MICROBIOLOGIE ALIMENTAR

CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL
ALIMENTELOR

EXAMENUL MICROBIOLOGIC AL ALIMENTELOR DE

ORIGINE ANIMAL
Determinarea prezenei i numrului de bacterii
coliforme (coliformi totali) i a speciei Escherichia coli
STAS ISO 4832

Bacteriile coliforme = bacili Gram -, aerobi, facultativi anaerobi, oxidazopozitivi i care n cel mult 48 h de incubare la 30-37C, fermenteaz lactoza
cu producere de acid i gaz

Escherichia coli = bacterie coliform, la 44C fermenteaz lactoza, cu

producere de gaz i formeaz indol din triptofan. Sunt bacterii mobile,
nesporogene i au form de bastona. Identificarea E. coli se face pe
baza aspectului cultural caracteristic pe agar Levine.

E. coli reprezint indicatorul contaminrii fecale!

ASM MicrobeLibrary.org

www.nirgalnet/graphics/e.coli.jpg

Determinarea prezenei i numrului de bacterii coliforme i E. coli n

medii lichide (cu mbogire)
1. Prezena bacteriilor coliforme i a E. coli la o anumit cantitate de
produs (1 g sau 0,1 g, etc..) se determin prin:
- nsmnarea a 1 mL din produs omogenizat i din fiecare diluie n eprubete
care conin 10 mL bulion lauril sulfat de sodiu i tub colector de gaz
(Durham).
1 mL proba/ i 1mL diluii.la 10 mL bulion lauril sulfat
- la produse solide, la 1 g produs din prima diluie (10), se nsmneaz 10
mL ntr-o eprubet cu 10 mL bulion lauril sulfat de sodiu dublu concentrat.
10 ml din diluia (10) . ..la 10 mL bulion lauril sulfat dublu
concentrat
Se incubeaz la 30 - 37 C timp de 24-48 de ore i se noteaz eprubetele
unde au aprut gaze n tubul colector. Se confirm prin coloraie Gram i
trecerea cu o ans din cultur pe mediul Levine (incubare la 30 - 37 C, 24 h).
n funcie de diluiile pozitive se raporteaz prezena sau absena la o
anumit cantitate de produs.

Obinerea primei diluii zecimale i

omogenizarea produselor lactate solide

nsmnarea probelor din brnzeturi

Prelevarea i nsmnarea probelor din

iaurturi

Determinarea prezenei i numrului de bacterii coliforme i E.

coli n medii lichide (cu mbogire)
2. Prezena cantitativ a bacteriilor coliforme i a E. coli folosind tehnica
numrului cel mai probabil:
- Const n nsmnarea a 3 diluii succesive folosind 3 tuburi pentru fiecare diluie.
n fiecare tub cu mediu lichid se nsmneaz 1 mL omogenat sau 10 mL diluie
10 din proba solid sau semisolid.
10

10

10

1mL omogenat
10ml dil.10
din proba solid

Se incubeaz la 30 - 37 C timp de 24-48 de ore, n funcie de numrul de tuburi din

fiecare diluie (confirmate prin ex. bacterioscopic sau Levine) se citete numrul
corespunztor combinaiei de 3 cifre obinute, din tabelul Mac Grady.

Nr. cel mai probabil de bacterii coliforme/ g (ml): Nr. din tabel x factorul de diluie
(prima diluie din cele 3 folosite).

2. Prezena cantitativ a bacteriilor coliforme i a E. coli folosind tehnica

numrului cel mai probabil
Tabelul Mac Grady

Pentru confirmarea E. coli se nsmneaz colonii caracteristice de pe Levine

ntr-o eprubet cu BBLV (bulion bil-lactoz-verde briliant) sau BLS (bulion
lauril-sulfat) cu tub de fermentare i o eprubet cu ap peptonat (pentru
prezena indolului), prenclzite la 44 C, 24 h.

Confirmarea E. coli n diluia de 10 (cnd se lucreaz cu un tub de diluie),

se raporteaz c E. coli este prezent pe 0,1 g produs (absent la 0,01 g).
Evidenierea E. coli enteropatogen se face prin reacia de aglutinare
rapid pe lam cu ser anti-E. coli (serotipuri patogene pentru om) polivalent.
Dac are loc aglutinarea se confirm E. coli enteropatogen.

Determinarea numrului de bacterii coliforme i E. coli direct n

medii solide

Pentru produsele alimentare lichide la care se presupune o ncrctur de

germeni mai mare de 30 /ml sau de 300 /g, pentru produsele solide sau
semisolide, determinarea cantitativ a coliformilor se face prin tehnica
ncorporrii inoculului ntr-un mediu selectiv (VRBLG cristal violet-rou
neutru bil-lactoz), cu un strat de 4 ml mediu pe suprafa i incubare la 3237C, 24-48 h. dup incubare se aplic formula pentru aflarea NTG coliformi
pe ml sau g prob.

Confirmarea tulpinilor de E. coli:

Pentru numrul de E. coli se aleg 5 colonii caracteristice i se striaz pe

geloz Levine, n plci Petri. Este un examen prezumtiv de identificare.
Numrul de E. coli /g (ml) prob se stabilete n funcie de numrul de
colonii confirmate din cele 5 colonii striate i de numrul total de bacterii
coliforme/ g (ml) prob.
Exemplu: dac din 5 colonii striate s-au confirmat 2, iar numrul total de
bacterii coliforme / g a fost de 250, E. coli /g va fi 100.

Izolarea i identificarea E. coli O157: H7

Metod orizontal pentru detectarea E.coli O 157
SR EN ISO 16654

Determinarea se bazeaz pe incapacitatea E. coli O157: H7 de a fermenta

sorbitolul, celobioza i de a produce beta-galactozidaz ct i pe structura
antigenic specific.

1) Din produsul omogenizat i din fiecare diluie se nsmneaz cte 1 ml n tuburi cu cte
10 ml bulion Ec cu novobiocin i tub de fermentare. Tuburile nsmnate se
termostateaz la 37 C timp de 24 h.
2) din tuburile n care se constat multiplicare bacterian i gaz n tubul Durham se striaz o
ans de cultur pe suprafaa gelozei Mac Conkey cu sorbitol. Plcile identificate se
incubeaz la 42 C, 24 h.
3) Se aleg 5 colonii incolore (sorbitol negative) i fiecare va fi testat pentru confirmare pe:
- Un tub cu bulion nutritiv identificarea indolului cu reactiv Kovacs (+)
- Un tub cu geloz nclinat
- Un tub cu Ec novobiocin i tub de fermentare cultur cu producere de gaz (+)
- Geloz Levine repartizat n plci Petri se dezvolt colonii violet nchis cu luciu metalic (+)
4) Confirmarea de E.coli O157:
de seroaglutinare.

H7 se face cu ajutorul testelor biochimice i de a reaciei

Medii selective de identificare a tulpinilor de E. coli

Agar Mac Conkey cu sorbitol.

E. coli serotipul O157:H7 sunt incolore
pentru c nu fermenteaz sorbitolul, n
contrast cu 80% dintre toate celelalte
tulpini de Escherichia coli care
fermenteaz sorbitolul (colonii roii)

Agar TBX (tripton, bil, x-glucuronid) conine

un agent cromogen - X-glucuronide care
detecteaz activitatea glucuronidazei.
Aceasta este aceeai enzim depistat de
reagentul MUG i este demonstrat a fi foarte
specific E. coli, cu excepia a 3-4% care
sunt glucuronidaz negative, respectiv
Escherichia coli O157

Teste biochimice de identificare: Api 20E (BioMerieux, Frana)