii de care depinde manifestarea acestui fenomen menionm: genotipul, felul esutului din care se produce regenerarea i compoziia mediului de cultur. Dac pentru regenerare se trece mai nti prin faza de esut nedifereniat sau calus fenomenul variabilitii somaclonale este mult amplificat. n ceea ce privete mediul de cultur se pare c excesul de citokinine i clorur de calciu favorizeaz poliploidia n timp ce excesul de EDTA favorizeaz restructurrile cromozomale. Problema cea mai important i dificil este reprezentat de izolarea variaiilor utile. Acest lucru se poate face in vitro , nainte de regenerare sau in vivo,dup regenerare. Regenerarea in vitro, nainte de regenerare, este cea mai eficient deoarece unitatea de selecie este celula. Pentru izolarea celulelor ce prezint anumite variaii utile trebuie folosit un mediu de selecie adecvat. Prin adugarea la mediul de cultur a clorurii de sodiu n exces (3%) s-au obinut plante de n i orez rezistente la excesul de sruri. Prin adugarea la mediul de cultur de ioni de aluminiu s-au obinut plante de Nicotiana plumbaginifolia rezistente la aceti ioni. Prin adugarea la mediul de cultur a erbicidului 2.4D s-au obinut plante de ghizdei rezistente la acest erbicid. Prin adugarea la mediul de cultur a hidroxiprolinei s-au obinut plante de cartof rezistente la temperaturi sczute (-4 C). Prin adugarea la mediul de cultur n exces a unor aminoacizi eseniali (lizin, triptofan) sau a unor analogi ai acestora, se pot obine forme cu un coninut mai bogat n aceti aminoacizi. Pentru obinerea de forme rezistente la agenii fitopatogeni se poate aduga la mediul de cultur toxina agentului, dac acesta produce aa ceva, extractul crud sau chiar agentul patogen uor inactivat. Din pcate nu toate variaiile identificate in vitro se manifestin
0

somatic,

recombinarea

la

nivelul

ADN-ului

mitocondrial,

111

vivodup cum anumite forme de rezisten ce in de structura anatomo-morfologic a plantei (prezena cuticulei de exemplu ce nu se formeaz in vitro) nu se pot evidenia in vitro Confirmarea naturii genetice a variabilitii somaclonale se poate face i cu ajutorul markerilor moleculari (Botez i colab.,1999).

112

7. Bibliografie
1. Able,J.A., C.Rathus, I.D.Godwin, 2001, The Investigation of Optimal Bombardment Parameters for Transient and Stable Transgene Expression n Sorgum. n Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 37: 341-348. 2. Albert,H, E.C.Dale, E.Lee, D.W.Ow, 1995, Site-specific integration of DNA into wild-type and mutant lox sites placed n the plant genome. Plant J.,7(4):649-659. 3. Bajaj,I.P.S.,eds., II, 1990, Biotechnology n Agriculture and Forestry 12. Haploids n crop improvement I. Springer-Verlag, Germany. 4. Balazs Erika, C.Botez, A.Taoutaou, Dana Curticiu, Daniela Briciu, Laura Cristina Cota, Al.Briciu, 2010, Preliminary results concerning cloning resistance genes to Phytophthora infestans from Solanum tuberosum. Buletin USAVM Agriculture, 67 (1):29-34. 5. Binns,A.N., 1988, Cell Biology of Agrobacterium infection and Transformation of Plants. Ann.Rev. Microbiol.,42:575-606. 6. Birnboim,H.C., J. Doly, 1979, A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acid Research, Vol.9, nr.6, 1513-1523. 7. Bizily,S. C.L.Rugh, A.O.Summers, R.B.Meagher, 1999, Phytoremediation of methylmercury pollution: merBexpression n Arabidopsis thaliana confersresistance to organomercurials. Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A., 96: 6808-6813. 8. Botez C., Doru Pamfil, Marin Ardelean, Corina Ctan, Rodica Pop, 2002, Izolarea i clonarea genelor exprimate difereniat n vitro la mr (Malus domestica) sub influena unor factori de difereniere, Cercetri de Genetic Animal i Vegetal, vol.VII,p.328336. 9. Botez C., C.O.Marian, D.Pamfil, L.S.Muntean, S.Cernea, L.Muntean jr., 1999, Utilization of RAPD molecular markers to identify somaclonal variation n hop plants (Humulus lupulus L.), Hameiul i Plantele Medicinale, anul VII nr.1-2 (13-14), p.6772. 10. Botez C., D.Pamfil, Dana Curticiu, Laura Cota, N.N.Sulescu, 2009, Marker Assisted Selection for Septoria tritici Resistance n Wheat Dihaploid Lines. Not.Bot.Hort.Agrobot. Cluj, 37: 253-255. 11. Botez C., M.Ardelean, C.Marian, 1997, Improvement of yield quality of crop plants by Means of Genetic Engineering, Buletin USAMVCN-AH, 52, p.11-16. 12. Botez,C., M.Savatti, M.Ardelean, 1995a, Ameliorarea rezistenei plantelor la boli i duntori cu ajutorul metodelor de inginerie genetic, Buletin USACN, A-H, vol 49, nr.1. 13. Botez,C., M.Savatti, M.Ardelean, Elena Tma, M.Savatti jr., 1995b, Ameliorarea rezistenei plantelor de cultur la erbicide cu ajutorul metodelor de inginerie genetic. Buletin USACN, A-H, 49/2. 14. Botstein, D., White, R.L., Skolnick, M., Davis, R.W., 1980, Construction of a genetic linkage map n man using restriction fragment length polymorphisms, Am J Hum Genet
32(3):314-31.

113

15. Chase,S.S., 1969, Monoploids and monoploid-derivatives of maize (Zea mays L.). The Botanical Review, 35:117-168. 16. Christou P., 1994, Gene transfer n plants via particle bombardment. Plant Molecular Biology Manual A2: 1-15, Kluwer Academic Publisher, Belgium. 17. Cipriani, G., Lot, G., Huang, W.-G., Marrazzo, M. T., Peterlunger, E., Testolin, R. (1999), AC/GT and AG/CT microsatellite repeats n peach [Prunus persica (L) Batsch]: isolation, characterisation and cross-species amplification n Prunus, Theor Appl Genet , 99: 65-72. 18. Clark,M.S., 1997, Plant Molecular Biology, A Laboratory Manual. Springer. 19. Clive, J., 2011. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2011. ISAAA Brief No. 43. ISAAA: Ithaca, NY. 20. Cocking,E.C.,1983, Aplication of Protoplast Technology to Agriculture. Protoplast. Lecture Proceedings 6th International Protoplast Symposium, Basel. Birkhuser Verlag. 21. Coa Laura Cristina, C.Botez, M.A.Grigora, Dana Curticiu, 2009, A putative RAPD Marker for Common Bunt Resistance n Wheat Dihaploid Lines. Buletin USAMV Agriculture, 66: 539. ISSN 1843-5246. 22. Davey MR, A.Kumar, 1983, Higher plant protoplastsretrospect and prospect. Int Rev Cytol Suppl ;16:219 299. 23. Davey,M.R., E.L.Reach, B.J.Mulligan, 1989, Direct DNA transfer to plant cells. Plant Molecular Biology, 13: 273-285. 24. Davey,M.R., P.Antony, J.B.Power, K.C.Lowe, 2005, Plant protoplast: status and biotrechnological perspectives. Biotechnology Advances 23: 131171. 25. Day,C.D., E.Lee, J.Kobayashi, L.D.Holappa, H.Albert, D.W.Ow, 2000, Transgenic integration into the same chromosome location can produce alleles that express at a predictable level, or alleles that are differentially silenced. Genes Dev., 14: 2869-2880. 26. De la Pna A.,H.Lrz, J.Schell, 1987, Transgenic rye plants obtained by injecting DNA into young floral tillers. Nature 325: 274-276. 27. De Vicente, M.C., Lpez, C. and Fulton, T. (eds.). 2004. Genetic Diversity Analysis with Molecular Marker Data: Learning Module. International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI), Rome, Italy 28. Delbart,F.C., J.R.Messai, M.Tepfer, 1990, Stratgies pour interfrer avec le dvloppment viral. Biofutur, Septembre: 61-64. 29. Dhankher,O.P., Y.Li, B.P.Rosen, J.Shi, D.Salt, J.F.Senecoff,N.A.Sashti, R.B.Meagher, 2002, Engineering tolerance and hyperacumulation of arsenic n plants by combining arsenat reductase and -glutamylcysteine syntetase expression. Nat. Biotechnol.20:1140-1145. 30. Dhekney, S.A., Z.T.Li, D.J.Gray, 2011, Grapevines Engineered to Express Cisgenic Vitis vinifera Thaumatin/like Protein Exhibit Fungal Disease Resistance. n Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 47:458-466. 31. Djennane,S., C.Cesborn, S.Sourice, K.Loridon, E.Chevreau, 2009, Production of Transgenic Pear Plants Expressing Ferritine Gene with the Aim to Reduce Fire Blight

114

Susceptibility. Proc.XIIth Eucarpia Symp.on Fruit Genetics.Eds.:R.Socias i Company et al. Acta Hort.814:781-783.

Breeding

and

32. Downey, S. L., Iezzoni, A. F. (2000), Polymorphic DNA markers n black cherry (Prunus serotina) are identified using sequences from sweet cherry, peach, and sour cherry, J Am Soc Hort Sci, 125:7680. 33. Ebinuma,H., K.Sugita, E.Matsunaga, M.Yamakado, 1997, Selection of marker-free transgenic plants using the isopentyl transferase gene. Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 2117-2121. 34. Ercisli S., G. Agar, N. Yildirim, B. Duralija, A. Vokurka and H. Karlidag. 2011. Genetic diversity n wild sweet cherries (Prunus avium) n Turkey revealed by SSR markers. Genet. Mol. Res. 10 (2): 1211-1219 (2011) 35. Erik,A., Van Der Biezen, J.J.Mark, Van Haaren, B.Overduin, H.John, J.Nijkamp, J.Hille, 1994, Heterologous transposon tagging as a tool for the isolation of plant genes. Plant Molecular Biology Manual K2: 1-16, Kluwer Academic Publisher, Belgium. 36. Foster,G.D., D.Twell, 1996, Plant gene isolation, principles and practice. Ed.John Wiley&Sons, Ltd.England. 37. Frame,B.R., H.Zhang, s.M.Cocciolone, L.V.Sidorenko, C.R.Dietrich, S.E.Pegg, S.Zhen, P.S.Schanable, K.Wang, 2000, Production of Transgenic Maiye from Bombardment Type II Callus: Effect of Gold Particle Siye and Callus Morfology on Transformation Efficiency. n Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 36:21-29. 38. Fukushige, S., B.Sauer, 1992, Genomic tageting with a positive selection lox integration vector allows highly reproducible gene expression n mamalian cells. Proc.Natl.Acad.Sci.,89:7905-7909. 39. Galun,E., A.Breiman, 1997, Transgenic Plants, Imperial College Press. London. 40. Ganopoulos Ioannis V., Evagellia Avramidou, Dionisia A. Fasoula, Grigorios Diamantidis and Filippos A. Aravanopoulos. 2010. Assessing inter- and intra-cultivar variation n Greek Prunus avium by SSR markers. Plant Genetic Resources: Characterization and Utilization (2010) 8(3); 242248 41. Gartland K.M.A.(editor), 1993, Techniques for Engineering Genes. Biotechnology by open learning. Butterworth-Hainemann Ltd. 42. Grant D., Shoemaker R. C., (2001) PLANT GENE MAPPING TECHNIQUES, Encyclopedia of Life Science, Nature Publishing Group, www.els.net 43. Grant, D., Shoemaker R. C. (2001), Plant gene mapping techniques, Encyclopedia of Life Science, Nature Publishing Group, www.els.net. 44. Ha,C.D., P.G.Lemaux, M.J.Cho, 2001, Stable transformation of Recalcitrant Kentucky Bulegrass (Poa pratensis L.) Cultivar Using Mature Seed-Derived Highly Regenerative Tissues. n Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 37: 6-11. 45. Hall,G.E.Jr., S.Spiker, 1994, Isolation and characterization of nuclear scaffold. Plant Molecular Biology Manual D2: 1-24, Kluwer Academic Publisher, Belgium. 46. Hamilton A., O.Voinnet, L.Chappell, D.Baulcombe, 2002, Two classes of interfering RNA n RNA silencing. EMBO J.,21: 4671-4679.

115

47. Harms,C.T., 1983, Somatic Hybridisation by Plant Protoplast Fusion. Protoplast. Lecture Proceedings 6th International Protoplast Symposium, Basel. Birkhuser Verlag. 48. Hrouart, D., H.Willekens, M.van Montagu, D.Inz, 1992, Activation Transcriptionnelle des Gnes Lors des Stress Oxydants. Biotechnologies`92, Le Biople, Le Conseil Regional de Picardie :71-77. 49. Higuchi R, Krummel B, Saiki R, 1988, A general method of n vitro preparetion and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res 16 (15): 735167. 50. Huang, W.-G., Cipriani G., Morgante M., Testolin R. (1998), Microsatellite DNA n Actinidia chinensis: isolation, characterisation, and homology n related species, Theor Appl Genet, 97: 12691278. 51. Hunt,A.G., I.B.Maiti, 2001, Strategies for Expressing Multiple Foring Genes n Plants as Polycistronic constructs. n Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 37:313-320. 52. Jacobsen,E., 2008, Cisgenesis: a new approach for introgression breeding. Eds.J.Prohens, M.L.Badenes, Modern varietz Breeding for Present and Future Needs, Editorial Universidad Politecnica de Valencia, Valencia, Spain, 678. 53. Jeffreys, A.J., Wilson, V., Thein, S.L., 1985, Hypervariable Minisatellite regions n human DNA, Nature 314: 67-73. 54. Jin,S., T.Komari, M.P.Gordon, E.W.Nester, 1987, Genes responsible for the supervirulencephenotype of Agrobacterium tumefaciens A281. J.Bact.,169:44174425. 55. Julian, K., C. Ma, E. Barros, R. Bock, P. Christou, P. J. Dale, P. J. Dix, R. Fischer, J. Irwin, R. Mahoney, M. Pezzotti, S. Schillberg, P. Sparrow, E. Stoger, R. M. Twyman, 2005, Molecular farming for new drogs and vaccines. Current perspectives on the production of pharmaceuticals n transgenic plants. EMBO Rep. 6(7):593-599. 56. Karcher, S.J., 1994, Non-radioactiv acid detection system. Plant Molecular Biology Manual F3: 1-25, Kluwer Academic Publisher, Belgium.. 57. Karp, A., Seberg, O. i Buiatti, M., 1996, Molecular techniques n the assessment of botanical diversity, Annals of Botany 78:143149. 58. Kikkert,J.R., G.A.Humiston, M.K.Roy, J.C.Sanford, 1999, Biological Projectiles (Phage, Yeast, Bacteria) for Genetic Transformation of Plants. n Vitro Cell.Dev. Biol.-Plant 35: 43-50. 59. Klein,T.M., M.E.Fromm, T.Gradziel, J.C.Stanford, 1988, Gene transfer into Zea mays cells by high-velocity microprojectiles is monitored with -Glucuronidase marker. Bio-Technology 6:559-563. 60. Korban,S.S., 2002, Targeting and Expression of Antigenic Proteins n Transgenic Plants for Production of Edible Vaccines. n Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 38:231-236. 61. Lai,F.M., K.Mei, M.Luke, J.Todd, 2007, Application of Two New Selectable Marker Genes, dsdA and dao1, n Maize Transformation. Biotechnology and Sustainable Agriculture 2006 and Beyond, Beijing, China, pg.141-142, Springer, Xu i colab.editor. 62. Larkin, P.J., W.R.Scowcroft, 1981,Somaclonal variation- a novel sours of variability from cell cultures for plant improvement. Theor.Appl.Genet. 60: 197-2014. 116

63. Latham, J.R., A.K.Wilson, 2008, Viral protein transcomplementation: a neglected risk of virus resistent transgenic plants. Eds.J.Prohens, M.L.Badenes, Modern varietz Breeding for Present and Future Needs, Editorial Universidad Politecnica de Valencia, Valencia, Spain, 679. 64. Lzr,G.B.,1983, Recent Development n Plant Protoplast Fusion and Selection Technology. Protoplast. Lecture Proceedings 6th International Protoplast Symposium, Basel. Birkhuser Verlag. 65. Leyser,O., C. Chang, 1996, Chromosome Walking. Plant Gene Isolation: principle and Practice, Gary D.Foster i David Twell eds., England. 66. Lnnig, W.E., P.Huijser, 1994, Gene tagging by endogenous transposones. Plant Molecular Biology Manual K1: 1-15, Kluwer Academic Publisher, Belgium. 67. Lupan,I., S.Valimareanu, A.Coste, O.Popescu, 2010, Molecular cloning of agglutinin gene from Galanthus nivalis for Lettuce transformation. Romanian Biotechnological Letters Vol. 15, No.2, Supplement, 69-77. 68. Malony, M., J.S.Venisse, M.N.Brisset, E.Chevreau, 2003, Expression of bovine lactoferrine cDNA confers resistance to Erwinia amylovora n transgenic pear. Mol.Breed., 12 231-244. 69. Marian C., C.Botez, 1996a, Instability of transgene expression n plants I-Modes of transgene silencing and silencing due to transcriptional inactivation, Buletin USACN, A-H, 50/1,p.57-66. 70. Marian C., C.Botez, 1996b, Instability of transgene expression n plants II- Silencing due to posttranscriptional inactivation events, Buletin USACN,A-H, 50/1,p.67/76. 71. Mnejja, M., Garcia-Mas, J., Howad, W. i Ars, P. (2005), Development and transportability across Prunus species of 42 polymorphic almond microsatellites, Molecular Ecology Notes, 5: 531535. 72. N. Senthil Kumar and G. Gurusubramanian, 2011. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers and its applications. Sci Vis 11 (3), 116-124. 73. Nato,K., K.Y.Watanabe, H.Ebinuma, 2005, Agrobacterium-mediated RMCE approach for gene replacement. Plant Biotechnol.J. 3(2):203-214. 74. Neale, D.B., Williams, C.G., 1991, Restriction fragment length polymorphism mapping n conifers and applications to forest genetics and tree improvement, Can J For Res 21:545-554. 75. Neuhaus,G., G.Spangenberg, O.M.Scheid, H.G.Schweiger, 1987, Transgenic rapeseed plants obtained by the microinjectionof DNA into microspore-derived embryoids. Theor.Appl.Genet., 70:30-36. 76. Old,R.W., S.B.Primrose, 1994, Principles of Gene Manipulation, an Introduction to Genetic Engineering. Bleckwell Science, Universitz of Warwick. 77. Olive D. M., Bean P. (1999), PRINCIPLES AND APPLICATIONS OF METHODS FOR DNA-BASED TYPING OF MICROBIAL ORGANISMS, Journal Of Clinical Microbiology, 37(6): 16611669 78. Olive, D. M., Bean P. (1999), Principles and applications of methods for DNA-based typing of microbial organisms, Journal Of Clinical Microbiology, 37(6): 16611669.

117

79. Ow., 2002, Recombinase-directed plant transformation for the post-genomic era. Plant.Mol.Biol.,48:183-200. 80. Pang,S.Z., D.L.DeBoer, Y.Wan, G.Ye, J.G.Layton, M.K.Nher, C.L.Armstrong, J.E.Fry, M.A.W.Hinchee, M.E.Fromm, 1996, An Improved Green Fluorescent Protein Gene as a Vital Marker n Plants. Plant Physiol.,112:893-900. 81. Paran I and Michelmore RW. 1993. Development of reliable PCR based markers linked to downy mildew resistance genes n lettuce. Theoretical and Applied Genetics 85:985993. 82. Pcurar,D.I., ,H. T.Christensen , M. L. Pcurar, D. Pamfil , C. Botez , C. Bellini, 2011, Agrobacterium tumefaciens: From crown gall tumors to genetic transformation. Physiological and Molecular Plant Pathology xxx : 1-6. 83. Pileggi,M., A.A.M.Pereira, J.S.Silva, S.A.V.Peleggi, D.P.S.Verma, 2001, An Improved Method for Transformation of Lettuce by Agrobacterium tumefaciens with a Gene that Confers Frizing Resistance. Brazilian Archives of Biology and Technology,.44/2:191-196. 84. Potrykus,I., 1991, Gene Transfer to Plants: Assesment of Published Approach and Results.Ann.Rev.Plant Physiol.Plant MolBiol.,42:205-225. 85. Potrykus,I., 2011, Golden Rice Tale. AgBioWorld. 86. Qutier,F., B.Lejune, M.J.Haumont, D.Squalli,P.Lebacq, 1988, Le point sur quelques techniques utilises en biologie molculaire vgtale et les perspectives. Bull.Soc.bot.Fr., Actual. Bot., 2: 5-22. 87. Rafalski, J.A. i Tingey, S.V., 1993, Genetic diagnostics n plant breeding: RAPDs, microsatellites and machines, Trends n Genetics 9 (8): 275-279. 88. Rao,K.V., K.S. Rathore, T.K. Hodges, X. Fu, E. Stoger, D. Sudhakar, S. Williams, P.Christou, M. Bharathi, D.P. Bown, K.S. Powell, J. Spence, A.M. Gatehouse, J.A.Gatehouse, 1998, Expression of snowdrop lectin (GNA) n transgenic rice plants confers resistance to rice brown planthopper Plant J. 15: 469-477. 89. Roberts M., 1996, Transposon-mediated Insertional Mutagenesis. Plant Gene Isolation:Principle and Practice. Ed.by G.D.Foster and D.Twell. John Wiley&Sons Ltd. 90. Rugh, C.L., H.D.Wilde, N.M.Stuck, D.M.Thomson, A.O.Summers, R.B. Meagher, 1996, Mercuric ion reduction and resistance n transgenic Arabidopsis thaliana plants expressing a modified bacterial merA gene. Proc. Natl.Acad.Sci. U.S.A., 93:31823187. 91. Saalbach, I., M.Riehl, M.Giersberg, J.Kumlehn, D.Falkenburg, 2007, Production of Recombinant Antibodies n Pea Seeds and Their Oral Application n Piglets. Biotechnology and Sustainable Agriculture 2006 and Beyond, Beijing, China, pg.399402, Springer, Xu i colab.editor. 92. Sanford,J.C., 1988, The biolistic process. Trends Biotech. 6:299-302. 93. Schafer,W., A.Gorz, G.Cahl, 1987, T-DNA integration and expression n a monocot crop plant after induction of Agrobacterium. Nature 327, 529-531. 94. Schultz,B., M.J.Bennett, B.P.Dilkers,K.A.Feldman, 1995, T-DNA tagging n Arabidopsis thaliana : Cloning by gene disruption. Plant Molecular Biology Manual K3: 1-17, Kluwer Academic Publisher, Belgium. 118

95. Selvaraj,N., S.Kasthurirengan, A.Vasudevan, M.Manickavasagam, C.W.Choi, A.Ganapatbi, 2010, Evaluation of Green Fluorescent Protein as a Reporter Gene and Phospinotricin as the Selective Agent for Achieving a Higher Recovery of Transformant n Cucumber (Cucumis sativus L.cv.Poinsett76) via Agrobacterium tumefaciens. n Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 46:329-337. 96. Sheehy,R.E., M.Kramer, W.R.Hiatt, 1988, Reduction of polygalacturonase activity n tomato fruit by antisens RNA. Proc. Natl.Acad.Sci. USA.,85:8805-8809. 97. Srivastava,V., M.A.Nieto, A.J.Wilson, 2004, Cre-mediated site-specific gene integration for consistent transgene expression n rice. Plant Biotechnology Journal. 2:169-179. 98. Staub J.E., Serquen, F.C. (1996), GENETIC MARKERS, MAP CONSTRUCTION, AND THEIR APPLICATION n PLANT BREEDING, Hortscience 31(5) 729-741. 99. Staub JE, Serquen FC and Gupta M. 1996. Genetic marchers, map construction, and their application n plant breeding. HortScience 31:729741 100. Subudbi ,P.K., N.Basiakb, 2011, Spartina alterniflora Loisel., a Halophyte Grass Model to Dissect Salt Stress Tolerance. n Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 47:441457. 101. Suzuki,D.T., A.J.F.Griffith, J.H.Miller, R.C.Lewontin, 1986, An Introduction to Genetic Analysis. W.H.Freeman and Company/New York. 102. Takeuchi,Y., M.Dotson, N.T.Keen, 1992, Plant transformation: a simple particle bombardment device based on flowing helium. Plant.Mol.Biol., 18:835-839. 103. Tang,K., Q.Hu, X.Sun, B.Wan, H.Qi, X.Lu, 2001, Development of Transgenic Rice Pure Lines with Enhanced Resistance to Rice Brown Planthopper. n Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 37: 334-340. 104. Tian,L., S.Zhang, H.S.Hon, A.Svircev, D.C.Brown, R.Wen, 2007, PPV Specific Hairpin RNAs is an Effective Method for Plum Pox Potyvirus Resistance. Biotechnology and Sustainable Agriculture 2006 and Beyond, Beijing, China, pg.103106, Springer, Xu i colab.editor. 105. Tinland,B., 1996, The integration of T-DNA into plant genoms. Trends n plant science. 1/6:178-183. 106. Vaeck,M., A.Reynaerts, H.Hofte, S.Jansens, M. De Beuckeleer, C.Dean, M.Zabeau, M.van Montagu, J.Leemans, 1987, Transgenic plants protected from insect attack. Nature 328:33-37. 107. Vaucheret,H., J.C.Palauqui, T.Elmayn, B.Moffatt, 1995, Molecular and genetic analysis of nitrite reductase co-suppression n transgenic tobacco plants. Mol.Gen.Genet.,248:311-317. 108. Vila, J., Marcos M. A., Jimenez de Anta M. T. (1996), A comparative study of different PCR-based DNA fingerprinting techniques for typing of the Acinetobacter calcoaceticus-A. baumannii complex, J. Med. Microbiol., 44:482489 109. Vila, J., Marcos M. A., Jimenez de Anta M. T., (1996), A COMPARATIVE STUDY OF DIFFERENT PCR-BASED DNA FINGERPRINTING TECHNIQUES FOR TYPING OF THE ACINETOBACTER CALCOACETICUS-A. BAUMANNII COMPLEX. J. Med. Microbiol. 44:482489.

119

110. Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M and Zabeau M. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23:44074414. 111. Vos Pieter, Rene Hogers, Marjo Bleeker, Martin Reijans, Theo van de Lee, Miranda Hornes, Adrie Frijters, Jerina Pot, Johan Peleman, Martin Kuiper and Marc Zabeau, 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 1995, Vol. 23, No. 21 4407-4414 112. Walterpeach,C.R., J.Velten, 1994, Agrobacterium mediated gene transfer to plant cells: Cointegrate and binary vectors syistems. Plant Molecular Biology Manual B1: 1-19, Kluwer Academic Publisher, Belgium. 113. Wang,Z., K.Zhang, X.Sun, K.Tang, J.Zhang, 2005, Enhancement of resistance to aphids by introducing the snowdrop lectin gene gna into maize plants. Jbiosci.,30(5):627-.638. 114. Wang,Z., Y.Ge, 2006, Recent Advances n Genetic Transformation of Forage and Truf Grasses. n Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 42:1-18. 115. Weising K., Nybom H., Wolff K. Meyer W., (1995) DNA FINGERPRINT n PLANTS AND FUNGI, CRC Press Inc. 116. Williams J., Reiter R., Young R., Scolnik P., (1993), GENETIC MAPPING OF MUTATIONS USING PHENOTYPIC POOLS AND MAPPED RAPD MARKERS., Nucleic Acids Res.. 21(11): 2697-702. 117. Williams, J., Kubelik A., Livak K., Rafalski J., Tingey S. (1990), DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers, Nucleic Acids Research, 18 (22): 6531-6535. 118. Wnsch, A. i Hormaza, J.I. (2002), Molecular characterisation of sweet cherry (Prunus avium L.) genotypes using peach [Prunus persica (L.) Batsch] SSR sequences, Heredity: 89, 5663. 119. Yabor,L. B.Valle, C.Carvajal, C.Aragn, M.Hernndez, J.Gonzles, M.Daquinta, A.Arencibia, J.C.Lorenzo, 2010, Characterization of a Field-grown Transgenic Pinapple Clone Containing the Genes Chitinase, A24, and Bar. n Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant, 46:1-7. 120. Yamamoto, T., Kimura, T., Sawamura, Y., Kotobuki, K., Ban, Y., Hayashi, T., Matsuta, N. (2001), SSRs isolated from apple can identify polymorphism and genetic diversity n pear, Theor Appl Genet, 102: 865870.
121. Zabeau, M and P. Vos. 1993. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerprinting. European Patent Office, publication 0 534 858 A1, bulletin 93/13.

122. Zagrai I., Ravelonandro M., Gaboreanu I., Ferencz B., Scorza R., Zagrai L., Kelemen B., Pamfil D., Popescu O. 2011, Transgenic Plums Expressing the Plum Pox Virus (PPV) Coat Protein Gene Do Not Assist the Development of PPV Recombinants Under Field Conditions. Journal of Plant Pathology, 93 (1), 159-165 123. Zagrai Ioan. 2007. Cercetari privind rezistenta prunului la virusul Plum pox i ameliorarea acesteia prin metode conventionale. Editura INVEL Multimedia Bucuresti.

120

124. Zane, L., Bargelloni, L., Patarnello, T. (2002), Strategies for microsatellite isolation: a review, Mol. Ecol., 11: 116 125. Zhang,J., N.Y.Klueva, Z.Wang, R.Wu, T.D.Ho, H.T.Nguyen, 2000, Genetic Engineering for Abiotic Stress Resistance n Crop Plants. n Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 36:108-114.

121