Sunteți pe pagina 1din 24

USAMV FAC.

DE BIOTEHNOLOGII MASTER BIOTEHNOLOGIE I SIGURAN ALIMENTAR

PROIECT MICROBIOLOGIE ANUL I, SEMESTRUL I

Cadru didactic Prof. dr. Florentina Radoi Masterande Dorina Farafin Brad Raluca Dudescu

BUCURETI 2010

PROIECT MICROBIOLOGIE

TEHNICI SI METODE DE EVALUARE A INCARCATURII MICROBIENE DIN ALIMENTE

Cadru didactic Prof. dr. Florentina Radoi Email: flore_radoi@hotmail.com Masterande Dorina Farafin Brad Email: dorina_farafin@yahoo.com Raluca Dudescu Email: raluca.dudescu@yahoo.com
ANUL I, SEMESTRUL I

CUPRINS

1. Introducere 2. Criterii de calitate microbiologica a alimentelor 3. Tehnici si metode clasice de evaluare a incarcaturii microbiene din alimente 4. Tehnici si metode moderne de evaluare a incarcaturii microbiene din alimente 4.1. Tehnica membranelor filtrante 4.2. Metoda bioluminiscentei 4.3 Tehnica petrifilmelor 5. Concluzii 6. Bibliografie

1. Introducere
Proiectul Tehnici si metode de evaluare a incarcaturii microbiene din alimente doreste sa dezvolte subiectul tehnicilor si metodelor studiate la curs si experimentate in laborator, cu accent pe noile tehnici din domeniu. Lucrarea este structurata in 3 capitole principale ce incep cu analiza cerintelor europene privind calitatea microbiologica. Capitolul urmator se concentreaza asupra prezentarii unor metode si tehnici microbiologice clasice. Ultima parte este o prezentare detaliata a trei tehnici si metode moderne tehnica membranelor filtrante, metoda bioluminiscentei si tehnica petrifilmelor de la utilizarea lor, tehnica propriu-zisa, pana la avantaje si costuri. Proiectul se incheie cu o concluzie finala privind tendintele din domeniu si strategia firmelor producatoare de aparatura si consumabile de laborator, oferind de asemenea informatii despre sursele bibliografice intr-o forma inovatoare, ce usureaza cititorului cautarea. Speram ca proiectul nostru sa fie util colegilor, reprezentand o lectura practica ce si interesanta, directionand studentii interesati spre lecturarea unor studii relevante in domeniul tehnicilor de evaluare a incarcaturii microbiene, realizate de cercetatori romani si straini.

2. Criterii de calitate microbiologica a alimentelor


Calitatea microbiologica este un criteriu extrem de important in aprecierea calitatii globale a alimentelor, incepand de la productia primara pana la comercializarea produsului catre consumator. Regulamentul CE nr. 2073/2005 amendat cu Regulamentul CE nr 1441/2007 al Comisiei Europene din 2007 a fost introdus ca norma ce stabileste criteriile microbiologice pentru produsele alimentare in toate statele membre. Acesta ofera o orientare privind caracterul acceptabil al produselor alimentare si al proceselor de fabricatie, manipulare si distributie a acestora, considerand ca utilizarea criteriilor microbiologice ar trebui s fac parte integrant din punerea n aplicare a procedurilor bazate pe principiile HACCP si a altor msuri de control al igienei.C1 Regulamentul CE 2073/2005 modificat prin 1441/2007 prezinta in anexa 1 3 capitole, structurate dupa cum urmeaza: Capitolul 1. Criterii de sigurant a produselor alimentare Capitolul 2. Criterii de igien a procesului o 2.1. Carne si produse din carne o 2.2. Lapte si produse lactate o 2.3. Produse din ou o 2.4. Produse pescresti o 2.5. Legume, fructe si produse din legume si fructe Capitolul 3. Norme pentru prelevarea de probe si pregtirea probelor pentru teste o 3.1. Norme generale pentru prelevarea de probe si pregtirea probelor pentru teste o 3.2. Prelevarea de probe bacteorologice n abatoarele si unittile de productie a crnii tocate si a preparatelor din carneC1 In anexa capitolului I este prezentat un tabel, in care sunt definite clar limitele microbiologice, pe categorii de alimente. Firmele alimentare din toate statele membre ale UE sunt obligate sa monitorizeze produsele realizate si sa se incadreze in aceste limite. De asemenea in tabel sunt prezentate standardele europene ce reprezinta, in domeniul reglementat, metodele analitice de referinta prin care laboratoarele fac determinari ale indicatorilor de calitate microbiologici:

In capitolul 2 Regulamentul european reglementeaza criteriile de igien ale proceselor, incepand de la produsele din carne si terminand cu legumele si fructele, concentrandu-se asupra etapelor din procesul tehnologic in care se aplica criteriul de igiena si actiunile corective in cazul in care rezultatele nu sunt satisfacatoare.

In capitolul 3 sunt stipulate normele pentru prelevarea de probe si pregtirea probelor pentru teste, in special pentru pentru carcasele de porcine, ovine, caprine si cabaline, descrise de asemenea in standardul ISO 17604.

Firmele alimentare din statele membre, obligate sa respecte norme microbiologice stricte dar si constranse de volumul si viteza de procesare ale propriilor procese, au avut nevoie sa se orienteze spre metode de analiza din ce in ce mai precise dar si mai rapide. Astfel, in ultimele decenii, companiile producatoare de aparatura si consumabile de laborator au fost la randul lor nevoite sa se orienteze spre noile cerinte si nevoi ale clientilor lor, dezvoltand metode mai simple, mai precise si mai rapide pentru evaluarea incarcaturii microbiene. Totusi, metodele clasice nu au fost uitate in totalitate, ele fiind folosite in continuare in laboratoarele firmelor alimentare si autoritatilor de control.

3. Tehnici si metode clasice de evaluare a incarcaturii microbiene din alimente

Printre metodele clasice, studiate si prezentate in cadrul laboratoarelor, se numara: metoda celulelor de masurat - se pot folosi mai multe tipuri de celule cum ar fi camera Thoma, camera Trck, Brker, RosenthalC1 pentru drojdii si spori de mucegaiuri

Fig 3.1 Celula de numarat Thoma reteaC1

Fig. 3.2 Celula de numarat Brker reteaC1

metoda Breed pentru bacterii lactice metoda standard SPC, de numarare a celulelor vii sau a unitatilor formatoare de colonii (ufc) tehnicile de reducere a colorantilor pentru microorganismele reducatoareD1

Toate aceste metode clasice prezinta avantaje de exemplu camera Thoma este o metoda rapida, prin SPC exista posibilitatea studiului la microscop, sau tehnic de reducere a colorantilor este o metoda foarte simpla dar au si dezavantaje, cum ar fi pentru camera Thoma precizia, timpul necesar incubarii pentru SPC sau erorile in cazul tehnicilor de reducere. Companiile producatoare de aparatura de laborator au incercat sa inlature aceste neajunsuri propunand metode moderne de determinare a incarcaturii microbiene.

4. Tehnici si metode moderne de evaluare a incarcaturii microbiene din alimente


Vom incerca in acest capitol sa ne concentram asupra prezentarii a trei tehnici moderne tehnica membranelor filtrante, metoda bioluminiscentei si tehnica petrifilmelor din perspectiva tehnologiei, metodelor, avantajelor, dezvantajelor dar si al costurilor utilizarii lor.

4.1. Tehnica membranelor filtrante


Tehnica membranelor filtrante pe care o prezentam este oferita de Sartorius. Principiul acesteia se bazeaza pe concentrarea microorganismelor din probe urmata de o incubare a acestora pe medii de cultura sub forma de cartonase sau agar. Practic, un filtru membrana cu o porozitate adecvata este montata pe un suport iar proba in general lichida este turnata peste acesta. Astfel microorganismele din proba de control, in integralitatea ei, sunt retinute pe suprafata filtrului prin efectul de separare al membranei acestuia. Inhibitorii de crestere sunt apoi indepartati prin clatire cu solutie NaCl sterila. La filtrare Sartorius ofera posibilitatea tratarii probei prin metoda standard sau prin metoda monitor, dupa cum se arata in figura de pe pagina urmatoare. Filtru membrana este apoi plasat pe un mediu de cultura si incubat. Schimbul de produse nutritive si metabolice are loc prin sistemul poros al filtrului membrana. Coloniile care s-au dezvoltat pe suprafata filtrului in timpul incubarii sunt apoi numarate si raportate la volumul probei. Un alt element ce usureaza munca personalului de laborator este folosirea in cadrul acestei metode a cartonaselor impregnate cu mediu nutritiv (CMN): medii de cultura sterile in forma uscata, preambalate in cutii Petri sterile. Dupa umezire cu 3,03,5 ml apa sterila si distilata sau demineralizata, ele sint gata de utilizare. Spre deosebire de mediile clasice in solutie, cartonasele sunt stabile si pot fi depozitate timp indelungat. Utilizarea CMN scuteste de asemenea personalul de operatiunile de pregatire a mediilor nutritive si turnarea lor in cutiile Petri, economisind timpul si energia specialistilor microbiologi. Utilizarea acestora este prezentata la pagina 9.

Un exemplu de crestere a coloniilor ca rezultat al aplicarii metodei membranelor impreuna cu CMN este aratat mai jos. Exemplificarea s-a facut pentru probe din industria bauturilor, utilizand mediu Wrze pentru detectarea drojdiilor si a mucegaiurilor.

Fig. 4.1. Culturi obtinute prin metoda membranelor filtrante impreuna cu CMN

Avantajele si beneficiile metodei mebranelor filtrante sunt: 1. Precizie de detectare sporita 2. Faptul ca in comparatie cu metoda directa, pot fi testate volume de proba considerabil mai mari. Acest efect de concentrare ridica acuratetea detectarii microbiene. 3. Din punct de vedere al rezultatelor cantitative coloniile vizibile pot fi raportate direct la volumul de proba. 4. Filtrele membrana cu coloniile crescute pe ele pot fi arhivate pentru documentarea testului efectuat.

Fig. 4.2 Detrminarea numarului de germeni prin membranele filtrante

Fig. 4.3. Utilizarea cartonaselor impreganate cu mediu nutritiv

10

4.2. Metoda bioluminiscentei


Metoda determinarii concentratiei de ATP prin bioluminiscenta este utilizata in intreprinderile alimentare deoarece este facila, rapida, simpla, si rentabila. Foarte interesant este faptul ca prin ea se detecteaza att prezena reziduurilor alimentare ct i prezena microorganismelor, prin urmare metoda reprezint un indicator real al strii de igien a suprafeelor de lucru, aratand cat de bine au fost curatate. Inainte de a incepe testrile pe baz de ATP trebuie determinate criteriile de difereniere a suprafeelor murdare de cele curate, n uniti RLU (Relative Light Units). Acest lucru trebuie fcut n timpul procesului de producie, n momentele n care se cunoate c suprafeele sunt murdare sau curateB2. Desigur, in prezent exista mai multe sisteme de detectie a ATP prin bioluminiscenta disponibile in diverse forme comerciale:

Tabelul 4.2.1 Productorii principali de teste pentru aprecierea strii de igien a suprafeelor prin detectarea ATP-ului prin bioluminiscenM1 Ne vom referi mai departe la Foto luminometrele HY-LITE si HY-LYTE2 produse de compania Merck i stilourile HY-LiTE Recharge, utilizate in testarea realizata de catre cercetatorii Institutului de Sanatate PublicaN1. Luminometru HY-LITE Merck este un aparat de msurare a cantitii de lumin emis ntr-o reacie de bioluminiscen - figura 4.2.1.

11

Fig. 4.2.1 Fotoluminometrul HY-LYTE si stilourile HY LYTE recharge Stilourile HY-LITE Recharge sunt cuve concepute pentru utilizare cu luminometrul HY-LITE, continnd reactivi gata de utilizare. Un stilou se compune din: capison detasabil ce contine solutie de umectare tij de culoare alb protejat de capison pentru prelevarea unui volum definit de prob; tija este acoperit la interior cu o substant chimic al crei rol este de a pune n libertate ATP-ul celular, in plus ea mai are rolul de a transfera proba n camera de reactie si de a deschide compartimentul ce contine reactivii; compartiment ce contine o solutie pentru diluarea, neutralizarea si tamponarea probelor compartiment cu reactivi, nchis cu folie de aluminiu; reactivii sunt un amestec de luciferin i luciferaz sub form liofilizat i stabilizat. Stilourile HY-Lite se utilizez mpreun cu tampoane Hy-Lite sterile i libere de ATP. Cu ajutorul stiloului se preleveaza probe de pe suprafata de lucru pe tampoanele sterile se pot preleva proble de pe inox, lemn, plastic, etc . Primele probe sunt de pe suprafete curate respectiv murdare. Dupa prelevarea primelor probe se preleveaza probe din toate punctele ce trebuie monitorizate pe fluxul de productie. Masurarea este foarte facila: din meniul principal al soft-ului fotoluminometrului se selecteaza modulul dorit - HACCP Plan, Test & Store, Test Only- si se apasa ok. Capacul se deschide automat pentru inserarea stiloului. Dupa scoaterea acestuia si inchiderea capacului aparatul masoara automat bioluminiscenta iar rezultatul apare pe ecran. In memoria aparatului pot fi inregistrate peste 2000 de date, luminometrul avand posibilitatea de a fi conectat la calculator pentru transferul acestora.M1

12

Fig. 4.2.2 Inserarea stiloului in fotoluminometrul HY-LYTE 2 de la Merck Dupa realizarea masuratorilor se determina valoarea luminiscentei in uniti RLU (Relative Light Units). Rezultatele se obtin in cateva minute deoarece reactia de bioluminiscenta este rapida. In functie de aceste valori se concluzioneaza asupra eficientei procedurilor de igienizare aplicate. De exemplu, in studiul publicat de Revista de Igiena si Sanatate Publica, se pot observa clar diferentele valorilor de luminiscenta obtinute pentru diferite metode de igienizare:

Tabel 4.2.1. Valori ale bioluminiscenei obinute pt suprafee si metode diferiteN1

13

Avantajele metodei: 1. metoda bioluminiscentei este simpla, practica, economica si mai ales rapida 2. tehnic, un mare avantaj al acesteia este ca detecteaza instant, in acelasi timp, prezena reziduurilor alimentare i a microorganismelor. Acesta reprezinta un mare avantaj din punct de vedere al economiei timpului in procesele de productie si operatiunile de igienizare, metoda permitand echipelor ce realizeaza igienizarea sa reia operatiunile in timp util, in cazul in care aceasta nu a fost realizata corect si complet. 3. trebuie mentionat de asemenea costul metodei, care este unul rezonabil fotoluminometrul HY-LYTE 2 de la Merck costa aproximativ 5.000 euro iar pretul consumabilelor este accesibil 4. in final, accesibilitatea valorilor masurate, softul prietenos, modulele pentru monitorizarea HACCP si posibilitatea transferului datelor face ca aparatul si metoda sa fie una preferata de foarte multe laboratoare apartinand firmelor alimentare.

14

4.3 Tehnica Petrifilmelor


Metodele bazate pe utilizarea Petrifilmelor sunt tehnici simple dar performante, reprezentand o alternativ la metodele culturale standard de evaluare a calitii microbiologice a alimentelor. Petrifilmele prezinta un mediul de cultur specific si selectiv, deshidratat, fixat pe un suport adeziv si acoperit cu o folie din plastic. Prin inocularea suspensiei de celule, lichidul hidrateaz mediul iar prin termostatare este posibil dezvoltarea microorganismelor. Pe piata exista in prezent mai multe varietati comerciale de Petrifilme, dintre care cateva sunt mentionate in tabelul urmator:

Tabelul 4.3.1 Tipuri de Petrifilme comerciale B2

15

Tehnica de utilizare a Petrifilmelor n analiza microbiologic este simpl i presupune parcurgerea etapelor prezentate in figura de mai josB2: 1. se dilueaz proba prin diluii decimale pn la o concentraie de celule de aproximativ 104 celule per ml 2. se ridic filmul superior 3. se inoculeaz 1 ml suspensie dintr-o diluie corespunztoare n centrul Petrifilmului aezat pe un suport special 4. se elibereaz filmul superior, care se las s cad liber 5. cu ajutorul dispozitivului de rspndire se preseaz uor deasupra zonei inoculate pentru distribuia uniform a celulelor din suspensie pe toat suprafaa circular a mediului de cultur; 6. se ndeprteaz dispozitivul de rspndire i se ateapt un minut pentru solidificarea mediului; 7. se termostateaz (pachete de pn la 20 Petrifilme) n condiii optime, specifice pentru dezvoltarea microorganismelor analizate, n funcie de recomandrile din instruciunile de utilizare a Petrifilmului.

16

Evalurile statistice, realizate pe baza coeficienilor de corelaie i a pantei ecuaiilor de regresie liniar, ofer certitudini privind fidelitatea rezultatelor pentru principalii indicatori microbiologici i recomand utilizarea Petrifilmelor, ca o alternativ la metodele microbiologice convenionale tip ufc, pentru controlul microbiologic.B2 De exemplu, intr-un studiu comparativ in care s-au realizat analize prin metode clasice si Petrifilme, pe mostre de branza de capra Crottin de catre un grup de cercetatori argentinieni, s-a concluzionat ca exista o foarte buna corelare intre rezultateB3:

Fig. 4.3.2 Regresie liniara numar colonii de bacterii aerobe in branza Crottin. Comparatie intre metoda clasica si Petrifilme. Gabriela Bahrim ne spune in studiul sau ca datele obinute, exprimate ca valori medii, stabilite prin calcul statistic, pentru cinci probe n paralel (n = 5), certific fidelitatea i acurateea analizelor realizate cu Petrifilme, amplificarea preciziei realizndu-se prin asigurarea condiiilor selective de cultivare i interpretare a rezultatelor, ceea ce permite evaluarea corect i distinctiv a speciilor analizate fig 4.3.2:

17

18

De asemenea studiile realizate de Jordano si colaboratorii sai recomanda utilizarea Petrifilmelor ca alternativa la metodele conventionaleJ1:

Tabelul 4.3.2. Rezultatele evalurilor cantitative, prin analiza microbiologic cu Petrifilme, comparativ cu tehnicile culturale clasiceJ1

19

In urma cercetarilor si analizelor statistice, Petrifilmele au fost validate de organismele de standardizare nationale si internationale pentru utilizarea in domeniul reglementat:

Tabelul 4.3.3 Organizatii ce au validat metoda Petrifilmelor pentru evaluarea calitii microbiologice a alimentelor

Concluzionand asupra acestei metode, putem spun ca ea prezinta nenumarate avantaje: 1. tehnicile sunt simple, mai rapide (timp de analiza redus, rezultat prompt) si mai performante decat cele clasice tip ufc.

20

2. din punct de vedere al costurilor, comparativ cu tehnicile culturale clasice, la Petrifilme exista avantajul analizei unui numr mare de probe, ceea ce conduce la eficientizarea lucrului n laborator i reducerea costurilor analizelor. a. Studii efectuate n 85 de companii productoare de alimente, privind eficiena economic a tehnicilor de evaluare a calitii microbiologice au aratat c prin utilizarea Petrifilmelor se pot economisi anual intre 99 si 400 de ore de munca ale personalului de laborator, timp ce poate fi valorificat pentru elaborarea de programe eficiente in scopul evaluarii calitii i creterii numrului de analizeJ1 3. ca avantaj pentru procesul de productie, aplicarea acestor sisteme moderne permite luarea unor msuri corective pe parcursul procesrii i previne comercializarea produsului neconform 4. de asemenea ele sunt bine adaptate nevoilor firmelor alimentare ce au implementat HACCP, avand nevoie de analiza unui numr mare de probe, cu obinerea unor rezultate prompte, obiective ce nu pot fi realizate prin aplicarea metodelor clasice de control microbiologic.

5. Concluzii
Calitatea si siguranta alimentului sunt azi mai importante ca oricand pentru toti actorii economici si membrii lantului alimentar, de la producatorii primari pana la comerciantii de alimente. Incercand pe de o parte sa raspunda unor conditii stricte - normative europene, conditiile de igiena a proceselor, inocuitatea produselor si calitatea lor microbiologica si cerinte ale consumatorilor ce devin pe zi ce trece mai selectivi, iar pe de alta parte constranse de volumul mare de produse realizate, firmele alimentare incep sa se orienteze din ce in ce mai mult spre utilizarea unor tehnici si metode moderne de evaluare a incarcaturii microbiene din alimente. Avantajele aduse de acestea simplitate, rapiditate, eficienta economica, adaptabilitate la sistemul HACCP au facut sa se bucure de succes si popularitate in randul specialistilor de laborator si calitate alimentara, fiind adoptate rapid. Totusi, in multe laboratoare se utilizeaza cu succes si metodele clasice camera Thoma, metoda ufc, etc ce ofera alte avantaje, cum ar fi posibilitatea studierii la microscop a microorganismelor. Ca o concluzie finala putem spune ca firmele producatoare de aparatura si consumabile de laborator sunt azi deosebit de inovative, orientandu-si in permanenta strategia de cercetare si dezvoltare spre crearea de noi metode si tehnici de evaluare microbiologica, din ce in ce mai rapide, selective, sensibile si eficiente din punct de vedere economic, in dorinta de a se adapta in permanenta nevoilor clientilor, realitatii industriei alimentare si necesitatilor pietei.

21

6. Bibliografie
A) Bibliografie lucrri publicate de autori Referin B Evaluarea calitii microbiologice a alimentelor
B1

Autor

Lucrare

Gabriela Bahrim

prin utilizarea petrifilmelor, Buletinul AGIR nr. 3/2003 Rapid methods for food hygiene

B2

Bonaparte C., Upman M. inspection, Encyclopedia of Food Microbiology, vol.3, Academic Press, p.18871895 methods for food hygiene C.E. Budde., R.D. Evaluation of Petrifilm method for enumerating aerobic bacteria in Crottin goat's cheese, Revista Argentina de Microbiologa (2005) 37: 214-216

B3

Gonzlez, G.B. de Sousa, L.M. Tamagnini,

C Metode si tehnici de control ale produselor


C1

Constantin Dumitriu

alimentare si de alimentatie publica, Ed. Ceres, 1980

D
D1

Dan Valentina

Microbiologia alimentelor, Ed. Alma, Galati, 2001

F
F1

Florentina Radoi Matei

Microbiologie industriala, Note de curs, 2006

H
H1

Liana Herascu, Florentina Radoi

Microbiologie speciala, Lucrari practice de laborator, Bucuresti, 2002

22

J Jordano R. si colab.
J1

Comparison of Petrifilm method to conventional methods for enumerating aerobic bacteria, coliforms, Escherichia coli and yeasts and molds in foods. J. Food Prot., 51, p. 658-662, 1995

N Aprecierea strii de igien a suprafeelor prin


N1

Nicolau A.I., Turtoi M.,

Bioluminiscen, Revista de igiena si sanatate publica nr. 4 din 2008 publicata de Societatea de Igiena si Sanatate Publica din Romania

B) Bibiografie lucrri fr autori Referin Organizaie C Consiliul


C1

Lucrare

Europei, Parlamentul European

Regulamentul CE nr. 2073/2005 amendat cu Regulamentul CE nr 1441/2007 al Comisiei Europene din 2007, gsit pe site-ul http://eur-lex.europa.eu Regulamentul (CE) nr. 178/2002 al Parlamentului European i

Consiliul
C2

al Consiliului, din 28 ianuarie 2002, de stabilire a principiilor i a cerinelor generale ale legislaiei alimentare, de instituire a Autoritii Europene pentru Sigurana Alimentar i de stabilire a procedurilor n domeniul siguranei produselor alimentar, gsit pe site-ul http://eur-lex.europa.eu

Europei, Parlamentul European

C3

Codex Alimentarius

Code of Hygienic Practices CAC/RCP 1-1969, rev. 4, 2003

M
M1

Merck Chemicals

Hy Lyte 2 System, Merck Microbiology Manual 12th Edition, gasite pe site-ul companiei Merck la data de 23.02.2010, link

23

http://www.merck-chemicals.ro/food-analytics/hy-lite-hygienemonitoring-system/MDA_CHEM130100/p_8jWb.s1LU3UAAAEWwMgfVhTm?attachments=PI Institutul de Igiena si


M2

Sanatate Publica Bucuresti

Metode de analiza microbiologica a alimentelor si a conditiilor de igiena din unitatile sectorului alimentar, 1995

S Controlul microbiologic al alimentelor, bauturilor si produselor


S1

Sartorius

farmaceutice, gasit pe site-ul www.sartorom.ro la data 01.02.2010

24