PCR = Polymerase Chain Reaction

Reactia de polimerizare in lant a

Acidului Dezoxiribonucleic (ADN)
• Este o tehnica prin care se genereaza multiple
copii identice, pornind de la (ipotetic) 1 singura
molecula de ADN - matrita.
• Mai multe molecule sunt mai usor de detectat
/analizat si de prelucrat ulterior (transfer pe
membrana, hibridizare, secventiere etc)
• Copiaza in vitro procesul biologic de Replicare a
ADN
– Reactia PCR a fost descoperita in 1983 de
catre Kary B. Mullis (1993 - Premiul Nobel)
– Reactia care a revolutionat Biologia
Moleculara a Acizilor Nucleici.
– Dezvoltarea tehnicii are la baza
descoperirea Taq- Polimerazei (izolata din
Thermus aquaticus), enzima-cheie a
reactiei, o polimeraza stabila la temperaturi
inalte (~94o C), la care moleculele de ADN,
in mod normal dublu catenare, disociaza si
astfel fiecare catena poate fi copiata.
• Componentii reactiei ciclice:
-ADN-ul care contine secventa ce urmeaza
a fi amplificata, de obicei ADN genomic
-amorse
-patru feluri de nucleozide trifosfat (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP)
-ADN polimeraza
-solutia tampon in care aceste elemente
sunt amestecate.
• Cantitatea de ADN de la care porneste
amplificarea, poate fi foarte redusa. De obicei
mai putin de 1 µg de ADN genomic total este
suficient, dar PCR poate fi folosita pentru
amplificarea unor secvente chiar dintr-o singura
molecula de ADN. Pentru o amplificare eficienta,
secventa tinta trebuie sa nu fie mai mare de cca
3 kb, deoarece Taq polimeraza devine instabila
din punct de vedere termodinamic dupa sinteza
unei catene lungi de cateva kb si se desprinde
de matrita.
• O conditie obligatorie este cunosterea prealabila
a secventelor care flancheaza regiunea ce
urmeaza a fi amplificata. Aceasta permite
selectarea (construirea) amorselor potrivite cu
secvente complementare celor cunoscute pe
flancuri.
 Amorsele sunt oligonucleotide sintetizate pe cale
chimica, de lungime diferita, de obicei intre 17-30 de
baze. Amorsele trebuie sa satisfaca urmatoarele cerinte:
• Secventa amorselor tebuie sa fie unica in regiunea ce
urmeaza a fi amplificata. Aceasta asigura amplificarea
unui fragment unic.
• Amorsele trebuie sa aiba o “clema G/C” de 1-2
nucleotide la capatul 3’. Includerea unei baze G sau C la
capatul 3’ ajuta la realizarea unei atasari corecte a
amorselor la matrita.
• Amorsele trebuie sa nu aiba portiuni complementare in
interiorul propriei secvente, ceea ce ar duce la structuri
partial dublu catenare, impiedicand hibridizarea cu
matrita.
• Cele doua amorse trebuie sa nu prezinte portiuni
complementare intre ele; ar duce la formarea de amorse
dimeri, cauzatori de artefacte.
• Temperatura de topire trebuie sa fie aceeasi pentru
ambele amorse.
 Principiul tehnicii PCR:

• Instrument: termociclu
• Program de incalziri / raciri repetate,
la temperaturi bine precizate …
• moleculele de ADN se separa…
• - in prezenta enzimei Taq-polimeraza + primeri
(amorse) + amestec de dNTP-uri (monomerii) +
MgCl 2
• - fiecare catena se “lasa copiata”, dand nastere unei
catene-surori, complet noua si identica
• - La randul lor, noile catene se vor separa si vor
servi drept matrite
• - Astfel, din 1 molecula initiala dublu catenara  2
molecule dublu catenare identice  4 molecule 
…
• -  … dupa de 32 de cicluri: > 1 milion de catene
identice
• Denaturarea moleculei de ADN
ADN-ul este o macromolecula polimerica, alcatuita
din 2 catene complementare, antiparalele. La 94o C,
cele 2 catene se separa  “Denaturarea”.
• Alinierea amorselor
(primerilor)
Amorsele = oligonucleotide
complementare cu capetele
fragmentului de amplificat
Taq-polymeraza recunoaste
capatul 3’ al amorsei atasata
la catena-matrita si incepe
elongarea acesteia.
Temperatura de hibridare
este de obicei intre 55-65oC
si permite amorselor sa se
ataseze la secventele lor
omoloage de pe matrita.
• Elongarea sau extensia
amorselor

Nucleotidele (caramizile)
se aseaza pe baza de
complementaritate la
matrita si vor fi legate
intre ele de catre Taq-
polimeraza.
Temperatura de extensie,
de 72-74oC, asigura
functionarea optima a
Taq-polimerazei si in
consecinta sinteza ADN.
Denaturare / aliniere /
elongare – repetate in
cateva zeci de cicluri
succesive …
• Detectarea / recunoasterea ampliconilor
– ulterior, ampliconii (fragmentele ADN obtinute) se detecteaza
prin electroforeza in gel de agaroza
– avand aceeasi dimensiune, toate moleculele vor avea
aceeasi mobilitate electroforetica si vor genera benzi la
aceeasi distanta;
– greutatea moleculara a ampliconilor se poate afla prin
compararea cu un marker de greutate care migreaza in
paralel.
 Aplicatii ale tehnicii PCR
- Prin detectarea prezentei unui fragment de ADN,
considerat drept “marker”, intr-un genom …
– Prezenta unei anumite specii sau tulpini bacteriene
intr-o populatie mixta (ex. confirmare bacteriologica)
– Caracterizarea si deosebirea unor taxoni infraspecifici
(ex. tulpina) – cu aplicatii in epidemiologie
– Diferite moduri de utilizare a tehnicii pot da combinatii
de markeri genomici ce pot constitui un pasaport
genetic pentru respectiva varietate (licenta pentru
tulpini de interes, soiuri si hibrizi – in agricultura)
– Diagnostic uman pentru maladii non-infectioase (gena
mutanta exista sau nu, individul este homo- sau
heterozigot)