TIIN A I ING IN ERIA ALIM EN TELOR

EVALUAREA CALITII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR PRIN UTILIZAREA PETRIFILMELOR

Conf. univ. dr. ing. Gabriela BAHRIM, Universitatea Dunrea de Jos, Galai
Absolvent a Facultii de Tehnologia i Chimia Produselor Alimentare i Tehnic Piscicol, Universitatea din Galai, promoia 1986. Confereniar la Facultatea de tiina i Ingineria Alimentelor, Universitatea Dunrea de Jos, Galai. Doctor n ramura de tiin tehnic, specializarea biotehnologie. Activitate tiinific: 65 de lucrri tiinifice publicate, 30 de contracte de cercetare tiinific; 2 brevete de invenie; 9 cri i manuale. REZUMAT Metodele bazate pe utilizarea Petrifilmelor sunt tehnici performante, ca o alternativ la metodele culturale standard de evaluare a calitii microbiologice a alimentelor. Metodologia de lucru cu Petrifilme este simpl, implicnd etape similare de analiz pentru diferite categorii de produse alimentare. Dac se are n vedere eficiena economic , comparativ cu tehnicile culturale clasice, utilizarea Petrifilmelor ofer avantajul analizei unui numr mare de probe, ceea ce conduce la eficientizarea lucrului n laborator i reducerea costurilor analizelor. Aplicarea acestor sisteme moderne pentru evaluarea calit ii microbiologice a alimentelor permite luarea unor msuri corective pe parcursul proces rii i previne comercializarea produsului nainte ca rezultatele controlului de calitate s fie cunoscute. ABSTRACT Petrifilm plate methods are advanced cultural techniques as an alternative to standard plate count methods for microbiological food testing. The methodology for plating on Petrifilm plates is quite sample and the steps to be followed in each product are identical. As far as economic aspect is concerned, and compared to the traditional plate count techniques, Petrifilm plate methods can be considered to have an advantage as a greater number of samples can be processed, thus increasing the work capacity of the laboratory and reducing labour costs per sample or test. Using these modern systems for assessing microbiological quality of food ensure the application of suitable corrective measures in the manufacturing process and prevents the food product from being marketed before the quality control results have been received.

Aplicarea principiilor moderne pentru evaluarea calitii microbiologice a alimentelor, n acord cu conceptele metodei HACCP (Hazard Analysis. Control Critical Points), i utilizarea criteriilor de apreciere recomandate de Comisia Internaional de Specificaii Microbiologice pentru Alimente (ICMSF) presupun analiza unui num r mare de probe, prin metode rapide, care s ofere r spunsuri prompte i uor de interpretat (Harrigan i Park,1991). O deosebit importan prezint standardizarea metodelor de analiz aplicabile, att pentru controlul calitii produselor finite ct i pentru controlul realizat n diferite etape ale procesrii sau n timpul p str rii i comercializrii alimentelor. n acest sens, Comisia Internaional de Specificaii Microbiologice pentru Alimente recomand utilizarea unor planuri de evaluare, stabilite pe baze statistice, care reprezint ghiduri de utilizare la nivel internaional, ce faciliteaz consumul fr risc, exportul i importul alimentelor. Un astfel de plan include: numrul de probe ce trebuie examinate (n), numrul de microorganisme prezente ntr-un gram sau cm 3 aliment (S), nivelul contamin rii pentru care nu exist riscuri (m) i gradul de

contaminare maxim admis (M), depirea acestui nivel conducnd la respingerea lotului, pe baza indicelui C (num rul maxim de probe analizate, cu valori ale contamin rii cuprinse ntre m i M, care dicteaz acceptabilitatea lotului)(Tofan i colab., 2002). Orientrile actuale se ndreapt spre standardizarea internaional a metodelor de analiz microbiologic i, n acest sens, a fost constituit, la Bruxelles, Comitetul European pentru Standardizare (CEN/T C) (Upman i Bonaparte 1999). Uniformizarea criteriilor de evaluare a calitii microbiologice a alimentelor a fost posibil prin elaborarea standardelor internaionale i a specificaiilor microbiologice, general valabile, care includ o prezentare general a microorganismelor i a toxinelor pe care acestea le-ar putea elabora, descrierea strategiilor de eantionare, a metodelor analitice (pentru recoltarea probelor, omogenizarea i realizarea diluiilor), a mediilor de cultur i a condiiilor de termostatare, precum i indicaii privind interpretarea rezultatelor. Aprecierea corect a parametrilor de calitate, n acord cu cerinele prev zute de aceste standardate, se va Buletinul AGIR nr. 3/2003 iulie - septembrie

80

EVALUAR EA CALITII M ICR O BIOLOG ICE A ALIM EN TELOR

putea realiza numai respectnd condiiile analitice impuse de aceste normative, ceea ce constituie garan ia realizrii corecte a analizelor i interpretrii ct mai fidele a rezultatelor. Principiile moderne de evaluare a calit ii microbiologice n industria alimentar vizeaz n principal trei categorii de proceduri analitice: tehnici de evaluare calitativ , pentru eviden ierea selectiv a unor microorganisme indicatori, prin teste care s ateste prezen a sau absen a acestora; tehnici de evaluare cantitativ , pentru determinarea ncrcturii microbiene, care s reflecte microbiota total sau pe grupe specifice de microorganisme; tehnici de izolare i caracterizare a unor microorganisme din microbiota nespecific, n special pentru eviden ierea poten ialului patogen, toxicogen sau de alterare. Literatura de specialitate prezint numeroase posibilit i de evaluare rapid a parametrilor microbiologici recomandai pentru aprecierea calit ii materiilor prime, pe faze de fabricaie, precum i a produselor finite (Raugel, 1993). n general, n alegerea celei mai adecvate metode de analiz trebuie s se in seama de urmtoarele criterii (Bibek, 1996): sensibilitate nalt pentru concentraii reduse de celule; acuratee i precizie; rapiditate; s implice o metodologie de lucru simpl, ieftin , nelaborioas, universal aplicabil; s ofere un rspuns prompt, uor interpretabil i reproductibil. Specialitii consider c n prezent nu exist metode general valabile care s ndeplinesc cerin ele particulare pentru analiza specific a diverselor produse alimentare. Singurele metode care asigur condiii pentru evaluarea simultan din punct de vedere cantitativ, calitativ i caracterizare a microbiotei sunt cele bazate pe examen cultural. Evalurile de acest tip prev d stabilirea gradului de contaminare microbian , prin determinarea numrului de unit i formatoare de colonii (ufc), cnd examenul cultural este corelat cu studii calitative de izolare i caracterizare a microorganismelor contaminante. n prezent, tehnicile culturale de analiz microbiologic au fost mult perfecionate, aspectele vizate fiind: rapiditatea, simplificarea condiiilor de analiz i posibilitatea obinerii unui rspuns prompt, uor interpretabil n sensul creterii acurateii i reproductibilitii rezultatelor. Au fost mbun tite de asemenea tehnicile destinate eviden ierii microorganismelor patogene, prin perfecionarea examenului cultural i corelarea acestuia cu determin ri imunologice, de biologie molecular .a. (Jordano i Medina,1999). Trebuie remarcat c rapiditatea tehnicilor culturale moderne nu survine n toate cazurile ca urmare a reducerii perioadei de termostatare, comparativ cu metodele clasice, Buletinul AGIR nr. 3/2003 iulie - septembrie ci este efectul simplificrii metodologiilor de lucru. Astfel, prin inoculare direct se elimin etapele de recoltare i pregtire a probelor pentru analiz, iar prin utilizarea de medii de cultur specifice, ct mai adecvate scopului propus, se asigur dezvoltarea selectiv a microorganismelor studiate. Metodele culturale sunt n prezent mult simplificate prin utilizarea unor sisteme comerciale, denumite Petrifilme (n limba englez, Petrifilms), n care mediul de c ultur specific (n general, un mediu selectiv), deshidratat este fixat pe un suport adeziv i acoperit cu o folie din plastic. Prin inocularea suspensiei de celule, lichidul hidrateaz mediul i prin termostatare este posibil dezvoltarea microorganismelor. Petrifilmele au fost concepute n vederea satisfacerii conceptelor sistemului HACCP (analiza hazardului, controlul punctelor critice), care prev d aplicarea unor msuri corective, pe tot parcursul procesului de producie, fr ca acesta s stagneze, ceea ce impune analiza unui num r mare de probe, cu obinerea unor rezultate prompte i n scurt timp, obiective ce nu pot fi realizate prin aplicarea metodelor clasice de control microbiologic. Practica a demonstrat c Petrifilmele constituie n prezent sisteme eficiente de analiz microbiologic, aplicabile mai ales pentru evaluarea calit ii materiilor prime i controlul n punctele critice pe parcursul procesrii acestora, oferind numeroase avantaje, care se regsesc n reducerea timpului de analiz, reducerea preului de cost al analizei per prob, creterea num rului de probe analizate, asigurarea inocuit ii alimentelor i mbun tirea substan ial a productivit ii (Jordano i Medina, 1999). Tehnica de utilizare a Petrifilmelor n analiza microbiologic este extrem de simpl i presupune parcurgerea urm toarelor etape (fig.1): se dilueaz proba prin tehnica diluiilor decimale pn la o concentraie de celule de aproximativ 10 4 celule per ml; se ridic filmul superior; se inoculeaz 1 ml suspensie dintr-o diluie corespunztoare n centrul Petrifilmului aezat pe un suport special; se elibereaz filmul superior, care se las s cad liber; cu ajutorul dispozitivului de rspndire se preseaz uor deasupra zonei inoculate pentru distribuia uniform a celulelor din suspensie pe toat suprafaa circular a mediului de cultur; se ndep rteaz dispozitivul de rspndire i se ateapt un minut pentru solidificarea mediului; se termostateaz (pachete de pn la 20 Petrifilme) n condiii optime, specifice pentru dezvoltarea microorganismelor analizate, n funcie de recomandrile din instruciunile de utilizare a Petrifilmului. Eficien a aplicrii Petrifilmelor a condus la extinderea utilizrii acestora pentru evaluarea calitii microbiologice a numeroase alimente, precum: lapte i produse lactate

81

 TIIN A I ING IN ERIA ALIM EN TELOR

(brnzeturi, iaurt, ngheat); carne i preparate din carne; pete i alte produse acvatice; ou; legume i fructe (cartofi, soia, mere, ciree, alune, nuci); cereale i produse cerealiere (fin , cereale mic dejun, paste finoase); condimente. n tabelul 1 sunt prezentate tipurile de Petrifilme comerciale, existente n prezent pe pia, i principalele lor caracteristici. Garan ia utilizrii Petrifilmelor este n prezent validat oficial de numeroase asociaii de renume din ntreaga lume (tabelul 2). Validarea s-a realizat pe trei criterii de baz: reproductibilitate, repetabilitate i precizie. n tabelul 3 se prezint o analiz comparativ a fidelit ii evalurilor cantitative, pentru patru indicatori microbiologici: drojdii i mucegaiuri, bacterii aerobe mezofile, bacterii coliforme i Escherichia coli, realizat prin analiza a ase tipuri diferite de produse alimentare (lapte pasteurizat, ngheat , ou, carne tocat , cp une, mazre congelat ), prin utilizarea Petrifilmelor, n paralel cu tehnicile culturale clasice ce utilizeaz medii selective (OGYE agar - oxytetracycline glucose yeast agar; PCA plate count agar; VRBA violet reed bile agar; EMB levine eosin methylene blue) (Jordano i colab., 1995). n toate cazurile, evalurile privind numrul total de drojdii i mucegaiuri au condus la rezultate inferioare, n variantele analizelor realizate cu Petrifilme, comparativ cu metodele conven ionale. Explicaia const probabil n existen a unei suprafee insuficiente pentru creterea extins a coloniilor de mucegai, ceea ce conduce n multe cazuri la suprapunerea coloniilor, genernd astfel erori n evaluarea corect a unitilor formatoare de colonii (ufc). De remarcat este faptul c la Petrifilmele destinate evalurii drojdiilor i mucegaiurilor, suprafaa mediului de cultur este de 30 cm2 , comparativ cu 20 cm 2, n cazul majorit ii Petrifilmelor concepute pentru studiul bacteriilor.

Tabelul 1. Tipuri de Petrifilme comerciale Tip Petrifilm PYM (Petrifilm yeast/mould) PAC (Petrifilm aerobic count) PCC (Petrifilm coliforms count) Grup de microorganisme analizate Drodjii i mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Condi ii de termostatare 72-120 ore, 25C 48 2 ore, 30 1C 24 2 ore, 35 1C sau 37 1C 24 2 ore, 32...35C 24 2 ore, 35 1C PHSCC (Petrifilm high sensivity coliforms count) P 2000 CC (Petrifilm rapid coliforms count) PEC (Petrifilm E. coli ) Bacterii coliforme Particulariti determinarea numrului total de drojdii i mucegaiuri; nu necesit ad ugarea de antibiotice sau acid tartric. determinarea numrului total de bacterii aerobe; analiza este eficient prin prezen a unui indicator care coloreaz coloniile n rou. evidenierea coliformilor totali; analiza este nlesnit de prezen a unui indicator ce coloreaz coloniile n rou; filmul superior reine gazele rezultate prin fermentaia substratului lactoz, cu apari ia specific a bulelor de gaz n jurul coloniilor. evidenierea bacteriilor coliforme la dilu ii mari n probele de analizat (1-2 celule g-1); permite inocularea a 5 ml prob, sau dilu ii ale acesteia; evaluare similar ca i n cazul utilizrii P etrifilmelor tip P CC. dezvoltarea rapid a bacteriilor coliforme; indicator de pH foarte sensibil, cu eviden ierea producerii de acid, chiar de la nceputul formrii coloniilor; reducerea timpului de analiz prin asigurarea unei creteri accelerate; rezultate test prezumtiv n 6-14h, cu confirmare n 18-24h. dou teste n unul singur: evaluarea cantitativ a coliformilor fecali i a lui E. coli; con ine indicator -glucuronidaz pentru evidenierea selectiv a tulpinilor de E. coli; rezultate pozitive n 24-48 ore; nalt selectivitate. evidenierea serotipurilor E. coli enteropatogene (O157: H7), care produc glucuronaze; se bazeaz pe utilizarea membranei active ELISA, care se men ine 2 minute n contact cu Petrifilmul, iar dup 18 ore de termostatare testul pozitiv se eviden iaz prin apariia unor pete gri pe membran . evidenierea bacteriilor din familia Enterobacteriaceae; producerea de acid este pus n eviden cu ajutorul unui indicator de p H, ce vireaz n galben n mediu acid; eviden ierea formrii de gaz prin fermenta ia heterolactic a lactozei. evidenierea selectiv a tulpinilor de Staphylococcus aureus prin formarea de colonii de culoare ro u-violet; conf irmarea prezen ei lui Staphylococcus aureus, cu ajutorul discului, care conine albastru-toluidin-O, ce faciliteaz developarea unei zone de culoare roz (reac ie DN-az pozitiv ), n jurul coloniilor specifice.

Bacterii coliforme

Escherichia coli

48 2 ore, 35 1C sau 24 2 ore, 42 1C 48 2 ore, 35 1C sau 24 2 ore, 42 1C 24 2 ore, 30 1C sau 37 1C 24 2 ore, 37 15C

Petrifilm Kit HEC

Escherichia coli tip enterohemoragic

Petrifilm Enterobacteriaceae Petrifilm Staph Express Count System (Petrifilm Staph Express Count Plate + Petrifilm Staph Express Disk)

Enterobacterii

Staphylococcus aureus

82

Buletinul AGIR nr. 3/2003 iulie - septembrie

EVALUAR EA CALITII M ICR O BIOLOG ICE A ALIM EN TELOR

Tabelul 3. Rezultatele evalu rilor cantitative, prin analiza microbiologic cu Petrifilme, comparativ cu tehnicile culturale clasice (Jordano i colab., 1995) Produse li t Lapte pasteurizat ngheat Indicatori i bi l i i Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Escherichia coli Drojdii i mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Escherichia coli Drojdii i mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Escherichia coli Drojdii i mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Escherichia coli Drojdii i mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Escherichia coli Drojdii i mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Escherichia coli Drojdii i mucegaiuri log 10 ufcg 1(ml 1) a) Petrifilme Metode culturale clasice 2,69 1,30 absent 1,30 5,17 absente absent absente 2,53 absente absent 1,77 5,81 5,60 absent 5,47 2,71 2,35 absent 5,26 5,34 2,31 1 2.82 2,30 1,0 absent 1,60 5,08 absente absent absente absente absente absent 2,30 5,69 5,58 absent 5,48 2,64 2,02 absent 5,29 5,49 1,55 Absent 3,86

Ou

Fig. 1. Etape de utilizare a P etrifilmelor n analiza microbiologic: 1 inoculare; 2 rspndire (etalare); 3 termostatare; analiz cantitativ i calitativ. Tabelul 2. Validarea oficial a utiliz rii Petrifilmelor pentru evaluarea calitii microbiologice a alimentelor Organiza ia interna ional * Produse pentru care s-a realizat validarea Indicator microbiologic

Carne tocat

Cpune proaspete

Mazre congelat

AOAC

ANFOR

NMKL VDIA

HPB

Drojdii i mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme i Majoritatea Escherichia coli alimentelor Petrifilmseria 2000 (P 2000 CC) pentru determinarea rapid a bacteriilor coliforme Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme i Escherichia coli Majoritatea Petrifilmseria 2000 (P 2000 CC) alimentelor pentru determinarea rapid a bacteriilor coliforme Enterobacterii Bacterii aerobe mezofile Majoritatea Bacterii coliforme i alimentelor Escherichia coli Bacterii aerobe mezofile Lapte i produse lactate Bacterii coliforme Lapte i produse Bacterii aerobe mezofile lactate Bacterii coliforme Drojdii i mucegaiuri Alte alimente Bacterii aerobe mezofile Evaluarea Bacterii coliforme i calitii mediului Escherichia coli Test Kit HEC

a)

Valorii medii, pentru cinci probe n paralel (n = 5), stabilite prin analiz statistic (P > 0,05).

* AOAC Association of Official Analytical Chemists (SUA); AFNOR French Standardization Association (Fran a); NMKL Nordic Committee of Food Analysis; VDIA Victorian dairy Industry Authority (Australia); HPB Health Protection Branch, Com pendium of Analytical Methods.

Evalurile statistice, realizate pe baza coeficien ilor de corelaie i a pantei ecuaiilor de regresie liniar, ofer certitudini privind fidelitatea rezultatelor pentru principalii indicatori microbiologici i recomand utilizarea Petrifilmelor, ca o alternativ la metodele microbiologice conven ionale, pentru controlul microbiologic, realizat att pe faze de fabricaie ct i n cazul materiilor prime i al produselor finite (tabelul 4). Datele obinute, exprimate ca valori medii, stabilite prin calcul statistic (P > 0,05), pentru cinci probe n paralel ( n = 5), certific fidelitatea i acurateea analizelor realizate cu Petrifilme, amplificarea preciziei realizndu-se prin asigurarea condiiilor selective de cultivare i interpretare a rezultatelor, ceea ce permite evaluarea corect i distinctiv a speciilor analizate (fig. 2). n concluzie, implementarea utilizrii Petrifilmelor n controlul calit ii microbiologice a alimentelor ofer numeroase faciliti care se reflect n: simplitate n utilizare i interpretarea cu acuratee a rezultatelor, prin crearea unor condiii selective de cretere i de evaluare a microorganismelor testate. Evalurile cantitative sunt facilitate, chiar n cazul dezvoltrii unui num r mare de colonii, prin caroiajul tip rit pe filmul inferior, care delimiteaz suprafee de 1 cm 2 ;

Buletinul AGIR nr. 3/2003 iulie - septembrie

83

 TIIN A I ING IN ERIA ALIM EN TELOR

Tabelul 4. Evalu ri statistice privind acurateea analizelor microbiologice realizate cu Petrifilme, comparativ cu metodele convenionale

(Jordano 1995, 1999)

Indicatorul microbiologic

Parametrul statistic Coeficient de

Petrifilme/ Metode culturale clasicea)

corelaie

Panta ecuaiei

de regresie

Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Drojdii i mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Drojdii i mucegaiuri

0,897 0.861 0.981 0,599 1.051 0,998

a) Valori medii pentru 5 probe n paralel (n = 5), pentru ase tipuri diferite de produse alimentare: lapte pasteurizat, nghe at, ou, carne tocat, cpune proaspete, soia congelat .

reducerea semnificativ a costului manoperei per analiz; reducerea la jum tate a timpului necesar pentru realizarea analizelor microbiologice, cu impact pozitiv asupra: controlului eficient al punctelor critice, optimizrii strategiilor de control, creterii numrului de analize efectuate, eficientizrii procesrii, mbun tirii calit ii i asigur rii inocuit ii produselor finite; impact pozitiv asupra organizrii laboratorului de microbiologie, prin eliminarea operaiilor de pregtire i sterilizare a mediilor de cultur i a ustensilelor de laborator, impuse de metodele conven ionale de analiz microbiologic; riscuri reduse pentru mediul nconjurtor dup utilizare; economie de spaiu la transport, p strare i termostatare. Studii efectuate n 85 de companii productoare de alimente, privind eficiena economic a tehnicilor de evaluare a calit ii microbiologice, au demonstrat c manopera se reflect n propro ie de 70,7 % n costul total al analizelor, iar prin utilizarea Petrifilmelor se pot economisi anual 99 400 ore, timp ce poate fi valorificat pentru elaborarea de programe eficiente pentru evaluarea calitii i creterea numrului de analize (Jordano, 1999).

BIBLIOGRAFIE
1. 2.

3.

4. Fig. 2. Dezvoltarea selectiv a microorganismelor, 1 drojdii i mucegaiuri; 2 bacterii aerobe mezofile; 3 enterobacterii; 4 bacterii coliforme/ E. coli.

n func ie de natura Petrifilmelor:

1. Harrigan, W.F., Park, R.W. Making safe food. A management guide for microbiological quality. Academic Press, Londra, New York, 1991. 2. Bibek, R. Fundamental Food Microbiology. CRC Press, Boston, Londra, New York, 1996. 3. Jordano, R. et al . Comparison of Petrifilm method to conventional methods for enumerating aerobic bacteria, coliforms, Escherichia coli and yeasts and molds in foods. J. Food Prot ., 51 , p. 658-662, 1995. 4. Jordano, R,Medina, L. Petrifilm An Enhanced cultural technique. In: Robinson, RK; Batt, CA; Patel, PD .eds. Encyclopedia of Food Microbiology, vol.3 , p.2095-2100, Academic Press, 1999. 5. Raugel, N. Nouveaux outils et nouvelles mthodes d'analyse rapide en agro-alimentaire. Tech. Et Doc, Lavoisier, Paris, 2002. 6. Tofan, C., Bahrim, G., Nicolau, A., Zara, M. Microbiologia produselor alimentare. Tehnici i analize de laborator . Editura AGIR, Bucureti, 1993. 7. Upman, M., B onaparte, C. Rapid methods for food hygiene inspection. In: Robinson, RK; Batt, CA; Patel, PD .eds., Encyclopedia of Food Microbiology, vol.3 , p.1887-1895, Academic Press, 1999.

84

Buletinul AGIR nr. 3/2003 iulie - septembrie